Способ получения l-аминокислот с использованием бактерий, обладающих повышенной экспрессией гена pcka

Изобретение относится к биотехнологии. Ароматическую L-аминокислоту получают культивированием бактерии, принадлежащей к роду Escherichia и модифицированной таким образом, что активность РЕР-карбоксикиназы в ней увеличена. Затем накопленную аминокислоту выделяют из культуральной жидкости. Заявленное изобретение позволяет получать ароматические L-аминокислоты с высокой степенью эффективности. 2 н. и 10 з.п. ф-лы, 1 ил., 2 табл.

 

Область техники.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения L-аминокислот методом ферментации и более конкретно к гену, полученному из бактерии Escherichia coli. Указанный ген является полезным для увеличения продукции L-аминокислот, а именно ароматических кислот, таких как L-триптофан, L-фенилаланин и L-тирозин.

Предшествующий уровень техники.

Традиционно L-аминокислоты получают в промышленном масштабе методом ферментации с использованием штаммов микроорганизмов, полученных из природных источников или их мутантов, специально модифицированных для увеличения продукции L-аминокислот.

Для увеличения продукции L-аминокислот обычно используется, например, амплификация генов биосинтеза путем трансформации микроорганизма рекомбинантной ДНК (смотри, например, патент США 4278765). Подобные методики основаны на увеличении активностей ферментов, вовлеченных в биосинтез аминокислот и/или устранении чувствительности целевого фермента к ингибированию продуцируемой аминокислотой или ее побочными продуктами по типу обратной связи (смотри, например, выложенную заявку Японии №56-18596 (1981), заявку РСТ 95/16042 или патенты США 5661012 и 6040160).

Фосфоенолпируват (PEP) и эритрозо-4-фосфат (Е4р) являются важными предшественниками общего пути биосинтеза ароматических L-аминокислот. Фосфоенолпируват также является ключевым интермедиатом, вовлеченным в несколько других клеточных процессов. В природной бактерии Е.coli главным потребителем PEP является фосфотрансферазная система (PTS). Другими ферментами, использующими PEP, является фосфоенолпируваткарбоксилаза, кодируемая геном ррс, и пируваткиназа, кодируемая генами pykA и pykF. Реакции образования PEP в Е.coli катализируются гликолитическим ферментом енолазой и ферментами глюконеогенеза фосфоенолпируватсинтазой и фосфоенолпируваткарбоксикиназой, кодируемыми генами eno, ppsA и pckA соответственно (Escherichia coli and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F.C.Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996).

Оптимизация специфических путей биосинтеза PEP и Е4р может улучшить продукцию ароматических L-аминокислот. В частности, повышение содержания PEP в бактерии является стандартным методом повышения продукции ароматических L-аминокислот. Первым способом повышения содержания PEP в клетке является предотвращение потребления PEP в фосфотрансферазной системе за счет использования non-PTS системы транспорта источника углерода. Вторым способом является создание условий, когда включение глюкозы в клетку и ее фосфорилирование происходит без участия PEP. Другим способом повышения содержания PEP является возобновление PEP из его производных, таких как пируват и оксалоацетат. Также может быть использована инактивация PEP карбоксилазы или PEP киназы для предотвращения утилизации PEP в гликолизе. Одновременная инактивация генов pykA и pykF значительно повышает поток углерода из глюкозы в L-фенилаланин (Grinter, N.J., ChemTech, 1998, 33-37 (July)). С другой стороны, значительное повышение образования L-фенилаланина штаммом Е.coli - продуцентом L-фенилаланина, содержащим инактивированный ген ррс, сопровождается повышенным образованием нежелательных побочных продуктов, таких как ацетат и пируват (Miller J.E. et al., J. Ind. Microbiol., 1987, 2, 143-149).

Превращение пирувата обратно в PEP может быть осуществлено путем суперэкспрессии фосфоенолпируватсинтазы, кодируемой геном ppsA. В этом случае поток углерода будет успешно направлен в сторону, обратную образованию DAHP (3-дезокси-D-арабино-гептулозонат-7-фосфат) (Patnaik R. and Liao J.C., Appl. Environ. Microbiol., 1994, 60, 3903-3908; патенты США 5906925, 5985617, 6489100; заявка РСТ W09608567A1). Было показано, что повышение активности фосфоенолпируватсинтазы в клетках коринеформных бактерий приводит к повышению продукции L-аминокислот, таких как L-лизин, L-глутаминовая кислота, L-треонин, L-изолейцин и L-серин (заявка РСТ WO 0056859 A1). Также было показано, что повышение активности фосфоенолпируватсинтазы в клетках коринеформных бактерий или бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, является полезным для продукции L-триптофана, L-фенилаланина, L-тирозина, L-треонина и L-изолейцина (Европейская патентная заявка ЕР 0877090 А1).

Известно, что в ходе роста на дикарбоновых кислотах или ацетате образование PEP и интермедиатом гликолитического пути требует, в частности, декарбоксилирования оксалоацетата PEP карбоксикиназой (PckA) с образованием PEP в АТФ-зависимой реакции. С другой стороны, при росте на глюкозе обнаруживается самая высокая экспрессия гена ppc и самая низкая экспрессия гена pckA (Teroaka H. et al., J. Biochem. 1970, 67, 567-575; Goldie H., J. Bacteriol. 1984, 59, 832-838).

На основании стехиометрического анализа путей был предложен, но не подтвержден экспериментально новый путь превращения пирувата в PEP. Как предполагалось, этот гипотетический путь состоит из PEP карбоксикиназы (PckA), превращающей оксалоацетат в PEP, и глиоксилатного шунта (Liao J.C. et al., Biotechnol. Bioeng., 1996, 52,129-140).

Ранее было показано, что ослабление экспрессии или полное выключение гена pckA и/или открытых рамок считывания yifA и ytfP в клетке микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae оказывается полезным для продукции L-треонина (заявка РСТ WO 0229080 A2). Но к настоящему времени нет сообщений, описывающих тот факт, что усиление активности PEP карбоксикиназы в клетке бактерии - продуцента L-аминокислоты приводит к увеличению продукции этой L-аминокислоты.

Описание изобретения

Целью настоящего изобретения является увеличение продуктивности штаммов - продуцентов ароматических L-аминокислот и предоставление способа получения L-аминокислот с использованием указанных штаммов.

Данная цель была достигнута путем установления того факта, что оптимизация транскрипции и усиление трансляции гена pckA, кодирующего PEP карбоксикиназу, катализирующую превращение оксалоацетата в PEP, может увеличивать продукцию L-триптофана соответствующим штаммом - продуцентом L-триптофана. Таким образом было совершено настоящее изобретение.

Настоящее изобретение включает в себя следующее:

1. Бактерия, принадлежащая к роду Escherichia, -продуцент L-аминокислоты, которая модифицирована с целью увеличения активности PEP карбоксикиназы.

2. Бактерия в соответствии с 1, в которой активность PEP карбоксикиназы увеличена за счет модификации нуклеотидной последовательности, контролирующей экспрессию гена PEP карбоксикиназы, в хромосоме указанной бактерии таким образом, что экспрессия этого гена увеличивается.

3. Бактерия в соответствии с 2, в которой природный промотор указанного гена заменен на более сильный промотор.

4. Бактерия в соответствии с 2, в которой природная последовательность SD указанного гена заменена на более эффективную последовательность SD.

5. Бактерия в соответствии с 2-4, в которой ген PEP карбоксикиназы получен из бактерии, принадлежащей к роду Escherichia.

6. Бактерия в соответствии с 5, в которой ген PEP карбоксикиназы кодирует следующие белки (А) или (В):

(A) белок, который представлен последовательностью аминокислот, приведенной в списке последовательностей под номером 2;

(B) белок, который представлен последовательностью аминокислот, включающей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в последовательность аминокислот, приведенную в списке последовательностей под номером 2, и который обладает активностью PEP карбоксикиназы

(здесь и далее белки, описанные выше как (А) и (В), упоминаются как «белки согласно настоящему изобретению»).

7. Бактерия в соответствии с 5, в которой ген PEP карбоксикиназы содержит следующую ДНК (а) или (b)

(a) ДНК, которая представлена последовательностью нуклеотидов с 1 по 1623, приведенной в списке последовательностей под номером 1;

(b) ДНК, которая гибридизуется в жестких условиях с последовательностью нуклеотидов с 1 по 1623, приведенной в списке последовательностей под номером 1, или с зондом, приготовленным на основании указанной последовательности нуклеотидов, и кодирует белок, обладающий активностью PEP карбоксикиназы.

8. Бактерия в соответствии с 7, где жесткими условиями являются условия, при которых отмывка осуществляется при 60°С, а концентрация соли соответствует 1 × SSC и 0.1% SDS.

9. Бактерия в соответствии с 1-8, где указанная бактерия далее модифицирована с целью повышения экспрессии открытой рамки считывания yddG.

10. Бактерия в соответствии с 1-9, где L-аминокислотой является ароматическая L-аминокислота, выбранная из группы, состоящей из L-триптофана, L-фенилаланина и L-тирозина.

11. Способ получения ароматической L-аминокислоты, включающий стадии выращивания бактерии в соответствии с 1-10 в питательной среде и выделения из культуральной жидкости произведенной и накопленной в ней L-аминокислоты.

12. Способ в соответствии с 11, в котором L-аминокислотой является L-триптофан.

13. Способ в соответствии с 12, в котором бактерия обладает повышенной экспрессией генов биосинтеза триптофана.

Способ получения L-аминокислоты включает продукцию L-триптофана с использованием бактерии - продуцента L-триптофана, в которой активность белка согласно настоящему изобретению увеличена.

Настоящее изобретение более детально будет описано ниже.

Вышеуказанной бактерией согласно настоящему изобретению является бактерия, принадлежащая к роду Escherichia, - продуцент L-аминокислоты, обладающая повышенной активностью белка, увеличивающего продукцию целевой L-аминокислоты. Более конкретно, бактерией согласно настоящему изобретению является бактерия, принадлежащая к роду Escherichia, - продуцент ароматической L-аминокислоты, в которой увеличена активность белка согласно настоящему изобретению. Более конкретно, бактерией согласно настоящему изобретению является бактерия, принадлежащая к роду Escherichia, - продуцент ароматической L-аминокислоты, например продуцент L-триптофана, которая модифицирована с целью повышения активности PEP карбоксикиназы. Более конкретно, бактерия согласно настоящему изобретению включает в себя ДНК, содержащую ген pckA с модифицированной нуклеотидной последовательностью, контролирующей экспрессию, в хромосоме указанной бактерии, и такая бактерия обладает повышенной способностью к продукции L-триптофана.

Термин «бактерия - продуцент L-аминокислоты» означает бактерию, обладающую способностью к накоплению L-аминокислоты в питательной среде, в условиях, когда бактерия согласно настоящему изобретению выращивается в указанной питательной среде. Способность к продукции L-аминокислоты может быть придана или улучшена путем селекции. Термин «бактерия - продуцент L-аминокислоты», использованный здесь, также означает бактерию, способную к продукции и накоплению L-аминокислоты в питательной среде в количестве, большем чем природный или родительский штамм, и предпочтительно означает микроорганизм, способный к продукции накоплению в среде не менее 0.5 г/л, а более предпочтительно не менее 1.0 г/л целевой L-аминокислоты. К L-аминокислотам относятся L-аланин, L-аргинин, L-аспарагин, L-аспарагиновая кислота, L-цистеин, L-глутаминовая кислота, L-глутамин, L-глицин, L-гистидин, L-изолейцин, L-лейцин, L-лизин, L-метионин, L-фенилаланин, L-пролин, L-серин, L-треонин, L-триптофан, L-тирозин и L-валин, предпочтительно ароматические L-аминокислоты, такие как L-триптофан, L-фенилаланин и L-тирозин.

Термин «бактерия, принадлежащая к роду Escherichia» означает, что бактерия относится к роду Escherichia в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. В качестве примера микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, использованного в настоящем изобретении, может быть упомянута бактерия Escherichia coli (Е.coil).

Термин «активность PEP карбоксикиназы» означает активность по катализу реакции превращения оксалоацетата в фосфоенолпируват с потреблением АТФ и высвобождением АДФ и диоксида углерода. Активность PEP карбоксикиназы может быть измерена с помощью метода, описанного, например, Krebs А. и Bridger W.A. (Can. J. Biochem., 1980, 58, 309-318).

Термин «модифицирована с целью увеличения активности PEP карбоксикиназы» означает то, что удельная активность в пересчете на клетку становится выше, чем у немодифицированного штамма, например природного штамма. Например, в случае, когда количество молекул PEP карбоксикиназы в клетке увеличено, когда специфическая активность у молекулы PEP карбоксикиназы увеличена и так далее. Кроме того, в качестве природного штамма, который может служить объектом для сравнения, может быть упомянут штамм Escherichia coli К-12. В результате увеличения внутриклеточной активности PEP карбоксикиназы наблюдается эффект увеличения количества накопленного в питательной среде L-триптофана.

Увеличение активности PEP карбоксикиназы в клетке бактерии может быть достигнуто путем усиления экспрессии гена, кодирующего PEP карбоксикиназу. В качестве гена, кодирующего PEP карбоксикиназу, может быть использован любой такой ген, выделенный из бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, а также гены, выделенные из бактерий других видов, таких как коринеформные бактерии. Наиболее предпочтительными из них являются гены, выделенные из бактерий, принадлежащих к роду Escherichia.

В качестве гена, кодирующего PEP карбоксикиназу из Escherichia coli (EC номер 4.1.1.49), известен ген pckA (номера нуклеотидов с 3530456 по 3532078 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1 в GenBank; gi:16131280). Более того, ген pckA может быть получен методом ПЦР (полимеразная цепная реакция; White, T.J. et al.. Trends Genet., 5,185 (1989)) с использованием затравок, приготовленных на основании последовательности нуклеотидов указанного гена. Гены, кодирующие PEP карбоксикиназу из других микроорганизмов, могут быть получены подобным способом.

Примером гена pckA из Escherichia coli является ДНК, кодирующая следующие белки (А) и (В):

(A) белок, который представлен последовательностью аминокислот, приведенной в списке последовательностей под номером 2;

(B) белок, который представлен последовательностью аминокислот, включающей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в последовательность аминокислот, приведенную в списке последовательностей под номером 2, и который обладает активностью PEP карбоксикиназы.

К ДНК, кодирующей белки согласно настоящему изобретению, относится ДНК, кодирующая белок, содержащий делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в одно или множество положений белка (А) при условии, что такой белок не теряет активности указанного белка. Хотя количество «нескольких» аминокислот различается в зависимости от положения или типа аминокислотного остатка в трехмерной структуре белка, оно может составлять от 2 до 50, предпочтительно от 2 до 25 и более предпочтительно от 2 до 10 для белка (А).

ДНК, кодирующая практически такой же белок, как описанный выше белок (А), может быть получена, например, путем модификации нуклеотидной последовательности ДНК, кодирующей этот белок, например, с помощью метода сайт-направленного мутагенеза, таким образом, что один или несколько аминокислотных остатков в определенных местах содержат делеции, замены, вставки или добавления. ДНК, модифицированная, как описано выше, может быть получена традиционными известными методами обработки с целью получения мутаций. Такие методы включают обработку ДНК, кодирующей белок согласно настоящему изобретению, гидроксиламином или обработку бактерии, содержащей указанную ДНК, с помощью УФ-излучения или реагентом, таким как N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин или азотистая кислота.

К ДНК, кодирующей белок согласно настоящему изобретению, относятся варианты, которые могут быть обнаружены в различных штаммах и вариантах бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, существующие в виду природного разнообразия.

ДНК, кодирующая такие варианты, может быть получена путем выделения ДНК, которая гибридизуется с геном pckA или частью этого гена в жестких условиях и которая кодирует белок, обладающий активностью PEP карбоксикиназы. Термин «жесткие условия», упомянутый здесь, означает условия, при которых образуются так называемые специфические гибриды, а неспецифические - не образуются. Например, к жестким условиям относятся условия, при которых гибридизуются ДНК, обладающие высокой степенью гомологии, к примеру ДНК, обладающие гомологией не менее 70% друг относительно друга. В качестве варианта примером жестких условий являются условия, соответствующие условиям отмывки при гибридизации по Саузерну, например 1 × SSC, 0.1% SDS, предпочтительно 0.1 × SSC, 0.1% SDS при 60°С. В качестве зонда для ДНК, кодирующей варианты и гибридизующейся с геном pckA, может быть использована часть нуклеотидной последовательности под номером 1. Зонд подобного рода может быть получен в результате ПЦР с использованием в качестве затравок олигонуклеотидов, полученных на основе нуклеотидной последовательности под номером 1, и фрагмента ДНК, содержащего нуклеотидную последовательность под номером 1, в качестве матрицы. В случае, когда в качестве зонда используется фрагмент ДНК длиной около 300 пар оснований, условия отмывки при гибридизации соответствуют, например, 50°С, 2 × SSC и 0.1% SDS.

Трансформация бактерии с помощью ДНК, кодирующей какой-либо белок, означает введение указанной ДНК в клетку бактерии, например, традиционными методами для увеличения экспрессии указанного гена, кодирующего белок согласно настоящему изобретению, и увеличения активности указанного белка в клетке бактерии.

К бактерии согласно настоящему изобретению относится бактерия, в которой активность белка согласно настоящему изобретению повышена путем изменения нуклеотидной последовательности, контролирующей экспрессию, в ДНК, кодирующей белок, описанный как (А) или (В), в хромосоме указанной бактерии. Увеличение экспрессии гена может быть достигнуто путем помещения ДНК согласно настоящему изобретению под контроль сильного промотора вместо природного промотора. Термин «природный промотор» означает область ДНК, присутствующую в природном организме и расположенную перед открытой рамкой считывания гена, вызывающую экспрессию этого гена. Последовательность природного промотора гена pckA описана Ramseier T.M. et al (Mol. Microbiol., 1995,16, 6,1157-1169) и доступна в базе данных EMBL/GenBank под номером U21325. Сила промотора определяется частотой актов инициации синтеза РНК. Метод оценки силы промотора описан, например, Deuschle U., Kammerer W., Gentz R., Bujard H. (Promoters in Escherichia coli: a hierarchy of in vivo strength indicates alternate structures. EMBO J. 1986, 5, 2987-2994).

Белок FruR (также известный как Cra - Catabolite Repressor/Activator) является глобальным регуляторным белком, влияющим на распределение потоков углерода. Ключевые белки многих центральных путей метаболизма углеводов являются мишенями АМФ-независимого механизма катаболитической репрессии в кишечных бактериях, осуществляемого белком FruR. В присутствии подходящих экзогенных углеводных субстратов активируется экспрессия генов, кодирующих гликолитические ферменты и ферменты пути Энтнер-Дудорофф, включая некоторые гены, кодирующие ключевые белки системы PTS. В то же время ингибируется экспрессия генов, кодирующих ключевые ферменты гликонеогенеза, глиоксилатного шунта и цикла Кребса. Белок FruR регулирует экспрессию всех этих генов. Белок FruR репрессирует синтез ключевых гликолитических ферментов и ферментов пути Энтнер-Дудорофф и активирует синтез ключевых ферментов трех остальных путей (Escherichia coli and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F.C.Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996). PEP карбоксикиназа, кодируемая геном pckA, является ферментом гликонеогенеза. Поскольку известно, что промотор P_ppsA активируется белком FruR в 20 раз, в то время как промотор PpckA только в 4 раза (Saier M.H., Jr., and Ramseier Т. М., J. Bacteriol., 1996, 178, 12, 3411-3417), можно считать, что промотор P_ppsA является более сильным промотором, чем P_pckA, в штаммах, конститутивно экспрессирующих ген fruR.

Увеличение экспрессии гена может быть достигнуто путем введения в ДНК согласно настоящему изобретению более эффективной последовательности Shine-Dalgarno (SD последовательность). SD последовательностью называется область перед старт-кодоном мРНК, взаимодействующая с 16S РНК рибосомы (Shine J. and Dalgarno L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1974, 71, 4, 1342-6). Термин «природная SD последовательность» означает SD последовательность, присутствующую в природном организме. Нуклеотидная последовательность природной SD последовательности гена pckA, являющейся частью промоторной области, описана Ramseier T.M. et al (Mol. Microbiol., 1995,16, 6,1157-1169) и доступна в базе данных EMBL/GenBank под номером U21325. SD последовательность гена ϕ10 фага Т7 может быть примером эффективной SD последовательности (Olins P.O. et al, Gene, 1988, 73, 227-235).

Методами получения плазмидной ДНК, разрезания и лигирования ДНК, трансформации, выбора олигонуклеотидов в качестве затравок и подобные им могут быть обычные методы, хорошо известные специалисту в данной области. Эти методы описаны, например, в книге Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, Т., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).

Бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем введения вышеуказанных ДНК в бактерию, уже обладающую способностью к продукции L-аминокислоты. С другой стороны, бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем придания бактерии, уже содержащей указанные ДНК, способности к продукции L-аминокислоты.

В качестве родительского штамма, в котором активность белка согласно настоящему изобретению будет повышена, могут быть использованы штаммы - продуценты L-триптофана, принадлежащие к роду Escherichia, такие как штаммы Е.coli JP4735/pMU3028 (DSM10122) и JP6015/pMU91 (DSM10123), дефицитные по активности триптофанил-тРНК синтетазы, кодируемой мутантным геном trpS (патент США 5756345); штамм Е.coli SV164(pGH5), содержащий аллель serA, нечувствительный к ингибированию серином по типу обратной связи (патент США 6180373); штаммы Е. coli AGX17(pGX44) (NRRL В-12263) и AGX6(pGX50)aroP (NRRL В-12264), дефицитные по активности трипофаназы (патент США); штамм Е. coli AGX17/pGX50, pACKGG-pps, в котором повышена способность к продукции фосфоенолпирувата (заявка РСТ WO 9708333, патент США 6319696) и подобные им.

Ранее авторы настоящего изобретения установили, что ген yddG, кодирующий мембранный белок, не вовлеченный в пути биосинтеза L-аминокислот, придавал микроорганизму устойчивость к L-фенилаланину и нескольким его аналогам в случае, когда природный аллель этого гена был амплифицирован на многокопийном векторе, содержащемся в этом микроорганизме. Кроме того, ген yddG может увеличивать продукцию L-фенилаланина и L-триптофана, когда дополнительные копии этого гена внедрены в клетки соответствующего штамма - продуцента (Российская патентная заявка 2002121670). Таким образом, желательно, чтобы бактерия - продуцент L-триптофана была дополнительно модифицирована с целью повышения экспрессии открытой рамки считывания yddG.

К генам, эффективным в продукции L-триптофана, относятся гены оперона trpEDCBA, гены общего пути синтеза ароматических аминокислот, такие как aroF, aroG, aroH, aroB, aroD, aroE, aroK, aroL, aroA и агоС, гены биосинтеза L-серина, такие как serA, serB и serC, и подобные им.

К способу согласно настоящему изобретению относится способ получения L-аминокислоты, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде с целью продукции и накопления L-аминокислоты и выделения L-аминокислоты из культуральной жидкости. Также к способу согласно настоящему изобретению относится способ получения L-триптофана, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде с целью продукции и накопления L-триптофана и выделения L-триптофана из культуральной жидкости.

Согласно настоящему изобретению выращивание, выделение и очистка L-аминокислоты, такой как L-триптофана, из культуральной или подобной ей жидкости может быть осуществлена способом, подобным традиционным способам ферментации, в которых аминокислота продуцируется с использованием микроорганизма. Питательная среда, используемая для выращивания, может быть как синтетической, так и натуральной, при условии, что указанная среда содержит источники углерода, азота, минеральные добавки и, если необходимо, соответствующее количество питательных добавок, необходимых для роста микроорганизмов. К источникам углерода относятся различные углеводы, такие как глюкоза и сахароза, а также различные органические кислоты. В зависимости от характера ассимиляции используемого микроорганизма могут использоваться спирты, такие как этанол и глицерин. В качестве источника азота могут использоваться различные неорганические соли аммония, такие как аммиак и сульфат аммония, другие соединения азота, такие как амины, природные источники азота, такие как пептон, гидролизат соевых бобов, ферментолизат микроорганизмов. В качестве минеральных добавок могут использоваться фосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат железа, сульфат марганца, хлорид кальция и подобные им соединения. Некоторые дополнительные питательные добавки могут быть добавлены в питательную среду, если это необходимо. Например, если микроорганизму для роста требуется тирозин (ауксотрофия по тирозину), необходимое количество тирозина может быть добавлено в питательную среду для выращивания.

Выращивание осуществляется предпочтительно в аэробных условиях, таких как перемешивание культуральной жидкости на качалке, взбалтывание с аэрацией, при температуре в пределах от 20 до 40°С, предпочтительно в пределах от 37 до 40°С. рН среды поддерживают в пределах от 5 до 9, предпочтительно от 6.5 до 7.2. рН среды может регулироваться аммиаком, карбонатом кальция, различными кислотами, основаниями и буферными растворами. Обычно выращивание в течение от 1 до 5 дней приводит к накоплению целевой L-аминокислоты в культуральной жидкости.

После выращивания твердые остатки, такие как клетки, могут быть удалены из культуральной жидкости методом центрифугирования или фильтрацией через мембрану, а затем целевая L-аминокислота может быть выделена и очищена методами ионообменной хроматографии, концентрирования и кристаллизации.

Краткое описание чертежей

На чертеже показана структура сконструированного фрагмента в хромосоме перед геном pckA.

Наилучший способ осуществления изобретения

Более детально настоящее изобретение будет разъяснено ниже со ссылкой на Примеры. Аминокислоты в Примерах являются L-аминокислотами, если не обозначено иное.

Пример 1. Конструирование плазмиды, содержащей ген fruR и мутантный ген serA, кодирующий белок, нечувствительный к ингибированию серином по типу обратной связи.

Штамм SV164(pGH5) - продуцент L-триптофана (патент США 6180373) содержит плазмиду pGH5, содержащую мутантный ген serA5, кодирующий белок, нечувствительный к ингибированию серином по типу обратной связи. Амплификация гена serA5 необходима для увеличения количества серина, являющегося предшественником L-триптофана.

С другой стороны, известно, что промотор P_ppsA активируется белком FruR в 20 раз, в то время как промотор P_pckA только в 4 раза (Saier M.H., Jr., and Ramseier T.М., J. Bacteriol., 1996, 178, 12, 3411-3417). Поскольку планировалось увеличение активности PEP карбоксикиназы путем замены промотора P_pckA на промотор P_ppsA, было необходимо получить конститутивную экспрессию гена fruR.

Для достижения этих двух целей в штамме - продуценте L-триптофана плазмида pGH5 была заменена на плазмиду pMW-P_lacUV5-serA5-fruR, сконструированную по следующей схеме.

На основе известной нуклеотидной последовательности плазмиды pGH5 (патент США 6180373) были сконструированы затравки, приведенные в Списке последовательностей под номерами SEQ ID NO: 3 (затравка А) и SEQ ID NO: 4 (затравка В). Последовательность затравки А комплементарна последовательности области старт-кодона гена serA5 и содержит на 5'-конце участок узнавания фермента рестрикции XbaI. Последовательность затравки В комплементарна последовательности области терминаторного кодона гена serA5 и содержит на 5'-конце участок узнавания фермента рестрикции SalI.

Плазмида pGH5 была выделена стандартньм методом. ПЦР проводили с использованием "ThermoHybaid PCRExpress PCR system" при следующих условиях: 30 секунд при 95°С, 30 секунд при 55°С, 30 секунд при 72°С, 25 циклов с использованием Taq полимеразы (MBI Fermentas).

Параллельно было осуществлена амплификация гена fruR. Хромосомная ДНК штамма Е.coli W3550 была выделена стандартным методом. Использовали затравки С (SEQ ID NO: 5) и D (SEQ ID NO: 6). Затравка С (комплементарна области старт-кодона гена fruR) содержит участок узнавания SalI. Затравка D (комплементарна области терминаторного кодона гена fruR) содержит участок узнавания HindIII. Условия для ПЦР были следующие: 30 секунд при 95°С, 30 секунд при 53°С, 30 секунд при 72°С, 25 циклов с использованием Taq полимеразы (MBI Fermentas).

Полученные с помощью ПЦР фрагменты, содержащие гены serA5 и fruR, были обработаны рестриктазой SalI, а затем лигированы. Продукт лигирования последовательно обработали рестриктазами XbaI и HindIII и вставили в плазмиду pMW-P_lacUV5-lacZ (Машко С.В. и др. Биотехнология, 2001, 5, 3-20), предварительно обработанную этими же рестриктазами. Так была получена плазмида pMW-P_lacUV5-serA5-fruR.

Пример 2. Клонирование гена yddG из Е.coli.

Ген yddG, кодирующий трансмембранный белок, улучшающий продукцию L-триптофана (Российская патентная заявка 2002121670), клонировали, используя затравки, приведенные в Списке последовательностей под номерами SEQ ID NO: 7 (затравка yddg1) и SEQ ID NO: 8 (затравка yddg2). Затравка yddg1 комплементарна последовательности с 91 по 114 нуклеотид после стоп-кодона гена yddG и содержит участок узнавания фермента рестрикции BamHI, введенный на ее 5'-конец. Затравка yddg2 комплементарна последовательности с 224 по 200 нуклеотид перед старт-кодоном гена yddG и содержит участок узнавания фермента рестрикции SalI, введенный на ее 5'-конец.

Хромосомную ДНК штамма E.coli TG1 получали стандартным методом. ПЦР осуществляли на "Perkin Elmer GeneAmp PCR System 2400" в следующих условиях: 40 секунд при 95°С, 40 секунд при 47°С, 40 секунд при 72°С, 30 циклов с использованием Taq-полимеразы (Fermentas). Полученный фрагмент ДНК, содержащий ген yddG с его собственным промотором, обрабатывали рестриктазами BamHI и SalI и вводили в многокопийный вектор pAYCTER3, предварительно обработанный теми же рестриктазами. Таким образом была получена плазмида pYDDG2.

Вектор pAYCTER3 является производным вектора pAYC32 - очень стабильного вектора с умеренным числом копийности, - сконструированного на основе плазмиды RSF1010 (Christoserdov A. Y., Tsygankov Y.D, Broad-host range vectors derived from a RSF1010 Tnl plasmid, Plasmid, 1986, v.16, pp.161-167). Вектор pAYCTER3 получен путем введения полилинкера из pUC19 и сильного терминатора rrnB в плазмиду pAYC32 вместо ее промотора следующим образом. Сначала полилинкер из плазмиды pUC19 был получен с помощью ПЦР с использованием затравок, приведенных под номерами 5 и 6 в Списке последовательностей. Полученный продукт ПЦР был обработан рестриктазами EcoRI и BglII. Терминатор rrnB также был получен с помощью ПЦР с использованием затравок, приведенных под номерами 7 и 8. Полученный продукт ПЦР был обработан рестриктазами BglII и BclII. Затем эти два фрагмента ДНК были лигированы в плазмиду pAYC32, предварительно обработанную рестриктазами EcoRI и BclII. Таким образом была получена плазмида pAYCTER3.

Пример 3. Замена природного участка перед геном pckA гибридным регуляторным элементом, содержащим промотор Р_ppsA и SD_ϕ10 в хромосоме Е.coli.

Для оптимизации экспрессии гена pckA начальный участок промотора гена ppsA (Р_ppsA) из Е.coli, соединенный с последовательностью Shine-Dalgarno (последовательность SD) гена ϕ10 из фага Т7, был интегрирован перед кодирующим участком гена pckA в хромосоме штамма Е.coli BW25113 вместо природного участка методом, описанным Datsenko K.A., and Wanner B.L. (Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 97,6640 - 6645,2000), также называемым «интеграцией с использованием Red-системы». Также искусственный фрагмент ДНК содержал ген устойчивости к хлорамфениколу (Cm^R) (чертеж). Нуклеотидная последовательность замененного природного участка, расположенного перед геном pckA, представлена в Списке последовательностей под номером 1 (SEQ ID NO: 1). Штамм Escherichia coli BW25113, содержащий рекомбинантную плазмиду pKD46, может быть получен в Е.coli Genetic Stock Center, Yale University, New Haven, USA, под инвентарным номером CGSC7630.

Конструирование вышеупомянутого искусственного фрагмента ДНК, интегрированного в соответствующий участок бактериальной хромосомы, осуществлялось в несколько стадий. На первой стадии с помощью ПЦР был получен фрагмент ДНК, содержащий в начале участок узнавания BglII, промотор P_ppsA и, наконец, последовательность SD гена ϕ10 из фага Т7, присоединенную непосредственно к инициирующему ATG-кодону гена pckA. Хромосомная ДНК штамма Е.coli W3550 была использована в качестве матрицы. ПЦР проводили с использованием затравок P1 (SEQ ID NO: 13) и Р2 (SEQ ID NO: 14). Затравка P1 содержит участок узнавания BglII. Затравка Р2 содержит последовательность SD гена ϕ10 из фага Т7 и 36 нуклеотидов из рамки считывания гена pckA. Последовательность из гена pckA была введена в затравку Р2 для последующей интеграции указанного фрагмента в бактериальную хромосому с использованием Red-системы.

Во всех случаях ПЦР проводили с использованием амплификатора «Perkin-Elmer 2400 GeneAmp PCR System». Реакционная смесь общим объемом 50 мкл состояла из 5 мкл 10-кратного буфера для ПЦР ("Fermentas", Литва) с добавкой MgCl₂ до конечной концентрации 15 мМ, 200 мкМ каждого dNTP, 20 нМ каждой из затравок и 1 ЕА Taq-полимеразы ("Fermentas", Литва). В качестве матрицы, добавлявшейся в реакционную смесь для последующей амплификации с помощью ПЦР, использовали 0.5 мкг хромосомной ДНК. Температурные условия ПЦР были следующими: начальная денатурация ДНК в течение 5 минут при 95°С, затем 25 циклов денатурации при 95°С в течение 30 секунд, отжига при 55°С в течение 30 секунд, полимеризации при 72°С в течение 30 секунд, и финальная полимеризация при 72°С в течение 7 минут.

Параллельно осуществляли вторую стадию конструирования фрагмента ДНК. Ген Cm^R был амплифицирован методом ПЦР с использованием коммерчески доступной плазмиды pACYC184 (инвентарный номер Х06403 в GenBank/EMBL, "Fermentas", Литва) в качестве матрицы и затравок Р3 (SEQ ID NO: 15) и Р4 (SEQ ID NO: 16). Затравка РЗ содержала участок узнавания BglII, использовавшийся для дальнейшего присоединения к ранее полученному фрагменту ДНК, содержащему промотор P_ppsA. Затравка Р4 содержит 36 нуклеотидов, расположенных перед геном pckA из Е.coli, необходимых для последующей интеграции указанного фрагмента в бактериальную хромосому с использованием Red-системы.

Полученные фрагменты ДНК концентрировали с помощью гель-электрофореза в агарозе и экстрагировали из геля центрифугированием через колонки "GenElute Spin Columns" ("Sigma", USA) с последующим осаждением этанолом.

Два полученных фрагмента ДНК были обработаны эндонуклеазой рестрикции BglII с последующим лигированием с использованием Т4 ДНК-лигазы (Maniatis Т., Fritsch E.F., Sambrook, J.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2^nd edn. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

Продукт лигирования амплифицировали с помощью ПЦР с использованием затравок Р2 и Р4. Реакционная смесь для ПЦР общим объемом 50 мкл состояла из 5 мкл 10-кратного буфера для AccuTaq LA ("Sigma", США), 200 мкМ каждого dNTP, 20 нМ каждой из затравок и 1 мкл AccuTaq-полимеразы ("Sigma", США). В качестве матрицы, добавлявшейся в реакционную смесь для последующей амплификации с помощью ПЦР, использовали примерно 50 нг лигированной ДНК. Температурные условия ПЦР были следующими: начальная денатурация ДНК в течение 5 минут при 95°С, затем 25 циклов денатурации при 95°С в течение 30 секунд, отжига при 55°С в течение 30 секунд, полимеризации при 72°С в течение 4 минут, и финальная полимеризация при 72°С в течение 7 минут.

Структура полученного фрагмента ДНК показана на Фиг.1. Нуклеотидная последовательность сконструированного фрагмента ДНК приведена в Списке последовательностей под номером SEQ ID NO: 18.

Полученный фрагмент ДНК, очищенный, как описано выше, использовали для электропорации и интеграции в бактериальную хромосому штамма Е.coli BW25113 с использованием Red-системы. Рекомбинантная плазмида pKD46 (Datsenko, K.A., Wanner, B.L., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 97,6640-6645,2000) с термочувствительным репликоном была использована в качестве донора генов фага λ, ответственных за рекомбинацию с использованием Red-системы.

Клетки BW25113(pKD46) выращивали в течение ночи при 30°С в жидкой среде LB, содержащей ампициллин (100 мкг/мл), затем разбавляли в отношении 1:100 средой SOB (дрожжевой экстракт - 5 г/л, NaCl - 0.5 г/л, триптон - 20 г/л, KCl - 2.5 мМ, MgCl₂ - 10 мМ), содержащей ампициллин (100 мкг/мл) и L-арабинозу (10 мМ) (арабинозу использовали для индукции плазмиды с генами, кодирующими Red-систему), и выращивали при 30°С до достижения оптической плотности бактериальной культуры OD₆₀₀=0.4-0.7. Подросшие клетки из 10 мл такой бактериальной культуры промыли 3 раза холодной (0°С) деионизованной водой и затем суспендировали в 100 мкл воды. 10 мкл фрагмента ДНК (100 нг), растворенного в деионизованной воде, добавляли к суспензии клеток. Электропорацию проводили с использованием электропоратора "Bio-Rad" (No. 165-2098, версия 2-89) в соответствии с рекомендациями производителя. Клетки, подвергшиеся электрошоку, перенесли в 1 мл среды SOC (Sambrook et al, "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), выращивали в течение 2 часов при 37°С, затем переносили на L-агар, содержащий 25 мкг/мл хлорамфеникола. Колонии, выросшие за 24 часа, проверяли на наличие маркера Cm^R перед геном pckA методом ПЦР с использованием затравок Р4 (SEQ ID NO: 16) и Р5 (SEQ ID NO: 17). Те же колонии проверяли на наличие промотора P_ppsA перед геном pckA методом ПЦР с использованием затравок P1 (SEQ ID NO:13) и Р5 (SEQ ID NO:17). Для этой цели свежевыделенные колонии растворяли в 20 мкл воды, а затем использовали 1 мкл для ПЦР. Условия ПЦР были следующие: начальная денатурация ДНК в течение 10 минут при 95°С, затем 30 циклов денатурации при 95°С в течение 30 секунд, отжига при 55°С в течение 30 секунд, полимеризации при 72°С в течение 1 минуты, и финальная полимеризация при 72°С в течение 7 минут. Несколько колоний с маркером Cm^R содержали необходимые фрагменты ДНК длиной 1749 и 697 нуклеотидов, подтверждая наличие в хромосоме Е.coli полного сконструированного фрагмента ДНК перед геном pckA и гибридного регуляторного элемента, содержащего промотор P_ppsA и SD_ϕ10 соответственно. Из одного из полученных штаммов удаляли термочувствительную плазмиду pKD46 путем выращивания при 37°С и полученный штамм Е.coli назвали BW25113 (Cm-P_ppsA-SD_ϕ10-pckA).

Пример 4. Влияние усиления экспрессии гена pckA на продукцию триптофана.

Штамм Е.coli SV164 (pMW-P_lacUV5-serA5-fruR, pYDDG2) - продуцент триптофана использовали в качестве родительского штамма для оценки эффекта усиления экспрессии гена pckA на продукцию триптофана. Штамм SV164 подробно описан в патенте США 6180373.

Для оценки эффекта усиления экспрессии гена pckA, находящегося под контролем промотора P_ppsA и SD гена ϕ10 из фага Т7 на продукцию триптофана полученный фрагмент ДНК из хромосомы штамма Е.coli BW25113 (Cm-P_ppsA-SD_ϕ10-pckA) перенесли в штамм Е.coli SV164 (pMW-P_lacUV5-serA5-fruR) методом Р1 трансдукции (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY). Затем плазмиду pYDDG2 вводили в штамм SV164 (pMW-P_lacUV5-serA5-fruR) и в полученный трансдуктант.

Оба штамма SV164 (pMW-P_lacUV5-serA5-fruR, pYDDG2) и SV164 P_ppsA-SD_ϕ10-pckA (pMW-P_lacUV5-serA5-fruR, pYDDG2) выращивали в течение ночи при 37°С в 3 мл питательной среды, содержащей ампициллин (30 мкг/мл) и стрептомицин (25 мкг/мл).

0.3 мл полученной культуры переносили в 3 мл среды для ферментации, содержащей тетрациклин (20 мкг/мл), в пробирках (20×200 мм) и выращивали при 37°С в течение 48 часов на роторной качалке при 250 об/мин.

Состав питательной среды для ферментации приведен в таблице 1.

Таблица 1
Секция	Компонент	Конечная концентрация, г/л
А	KH2PO4	1.5
	NaCl	0.5
	(NH4)2SO4	1.5
	L-метионин	0.05
	L-фенилаланин	0.1
	L-тирозин	0.1
Mameno (общий азот)	0.07
В	Глюкоза	40.0
MgSO4 × 7H2O	0.3
С	CaCl2	0.011
D	FeSO4 × 7H2O	0.075
Цитрат натрия	1.0
Е	Na2MoO4 × 2H2O	0.00015
	Н3ВО3	0.0025
	CoCl2 × 6H2O	0.00007
	CuSO4 × 5Н2O	0.00025
	MnCl2 × 4H2O	0.0016
ZnSO4 × 7H2O	0.0003
F	Тиамин HCl	0.005
G	СаСО3	30.0
Н	Пиридоксин	0.03
рН секции А, отрегулированный добавлением аммиака, составлял 7.1. Все секции стерилизовали раздельно

После выращивания количество триптофана, накопленного в культуральной жидкости, определяли методом ТСХ. Использовали пластинки для ТСХ размером 10×15 см, покрытые слоем в 0.11 мм силикагелем Sorbfil без флюоресцентного индикатора (Компания «Сорбполимер», Краснодар, РФ). Пластинки Sorbfil экспонировались с подвижной фазой следующего состава: пропан-2-ол: этилацетат: водный аммиак (25%): вода = 16:16:3:9 (v/v). В качестве реагента для визуализации использовался 2% раствор нингидрина в ацетоне. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2
Штамм Е.coli	OD600	Количество триптофана, г/л
SV164 (pMW-PlacUV5-serA5-fruR, pYDDG2) SV164 PppsA-SDϕ10-pckA (pMW-PlacUV5-serA5-fruR, pYDDG2)	7.5 7.5	4.20 4.61

Как видно из таблицы 2, усиление экспрессии гена pckA увеличивало продукцию триптофана штаммом SV164 (pMW-P_lacUV5-serA5-fruR, pYDDG2).

1. Бактерия, принадлежащая к роду Escherichia, - продуцент ароматической L-аминокислоты, модифицированная таким образом, что активность PEP карбоксикиназы в указанной бактерии увеличена.

2. Бактерия по п.1, отличающаяся тем, что активность PEP карбоксикиназы увеличена за счет модификации нуклеотидной последовательности, контролирующей экспрессию гена PEP карбоксикиназы, в хромосоме указанной бактерии таким образом, что экспрессия указанного гена увеличивается.

3. Бактерия по п.2, отличающаяся тем, что природный промотор указанного гена заменен на более сильный промотор.

4. Бактерия по п.2, отличающаяся тем, что природная последовательность SD указанного гена заменена на более эффективную последовательность SD.

5. Бактерия по любому из пп.2-4, отличающаяся тем, что ген PEP карбоксикиназы получен из бактерии, принадлежащей к роду Escherichia.

6. Бактерия по п.5, отличающаяся тем, что ген PEP карбоксикиназы кодирует следующие белки (А) или (В):

(A) белок, который представлен последовательностью аминокислот, приведенной в списке последовательностей под номером 2;

(B) белок, который представлен последовательностью аминокислот, включающей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в последовательность аминокислот, приведенную в списке последовательностей под номером 2, и который обладает активностью PEP карбоксикиназы.

7. Бактерия по п.5, отличающаяся тем, что ген PEP карбоксикиназы содержит следующий фрагмент ДНК (а) или (b):

(a) фрагмент ДНК, представленный последовательностью нуклеотидов с 1 по 1623, приведенной в списке последовательностей под номером 1;

(b) фрагмент ДНК, который гибридизуется в жестких условиях с последовательностью нуклеотидов с 1 по 1623, приведенной в списке последовательностей под номером 1, или с зондом, приготовленным на основании указанной последовательности нуклеотидов, и кодирует белок, обладающий активностью PEP карбоксикиназы, при этом жесткими условиями являются условия, при которых отмывка осуществляется при 60°С, а концентрация соли соответствует 1 x SSC и 0,1% SDS.

8. Бактерия по п.1, отличающаяся тем, что указанная бактерия далее модифицирована с целью повышения экспрессии открытой рамки считывания yddG.

9. Бактерия по п.1, отличающаяся тем, что ароматическая L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из L-триптофана, L-фенилаланина и L-тирозина.

10. Способ получения ароматической L-аминокислоты, включающий стадии выращивания бактерии по любому из пп.1-9 в питательной среде и выделения из культуральной жидкости произведенной и накопленной в ней L-аминокислоты.

11. Способ по п.10, отличающийся тем, что L-аминокислотой является L-триптофан.

12. Способ по п.11, отличающийся тем, что указанная бактерия обладает повышенной экспрессией генов биосинтеза триптофана.