Штамм phyllobacterium myrsinacearum dks-1 для деструкции нефтяных углеводородов солоноватоводных экосистем

Изобретение относится к экологической биотехнологии и микробиологии. Для очистки солоноватоводных экосистем от загрязнения нефтью и нефтепродуктами прпедлагается новый бактериальный штамм Phyllobacterium myrsinacearum DKS-1, выделенный из морских вод Северного Каспия в районе разведочного бурения нефтяных скважин. Штамм выращивают на стандартных средах и средах с добавлением морской соли. Деструктивная активность препарата на основе штамма против углеводородов нефти и нефтепродуктов составляет 54,5-96% в диапазоне солености морской воды 0,05-20%. 4 табл.

 

Изобретение предназначено для использования в экологической биотехнологии, микробиологии при разработке способов биологической очистки водных экосистем от загрязнения нефтью и нефтепродуктами, в частности бактериальным штаммом Phyllobacterium myrsinacearum DKS-1, обладающим способностью активизировать процесс деструкции нефтяных углеводородов.

Известны способы очистки воды и почвы от нефтяных загрязнений, где используются монокультуры бактерий родов Pseudomonas, Rhodococcus [см. а.с. СССР №1428809, кл. С 02 F 3/34, 1985; патент РФ №2039714, 1993]. Однако применение этих бактерий для увеличения эффективности очистки воды и почвы от нефтяного загрязнения требует внесения дополнительных минеральных источников питания (азота, фосфора и др.).

Наиболее близким по сути к заявленному изобретению (прототипом) является способ получения бактериального препарата для очистки водной среды от нефтяного загрязнения, включающий наращивание биомассы бактерий Pseudomonas putida - 36 ЦМПМ И-2443 и ее последующее высушивание [а.с. СССР №1076446, кл. С 02 F 3/34, 1982]. Недостатками способа является то, что максимальная эффективность данного препарата достигается лишь при предварительном "оживлении" биомассы подогревом воды (5 м³) до t=18-28°C, аэрировании 12-16 часов и перемешивании, что является достаточно трудоемкими процессами.

Техническим результатом данного изобретения является способность штамма Phyllobacterium myrsinacearum DKS-1 к деструкции нефтяных углеводородов солоноватоводных экосистем.

Анализ литературных данных и известных технических решений показывает, что не имеется сведений об использовании бактерий рода Phyllobacterium в качестве нефтеокисляющих бактерий. Следовательно, заявляемое изобретение соответствует условиям патентоспособности "новизна", "изобретательский уровень".

Штамм Phyllobacterium myrsinacearum DKS-1 выделен из морских вод Северного Каспия, отобранных в районе разведочного бурения нефтяных скважин. Филогенетическое положение штамма проведено на основании секвенирования гена 16S рРНК в Центре "Биоинженерия" РАН и ИНМИ РАН.

Штамм Phyllobacterium myrsinacearum DKS-1 характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.

1. Культурально-морфологические признаки

Грамвариабельные прямые подвижные палочки, спор не образуют.

Колонии на МПА круглые, выпуклые, блестящие, слизистые, 1-2 мм в диаметре. Край ровный. Пигментация колоний от светло-розовой до красной. На МПБ культуры образуют однородную муть и осадок, на жидкой среде Миллса с нефтью - пленка розового цвета.

2. Физиолого-биохимические признаки

Оксидазоположительные, каталазоположительные, галотолерантные (рост в интервале солености 0,05-20% NaCl), не гидролизуют крахмал, казеин, пектин и целлюлозу, не разжижают желатин, не образуют сероводород и индол, восстанавливают нитраты в нитриты, образуют кислоту из глюкозы, не окисляют лактозу. Не имеют аргининдегидролазы, лизин - и орнитиндекарбоксилаз, уреазы, фенилаланиндезаминазы, β-галактозидазы, не утилизируют цитрат и малонат натрия, цитрат натрия с глюкозой. Способен к росту на средах Чапека, Миллса, магниево-калиево-дрожжевой (МКД), Маккланга как с добавлением дизельного топлива и нефти, так и без добавления.

3. Условия культивирования

Культивирование штамма проводят при температуре от 22 до 30°С, оптимум 28°С, при значениях рН среды от 7,0 до 9,0, оптимум 7,1. Время культивирования для получения необходимой биомассы составляет 2 суток.

4. Хранение штамма.

Для сохранения штамма используют метод периодических пересевов (3-4 раза в год) на МПА или агаре Чапека. Инкубирование после пересева ведут при температуре 28°С в течение 3-4 дней, затем культуру хранят в холодильнике при температуре 4°С. Штамм хранится в лаборатории микробиологического мониторинга кафедры «Прикладная биология и микробиология» Астраханского государственного технического университета.

Применение штамма.

Пример 1.

В аквариумы (объемом 6000 мл), содержащие 5000 мл морской воды соленостью 10 промилле, вносили сырую стерильную нефть (1% по объему) и суспензию Ph.myrsinacearum DKS-1 из расчета 2,0×16⁶ кл/мл, предварительно выращенных на МПА в течение 2-х суток при 28°С, дважды отмытых от агара дистиллированной водой, отделенных центрифугированием (8 тыс. об/мин) и ресуспендированных в стерильной морской воде.

Контролем служили аквариумы с морской водой с добавлением стерильной нефти (1% по объему) без внесения микроорганизмов. Начальное содержание нефтяных углеводородов во всех аквариумах опыта составило 190 мг/л. Аквариумы инкубировали при комнатной температуре в течение 30 суток.

Через 3, 10, 20, 30 суток в аквариумах определяли содержание суммарных нефтяных углеводородов флюориметрическим методом. В ходе экспозиции Ph.myrsinacearum DKS-1 показал способность к активизации процесса деструкции нефти. Убыль суммарных нефтяных углеводородов в течение 30 суток составила 96,0%, что на 30% превышает аналогичный показатель в сравнении с контролем, где разрушение нефтяных углеводородов происходит в результате физико-химических процессов и деятельности аборигенной микрофлоры морской воды. Результаты эксперимента представлены в таблице 1.

Таблица 1. Убыль нефтепродуктов в ходе эксперимента, %
	Продолжительность эксперимента, сутки
Вариант опыта	3	10	20	30
Морская вода	31,6	55,0	64,7	66,0
Морская вода с добавлением Ph.myrsinacearum DKS-1	65,5	82,1	91,1	96,0

Пример 2. В колбы Эрленмейера (объемом 250 мл), содержащие 100 мл стерильной морской воды соленостью 10 промилле, вносили сырую стерильную нефть (1% по объему) и 1,0 мл суспензии Ph.myrsinacearum DKS-1 (2,0×16⁶ кл/мл), предварительно выращенных на МПА в течение 2-х суток при 28°С, дважды отмытых от агара дистиллированной водой, отделенных центрифугированием (8 тыс. об/мин) и ресуспендированных в стерильной морской воде. Контролем служили колбы со стерильной морской водой без добавления суспензии Ph.myrsinacearum DKS-1 с добавлением стерильной сырой нефти (1% по объему). Колбы инкубировали на перемешивающем устройстве (45 кол/мин) при комнатной температуре в течение 10 суток.

Через 1, 3, 7, 10 суток в колбах определяли титр клеток и содержание суммарных нефтяных углеводородов флюорометрическим методом. В ходе экспозиции Ph.myrsinacearum DKS-1 показал способность к деструкции нефти. Убыль нефтяных углеводородов в течение 10 суток составила 66,1%. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2. Убыль нефтепродуктов в ходе эксперимента, %
	Продолжительность эксперимента, сутки
Вариант опыта	1	3	7	10
Морская вода стерильная	13,6	19,7	27,8	28,0
Морская вода стерильная с добавлением Ph.myrsinacearum DKS-1	11,1	21,4	51,9	66,1
Титр клеток, кл/мл	106	107	106	105

Пример 3. В колбы Эрленмейера (объемом 250 мл), содержащие 100 мл среды Чапека (стандартная), вносили сырую стерильную нефть (1% по объему) и 1,0 мл суспензии Ph. myrsinacearum DKS-1 (2,0×16⁶ кл/мл), предварительно выращенных на МПА в течение 2-х суток при 28°С, дважды отмытых от агара дистиллированной водой, отделенных центрифугированием (8 тыс. об/мин) и ресуспендированных в стерильной морской воде. Контролем служили колбы со средой Чапека без добавления суспензии Ph.myrsinacearum DKS-1 и с добавлением сырой стерильной нефти (1% по объему). Колбы инкубировали на перемешивающем устройстве (45 кол/мин) при комнатной температуре в течение 10 суток.

Через 1, 2, 3, 7, 10 суток в колбах определяли титр клеток и содержание суммарных нефтяных углеводородов. В ходе экспозиции Ph.myrsinacearum DKS-1 показал способность к активизации процесса деструкции нефти. Убыль нефтяных углеводородов в течение 10 суток составила 72,2%. Результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3. Убыль нефтепродуктов в ходе эксперимента, %
	Продолжительность эксперимента, сутки
Вариант опыта	1	2	3	7	10
Среда Чапека	10,3	18,0	24,2	27,2	32,5
Среда Чапека с добавлением Ph.myrsinacearum DKS-1	12,1	21,5	27,6	60,4	72,2
Титр клеток, кл/мл	106	107	107	105	104

Пример 4. В колбы Эрленмейера (объемом 250 мл), содержащие 100 мл среды Миллса (NaCl - 24,0 г/л; MgSO₄·7H₂O - 1,0 г/л; KCl - 0,7 г/л; K₂HPO₄ - 2,0 г/л; Na₂HPO₄ - 3,0 г/л; NH₄NO₃ - 1,0 г/л), вносили сырую стерильную нефть (1% по объему) и 1,0 мл суспензии Ph.myrsinacearum DKS-1 (2,0×16⁶ кл/мл), предварительно выращенных на МПА в течение 2-х суток при 28°С, дважды отмытых от агара дистиллированной водой, отделенных центрифугированием (8 тыс. об/мин) и ресуспендированных в стерильной морской воде. Контролем служили колбы со средой Миллса без добавления суспензии Ph.myrsinacearum DKS-1 и с добавлением сырой стерильной нефти (1% по объему). Колбы инкубировали на перемешивающем устройстве (45 кол/мин) при комнатной температуре в течение 10 суток.

Через 1, 2, 3, 7, 10 суток в колбах определяли титр клеток и содержание суммарных нефтяных углеводородов. В ходе экспозиции Ph.myrsinacearum DKS-1 показал способность к активизации процесса деструкции нефти.

Убыль нефтяных углеводородов в течение 10 суток составила 54,5%. Результаты представлены в таблице 4.

Таблица 4. Убыль нефтепродуктов в ходе эксперимента, %
	Продолжительность эксперимента, сутки
Вариант опыта	1	2	3	7	10
Среда Миллса	9,3	24,0	24,3	41,2	42,3
Среда Миллса с добавлением Ph.myrsinacearum DKS-1	24,8	28,4	34,5	40,8	54,5
Титр клеток, кл/мл	106	106	105	106	105

Таким образом, представленные экспериментальные данные показывают способность штамма Phyllobacterium myrsinacearum DKS-1 использовать нефтяные углеводороды в качестве источника питания и энергии и рассматривать его деструктором нефтяных углеводородов в солоноватоводных экосистемах.

Изобретение обеспечивает достижение технического результата, может быть использовано на практике, обеспечивает возможность воспроизводимости, что удовлетворяет условию патентоспособности "промышленная применимость".

Штамм Phyllobacterium myrsinacearum DKS-1, используемый для деструкции нефтяных углеводородов солоноватоводных экосистем.