Способ получения липидов, содержащих полиненасыщенные жирные кислоты (варианты) и способ культивирования микроорганизмов, продуцирующих эти липиды
Изобретение относится к биотехнологии. Способы предусматривают культивирование микроорганизмов подкласса Thraustochytriales, способных продуцировать полиненасыщенные жирные кислоты по меньшей мере 15% от общего количества липидов. Микроорганизмы культивируют в среде, содержащей неспиртовой источник углерода и источник лимитирующих питательных веществ. Неспиртовой источник углерода и источник лимитирующих питательных веществ добавляют до достижения плотности биомассы по меньшей мере 100 г/л в пересчете на массу сухих клеток, затем процесс проводят, обеспечивая условия, при которых лимитирующее вещество ограничено. При этом концентрацию растворенного кислорода поддерживают на уровне не выше 3% от насыщения. Изобретение позволяет получить липиды с повышенным содержанием полиненасыщенных жирных кислот. 7 н. и 58 з.п. ф-лы, 1 ил., 9 табл.
Область применения настоящего изобретения
Настоящее изобретение относится к новому процессу выращивания микроорганизмов и извлечения липидов микроорганизмов. В частности, настоящее изобретение относится к способу получения липидов, содержащих полиненасыщенные жирные кислоты, и способу культивирования микроорганизмов, продуцирующих эти липиды.
Предпосылки настоящего изобретения
Считалось общепринятым, что эукариотным микроорганизмам для продуцирования жирных кислот на основе полиенов (жирных кислот, содержащих две или большее число ненасыщенных связи углерод-углерод) необходимо присутствие молекулярного кислорода (а именно, аэробные условия). Это вызвано тем, что предполагалось, что двойная цис-связь, образующаяся в жирных кислотах всех непаразитных эукариотных микроорганизмов, включает непосредственную, зависимую от кислорода реакцию десатурации (окислительные системы десатуразы микроорганизмов). Другие липиды эукариотных микроорганизмов, которые, как известно, нуждаются в молекулярном кислороде, включают: стерины грибов и растительные стерины, оксикаротеноиды (например, ксантофиллы), убихиноны и соединения, построенные из любых таких липидов (а именно, вторичные метаболиты).
Было показано, что определенные эукариотные микроорганизмы (типа водорослей; грибов, включая дрожжи; и простейших одноклеточных микроорганизмов) являются хорошими продуцентами кислот на основе полиенов в ферментерах. Однако культивирование при очень высокой плотности процесса (более чем приблизительно 100 г/л биомассы микроорганизмов, особенно в промышленных масштабах) может привести к снижению содержания жирных кислот на основе полиенов, а следовательно, к снижению продуктивности указанных жирных кислот. Это может быть частично обусловлено несколькими факторами, включая трудность поддержания высоких концентраций растворенного кислорода, связанной с необходимостью его большого объема, что вызвано высокой концентрацией микроорганизмов в ферментационном бульоне. Способы поддержания более высоких концентраций кислорода включают увеличение скорости аэрации и/или использование для аэрации вместо воздуха чистого кислорода, и/или увеличение скорости взбалтывания в ферментере. Такие решения, как правило, увеличивают стоимость продуцирования липида и капитальные затраты на ферментационное оборудование, а также они могут создать дополнительные проблемы. Например, рост аэрации при высокой плотности клеток легко может вызвать серьезные проблемы, связанные с образованием пены в ферментере, а усиленное перемешивание может привести к разрушению клеток микроорганизмов из-за выросших в ферментационном бульоне усилий сдвига (эти усилия вызывают высвобождение липидов в ферментационный бульон, в котором, под действием энзимов, возможно их окисление и/или разрушение). Для клеток, испытавших ограничение азота или азотное обеднение, индуцирование образования липидов представляет собой усиливающуюся проблему, это приводит к ослаблению стенок клеток и к разрушению клеток микроорганизмов.
Поэтому, если продуцирующие липиды эукариотные микроорганизмы росли при очень высокой концентрации клеток, то их липиды обычно содержат только очень небольшие количества жирных кислот на основе полиенов. Например, плотность дрожжей Lipomyces starkeyi, которые росли в течение 140 ч при использовании в качестве источника углерода спирта, составляла 153 г/л при результирующей концентрации липида в 83 г/л. Однако при концентрации дрожжей выше 100 г/л среднее содержание жирных кислот на основе полиенов составляет только 4,2% общего содержания жирных кислот (снизившись с величины 11,5% при плотности клеток в 20-30 г/л) Yamauchi et al., Ferment. Technol., 1983, 61, 275-280. В результате концентрация жирных кислот на основе полиенов составляет приблизительно только 3,5 г/л, а средняя продуктивность жирных кислот на основе полиенов - приблизительно только 0,025 г/л/ч. Кроме того, сообщается о присутствии в липидах дрожжей единственной жирной кислоты на основе полиенов, ею является кислота С 18:2.
Было показано, что другие дрожжи, Rhodotorula glutinus, обладают средней продуктивностью липидов, составляющей приблизительно 0,49 г/л/ч, но их липиды также имеют общее низкое содержание жирных кислот на основе полиенов (общее содержание жирных кислот 15,8%; 14,7% С18:2 и 1,2% С18:3), что дает продуктивность жирных кислот на основе полиенов, составляющую лишь 0,047 г/л/ч в подпитываемой культуре, и 0,077 г/л/ч в непрерывной культуре.
Ранее одним из настоящих заявителей было показано, что отдельные морские водоросли подкласса Thraustochytriales могут быть отличными продуцентами жирных кислот на основе полиенов в ферментерах, особенно при выращивании в условиях низкой минерализации, и особенно при очень низких концентрациях хлорида. Другие исследователи описали Thraustochytriads, которая, при росте в течение 120 ч до плотности клеток в 59 г/л, продемонстрировала среднюю продуктивность жирной кислоты на основе полиенов (докозагексаеновой кислоты или ДГК, С22:6n-3; и ДПК, С22:5n-6), составляющую приблизительно 0,158 г/л/ч. Однако такая продуктивность достигается лишь при степени минерализации, равной приблизительно 50% минерализации морской воды, т.е. при такой концентрации, которая должна вызвать серьезную коррозию стандартных ферментеров из нержавеющей стали.
Стоимость продуцирования липидов микроорганизмов, содержащих жирные кислоты на основе полиенов, и главным образом сильно ненасыщенные жирные кислоты (типа С18:4n-3, С20:4n-6, С20:5n-3, С22:5n- 3, С22:5n-6 и С22:6n-3) оставалась высокой. Это объясняется частично ограниченными плотностями, до которых культивируется присутствующая в эукариотных микроорганизмах жирная кислота на основе полиенов, и ограниченной доступностью кислорода, который необходим для достижения высокой продуктивности, и при такой высокой концентрации клеток, и при более высоких температурах.
Следовательно, необходим процесс для выращивания микроорганизмов при высокой концентрации, которая, тем не менее, способствует усиленному продуцированию липидов, содержащих жирные кислоты на основе полиенов.
Краткое изложение настоящего изобретения
В основу изобретения поставлена задача разработать способ получения липидов, содержащих полиненасыщенные жирные кислоты, из микроорганизмов, обеспечивающего высокую продуктивность процесса. Предпочтительно, чтобы указанные липиды содержали одну жирную кислоту на основе полиенов или большее их число.
Задача решена тем, что в заявляемом способе получения липидов, содержащих полиненасыщенные жирные кислоты, из микроорганизмов подкласса Thraustochytriales, способных продуцировать полиненасыщенные жирные кислоты по меньшей мере 15% от общего количества липидов, продуцируемых указанными микроорганизмами, включающем культивирование микроорганизмов в среде, содержащей не спиртовой источник углерода и источник лимитирующих питательных веществ, согласно изобретению, в указанную среду добавляют не спиртовой источник углерода и источник лимитирующих питательных веществ до достижения плотности биомассы по меньшей мере 100 г/л в пересчете на массу сухих клеток, затем процесс проводят, обеспечивая условия, при которых лимитирующее вещество ограничено, и концентрацию растворенного кислорода поддерживают на уровне не выше 3% от насыщения. Способ может представлять собой процесс с подпиткой или непрерывный процесс.
Когда плотность биомассы среды составляет, по меньшей мере, приблизительно 100 г/л в пересчете на массу сухих клеток, добавляют источник углерода без дополнительного источника лимитирующих питательных веществ или с небольшим количеством лимитирующих питательных веществ для индуцирования условий лимитирования питательного вещества, что индуцирует продуцирование липидов.
Предпочтительно достигать плотность биомассы по меньшей мере 150 г/л в пересчете на массу сухих клеток. Заявляемый процесс проводят в течение по меньшей мере 90 ч, причем в течение первых 24 ч концентрацию растворенного кислорода поддерживают на уровне, приблизительно составляющем 8%, в течение от 24-го часа до 40-го часа - на уровне, приблизительно составляющем 4%, а с 40-го часа вплоть до завершения указанного процесса - на уровне, составляющем приблизительно 0,5% или ниже. Указанный не спиртовой источник углерода предпочтительно включает углевод, а указанный источник лимитирующих питательных веществ включает источник питательных веществ, выбранный из группы, содержащей источники азота, источники углерода, источники фосфата, источники витаминов, источники металлов микроэлементов, источники металлов - макроэлементов, источники кремния, а также их смеси.
Указанный источник лимитирующих питательных веществ может включать источник питательных веществ, выбранный из группы, содержащей источник металлов- микроэлементов, а также источник металлов-макроэлементов, выбранных из группы, включающей соли серной и хлористоводородной кислоты указанных металлов, а также их смеси.
Более предпочтительно, чтобы указанный источник лимитирующих питательных веществ включал источник азота или неорганическую соль или гидроксид аммония. С помощью указанного источника лимитирующих веществ регулируют рН среды. Культивирование предпочтительно проводят при температуре по меньшей мере 20°С.
Способ продуцирует полиненасыщенные жирные кислоты по меньшей мере 15% от общего количества липидов, продуцируемых указанными микроорганизмами. Полиненасыщенные жирные кислоты предпочтительно представлены докозагексаноевой кислотой. Скорость продуцирования липидов предпочтительно составляет по меньшей мере 0,5 г/л/ч, и по меньшей мере 15% указанных липидов представляют собой полиненасыщенные жирные кислоты. Предпочтительными вариантами осуществления способа могут быть, если скорость продуцирования липидов составляет по меньшей мере 0,5 г/л/ч, и по меньшей мере 20% указанных липидов составляет суммарное количество омега-3 и омега-6 полиненасыщенных жирных кислот или, если скорость продуцирования липидов составляет по меньшей мере 0,5 г/л/ч, и по меньшей мере 25% указанных липидов составляет докозагексаноевая кислота. Указанные микроорганизмы способны продуцировать полиненасыщенные жирные кислоты в аэробных условиях. Указанные микроорганизмы выбирают из группы, включающей Thraustochytrium, Schizochytrium, а также их смеси.
При культивировании возможно осуществлять регулирование количества растворенного кислорода. Регулирование растворенного кислорода осуществляют, контролируя количество кислорода в верхней части ферментера, или контролируя контроль скорости перемешивания среды.
Концентрацию растворенного кислорода предпочтительно поддерживать менее чем 2% от насыщения и более предпочтительно менее, чем 1% от насыщения. В указанном процессе микроорганизмы продуцируют по меньшей мере 0,2 г/л/ч докозагексаноевой кислоты.
Способ может включать: (а) удаление воды из указанной среды с получением сухих микроорганизмов и (б) выделение липидов из указанных сухих микроорганизмов.
Способ дополнительно может включать: (а) обработку, приводящую к нарушению проницаемости мембран клеток микроорганизмов, растворению или разрушению указанных клеток, и (б) извлечение липидов с помощью гравитационного разделения, с помощью средства, способствующего разрушению эмульсии липид/вода, или без его помощи.
В способе получения липидов, содержащих полиненасыщенные жирные кислоты, из микроорганизмов подкласса Thraustochytriales, способных продуцировать по меньшей мере 20% от биомассы липидов, включающем культивирование указанных микроорганизмов в среде, содержащей не спиртовой источник углерода и источник лимитирующих питательных веществ, согласно изобретению, указанный источник углерода и источник лимитирующих питательных веществ добавляют в среду в процессе с подпиткой до достижения плотности биомассы по меньшей мере 100 г/л в пересчете на массу сухих клеток, затем подачу источника лимитирующих питательных веществ ограничивают или прекращают и концентрацию растворенного кислорода поддерживают на уровне не выше 3% от насыщения.
Предпочтительно достигать плотность биомассы по меньшей мере 150 г/л в пересчете на массу сухих клеток. Скорость продуцирования липидов предпочтительно составляет по меньшей мере 0,5 г/л/ч. Предпочтительно указанные микроорганизмы выбирают из группы, включающей Thraustochytrium, Schizochytrium, а также их смеси. В указанном процессе микроорганизмы продуцируют по меньшей мере 0,2 г/л/ч докозагексаноевой кислоты.
В способе получения липидов, содержащих полиненасыщенные жирные кислоты, из микроорганизмов подкласса Thraustochytriales, способных продуцировать липидов по меньшей мере 20% от биомассы, включающем культивирование указанных микроорганизмов в среде, содержащей не спиртовой источник углерода и источник лимитирующих питательных веществ, согласно изобретению, не спиртовой источник углерода и источник лимитирующих питательных веществ добавляют в среду до достижения плотности биомассы по меньшей мере 100 г/л в пересчете на массу сухих клеток; затем подачу источника лимитирующих питательных веществ ограничивают или прекращают и концентрацию растворенного кислорода поддерживают на уровне не выше 3% от насыщения. Способ представляет собой процесс с подпиткой. Предпочтительно достигают плотность биомассы по меньшей мере приблизительно 150 г/л в пересчете на массу сухих клеток. Скорость продуцирования липидов предпочтительно составляет по меньшей мере 0,5 г/л/ч. Указанные микроорганизмы предпочтительно выбирают из группы, включающей Thraustochytrium, Schizochytnum, а также их смеси. В указанном процессе микроорганизмы продуцируют по меньшей мере 0,2 г/л/ч докозагексаноевой кислоты.
В способе получения липидов, содержащих полиненасыщенные жирные кислоты, из микроорганизмов подкласса Thraustochytriales, способных продуцировать полиненасыщенные жирные кислоты по меньшей мере 15% от общего количества липидов, продуцируемых указанными микроорганизмами, включающем культивирование указанных микроорганизмов в среде, содержащей не спиртовой источник углерода и источник лимитирующих питательных веществ, согласно изобретению, указанный источник углерода и источник лимитирующих питательных веществ добавляют в процессе с подпиткой до достижения плотности биомассы по меньшей мере 100 г/л в пересчете на массу сухих клеток, затем процесс проводят, обеспечивая условия, при которых лимитирующее вещество ограничено, и концентрацию растворенного кислорода поддерживают на уровне не выше 3% от насыщения.
Предпочтительно достигают плотность биомассы по меньшей мере приблизительно 150 г/л в пересчете на массу сухих клеток. Скорость продуцирования липидов предпочтительно составляет по меньшей мере 0,5 г/л/ч. Указанные микроорганизмы предпочтительно выбирают из группы, включающей Thraustochytrium, Schizochytrium, а также их смеси. В указанном процессе микроорганизмы продуцируют по меньшей мере 0,2 г/л/ч докозагексаноевой кислоты.
Изобретением также является способ культивирования микроорганизмов подкласса Thraustochytriales. В заявляемом способе культивирования микроорганизмов подкласса Thraustochytriales, способных продуцировать липидов по меньшей мере 20% от биомассы, включающем культивирование указанных микроорганизмов в среде, содержащей источник не спиртового углерода и источник лимитирующих питательных веществ, согласно изобретению, не спиртовой источник углерода и источник лимитирующих питательных веществ добавляют в среду до достижения плотности биомассы по меньшей мере до 100 г/л в пересчете на массу сухих клеток; затем процесс проводят, обеспечивая условия, при которых лимитирующее вещество ограничено, и концентрацию растворенного кислорода поддерживают на уровне не выше 3% от насыщения, скорость продуцирования липидов составляет по меньшей мере 0,5 г/л/ч и по меньшей мере 15% от общего количества липидов, продуцируемых микроорганизмами, представляют собой полиненасыщенные жирные кислоты. Способ представляет собой процесс с подпиткой.
Предпочтительно достигают плотность биомассы по меньшей мере приблизительно 150 г/л в пересчете на массу сухих клеток. Указанные микроорганизмы предпочтительно выбирают из группы, включающей Thraustochytrium, Schizochytrium, а также их смеси. В указанном процессе микроорганизмы продуцируют по меньшей мере 0,2 г/л/ч докозагексаноевой кислоты.
В способе культивирования микроорганизмов подкласса Thraustochytriales, способных продуцировать по меньшей мере 20% от биомассы липидов, содержащих полиненасыщенные жирные кислоты, включающем культивирование указанных микроорганизмов в среде, содержащей не спиртовой источник углерода и источник лимитирующих питательных веществ, согласно изобретению, не спиртовой источник углерода и источник лимитирующих питательных веществ добавляют в среду до достижения плотности биомассы по меньшей мере 100 г/л в пересчете на массу сухих клеток, затем процесс проводят, обеспечивая условия, при которых лимитирующее вещество ограничено, и концентрацию растворенного кислорода поддерживают на уровне не выше 3% от насыщения. Способ представляет собой процесс с подпиткой. Предпочтительно достигают плотность биомассы по меньшей мере приблизительно 150 г/л в пересчете на массу сухи клеток. Скорость продуцирования липидов предпочтительно составляет по меньшей мере 0,5 г/л/ч. Указанные микроорганизмы предпочтительно выбирают из группы, включающей Thraustochytrium, Schizochytrium, а также их смеси. В указанном процессе микроорганизмы продуцируют по меньшей мере 0,2 г/л/ч докозагексаноевой кислоты.
В заявляемом способе получения липидов, содержащих полиненасыщенные жирные кислоты, из микроорганизмов подкласса Thraustochytriales, способных продуцировать полиненасыщенные жирные кислоты по меньшей мере 15% от общего количества липидов, продуцируемых указанными микроорганизмами, включающем культивирование микроорганизмов в среде, содержащей не спиртовой источник углерода и источник лимитирующих питательных веществ, согласно изобретению, в указанную среду добавляют не спиртовой источник углерода и источник лимитирующих питательных веществ до достижения плотности биомассы по меньшей мере 100 г/л в пересчете на массу сухих клеток, затем процесс проводят, обеспечивая условия, при которых лимитирующее вещество ограничено, и концентрацию растворенного кислорода поддерживают на уровне не выше 3% от насыщения, после завершения культивирования, полученные липиды выделяют. Способ представляет собой процесс с подпиткой.
Предпочтительно достигают плотность биомассы по меньшей мере приблизительно 150 г/л в пересчете на массу сухих клеток. Скорость продуцирования липидов предпочтительно составляет по меньшей мере 0,5 г/л/ч. Указанные микроорганизмы предпочтительно выбирают из группы, включающей Thraustochytrium, Schizochytrium, а также их смеси. В указанном процессе микроорганизмы продуцируют по меньшей мере 0,2 г/л/ч докозагексаноевой кислоты.
Краткое описание чертежей
На чертеже представлена таблица и график различных параметров продуцирования микроорганизмов в зависимости от количества растворенного в ферментационной среде кислорода.
Подробное описание настоящего изобретения
Настоящее изобретение обеспечивает процесс выращивания микроорганизмов, таких как, например, водоросли, грибы (включая дрожжи), простейшие одноклеточные организмы и бактерии. Предпочтительно, чтобы микроорганизмы выбирали их группы, включающей водоросли, простейшие одноклеточные организмы и их смеси. Более предпочтительными микроорганизмами являются водоросли. Кроме того, процесс по настоящему изобретению можно использовать для получения разнообразных липидных соединений, в частности ненасыщенных липидов, предпочтительно полиненасыщенных липидов (а именно, липидов, содержащих по крайней мере две ненасыщенные связи углерод-углерод, например двойные связи), а более предпочтительны сильно ненасыщенные липиды (а именно, липиды, содержащие четыре ненасыщенные связи углерод-углерод, или большее их количество), типа омега-3 и/или омега-6 полиненасыщенных жирных кислот, включая докозагексаеновую кислоту (а именно, ДГК); а также другие природные ненасыщенные, полиненасыщенные и сильно ненасыщенные соединения. Термин «липид», используемый здесь, включает фосфолипиды; свободные жирные кислоты; эфиры жирных кислот; триглицерины; стерины и сложные эфиры стеринов; каротеноиды; ксантофиллы (например, оксикаротеноиды); углеводы; соединения, являющиеся производными изопреноида, а также другие липиды, которые известны людям, обладающим стандартными навыками в данной технологии.
Более конкретно процессы по настоящему изобретению пригодны для продуцирования жирных кислот на основе полиенов эукариотных микроорганизмов, каротеноидов, стеринов грибов, фитостеринов, ксантофиллов, убихинонов и других соединений, являющихся производными изопреноида, которым, как обычно полагают, для формирования ненасыщенных связей углерод-углерод необходим кислород (а именно, аэробные условия), а также их вторичных метаболитов. В частности, процессы по настоящему изобретению пригодны для культивирования микроорганизмов, которые продуцируют жирную кислоту на основе полиенов (кислоты), а также для продуцирования микроорганизмами жирной кислоты (кислот) на основе полиенов.
Хотя процессы по настоящему изобретению можно использовать для культивирования широкого спектра микроорганизмов, а также для получения полиненасыщенных липидов, содержащих соединения, продуцируемых теми же микроорганизмами, для краткости, удобства и иллюстрации в подробном описании настоящего изобретения будут обсуждаться процессы роста микроорганизмов, способных продуцировать липиды, включая омега-3 и/или омега-6 полиненасыщенные жирные кислоты, в частности микроорганизмы, способные продуцировать ДГК (докозагексаеновую кислоту) или такие родственные ей соединения, как ЭПК (эйкозапентаеновая кислота), ДПК (докозапентаеновая кислота) или ARA. Предпочтительные микроорганизмы включают микроводоросли, грибы (включая дрожжи), простейшие одноклеточные организмы и бактерии. Одна группа предпочтительных микроорганизмов является членом группы микроорганизмов, называемых Stramenopiles, в которую входят микроводоросли и микроорганизмы, подобные водорослям. Stramenopiles включает следующие группы микроорганизмов: Hamatores, Proteromonads, Opalines, Developayella, Labrinthulids, Thraustochytrids, Biosecids, Oomycetes, Hypochytridiomycetes, Commation, Reticulosphaera, Pelagomonas, Pelagococcus, Ollicola, Aureococcus, Parmales, Diatoms, Xanthophytes, Phaeophytes (коричневые водоросли), Eustigmatophytes, Raphidophytes, Synurids, Axodines (включая Rhizochromulinaales, Pedinellales, Dictyochales), Chrysomeridales, Sarcinochrysidales, Hydruuales, Hibberdiales и Chromulinales. Другие предпочтительные группы микроводорослей включают членов группы зеленых водорослей и диножгутиконосцев, включая членов рода Chrypthecodium. Более конкретно предпочтительные воплощения настоящего изобретения будут обсуждаться со ссылкой на процесс выращивания морских микроорганизмов, в частности водорослей, таких как Thraustochytrids из подкласса Thraustochytriales рода Thraustochytrium и Schizochytrium, включая Thraustochytriales; процесс раскрывается в патентах США No.5340594 и No.5340742 (оба принадлежащих Barclay), на них здесь сделаны полные ссылки. Следует отметить, что многие эксперты согласны с тем, что Ulkenia не представляет собой отдельный род, а на самом деле является частью рода Schizochytrium. Согласно использованию здесь в род Schizochytrium должен входить Ulkenia.
Предпочтительными микроорганизмами являются такие микроорганизмы, которые с помощью систем поликетидсинтазы продуцируют целевые соединения. Такие микроорганизмы включают микроорганизмы с эндогенной системой поликетидсинтазы и микроорганизмы, в которых система поликетидсинтазы получена методом генной инженерии. Поликетиды представляют собой структурные производные природных продуктов, обладающих широким диапазоном биологических активностей, включая антибиотические и фармакологические свойства. Поликетидсинтаза катализирует биосинтез основной углеродной цепи поликетидов. Поликетидсинтаза, также как структурно и механистически родственная ей жирная кислота синтетазы, катализирует повторяющиеся декарбоксилирующие конденсации ациловых тиоэфиров, которые одновременно удлиняют основную углеродную цепь на два атома углерода. Однако поликетидсинтазы, в отличие от жирной кислоты синтетазы, могут обеспечивать значительную структурную вариабельность конечного продукта. Отдельные системы поликетидсинтазы могут осуществлять это, используя исходные звенья, отличные от ацетата, и применяя в качестве «удлинителя звена» метил- или этилмалонат, а также варьируя циклы кето-восстановления, дегидрирования и еноил-восстановления по образующейся после каждой конденсации β-кето-группе. Особый интерес здесь представляет то, что в конечном продукте можно сохранить двойные связи углерод-углерод, вводимые на стадии дегидрирования. Кроме того, хотя эти двойные связи первоначально имеют транс-конфигурацию, с помощью ферментной изомеризации их можно превратить в цис-конфигурацию, которую находят в ДГК (и других представляющих интерес жирных кислот на основе полиенов). Как реакция дегидразы, так и реакция изомеризации могут происходить в отсутствии молекулярного кислорода.
Предпочтительно, чтобы для продуцирования продуктов и микроорганизмов по настоящему изобретению был обеспечен гетеротрофный процесс. Этот процесс предпочтительно включает культивирование микроорганизмов в питательной среде, причем указанные микроорганизмы содержат систему поликетидсинтазы. Предпочтительно, чтобы концентрация растворенного кислорода поддерживалась на уровне меньше чем приблизительно 8%, предпочтительно меньше чем приблизительно 4%, более предпочтительно меньше чем приблизительно 3% и более предпочтительно менее чем приблизительно 1%.
Следует понимать, однако, что в целом настоящее изобретение не предназначено для такого ограничения, и что квалифицированный в данной технологии человек признает, что в соответствии с обсуждаемыми здесь методиками идея настоящего изобретения приложима к другим микроорганизмам, продуцирующим многообразие других соединений, включая другие липидные составы.
Предполагая, что скорость продуцирования липидов водорослями относительно постоянна, легко станет очевидным, что более высокая плотность биомассы должна обеспечить большее общее количество липидов, продуцируемых единицей объема. Стандартные современные процессы ферментации при выращивании водорослей обеспечивают плотность биомассы от приблизительно 50 до приблизительно 80 г/л или менее. Настоящие заявители установили, что при использовании процесса по настоящему изобретению можно получить плотность биомассы значительно более высокую, чем это известно в настоящее время. Предпочтительно, чтобы процессы по настоящему изобретению обеспечивали плотность биомассы по крайней мере приблизительно 100 г/л, более предпочтительно по крайней мере приблизительно 130 г/л, еще более предпочтительно по крайней мере приблизительно 150 г/л, еще более предпочтительно по крайней мере приблизительно 170 г/л, а наиболее предпочтительно выше 200 г/л. Таким образом, при столь высокой плотности биомассы, даже если скорость продуцирования липидов водорослями немного снижается, но общая скорость продуцирования липидов на единицу объема будет значительно выше, чем для процессов, известных в настоящее время.
Процессы по настоящему изобретению для культивирования микроорганизмов подкласса Thraustochytriales включают добавление в ферментационную среду, содержащую указанные микроорганизмы, источника углерода и источника ключевых питательных веществ; причем это введение проводят со скоростью, достаточной для того, чтобы плотность биомассы ферментационной среды увеличилась до описанных выше значений. Используемый здесь термин «источник ключевых питательных веществ» относится к источнику питательных веществ (включая само питательное вещество), важность которого для роста микроорганизма заключается в том, что если в питательной среде указанный источник ключевых питательных веществ исчерпан, то его отсутствие существенно ограничивает дальнейший рост или воспроизведение. Однако, т.к. по- прежнему имеется изобилие остальных питательных веществ, то организм способен производить и аккумулировать внутриклеточные и/или внеклеточные продукты. Подбирая определенное ключевое питательное вещество, можно контролировать тип аккумулируемых продуктов. Таким образом, обеспечение источника ключевых питательных веществ до определенной степени позволяет контролировать как скорость роста микроорганизмов, так и продуцирование или аккумулирование целевых продуктов (например, липидов). Ферментационный процесс, при котором один или более субстратов (например, источник углерода и источник ключевых питательных веществ) вводят в виде добавок, обычно называют ферментационным процессом с подпитыванием. Было обнаружено, что когда субстрат вводят в ферментационный процесс с подпитыванием, то присутствие большого количества источника углерода (например, приблизительно 200 г/л или более на 60 г/л плотности биомассы) оказывает пагубное воздействие на микроорганизмы. Без взаимосвязи с какой-либо теорией предполагается, что такое большое количество источника углерода оказывает пагубное воздействие на микроорганизмы (включая осмотическое напряжение) и подавляет их исходную продуктивность. Процессы по настоящему изобретению устраняют этот нежелательный пагубный эффект, обеспечивая при этом такое количество субстрата, которое достаточно для получения указанной выше плотности биомассы микроорганизмов.
Процессы для культивирования микроорганизмов по настоящему изобретению могут включать стадию увеличения плотности биомассы. Основной целью процесса ферментации на стадии увеличения плотности биомассы является увеличение плотности биомассы в ферментационной среде в целях получения описанной выше плотности биомассы. Обычно скорость введения источника углерода поддерживают на таком уровне или в таком диапазоне, которые не оказывают значительного нежелательного воздействия на продуктивность микроорганизмов или на их жизнеспособность, вызванного недостаточной мощностью ферментационного оборудования по отводу тепла и по передачи газов к жидкому бульону и от него. Допустимый диапазон количества источника углерода, необходимый для определенного микроорганизма в течение всего ферментационного процесса, хорошо известен людям, имеющим стандартные навыки в этой технологии. Предпочтительно, чтобы источником углерода по настоящему изобретению являлся неспиртовой источник углерода, а именно такой источник углерода, который не содержит спирта. Используемый здесь термин «спирт» относится к соединениям, имеющим 4 или менее атомов углерода с одной гидрокси-группой, например метанол, этанол и изопропанол, но в целях настоящего изобретения не включены такие гидроксиорганические кислоты, как молочная кислота и аналогичные соединения. Более предпочтительно, чтобы источником углерода по настоящему изобретения являлся углевод, включая (но ими не ограничиваясь): фруктозу, глюкозу, сахарозу, мелассу и крахмал. Другие пригодные простые и сложные источники углерода и источники азота раскрываются в вышеупомянутых патентах. Однако обычно в качестве исходного источника углерода используют углевод, предпочтительно кукурузный сироп. Источниками углерода могут также служить жирные кислоты в форме гидроксижирных кислот, триглицеридов, а также ди- и моноглицериды.
Особенно предпочтительными источниками азота являются: мочевина, нитрат, нитрит, соевый белок, аминокислоты, белок, раствор кукурузного экстракта, дрожжевой экстракт, субпродукты животного происхождения, неорганические соли аммония, предпочтительно сульфаты аммония, гидроксид аммония; гидроксид аммония наиболее предпочтителен. Другие ключевые источники питательных веществ включают источники углерода (указанные выше), источники фосфора, источники витаминов (таких, как источники витамина В12, источники пантотената, источники тиамина), металлы-источники микроэлементов (такие, как источники цинка, источники меди, источники кобальта, источники никеля, источники железа, источники марганца, источники молибдена) и источники основных металлов (такие, как источники магния, источники кальция, источники натрия, источники калия и источники кремния и т.д.) Металлы-источники микроэлементов и источники основных металлов могут включать сульфаты и хлориды этих металлов (например, таких как MgSO4 7Н2О; MnCl2 4Н2О; ZnSO4 7Н2О; CoCl2 6Н2O; Na2MoO4 2H2O; CuSO4 5H2O; NiSO4 6Н2О; FeSO4 7H2O; CaCl2; K2SO4; KCl и Na2SO4).
При использовании в качестве источника азота аммониевых солей ферментационная среда становится кислой, если ее не регулируют добавками оснований или буферов. Если в качестве исходного источника азота используют гидроксид аммония, то возможно также его применение и для контроля рН. Микроорганизмы подкласса Thraustochytriales, в частности Thraustochytriales рода Thraustochytrium и Schizochytrium, будут расти в широком диапазоне рН, например от рН со значением приблизительно 5 до рН со значением приблизительно 11. Точный диапазон рН для ферментации каждого конкретного микроорганизма находится в пределах компетенции квалифицированных в данной технологии людей.
Процессы культивирования микроорганизмов по настоящему изобретению могут также включать стадию продуцирования. На этой стадии первичное использование микроорганизмами субстрата не увеличивает плотность биомассы, скорее субстрат используется для продуцирования липидов. Следует понимать, что липиды также продуцируются микроорганизмами на стадии увеличения плотности биомассы; однако, как это отмечалось выше, главной целью стадии увеличения плотности биомассы является рост плотности биомассы. Обычно на стадии продуцирования добавки ключевого источника питательных веществ снижаются или предпочтительно прерываются.
Обычно раньше полагали, что присутствие в ферментационной среде растворенного кислорода представляет собой решающий момент для продуцирования эукариотными микроорганизмами полиненасыщенных соединений, включая омега-3 и/или омега-6 полиненасыщенные жирные кислоты. Внезапно и неожиданно настоящими заявителями было обнаружено, что скорость продуцирования липидов поразительно увеличилась, когда на стадии продуцирования снизилась концентрация растворенного кислорода. Таким образом, в то время как концентрация растворенного кислорода в ферментационной среде на стадии увеличения плотности биомассы составляет предпочтительно по крайней мере приблизительно 8% насыщения, а предпочтительно по крайней мере приблизительно 4% насыщения, концентрация растворенного кислорода на стадии продуцирования в ферментационной среде снижается до приблизительно 3% насыщения или ниже, предпочтительно до приблизительно 1% насыщения или ниже, а более предпочтительно до приблизительно 0% насыщения. В начале ферментации количество растворенного кислорода может быть близким к состоянию насыщения, а по мере роста микроорганизмов допускается его снижение до таких низких значений. В одном варианте настоящего изобретения концентрация растворенного кислорода в ферментационной среде меняется на протяжении всего процесса ферментации. Например, в ферментационном процессе с общим времени ферментации от приблизительно 90 ч до приблизительно 100 ч концентрация растворенного кислорода в ферментационной среде в течение первых 24 ч поддерживается на уровне приблизительно 8%, в период от приблизительно 24-го часа до приблизительно 40-го часа - на уровне приблизительно 4% и в период от 40-го часа до конца процесса ферментации - на уровне приблизительно 0,5% или ниже.
Количество растворенного кислорода, присутствующего в ферментационной среде, можно регулировать, контролируя количество кислорода в верхней части объема ферментера, или предпочтительно контролируя ту скорость, с которой встряхивается (или перемешивается) ферментационная среда. Например, встряхивание (или перемешивание) с большой скоростью обеспечивает количество растворенного кислорода в ферментационной среде большее, чем встряхивание с низкой скоростью. Например, для получения указанной выше концентрации растворенного кислорода в ферментере объемом приблизительно 14000 галлонов в течение первых 12 ч скорость встряхивания устанавливают равной от приблизительно 50 об/мин до приблизительно 70 об/мин, в интервале от приблизительного 12-го ч до приблизительно 18-го ч скорость встряхивания устанавливают от приблизительно 55 об/мин до приблизительно 80 об/мин, а в интервале от приблизительного 18-го ч до окончания процесса ферментации скорость встряхивания устанавливают от приблизительно 70 об/мин до приблизительно 90 об/мин; при этом общая продолжительность ферментационного процесса составляла от приблизительно 90 ч до приблизительно 100 ч. Люди, квалифицированные в данной технологии, могут легко установить такой диапазон скоростей встряхивания, который необходим для получения определенного количества растворенного кислорода.
Предпочтительная температура процесса по настоящему изобретению составляет по крайней мере приблизительно 20°С, более предпочтительно по крайней мере приблизительно 25°С, а наиболее предпочтительно по крайней мере приблизительно 30°С. Необходимо принимать во внимание, что холодная вода способна удерживать большее количество растворенного кислорода, чем теплая вода. Таким образом, более высокая температура ферментационной среды дает дополнительное преимущество, состоящее в том, что количество растворенного кислорода при этом снижается, что, как было указано выше, крайне желательно.
Конкретным микроорганизмам может потребоваться присутствие в ферментационной среде определенного количества солесодержащих минералов. Такие солесодержащие минералы, в частности ионы хлора, могут вызывать коррозию ферментера и другого расположенного после него технологического оборудования. Для того чтобы предотвратить или уменьшить нежелательное воздействие, вызванное относительно большим количеством ионов хлора, присутствующих в ферментационной среде, в процессах по настоящему изобретению в ферментационной среде возможно использование в качестве источника натрия не содержащих хлора натриевых солей, предпочтительно сульфата натрия. В частности, значительная часть требуемого для ферментации натрия поставляется в виде не содержащих хлора натриевых солей. Например, менее чем приблизительно 75% натрия в ферментационной среде поставляется в виде хлорида натрия, более предпочтительно меньше чем приблизительно 50% и более предпочтительно меньше чем приблизительно 25%. Микроорганизмы по настоящему изобретению способны к росту при концентрации хлора меньше чем приблизительно 3 г/л, более предпочтительно меньше чем приблизительно 500 мг/л, более предпочтительно меньше чем приблизительно 250 мг/л, а наиболее предпочтительно - от приблизительно 60 мг/л до приблизительно 120 мг/л.
Не содержащие хлора натриевые соли могут включать кальцинированную соду (смесь карбоната натрия и оксида натрия), карбонат натрия, бикарбонат натрия, сульфат натрия и их смеси, а предпочтительным является включение сульфата натрия. Кальцинированная сода, карбонат натрия и бикарбонат натрия имеют тенденцию увеличивать рН ферментационной среды, поэтому, чтобы поддерживать нужное значение рН указанной среды, необходимы стадии контроля. Концентрация сульфата натрия эффективна для того, чтобы соответствовать требованиям микроорганизмов относительно степени минерализации, предпочтительная концентрация натрия (выраженная как г/л Na) составляет приблизительно 1 г/л, более предпочтителен диапазон от приблизительно 1 г/л до приблизительно 50 г/л, а более предпочтителен диапазон от приблизительно 2 г/л до приблизительно 25 г/л.
Различные параметры ферментации для инокулирования, культивирования и извлечения микроорганизмов детально обсуждаются в патенте США No.5130242, ссылка на который приведена здесь полностью.
Для выделения микроорганизмов из ферментационной среды можно использовать любой из известных в настоящее время способов выделения, включая центрифугирование, фильтрацию, ультрафильтрацию, декантацию и выпаривание растворителя. Настоящими заявителями было обнаружено, что если для извлечения микроорганизмов используют центрифугу, то, из-за высокой плотности биомассы, получаемой в процессах по настоящему изобретению, ферментационную среду предпочтительно разбавлять водой, это снижает плотность биомассы, позволяя тем самым проводить более эффективное отделение микроорганизмов от ферментационной среды.
Крайне высокая плотность биомассы, получаемая по настоящему изобретению, также способствует извлечению липидов микроорганизмов без помощи растворителя. Предпочтительные процессы извлечения липидов, когда в ферментере (допускающем разрушение липидной эмульсии и извлечение фракции, богатой содержанием липидов) происходит разрушение клеток, их лизис или нарушение проницаемости клеточной мембраны, включают процессы обезжиривания. В этом процессе в эмульсию масло/вода для ее разрушения добавляют растворимое в воде соединение (например, спирт или ацетон), а полученную в результате смесь подвергают гравитационному разделению (например, центрифугированию). Этот процесс также возможно модифицировать, чтобы для разрушения указанной эмульсии можно было использовать другие средства (растворимые в воде и/или липиде).
Или же микроорганизмы из ферментационной среды извлекают, выпаривая из указанной среды воду, например, путем контактирования этой среды непосредственно (а именно, без предварительного концентрирования, например, с помощью центрифугирования) с сушилкой, типа барабанной сушилки, то есть при непосредственном извлечении с помощью барабанной сушилки. При применении для выделения микроорганизмов непосредственного процесса извлечения с помощью барабанной сушилки обычно применяют барабанную сушилку с паровым подогревателем. Кроме этого при использовании непосредственного процесса извлечения с помощью барабанной сушилки плотность биомассы ферментационной среды составляет предпочтительно по крайней мере приблизительно 130 г/л, более предпочтительно по крайней мере приблизительно 150 г/л, а наиболее предпочтительно по крайней мере приблизительно 180 г/л. Такая высокая плотность биомассы обычно желательна для непосредственного извлечения с помощью барабанной сушилки, поскольку при меньшей плотности биомассы в ферментационной среде содержится количество воды, достаточное для существенного охлаждения указанной сушилки, а это приводит к неполному высушиванию микроорганизмов. Людям, квалифицированным в этой технологии, хорошо известны другие способы высушивания клеток, включая распылительную сушку.
Процессы по настоящему изобретению обеспечивают среднюю скорость продуцирования липидов, составляющую по крайней мере приблизительно 0,5 г/л/ч, предпочтительно по крайней мере приблизительно 0,7 г/л/ч, более предпочтительно по крайней мере приблизительно 0,9 г/л/ч, а наиболее предпочтительно по крайней мере приблизительно 1,0 г/л/ч. Помимо этого липиды, полученные с помощью процессов по настоящему изобретению, содержат полиненасыщенные липиды, их количество выше, чем приблизительно 15%, предпочтительно выше, чем приблизительно 20%, более предпочтительно выше, чем приблизительно 25%, еще более предпочтительно выше, чем приблизительно 30%, а наиболее предпочтительно выше, чем приблизительно 35%. Липиды можно извлекать или из высушенных микроорганизмов, или из микроорганизмов в ферментационной среде. Обычно по крайней мере приблизительно 20% липидов, продуцируемых микроорганизмами в процессах по настоящему изобретению, представляют собой омега-3 и/или омега-6 полиненасыщенные жирные кислоты; предпочтительно по крайней мере приблизительно 30% липидов являются омега-3 и/или омега-6 полиненасыщенными жирными кислотами, более предпочтительно по крайней мере приблизительно 40% липидов являются омега-3 и/или омега-6 полиненасыщенными жирными кислотами, а наиболее предпочтительно по крайней мере приблизительно 50% липидов являются омега-3 и/или омега-6 полиненасыщенными жирными кислотами. Или же процессы по настоящему изобретению обеспечивают среднюю скорость продуцирования омега-3 жирной кислоты (например, ДГК), составляющую по крайней мере приблизительно 0,2 г омега-3 жирной кислоты (например, ДГК)/л/ч, предпочтительно по крайней мере приблизительно 0,3 г омега-3 жирной кислоты (например, ДГК)/л/ч, более предпочтительно по крайней мере приблизительно 0,4 г омега-3 жирной кислоты (например, ДГК)/л/ч, а наиболее предпочтительно по крайней мере приблизительно 0,5 г омега-3 жирной кислоты (например, ДГК)/л/ч. Или же процессы по настоящему изобретению обеспечивают среднюю скорость продуцирования омега-6 жирной кислоты (например, ДПКn-6), составляющую по крайней мере приблизительно 0,07 г омега-6 жирной кислоты (например, ДПКn-6)/л/ч, предпочтительно по крайней мере приблизительно 0,1 г омега-6 жирной кислоты (например, ДПКn-6)/л/ч, более предпочтительно по крайней мере приблизительно 0,13 г омега-6 жирной кислоты (например, ДПКn-6)/л/ч, а наиболее предпочтительно по крайней мере приблизительно 0,17 г омега-6 жирной кислоты (например, ДПКn-6)/л/ч. Или же по крайней мере приблизительно 25% липида представляет собой ДГК (на основе полного метилового эфира жирной кислоты, или МЭЖК), предпочтительно по крайней мере приблизительно 30%, более предпочтительно по крайней мере приблизительно 35%, а наиболее предпочтительно по крайней мере приблизительно 40%.
Микроорганизмы, из которых экстрагируют липиды, остающуюся после экстракции липидов биомассу, или их комбинацию можно непосредственно использовать в качестве пищевого ингредиента, как составную часть напитков, соусов, молочных продуктов (таких как молоко, йогурт, сыр и мороженое) и выпечки; в качестве питательной добавки (в форме капсул или таблеток); как корм или как кормовую добавку для любых животных, мясо или другие продукты которых употребляет человек; как пищевую добавку, включая пищевые добавки для младенцев и детей; а также как фармацевтические составы (как прямую или дополнительную терапию). Термином «животное» обозначен любой организм, принадлежащий к царству животных и включающий, без ограничений, любое животное, от которого получают мясо домашней птицы, морские продукты, говядину, свинину или баранину. Морские продукты получают, без ограничений, от рыб, креветок и ракообразных. Термин «продукты» включает любой продукт, полученный от животных и отличный от мяса, в него включены, без ограничений, яйца, молоко или другие продукты. Полиненасыщенные липиды, которыми кормят таких животных, могут входить в состав мяса, яиц или иных продуктов, получаемых от таких животных, чтобы увеличить содержание в них липидов.
Другие цели, преимущества и новые характеристики настоящего изобретения станут очевидны квалифицированным в данной технологии людям при изучении приведенных далее примеров настоящего изобретения, которые не следует считать ограничительными.
ПРИМЕРЫ
Штамм Schizochytrium, используемый в этих примерах, в разнообразных условиях ферментации продуцирует две основные кислоты на основе полисное ДГКn-3 и ДПКn-6 при их соотношении приблизительно 3:1, а также небольшие количества других кислот на основе полиенов, таких как ЭПК и С20:3. Таким образом, поскольку в приведенных далее примерах указаны лишь количества ДГК, то, используя указанное выше соотношение, легко подсчитать количество продуцируемой DPA(n-6).
ПРИМЕР 1
Этот пример иллюстрирует влияние содержания кислорода в ферментационной среде на продуктивность липида.
Были оценены результаты ферментации Schizochytrium ATCC No. 20888 при различных концентрациях растворенного кислорода. Полученные результаты приведены на чертеже, на котором ОКС представляет собой остаточную концентрацию сахара, а МСК - массу клеток в сухом состоянии.
ПРИМЕР 2
Этот пример также иллюстрирует влияние низких концентраций кислорода в ферментационной среде на содержание ДГК (% массы в сухом состоянии) в биомассе конечного продукта.
Эксперимент был проведен в 250 мл колбах Эрленмейера в уменьшенном масштабе в целях имитации влияния низкой концентрации кислорода в ферментационной среде на содержание ДГК в клетках Schizochytrium sp., культивированных в крупномасштабных ферментерах. Культивирование Schizochytrium sp. ATCC No.20888 проводили в среде О4-4. Эта культуральная среда содержит следующие компоненты (в пересчете на 1 л основы, растворенной в деионизированной воде): Na2SO4 12,61 г; MgSO4 7H2O 1,2 г; KCl 0,25 г; CaCl2 0,05 г; глютамат натрия 7,0 г; глюкоза 10 г; KH2PO4 0,5 г; NaHCO3 0,1 г; экстракт дрожжей 0,1 г; смесь витаминов 1,0 мл; смесь металлов PII 1,00 мл. Смесь металлов PII содержит (в 1 л): 6,0 г Na2 EDTA; 0,29 г FeCl3 6H2O; 6,84 г Н3ВО3; 0,86 г MnCl2 4Н2О; 0,06 г ZnCl2; 0,026 г CoCl2 6Н2O; 0,052 г NiSO4 Н2О; 0,002 г CuSO4 Н2О и 0,005 г Na2MoO4 2H2O. Смесь витаминов содержит (в 1л): 100 мг тиамина, 0,5 мг биотина и 0,5 мг цианокобаламина. Значение рН культуральной среды довели до величины 7,0, после чего смесь простерилизовали на фильтре.
После этого план эксперимента в уменьшенном масштабе состоял в культивировании клетки во встряхиваемых колбах с разным объемом культуральной среды в них; почти полные колбы (например, 200 мл в 250 мл встряхиваемой колбе) не будут нормально перемешиваться на станковом шейкере, и, следовательно, по мере роста клеток будут создаваться условия с низким содержанием растворенного кислорода. Поэтому в ходе этого эксперимента осуществили 4 технологических обработки, каждую из которых дублировали: (1) колбы на 250 мл были заполнены 50 мл культуральной среды; (2) колбы на 250 мл были заполнены 100 мл культуральной среды; (3) колбы на 250 мл были заполнены 150 мл культуральной среды; и (4) колбы на 250 мл были заполнены 200 мл культуральной среды. Каждую из 8 колб инокулировали клетками 48 часовой культуры Schizochytrium в среде О4-4 при соблюдении условий обработки (1), и на станковом шейкере при 28°С и 220 об/мин. Все 8 колб на станковом шейкере (220 об/мин) поместили в инкубатор (28°С), где в течение 48 ч в темноте проходило культивирование. По окончании эксперимента с помощью измерителя растворенного кислорода YSI измерили концентрацию растворенного кислорода (РК) в каждой колбе. Были определены также рН культуральной среды, масса клеток в сухом состоянии и содержание в них жирных кислот. Полученные результаты приведены в таблице 1.
| Таблица 1. Результаты эксперимента в уменьшенном масштабе по определению влияния низких концентраций растворенного кислорода на содержание сильно ненасыщенных жирных кислот с длинной цепью (масса ДГК в сухом состоянии, %) в Schizochytrium sp. | |||||
| Среда, мл | Метиловый эфир жирной кислоты (% TFA) | ДГК(% массы в сухом состоянии) | Биомасса (г/л) | Конечное значение рН | РК (% насыщения) |
| 50 | 16,5 | 7,4 | 4,2 | 7,4 | 31 |
| 100 | 17,0 | 6,5 | 3,9 | 7.2 | 29 |
| 150 | 22,4 | 9,2 | 2,7 | 7,0 | 11 |
| 200 | 35,9 | 14,5 | 1,8 | 6,9 | 3 |
Полученные результаты показывают, что содержание липида (в % в виде метилового эфира жирной кислоты, МЭЖК) и содержание ДГК (% массы по сухому состоянию) выше для клеток, культивированных при низких концентрациях растворенного кислорода; чем ниже концентрация растворенного кислорода, тем выше содержание липида и ДГК. Это оказалось неожиданным, поскольку обычно полагали, что для формирования ненасыщенных (двойных) связей необходим кислород. Было неожиданно, что при столь низкой концентрации растворенного кислорода образовалось такое большое количество ДГК, так как она представляет собой одну из наиболее ненасыщенных жирных кислот. Несмотря на то, что с понижением концентрации растворенного кислорода выход биомассы уменьшился, содержание ДГК увеличилось. Поэтому предпочтительно, чтобы в период фазы роста в целях максимального увеличения образования биомассы концентрации растворенного кислорода были более высокими, а затем для максимального продуцирования жирной кислоты с длинной цепью, чтобы эти концентрации снизились.
ПРИМЕР 3
Этот пример иллюстрирует воспроизводимость процессов по настоящему изобретению.
Микроорганизмы продуцировали, используя ферментеры с номинальным объемом в 1200 галлонов. Получившийся ферментационный бульон сконцентрировали, а микроорганизмы высушили с помощью барабанной сушилки. Липиды из аликвот полученных микроорганизмов экстрагировали и очистили для того, чтобы получить рафинированное, отбеленное и дезодорированное масло. До проведения анализа липидов, в качестве питательной добавки был дополнительно введен d-1-α-токоферилацетат, его количество составило приблизительно 3000×10-6.
Было осуществлено 9 ферментации Schizochytrium sp. ATCC No.20888, результаты их приведены в таблице 2. В течение первых 24 ч концентрация растворенного кислорода составляла приблизительно 8%, а затем приблизительно 4%.
| Таблица 2. Результаты ферментации с подпитыванием по продуцированию ДГК из Schizochytrium sp. | |||||
| Позиция | Возраст (ч) | Выход1 (г/л) | ДГК2 (%) | МЭЖК3 (%) | Продуктивность4 |
| 1 | 100,3 | 160,7 | 17,8 | 49,5 | 0,285 |
| 2 | 99,8 | 172,4 | 19,4 | 51,3 | 0,335 |
| 3 | 84,7 | 148,7 | 14,4 | 41,4 | 0,253 |
| 4 | 90,2 | 169,5 | 19,7 | 53,9 | 0,370 |
| 5 | 99,0 | 164,1 | 12,5 | 38,9 | 0,207 |
| 6 | 113,0 | 187,1 | 19,7 | 47,2 | 0,326 |
| 7 | 97,0 | 153,5 | 13,7 | 41,0 | 0,217 |
| 8 | 92,8 | 174,8 | 16,4 | 48,6 | 0,309 |
| Сред.5 | 97,1 | 166,4 | 16,7 | 46,5 | 0,288 |
| Ст. откл.6 | 8,4 | 12,3 | 2,9 | 5,4 | 0,058 |
| К.в.7(%) | 8,7 | 7,4 | 17,3 | 11,7 | 20,2 |
| 1Реальный выход по плотности биомассы 2Содержание ДГК в % от массы клеток в сухом состоянии 3Общее содержание жирной кислоты в % от массы клеток в сухом состоянии (измеренное в виде метилового эфира) 4(г ДГК)/л/ч 5Среднее 6Стандартное отклонение 7Коэффициент вариации. Значение коэффициента вариации ниже 5% означает, что процесс имеет превосходную воспроизводимость, значения коэффициента вариации от 5% до 10% означают хорошую воспроизводимость процесса, а значения коэффициента вариации от 10% до 20% означают, что процесс имеет удовлетворительную воспроизводимость. |
Подачу кукурузного сиропа проводили до тех пор, пока объем содержимого ферментера не достиг приблизительно 1200 галлонов, после чего введение кукурузного сиропа прекратили. Ферментационный процесс был прерван, когда остаточная концентрация сахара упала до значения, меньшего чем 5 г/л. Обычная продолжительность процесса от инокулирования до окончания составляла приблизительно 100 ч.
Ферментационный бульон, а именно ферментационную среду, разбавили водой в соотношении приблизительно 2:1; это сделали для того, чтобы содержание золы в конечном продукте снизить, и чтобы на стадии центрифугирования облегчить разделение фаз. Концентрированную пасту клеток нагрели до 160°F (приблизительно 71°С) и высушили на двойной барабанной сушилке Blaw Knox (42"×36"). Предпочтительно, однако, чтобы высушивание микроорганизмов проводили непосредственно, без предварительного центрифугирования.
Результаты анализа липидов, экстрагированных из аликвот каждой позиций, указанной в таблице 2, обобщены в таблице 3.
| Таблица 3. Анализ биомассы микроорганизмов, полученной в результате ферментации с подпитыванием, приведенных в таблице 2 | ||
| Позиция | ДГК, % относительно МЭЖК1 | Всего липидов в весовых % |
| 1 | 36,0 | 72,3 |
| 2 | 37,8 | 70,3 |
| 3 | 34,8 | 61,5 |
| 4 | 36,5 | 74,8 |
| 5 | 32,1 | 52,8 |
| 6 | 41,7 | 67,7 |
| 7 | 33,4 | 49,9 |
| 8 | 33,7 | 61,4 |
| Среднее | 35,8 | 63,8 |
| Ст.откл.3 | 3,0 | 9,1 |
| К.в4 (%) | 8,5 | 14,2 |
| 1 См. таблицу 2 См. обсуждение выше 3 Стандартное отклонение 4 Коэффициент вариации. Значение коэффициента вариации ниже 5% означает, что процесс имеет превосходную воспроизводимость, значения коэффициента вариации от 5% до 10% означают хорошую воспроизводимость процесса, а значения коэффициента вариации от 10% до 20% означают, что процесс имеет удовлетворительную воспроизводимость. |
Если иного не оговорено, то в состав ферментационной среды раздела «Примеры» были включены указанные далее ингредиенты; причем первое число обозначает номинальную величину целевой концентрации, а числа, приведенные в скобках, обозначают допустимый диапазон концентраций: сульфат натрия 12 г/л (11-13); KCl 0,5 г/л (0,45-0,55); MgSO4 7Н2О 2 г/л (1,8-2,2);противопенная добавка Hodag K-60 0,35 г/л (0,3-0,4); K2SO4 0,65 г/л (0,60-0,70); KH2PO4 1 г/л (0,9-1,1); (NH4)2SO4 1 г/л (0,95-1,1); CaCl2 2Н2О 0,17 г/л (0,15-0,19); кукурузный сироп 95 DE (на основе твердых частиц) 4,5 г/л (2-10); MnCl2 4Н2О 3 мг/л (2,7-3,3); ZnSO4 7Н2О 3 мг/л (2,7-3,3); CoCl2 6Н2О 0,04 мг/л (0,035-0,045); Na2MoO4 2Н2O 0,04 мг/л (0-0,045); CuSO4 5Н2О 2 мг/л (1,8-2,2); NiSO4 6Н2О 2 мг/л (1,8-2,2); FeSO4 7H2O 10 мг/л (9-11); тиамин 9,5 мг/л (4-15); витамин B12 0.15 мг/л (0,05-0,25) и пантотенат кальция 3,2 мг/л (1,3-5,1). Кроме того, в качестве источника азота используют 28% NH4OH.
Содержание золы в сухих микроорганизмах составляет приблизительно 6% по весу.
ПРИМЕР 4
Этот пример иллюстрирует влияние уменьшенной концентрации кислорода, растворенного в ферментационной среде, на продуктивность микроорганизмов в дозаторе на 14000 галлонов.
Используя методику, описанную в примере 3, в номинальном объеме на 14000 галлонов была осуществлена ферментация натурального штамма Schizochytrium, который был получен с использованием процессов выделения, описанных в упомянутых выше патентах США No.5340594 и No.5340742. Концентрация растворенного кислорода в ферментационной среде в течение первых 24 ч составляла приблизительно 8%, в период от 24-го часа до 40-го часа - приблизительно 4%, и в период от 40-го часа до конца процесса ферментации - приблизительно 0,5%. Результаты ферментации при такой сниженной концентрации кислорода, растворенного в ферментационной среде, показаны в таблице 4.
| Таблица 4. Результаты ферментации Schizochylrium с подпитыванием, проводимые в 14000 галлоном дозаторе при сниженной концентрации кислорода | ||||||
| Позиция | Возраст (ч) | Выход (г/л) | ДГК, % | МЭЖК, % | ДГК, % относительно МЭЖК | Продуктивность ДГК (г ДГК/л/ч) |
| 1 | 82,0 | 179,3 | 21,7 | 52,4 | 41,4 | 0,474 |
| 2 | 99,0 | 183,1 | 22,3 | 55,0 | 40,5 | 0,412 |
| 3 | 72,0 | 159,3 | - | - | 40,9 | - |
| 4 | 77,0 | 161,3 | - | - | 43,2 | - |
| 5 | 100,0 | 173,0 | 23,9 | 53,3 | 44,9 | 0,413 |
| 6 | 102,0 | 183,3 | 21,6 | 50,8 | 42,6 | 0,388 |
| 7 | 104,0 | 185,1 | 23,7 | 55,0 | 43,1 | 0,422 |
| 8 | 88,0 | 179,3 | 22,3 | 52,6 | 42,4 | 0,454 |
| 9 | 100,0 | 166,4 | 22,5 | 53,5 | 42,1 | 0,374 |
| 10 | 97,0 | 182,6 | 22,8 | 51,6 | 44,1 | 0,429 |
| 11 | 87,5 | 176,5 | 19,8 | 45,6 | 43,5 | 0,399 |
| 12 | 67,0 | 170,8 | 18,8 | 48,1 | 39,1 | 0,479 |
| 13 | 97,0 | 184,9 | 23,2 | 52,7 | 44,0 | 0,442 |
| 14 | 102,0 | 181,9 | 23,6 | 52,9 | 44,6 | 0,421 |
| 15 | 102,0 | 186,9 | 19,9 | 47,8 | 41,8 | 0,365 |
| 16 | 97,0 | 184,4 | 19,6 | 45,5 | 43,0 | 0,373 |
| 17 | 98,0 | 174,7 | 19,7 | 45,1 | 43,7 | 0,351 |
| 18 | 103,5 | 178,8 | 18,3 | 44,5 | 41,2 | 0,316 |
| 19 | 102,0 | 173,7 | 15,8 | 43,1 | 36,7 | 0,269 |
| 20 | 94,0 | 190,4 | 19,3 | 46,9 | 41,1 | 0,391 |
| 21 | 72,0 | 172,5 | 22,8 | 52,8 | 43,2 | 0,546 |
| 22 | 75,0 | 173,1 | 21,0 | 51,7 | 40,8 | 0,485 |
| 23 | 75,0 | 152,7 | 20,3 | 50,3 | 40,4 | 0,413 |
| 24 | 75,5 | 172,5 | 21,9 | 51,7 | 42,3 | 0,500 |
| 25 | 61,0 | 156,4 | 17,3 | 45,7 | 37,8 | 0,444 |
| 26 | 74,5 | 150,6 | 20,2 | 50,1 | 40,2 | 0,408 |
| 27 | 70,5 | 134,3 | 14,8 | 40,6 | 36,6 | 0,282 |
| 28 | 75,5 | 146,1 | 21,3 | 49,7 | 42,8 | 0,412 |
| 29 | 82,0 | 174,3 | 21,4 | 50,4 | 42,5 | 0,455 |
| 30 | 105,0 | 182,3 | 21,7 | 50,7 | 42,8 | 0,377 |
| 31 | 66,0 | 146,2 | 16,4 | 44,6 | 36,7 | 0,363 |
| Среднее | 87,2 | 171,5 | 20,6 | 49,5 | 41,6 | 0,409 |
| Ст. отклонение | 13,9 | 14,1 | 2,4 | 3,8 | 2,3 | 0,061 |
| Коэффициент вариации | 16,0% | 8,2% | 11,6% | 7,7% | 5,5% | 15,0% |
ПРИМЕР 5
Этот пример иллюстрирует влияние уменьшенной концентрации растворенного в ферментационной среде кислорода на продуктивность микроорганизмов в дозаторе на 41000 галлонов.
Использовались те же методики, что и в примере 4, за исключением того, что ферментацию проводили в ферментере на 41000 галлонов. Объемы культуральной среды были увеличены, для того чтобы в указанном дозаторе поддерживать концентрации целевых соединений. Полученные результаты приведены в таблице 5.
| Таблица 5. Ферментация Schizochytrium, проводимые в 41000 галлоном дозаторе | ||||||
| Позиция | Возраст (ч) | Выход (г/л) | ДГК, % | МЭЖК, % | ДГК, % относительно МЭЖК | Продуктивность ДГК (г ДГК/л/ч) |
| 1 | 75,0 | 116,1 | 17,3 | 46,1 | 37,4 | 0,268 |
| 2 | 99,0 | 159,3 | 17,4 | 47,0 | 37,1 | 0,280 |
| 3 | 103,0 | 152,6 | 16,0 | 47,2 | 33,8 | 0,237 |
| 4 | 68,0 | 136,8 | 17,9 | 45,9 | 39,1 | 0,360 |
| 5 | 84,0 | 142,0 | 17,5 | 47,0 | 37,2 | 0,296 |
| Среднее | 85,8 | 141,4 | 17,2 | 46,6 | 36,9 | 0,288 |
| Ст. отклонение | 15,1 | 16,6 | 0,7 | 0,6 | 1,9 | 0,046 |
| Коэффициент вариации | 17,5% | 11,8 | 4,2% | 1,3% | 5,2% | 15,8% |
ПРИМЕР 6
Этот пример иллюстрирует влияние избыточного азота на процесс ферментации по настоящему изобретению.
Было проведено 4 серии экспериментов с подпитыванием в объеме 250 л, при этом использовалась методика, аналогичная методике из примера 4. Было сделано 2 контрольных эксперимента и 2 эксперимента с избыточным азотом (превышение нормального количества в 1,15 раз ив 1,25 раза). Полученные результаты показаны в таблице 6.
| Таблица 6. Влияние избытка аммония на ферментацию Schizochytrium | ||||||
| Возраст (ч) | Выход (г/л) | Продуктивность биомассы | Эффективность конверсии | Содержание ДГК | Содержание МЭЖК | Продуктивность ДГК |
| Сахарная мишень: 7 г/л. контрольная точка рН по основанию: 5,5; контрольная точка | ||||||
| рН по кислоте 7,3; 1,0X NH3 | ||||||
| 48 | 178 | 3,71 г/л/ч | 51,5% | 10,7% | 37,8% | 0,40 г/л/ч |
| 60 | 185 | 3,08 г/л/ч | 46,9% | 16,3% | 47,2% | 0,50 г/л/ч |
| 72 | 205 | 2,85 г/л/ч | 45,2% | 17,4% | 47,4% | 0,50 г/л/ч |
| 84 | 219 | 2,61 г/л/ч | 43,8% | 17,1% | 45,5% | 0,45 г/л/ч |
| 90 | 221 | 2,46 г л/ч | 44,1% | 18,4% | 48,9% | 0,45 г/л/ч |
| Сахарная мишень: 7 г/л, контрольная точка рН по основанию: 5,5; контрольная точка рН по кислоте 7,3; 1,0X NH3 | ||||||
| 48 | 171 | 3,56 г/л/ч | 55,6% | 12,0% | 36,3% | 0,43 г/л/ч |
| 60 | 197 | 3,28 г/л/ч | 54,6% | 9,4% | 38,4% | 0,31 г/л/ч |
| 72 | 191 | 2,65 г/л/ч | 52,8% | 9,4% | 40,0% | 0,25 г/л/ч |
| 84 | 190 | 2,26 г/л/ч | 52,5% | 10,0% | 42,5% | 0,23 г/л/ч |
| 90 | 189 | 2,10 г/л/ч | 52,2% | 9,29% | 43,3% | 0,19 г/л/ч |
| Сахарная мишень: 7 г/л, контрольная точка рН по основанию: 5,5; контрольная точка рН по кислоте 7,3; 1,0X NH3 | ||||||
| 48 | 178 | 3,71 г/л/ч | 56.4% | 11,5% | 33,7% | 0,43 г/л/ч |
| 60 | 179 | 2,98 г/л/ч | 48,6% | 10,3% | 36,0% | 0,31 г/л/ч |
| 72 | 180 | 2,50 г/л/ч | 48,8% | 12,0% | 37,6% | 0,30 г/л/ч |
| 84 | 181 | 2,15 г/л/ч | 46,1% | 13,6% | 40,1% | 0,29 г/л/ч |
| 90 | 185 | 2,06 г/л/ч | 45,7% | 12,6% | 40,7% | 0,26 г/л/ч |
| Сахарная мишень: 7 г/л, контрольная точка рН по основанию: 5,5; контрольная точка рН по кислоте 7,3; 1,0Х NH3 | ||||||
| 48 | 158 | 3,29 г/л/ч | 55,7% | 13,1% | 36,5% | 0,43 г/л/ч |
| 60 | 174 | 2,90 г/л/ч | 48,9% | 17,9% | 39,2% | 0,52 г/л/ч |
| 72 | 189 | 2,63 г/л/ч | 45,7% | 21,0% | 39,4% | 0,55 г/л/ч |
| 84 | 196 | 2,33 г/л/ч | 44,1% | 22,4% | 40,1% | 0,52 г/л/ч |
| 90 | 206 | 2,29 г/л/ч | 44,8% | 22,1% | 40,3% | 0,51 г/л/ч |
В целом избыток азота оказывал негативное воздействие на осуществление ферментации, поскольку в тех двух партиях, в которые добавляли избыток азота, наблюдалось значительное снижение продуктивности ДГК. Как показано в таблице 6, конечная концентрация ДГК в контрольных партиях составила 18,4% и 22,1% от общей массы клеток в сухом состоянии по сравнению с 9,2% (1,15-кратный избыток аммония) и 12,6% (1,25-кратный избыток аммония) в партиях с избыточным азотом.
ПРИМЕР 7
Этот пример демонстрирует кинетический профиль ферментационного процесса по настоящему изобретению. Используя методику, аналогичную методике из примера 4, эксперимент проводили в 1000 галлоновом дозаторе. Кинетический профиль ферментационного процесса показан в таблице 7.
| Таблица 7. Кинетический профиль ферментации подпитываемой культуры Schizochytrium в 1000 галлоновом дозаторе | ||||||
| Возраст (ч) | Выход (г/л) | Продуктивность биомассы | Эффективность конверсии | Содержание ДГК,% | Содержание МЭЖК,% | Продуктивность ДГК |
| 24 | 118 | 4,92 г/л/ч | 78,2% | 7,4 | 18,8 | 0,36 г/л ч |
| 30 | 138 | 4,60 г/л/ч | 60,3% | 10,6 | 30,9 | 0,49 г/л/ч |
| 36 | 138 | 3,83 г/л/ч | 46,6% | 11,6 | 36,5 | 0,44 г/л/ч |
| 42 | 175 | 4,17 г/л/ч | 49,8% | 13,4 | 41,7 | 0,56 г/л/ч |
| 48 | 178 | 3,71 г/л/ч | 45,1% | 18,7 | 52,8 | 0,69 г/л/ч |
| 48* | 164 | 3,42 г/л/ч | 41,5% | 15,3 | 33,1 | 0,52 г/л/ч |
| 54 | 196 | 3,63 г/л/ч | 45,7% | 16,6 | 51,2 | 0,60 г/л/ч |
| 60 | 190 | 3,17 г/л/ч | 41,7% | 16,9 | 33,9 | 0,54 г/л/ч |
| 72 | 189 | 2,62 г/л/ч | 39,1% | 15,6 | 31,8 | 0,41 г/л/ч |
| 84 | 195 | 2,32 г/л/ч | 38,5% | 16,4 | 32,7 | 0,38 г/л/ч |
| 90 | 200 | 2,22 г/л/ч | 39,0% | 18,8 | 33,3 | 0,42 г/л/ч |
| 90 | 171 | 1,90 г/л/ч | 33,3% | 22,2 | 61,6 | 0,42 г/л/ч** |
| * Анализировали два разных образца с возрастом в 48 ч. ** Значение для промытых образцов сухих клеток (масса клеток в сухом состоянии, МСК). Остальные значения относятся к непромытым образцам. |
ПРИМЕР 8
Этот пример иллюстрирует влияние количества углерода на продуктивность.
С применением различных источников углерода провели три разных ферментационных процесса, используя процесс из примера 4. Полученные результаты приведены в таблице 8.
| Таблица 8. Результаты разных количеств источника углерода на ферментацию Schizochytrium | ||||||
| Возраст (ч) | Выход (г/л) | Доза углерода | Эффективность конверсии | Содержание ДГК, % | Содержание МЭЖК, % | Продуктивность (г/л/ч) |
| 90 | 171 | 51,3% | 33,3% | 22,2 | 61,6 | 0,42 |
| 94 | 122 | 40,5% | 30,1% | 19,1 | 57,3 | 0,25 |
| 59 | 73 | 20,0% | 36,5% | 11,9 | 40,8 | 0,15 |
ПРИМЕР 9
Этот пример иллюстрирует влияние ключевых питательных веществ на эффективность конверсии углерода в биомассу, липид, а именно в ДГК.
Для исследования влияния ключевых питательных веществ на непрерывную культуру провели эксперимент по культивированию Schizochytrium ATCC No. 20888. Эксперимент проводили в 2 л ферментере Applikon в базальной питательной среде (ICM-2), содержащей перечисленные далее соединения (номинальные концентрации): ингредиенты группы I: Na2SO4 (18,54 г/л), MgSO4 7H2O (2,0 г/л) и KCl (0,572 г/л); ингредиенты группы II (каждый готовится отдельно): глюкоза (43,81 г/л), KH2PO4 (1,28 г/л), CaCl2 2H2O (0,025 г/л) и (NH4)2SO4 (6,538 г/л); ингредиенты группы III: Na2EDTA (6,0 мг/л), FeCl3 6Н2О (0,29 мг/л), Н2ВО3 (6,84 мг/л), MnCl2 4H2O (0,86 мг/л), ZnSO4 7Н2О (0,237 мг/л), CoCl2 2H2O (0,026 мг/л), Na2MoO4 2Н2О (0,005 мг/л), CuSO4 5Н2О (0,002 мг/л) и NiSO4 6Н2O (0,052 мг/л) и ингредиенты группы IV: тиамин HCl (0,2 мг/л), витамин В12 (0,005 мг/л), пантотенат кальция (0,2 мг/л). Перед добавлением в ферментер ингредиенты из групп I и II стерилизовали в автоклаве, а ингредиенты групп III и IV стерилизовали на фильтре. Затем питательную среду инокулировали Schizochytrium и культивировали при контролируемых условиях, которые включали 30°С, рН 5,5 и количество растворенного кислорода, соответствующее 20% насыщению; процесс проводили до тех пор, пока не получили максимальную плотность клеток.
Затем установили непрерывный операционный режим. Его осуществили одновременным закачиванием внутрь ферментера питательной среды ICM-2 и удалением бульона, содержащего клетки Schizochytrium со скоростью, достаточной для поддержания степени разбавления 0,06 ч-1; процедуру осуществляли до тех пор, пока не был достигнут стационарный режим. Чтобы изучить влияние ключевого питательного вещества, содержание соединения, включающего этот специфический нутриент в питательной среде ICM-2, снижали таким образом, чтобы его количество в выходящем бульоне, содержащем клетки, было резко уменьшено, и чтобы рост этих клеток был лимитирован отсутствием этого необходимого питательного вещества. Когда стационарный режим был достигнут для каждого состояния, то измерили сухую биомассу конечного бульона, остаточное количество глюкозы, концентрацию ключевых питательных веществ, содержание липида в клетках и содержание в них ДГК. Эффективность конверсии глюкозы в биомассу подсчитывали делением общего количества потребленной глюкозы на общее количество образовавшейся сухой биомассы, полученную при этом величину выразили в процентах.
Влияние каждого отдельного питательного вещества на ограничение роста изучали путем повторений этого эксперимента для каждого из нутриентов, приведенных далее в таблице. В ней суммированы конечные результаты.
| Таблица 9. Влияние ключевых питательных веществ на выход биомассы, эффективность конверсии (глюкоза → биомасса), содержание липида и содержания ДГК для Schizochytrium sp. | |||||
| Ключевое питательное | Биомасса1 (г/л) | Коэффициент выхода2 | ОКГ3 (г/л) | Содержание липида4, % | Содержание ДГК5, % |
| вещество | |||||
| Глюкоза | 18,7 | 46,8 | 0,0 | 19,8 | 7,3 |
| Азот | 14,5 | 36,3 | 0,6 | 47,5 | 10,3 |
| Фосфат | 17,8 | 44,5 | 0,8 | 37,0 | 8,2 |
| Тиамин | 7,5 | 18,8 | 7,7 | 11,1 | 4,0 |
| Цинк | 16,0 | 40,0 | 1,3 | 27,8 | 7,2 |
| Медь | 14,0 | 35,0 | 10,4 | 13,8 | 5,3 |
| Кобальт | 14,5 | 36,3 | 0,0 | 22,2 | 6,9 |
| Никель | 17,8 | 44,5 | 0,0 | 21,9 | 8,0 |
| Железо | 15,9 | 39,8 | 3,5 | 18,5 | 7,2 |
| Марганец | 12,5 | 31,3 | 3,4 | 26,1 | 8,0 |
| Магний | 13,9 | 34,8 | 5,3 | 18,7 | 6,4 |
| Кальций | 16,7 | 41,8 | 4,3 | 18,7 | 6,4 |
| Витамин B12 | 19,6 | 49,0 | 0,0 | 17,5 | 6,3 |
| Молибден | 18,9 | 47,3 | 0,0 | 19,3 | 7,0 |
| Пантотенат | 19,2 | 48,0 | 0,0 | 20,4 | 6,7 |
| Натрий | 17,9 | 44,8 | 1,8 | 21,8 | 8,2 |
| Калий | 13,0 | 32,5 | 8,8 | 14,1 | 5,3 |
| 1 Концентрация сухой биомассы (г/л) 2 Коэффициент выхода (% продуцированной биомассы потребленная глюкоза) 3 Остаточная концентрация глюкозы в бульоне (г/л) 4 Содержание липида в сухой биомассе (г липида (в виде МЭЖК)/г сухой биомассы) 5 Содержание ДГК в сухой биомассе (г ДГК/г сухой биомассы) |
Из приведенной таблицы ясно, что из ключевых питательных веществ самое высокое аккумулированию ДГК в клетках дает азот, за ним следует фосфат, натрий, никель, марганец, глюкоза (углерод), цинк и железо. Эту информацию можно использовать в промышленных целях, подавая одно (или более) из указанных питательных веществ в ферментацию с подпитыванием со скоростью, достаточной для ограничения роста клеток. В наиболее предпочтительном случае для того, чтобы обеспечить максимум содержания ДГК в клетках, в ферментацию с подпитыванием подают азот с ограничениями. Другие питательные вещества (или их смеси) можно подавать с ограничениями в целях обеспечения максимального продуцирования биомассы или других полезных продуктов. В такой стратегии контроля за ферментацией можно также в качестве ключевых использовать другие необходимые биологически элементы или питательные вещества, количество которых не было установлено (такие как сера).
Настоящее изобретение в своих различных вариантах включает компоненты, способы, процессы, системы и/или устройства, в значительной степени изображенные и описанные здесь, включая их различные варианты, сочетания и подгруппы. Квалифицированным в этой технологии людям должно стать ясно каким образом, после осмысления раскрытия настоящего изобретения, можно его реализовать и использовать. Настоящее изобретение в своих различных вариантах включает обеспечение устройств и процессов при отсутствии объектов, не изображенных или не описанных здесь, или в их различных вариантах, включая отсутствие таких объектов, которые могли быть использованы в более ранних устройствах или процессах (например, для увеличения эксплуатационных характеристик, достижения легкости реализации и/или для снижения ее стоимости).
Приведенное выше обсуждение сделано для описания и иллюстрации настоящего изобретения. Оно не предназначено для ограничения настоящего изобретения по форме или формам, раскрываемым здесь. Хотя описание настоящего изобретения включает описание одного его варианта или большего их числа, а также определенных изменений и модификаций, в границы настоящего изобретения входят другие изменения и модификации, например те, которые находятся в пределах навыков и знаний в данной технологии после осмысления раскрытия настоящего изобретения. Это описание предназначено для приобретения прав на альтернативные до допустимой степени варианты, включая, помимо заявляемых, противоположные, взаимозаменяемые и/или эквивалентные структуры, функции, диапазоны или стадии, вне зависимости от того, раскрываются ли в этом описании указанные противоположные, взаимозаменяемые и/или эквивалентные структуры, функции, диапазоны или стадии; при этом описание не предназначено для публичного раскрытия какого-либо патентоспособного объекта.
1. Способ получения липидов, содержащих полиненасыщенные жирные кислоты, из микроорганизмов подкласса Thraustochytriales, способных продуцировать полиненасыщенные жирные кислоты по меньшей мере 15% от общего количества липидов, продуцируемых указанными микроорганизмами, включающий культивирование микроорганизмов в среде, содержащей неспиртовой источник углерода и источник лимитирующих питательных веществ, отличающийся тем, что в указанную среду добавляют неспиртовой источник углерода и источник лимитирующих питательных веществ до достижения плотности биомассы, по меньшей мере, 100 г/л в пересчете на массу сухих клеток, затем процесс проводят, обеспечивая условия, при которых лимитирующее вещество ограничено, и концентрацию растворенного кислорода поддерживают на уровне не выше 3% от насыщения.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что представляет собой процесс с подпиткой или непрерывный процесс.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что когда плотность биомассы среды составляет, по меньшей мере, 100 г/л в пересчете на массу сухих клеток, добавляют источник углерода без дополнительного источника лимитирующих питательных веществ или с небольшим количеством источника лимитирующих питательных веществ для индуцирования условий лимитирования питательного вещества, что индуцирует продуцирование липидов.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что достигают плотность биомассы по меньшей мере 150 г/л в пересчете на массу сухих клеток.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный процесс проводят в течение по меньшей мере 90 ч, причем в течение первых 24 ч концентрацию растворенного кислорода поддерживают на уровне, приблизительно составляющем 8%, в течение от 24-го часа до 40-го часа - на уровне, приблизительно составляющем 4%, а с 40-го часа вплоть до завершения указанного процесса - на уровне, составляющем приблизительно 0,5% или ниже.
6. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный неспиртовой источник углерода включает углевод.
7. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный источник лимитирующих питательных веществ включает источник питательных веществ, выбранный из группы, содержащей источники азота, источники углерода, источники фосфата, источники витаминов, источники металлов - микроэлементов, источники металлов - макроэлементов, источники кремния, а также их смеси.
8. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный источник лимитирующих питательных веществ включает источник питательных веществ, выбранный из группы, содержащей источник металлов-микроэлементов, а также источник металлов-макроэлементов, выбранных из группы, включающей соли серной и хлористо-водородной кислоты указанных металлов, а также их смеси.
9. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный источник лимитирующих питательных веществ включает источник азота.
10. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный источник лимитирующих питательных веществ включает неорганическую соль аммония.
11. Способ по п.9, отличающийся тем, что указанный источник азота включает гидроксид аммония.
12. Способ по п.1, отличающийся тем, что рН среды регулируют с помощью указанного источника лимитирующих веществ.
13. Способ по п.1, отличающийся тем, что культивирование проводят при температуре по меньшей мере 20°С.
14. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанные микроорганизмы продуцируют полиненасыщенные жирные кислоты, по меньшей мере 15% от общего количества липидов.
15. Способ по п.1, отличающийся тем, что полиненасыщенные жирные кислоты представлены докозагексаноевой кислотой.
16. Способ по п.1, отличающийся тем, что скорость продуцирования липидов составляет по меньшей мере 0,5 г/л/ч.
17. Способ по п.1, отличающийся тем, что скорость продуцирования липидов составляет по меньшей мере 0,5 г/л/ч, а также тем, что по меньшей мере 15% указанных липидов представляют собой полиненасыщенные жирные кислоты.
18. Способ по п.1, отличающийся тем, что скорость продуцирования липидов составляет по меньшей мере 0,5 г/л/ч, а также тем, что по меньшей мере 20% указанных липидов составляет суммарное количество омега-3 и омега-6 полиненасыщенных жирных кислот.
19. Способ по п.1, отличающийся тем, что скорость продуцирования липидов составляет по меньшей мере 0,5 г/л/ч, а также тем, что по меньшей мере 25% указанных липидов составляет докозагексаноевая кислота.
20. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанные микроорганизмы способны продуцировать полиненасыщенные жирные кислоты в аэробных условиях.
21. Способ по п.20, отличающийся тем, что указанные микроорганизмы продуцируют полиненасыщенные жирные кислоты в аэробных условиях.
22. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанные микроорганизмы способны продуцировать полиненасыщенные жирные кислоты в аэробных условиях, а также тем, что указанные микроорганизмы культивируют в процессе с подпиткой.
23. Способ по п.22, отличающийся тем, что указанные микроорганизмы продуцируют полиненасыщенные жирные кислоты в аэробных условиях.
24. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанные микроорганизмы выбирают из группы, включающей Thraustochytrium, Schizochytrium, a также их смеси.
25. Способ по п.1, отличающийся тем, что при культивировании осуществляют регулирование количества растворенного кислорода.
26. Способ по п.25, отличающийся тем, что регулирование растворенного кислорода осуществляют, контролируя количество кислорода в верхней части ферментера, или контролируя скорость перемешивания среды.
27. Способ по п.1, отличающийся тем, что в указанном процессе микроорганизмы продуцируют по меньшей мере 0,2 г/л/ч докозагексаноевой кислоты.
28. Способ по п.27, отличающийся тем, что по меньшей мере 15% липидов составляет докозагексаноевая кислота.
29. Способ по п.1, отличающийся тем, что включает (а) удаление воды из указанной среды с получением сухих микроорганизмов и (б) выделение липидов из указанных сухих микроорганизмов.
30. Способ по п.1, отличающийся тем, что дополнительно включает (а) обработку, приводящую к нарушению проницаемости мембран клеток микроорганизмов, растворению или разрушению указанных клеток, и (б) извлечение липидов с помощью гравитационного разделения с помощью средства, способствующего разрушению эмульсии липид/вода, или без его помощи.
31. Способ по п.1, отличающийся тем, что концентрацию растворенного кислорода поддерживают менее чем 2% от насыщения.
32. Способ по п.1, отличающийся тем, что концентрацию растворенного кислорода поддерживают менее чем 1% от насыщения.
33. Способ получения липидов, содержащих полиненасыщенные жирные кислоты, из микроорганизмов подкласса Thraustochytriales, способных продуцировать по меньшей мере 20% от биомассы липидов, включающий культивирование указанных микроорганизмов в среде, содержащей неспиртовой источник углерода и источник лимитирующих питательных веществ, отличающийся тем, что указанный неспиртовой источник углерода и источник лимитирующих питательных веществ добавляют в среду в процессе с подпиткой до достижения плотности биомассы по меньшей мере 100 г/л в пересчете на массу сухих клеток, затем подачу источника лимитирующих питательных веществ ограничивают или прекращают и концентрацию растворенного кислорода поддерживают на уровне не выше 3% от насыщения.
34. Способ по п.33, отличающийся тем, что достигают плотность биомассы по меньшей мере 150 г/л в пересчете на массу сухих клеток.
35. Способ по п.33, отличающийся тем, что скорость продуцирования липидов составляет по меньшей мере 0,5 г/л/ч.
36. Способ по п.33, отличающийся тем, что указанные микроорганизмы выбирают из группы, включающей Thraustochytrium, Schizochytrium, a также их смеси.
37. Способ по п.33, отличающийся тем, что в указанном процессе микроорганизмы продуцируют по меньшей мере 0,2 г/л/ч докозагексаноевой кислоты.
38. Способ получения липидов, содержащих полиненасыщенные жирные кислоты, из микроорганизмов подкласса Thraustochytriales, способных продуцировать липиды по меньшей мере 20% от биомассы, включающий культивирование указанных микроорганизмов в среде, содержащей неспиртовой источник углерода и источник лимитирующих питательных веществ, отличающийся тем, что неспиртовой источник углерода и источник лимитирующих питательных веществ добавляют в среду до достижения плотности биомассы по меньшей мере 100 г/л в пересчете на массу сухих клеток, затем подачу источника лимитирующих питательных веществ ограничивают или прекращают и концентрацию растворенного кислорода поддерживают на уровне не выше 3% от насыщения.
39. Способ по п.38, отличающийся тем, что представляет собой процесс с подпиткой.
40. Способ по п.38, отличающийся тем, что достигают плотности биомассы по меньшей мере приблизительно 150 г/л в пересчете на массу сухих клеток.
41. Способ по п.38, отличающийся тем, что скорость продуцирования липидов составляет по меньшей мере 0,5 г/л/ч.
42. Способ по п.38, отличающийся тем, что указанные микроорганизмы выбирают из группы, включающей Thraustochytrium, Schizochytrium, a также их смеси.
43. Способ по п.38, отличающийся тем, что в указанном процессе микроорганизмы продуцируют по меньшей мере 0,2 г/л/ч докозагексаноевой кислоты.
44. Способ получения липидов, содержащих полиненасыщенные жирные кислоты, из микроорганизмов подкласса Thraustochytriales, способных продуцировать полиненасыщенные жирные кислоты по меньшей мере 15% от общего количества липидов, продуцируемых указанными микроорганизмами, включающий культивирование указанных микроорганизмов в среде, содержащей неспиртовой источник углерода и источник лимитирующих питательных веществ, отличающийся тем, что указанный источник углерода и источник лимитирующих питательных веществ добавляют в процессе с подпиткой до достижения плотности биомассы по меньшей мере 100 г/л в пересчете на массу сухих клеток, затем процесс проводят, обеспечивая условия, при которых лимитирующее вещество ограничено, и концентрацию растворенного кислорода поддерживают на уровне не выше 3% от насыщения.
45. Способ по п.44, отличающийся тем, что достигают плотности биомассы по меньшей мере 150 г/л в пересчете на массу сухих клеток.
46. Способ по п.44, отличающийся тем, что скорость продуцирования составляет по меньшей мере 0,5 г/л/ч.
47. Способ по п.44, отличающийся тем, что указанные микроорганизмы выбирают из группы, включающей Thraustochytrium, Schizochytrium, a также их смеси.
48. Способ по п.44, отличающийся тем, что в указанном процессе микроорганизмы продуцируют по меньшей мере 0,2 г/л/ч докозагексаноевой кислоты.
49. Способ культивирования микроорганизмов подкласса Thraustochytriales, способных продуцировать липиды по меньшей мере 20% от биомассы, включающий культивирование указанных микроорганизмов в среде, содержащей неспиртовой источник углерода и источник лимитирующих питательных веществ, отличающийся тем, что неспиртовой источник углерода и источник лимитирующих питательных веществ добавляют в среду до достижения плотности биомассы по меньшей мере до 100 г/л в пересчете на массу сухих клеток; затем процесс проводят, обеспечивая условия, при которых лимитирующее вещество ограничено, и концентрацию растворенного кислорода поддерживают на уровне не выше 3% от насыщения, при этом скорость продуцирования липидов составляет по меньшей мере 0,5 г/л/ч и по меньшей мере 15% от общего количества липидов, продуцируемых микроорганизмами, представляют собой полиненасыщенные жирные кислоты.
50. Способ по п.49, отличающийся тем, что представляет собой процесс с подпиткой.
51. Способ по п.49, отличающийся тем, что достигают плотность биомассы по меньшей мере 150 г/л в пересчете на массу сухих клеток.
52. Способ по п.49, отличающийся тем, что указанные микроорганизмы выбирают из группы, включающей Thraustochytrium, Schizochytrium, a также их смеси.
53. Способ по п.49, отличающийся тем, что в указанном процессе микроорганизмы продуцируют по меньшей мере 0,2 г/л/ч докозагексаноевой кислоты.
54. Способ культивирования микроорганизмов подкласса Thraustochytriales, способных продуцировать по меньшей мере 20% от биомассы липидов, содержащих полиненасыщенные жирные кислоты, включающий культивирование указанных микроорганизмов в среде, содержащей неспиртовой источник углерода и источник лимитирующих питательных веществ, отличающийся тем, что неспиртовой источник углерода и источник лимитирующих питательных веществ добавляют в среду до достижения плотности биомассы по меньшей мере 100 г/л в пересчете на массу сухих клеток, затем процесс проводят, обеспечивая условия, при которых лимитирующее вещество ограничено, и концентрацию растворенного кислорода поддерживают на уровне не выше 3% от насыщения.
55. Способ по п.54, отличающийся тем, что представляет собой процесс с подпиткой.
56. Способ по п.54, отличающийся тем, что достигают плотность биомассы по меньшей мере 150 г/л в пересчете на массу сухих клеток.
57. Способ по п.54, отличающийся тем, что скорость продуцирования липидов составляет по меньшей мере 0,5 г/л/ч.
58. Способ по п.54, отличающийся тем, что указанные микроорганизмы выбирают из группы, включающей Thraustochytrium, Schizochytrium, a также их смеси.
59. Способ по п.54, отличающийся тем, что в указанном процессе микроорганизмы продуцируют по меньшей мере 0,2 г/л/ч докозагексаноевой кислоты.
60. Способ получения липидов, содержащих полиненасыщенные жирные кислоты, из микроорганизмов подкласса Thraustochytriales, способных продуцировать полиненасыщенные жирные кислоты по меньшей мере 15% от общего количества липидов, продуцируемых указанными микроорганизмами, включающий культивирование микроорганизмов в среде, содержащей неспиртовой источник углерода и источник лимитирующих питательных веществ, отличающийся тем, что в указанную среду добавляют неспиртовой источник углерода и источник лимитирующих питательных веществ до достижения плотности биомассы по меньшей мере 100 г/л в пересчете на массу сухих клеток, затем процесс проводят, обеспечивая условия, при которых лимитирующее вещество ограничено, и концентрацию растворенного кислорода поддерживают на уровне не выше 3% от насыщения, после завершения культивирования полученные липиды выделяют.
61. Способ по п.60, отличающийся тем, что представляет собой процесс с подпиткой.
62. Способ по п.60, отличающийся тем, что достигают плотность биомассы по меньшей мере 150 г/л в пересчете на массу сухих клеток.
63. Способ по п.60, отличающийся тем, что скорость продуцирования составляет по меньшей мере 0,5 г/л/ч.
64. Способ по п.60, отличающийся тем, что указанные микроорганизмы выбирают из группы, включающей Thraustochytrium, Schizochytrium, a также их смеси.
65. Способ по п.60, отличающийся тем, что в указанном процессе микроорганизмы продуцируют по меньшей мере 0,2 г/л/ч докозагексаноевой кислоты.
