Биотрансплантат, способ его получения (варианты) и способ лечения алопеции

Изобретение относится к медицине и биофармакологии. Биотрансплантат для лечения различных видов алопеции содержит культуру генетически немодифицированных мезенхимальных клеток (МСК), фибробластов, в том числе фибробластов дермального сосочка волосяного фолликула, эпителиальных клеток, в том числе полученных из стволовой ниши волосяного фолликула. Биотрансплантат предназначен для внутрикожного введения. Способ лечения алопеции характеризуется тем, что пациенту в условиях процедурного кабинета внутрикожно микропапульным способом вводят биотрансплантат, содержащий от 10 до 100 млн. клеток. Биотрансплантат вводится в физиологическом растворе в концентрации от 1 до 10 млн. на 1 мл. Общее количество трансплантата от 1 до 10 мл в зависимости от площади поражения и формы алопеции. Изобретение обеспечивает высокую воспроизводимость результатов лечения. 5 н. и 7 з.п. ф-лы.

 

Изобретение касается получения культур генетически немодифицированных мезенхимальных стволовых клеток (МСК), фибробластов, в том числе клеток дермального сосочка волосяного фолликула, эпителиальных клеток, в том числе полученных из стволовой ниши волосяного фолликула, и способа лечения алопеции.

Алопеция (облысение) - это патологическое выпадение волос. Различают рубцовую алопецию, обусловленную разрушением волосяных фолликулов вследствие воспаления, атрофии кожи или рубцевания, и нерубцовую алопецию, протекающую без предшествующего поражения кожи. К нерубцовой алопеции относят очаговую алопецию, андрогенетическую алопецию, диффузную алопецию [Адаскевич В.П., Мяделец О.Д., Тихоновская И.В. 2000].

Очаговая алопеция - хронический дерматоз, характеризующийся патологическим выпадением волос, обусловленным различными воздействиями на волосяной фолликул и клинически проявляющийся формированием очагов с полным отсутствием волос на волосистой части головы, области бороды, бровей, ресниц и туловища. В последнее время большинство авторов считает, что в развитии алопеции ведущую роль играют нарушения иммунной системы. Применение местных раздражающих веществ, способных вызвать явления, аналогичные аллергическому дерматиту, способствуют возобновлению роста волос за счет того, что восстанавливается активность лимфоцитов (например, при использовании динитрохлорбензола). При исследовании биоптатов при очаговой алопеции обнаруживают перифолликулярный инфильтрат, нарушающий трофику волосяного фолликула, методом прямой иммунофлюорисценции выявлены отложения иммунных комплексов (Ig G, Ig М) и С3 комплемента в нижней части волосяного фолликула [Цветкова Г.М. и соавт., 1999].

Андрогенетическая алопеция - это прогрессирующее облысение, вызванное действием андрогенов на волосяные фолликулы и возникающее у людей с наследственной предрасположенностью. Заболевание начинается в любом возрасте, после окончания пубертатного периода, чаще после 40-50 лет. Мужчины болеют значительно чаще, андрогенетическая алопеция составляет почти 95% всех случаев выпадения волос у мужчин. Наследование у мужчин - полигенное или аутосомно-доминантное, у женщин - аутосомно-рецессивное. В основе возникновения андрогенетической алопеции лежит действие андрогенов на волосяные фолликулы, а также унаследованные особенности волосяных фолликулов. Андрогенетическая алопеция вызывается несколькими причинами: избыточное содержание дигидротестостерона (ДГТ) - мужского полового гормона; повышенная чувствительность волосяных фолликулов к ДГТ; повышенная активность фермента 5-α-редуктазы, которая превращает тестостерон в ДГТ, сниженное содержание ароматазы, конкурентно взаимодействующей с 5-α-редуктазой. В тестостерон-чувствительных волосяных фолликулах под воздействием ДГТ спазмируется капиллярная сеть дермального сосочка, в результате чего волос преждевременно входит в фазу покоя (телогена). В дальнейшем, волосяные фолликулы миниатюризируются, атрофируются, волосы теряют структуру, становятся тонкими, пушковыми, затем рост волос прекращается, наступает облысение.

К традиционным методам лечения алопеции относят применение препаратов, улучшающих микроциркуляцию, препараты меди, цинка, железа, биогенные стимуляторы, ноотропные и психотропные препараты, гормональную, иммуносупрессивную и раздражающую терапию, акупунктуру и физиотерапевтические методы. Несмотря на разнообразие представленных методов, необходимо отметить, что ни один из них не обладает большим процентом излечиваемости, терапевтический эффект носит, как правило, временный характер.

В настоящее время внимание многих исследователей обращает возможность применения заместительной клеточной терапии при алопеции. Известны случаи, когда алопеция спонтанно разрешалась после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток [Feher О, et al., 2002]. После аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток по поводу хронического миелолейкоза, диагностированного 5 месяцев назад, у пациента, страдающего около 12 лет общим облысением (alopecia universalis), начался рост волос, и за 2 года наблюдения процесс стабилизировался.

Проводимые эксперименты по получению роста волоса и формированию волосяного фолликула de novo позволяют говорить о возможности восстановления роста волоса введением фибробластов дермального сосочка внутрикожно при условии сохраненной стволовой ниши волоса и в случае разрушенной, поврежденной стволовой ниши волоса - о возможности восстановления волосяного фолликула внесением клеток стволовой ниши волоса и фибробластов дермального сосочка [Reynolds AJ, Jahoda CA,. 1992; Jahoda CA, Oliver RF, Reynolds AJ., 2001, Ferraris C, Chevalier G, Jahoda CA., 2000].

Задачей настоящего изобретения является получение гомогенных культур немодифицированных мезенхимальных клеток (МСК), фибробластов, в том числе фибробластов дермального сосочка волосяного фолликула, эпителиальных клеток, в том числе полученных из стволовой ниши волосяного фолликула, для лечения алопеции различного генеза.

Для решения поставленной задачи предложена группа изобретений, объединенных единым изобретательским замыслом.

Предложен биотрансплантат для лечения алопеции, содержащий суспензию культуры фибробластов, в том числе фибробластов дермального сосочка волосяного фолликула, и эпителиальных клеток, полученную из кожи эмбрионов на 5-8 неделях гестации или кожи взрослого человека, полученной в результате пластических операций, биопсий, липоаспиратов.

Биотрансплантат содержит свежеприготовленную культуру.

Предложен способ получения биотрансплантата для лечения алопеции, заключающийся в том, что кожу отмывают в среде Хэнкса, содержащей антибиотик и антимикотик, измельчают, далее кожу или липоаспират ферментативно дезагрегируют в 0,25% растворе трипсина в течение 40 минут в условиях CO₂ при температуре 37°С, полученную суспензию клеток разводят солевым раствором Хэнкса в соотношении 1:1, центрифугируют при 1000 об./мин в течение 5 минут и ресуспендируют в ростовой среде DMEM/F12, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 2 мМ глутамина, затем суспензию высевают при плотности посева первичной клеточной суспензии 500-1000 тысяч клеток на 1 см² и культивируют до формирования конфлюентного монослоя.

Предложен также биотрансплантат для лечения алопеции, содержащий мезенхимальные стволовые клетки (МСК), полученные из фетального, донорского или аутологичного материала, при этом ткань дезагрегируют, полученную клеточную суспензию ресуспендируют и культивируют на ростовой среде, содержащей трансферин, инсулин, фактор роста фибробластов и гепарин до накопления в культуре клеток зрелой стромы.

В качестве фетального материала используют: костный мозг, тимус, печень или жировую ткань эмбрионов человека 1-го триместра беременности.

В качестве донорского аутологичного материала используют: костный мозг, тимус, печень или жировую ткань.

Биотрансплантат содержит свежеприготовленную культуру.

Биотрансплантат содержит клеточную культуру, криоконсервированную с использованием в качестве криопротектора диметилсульфоксида.

Предложен также способ получения биотрансплантата для лечения алопеции, заключающийся в том, что мезенхимальные стволовые клетки (МСК), полученные из фетального, донорского или аутологичного материала ферментативно дезагрегируют, полученную клеточную суспензию ресуспендируют в ростовой среде DMEM/F12, содержащей 15% эмбриональной телячьей сыворотки и 2 мМ глутамина, далее высевают при плотности посева 1-20 млн мононуклеарных клеток на 1 см² и инкубируют при 37°С в атмосфере 5% CO₂, по достижении культурой 50% конфлуентности монослой трипсинизируют и пересевают с плотностью 10-30 клеток на 1 см² на ростовую среду, содержащую 10 мкг/мл трансферрина, 1 мкг/мл инсулина, 10 нг/мл фактора роста фибробластов - 2 и 8 ЕД/мл гепарина и с увеличением посевной дозы культивирование ведут до накопления в культуре зрелой стромы.

Предложен способ лечения алопеции, заключающийся в том, что пациенту внутрикожно, микропапульным способом, вводят биотрасплантат по п.1 и/или по п.4, содержащий от 10 до 100 млн. клеток, при этом биотрансплантат вводят в физиологическом растворе в концентрации от 1 до 10 млн. на 1 мл, при общем количестве трансплантата от 1 до 10 мл, в зависимости от площади поражения и формы алопеции и введение осуществляют в очаге облысения или по всей поверхности волосистой части головы, в случае тотальной или диффузной алопеции.

Эпителиальные клетки кожи (кератиноциты) получают из кожи эмбрионов на сроках I-II триместра беременности; кожи взрослого человека, полученных в результате пластических операций или биопсий. Кожу с содержащимися в ней волосяными фолликулами отмывают в среде Хэнкса, содержащей антибиотик и антимикотик, измельчают и ферментативно дезагрегируют в 0,25% растворе диспазы в течение 40 минут в условиях CO₂ инкубатора при температуре 37°С. Из них выделяют эпителий и фолликулы, разводят 1:1 солевым раствором Хэнкса, центрифугируют в режиме 1000 × об/мин 5 минут и ресуспендируют в ростовой среде 199 и помещают в пластмассовые покрытые коллагеном или гидрофильные чашки из расчета не менее 70000-100000 на 1 см². Сменяют среду каждые 3 дня до формирования конфлюентного монослоя.

Фибробласты получают из кожи фетусов 1-2 триместра беременности, кожи взрослого человека, полученной в результате пластических операций или биопсий, липоаспиратов. Кожу отмывают в среде Хэнкса, содержащей антибиотик и антимикотик, измельчают и ферментативно дезагрегируют в 0,25% растворе трипсина в течение 40 минут в условиях СО₂ инкубатора при температуре 37°С. Липоаспират ферментативно дезагрегируют аналогично. Суспензию клеток разводят 1:1 солевым раствором Хэнкса, центрифугируют в режиме 1000 × об./мин 5 минут и ресуспендируют в ростовой среде DMEM/F12, содержащей 10% эмбриональной телячей сыворотки, 2 мМ глутамина. Суспензию высевают на пластиковые чашки Петри с диаметром 100 мм. Плотность посева первичной клеточной суспензии составляет 500-1000 тысяч клеток на 1 см².

Предложен способ получения биотрансплантата для алопеции, заключающийся в том, что мезенхимальные стволовые клетки (МСК), полученные из фетального, донорского или аутологичного материала ферментативно дезагрегируют, полученную клеточную суспензию ресуспендируют в ростовой среде DMEM/F12, содержащей 15% эмбриональной телячьей сыворотки и 2 мМ глутамина, далее высевают при плотности посева 1-20 млн. мононуклеарных клеток на 1 см² и инкубируют при 37°С в атмосфере 5% CO₂, по достижении культурой 50% конфлюентности монослой трипсинизируют и пересевают с плотностью 10-30 клеток на 1 см² на ростовую среду, содержащую 10 мкг/мл трансферрина, 1 мкг/мл инсулина, 10 нг/мл фактора роста фибробластов - 2 и 8 ЕД/мл гепарина и с увеличением посевной дозы культивирование ведут до накопления в культуре зрелой стромы.

В качестве биотрансплантата используют свежеполученную клеточную культуру или после ее криоконсервировации. В качестве криопротектора используют 7% диметилсульфоксид.

Экспериментально подобранные условия, объединяющие критерии отбора исходного биоматериала и режим культивирования, являются оптимальными для достижения следующих результатов:

Система последовательной ферментативной дезагрегации исходной ткани позволяет получать максимальное количество жизнеспособных клеток одинакового фенотипа с незначительной примесью гетеротопных клеток.

Режим культивирования и селективные культуральные среды позволяют максимально наращивать количество аггрекан- и коллаген II-экспрессирующих клеток.

Режим культивирования и селективные культуральные среды позволяют получать гомогенную клеточную культуру с содержанием аггрекан- и коллаген II-экспрессирующих клеток не менее 80%.

Режим культивирования и селективные культуральные среды позволяют при многократном пассировании максимально наращивать гомогенную клеточную культуру недифференцированных клеток.

Режим культивирования и селективные культуральные среды позволяют сохранить плюрипотентность клеточных культур.

Режим культивирования и селективные культуральные среды позволяют получить большое количество клеток для трансплантации (серию), что обеспечивает воспроизводимость результатов лечения.

Предложенный способ лечения алопеции различного генеза заключается в том, что вышеуказанный биотрансплантат вводится микропапульным способом в кожу головы.

Суммарный объем вводимых клеток может варьировать от 10 до 100 млн., в зависимости от стадии и этиологии алопеции. Возможно использование как биотрансплантата, содержащего монокультуру, так и различных вышеперечисленных культур в различных соотношениях.

Биотрансплантаты, содержащие предложенные культуры клеток с последующей ферментативной дезагрегацией тканей и режима культивирования, обеспечивают большое количество гомогенных клеток для трансплантациии и высокую воспроизводимость результатов лечения.

1. Биотрансплантат для лечения алопеции, характеризующийся тем, что он содержит суспензию культуры фибробластов, в том числе фибробластов дермального сосочка волосяного фолликула и эпителиальных клеток, полученную из кожи эмбрионов на 5-8 неделях гестации или кожи взрослого человека, полученной в результате пластических операций, биопсий, липоаспиратов.

2. Биотрансплантат по п.1, содержит свежеприготовленную культуру.

3. Способ получения биотрансплантата для лечения алопеции, характеризующийся тем, что кожу отмывают в среде Хэнкса, содержащей антибиотик и антимикотик, измельчают, далее кожу или липоаспират ферментативно дезагрегируют в 0,25%-ном растворе трипсина в течение 40 мин в условиях CO₂ при температуре 37°С, полученную суспензию клеток разводят солевым раствором Хэнкса в соотношении 1:1, центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 мин и ресуспендируют в ростовой среде DMEM/F12, содержащей 10% эмбриональной телячей сыворотки и 2 мМ глутамина, затем суспензию высевают при плотности посева первичной клеточной суспензии 500-1000 тысяч клеток на 1 см² и культивируют до формирования конфлюентного монослоя.

4. Биотрансплантат для лечения алопеции, характеризующийся тем, что он содержит мезенхимальные стволовые клетки (МСК), полученные из фетального, донорского или аутологичного материала, при этом ткань дезагрегируют, полученную клеточную суспензию ресуспендируют и культивируют на ростовой среде, содержащей трансферрин, инсулин, фактор роста фибробластов и гепарин, до накопления в культуре клеток зрелой стромы.

5. Биотрансплантат по п.4, в качестве фетального материала используют костный мозг, тимус, печень или жировую ткань эмбрионов человека 1-го триместра беременности.

6. Биотрансплантат по п.4, в качестве донорского аутологичного материала используют костный мозг, тимус, печень или жировую ткань.

7. Биотрансплантат по п.4 содержит свежеприготовленную культуру.

8. Биотрансплантат по п.4 содержит клеточную культуру криоконсервированную с использованием в качестве криопротектора диметилсульфоксида.

9. Способ получения биотрансплантата для лечения алопеции, характеризующийся тем, что мезенхимальные стволовые клетки (МСК), полученные из фетального, донорского или аутологичного материала, ферментативно дезагрегируют, полученную клеточную суспензию ресуспендируют в ростовой среде DMEM/F12, содержащей 15% эмбриональной телячьей сыворотки и 2 мМ глутамина, далее высевают при плотности посева 1-20 млн. мононуклеарных клеток на 1 см² и инкубируют при 37°С в атмосфере 5% CO₂, по достижении культурой 50%-ной конфлуентности монослой трипсинизируют и пересевают с плотностью 10-30 клеток на 1 см² на ростовую среду, содержащую 10 мкг/мл трансферрина, 1 мкг/мл инсулина, 10 нг/мл фактора роста фибробластов - 2 и 8 ЕД/мл гепарина, и с увеличением посевной дозы культивирование ведут до накопления в культуре зрелой стромы.

10. Способ лечения алопеции, характеризующийся тем, что пациенту внутрикожно, микропапульным способом вводят биотрансплантат по п.1 и/или 4, содержащий от 10 до 100 млн. клеток.

11. Способ лечения по п.10, характеризующийся тем, что биотрансплантат вводят в физиологическом растворе в концентрации от 1 до 10 млн на 1 мл при общем количестве трансплантата от 1 до 10 мл в зависимости от площади поражения и формы алопеции.

12. Способ лечения по п.10, характеризующийся тем, что введение осуществляют в очаг облысения или по всей поверхности волосистой части головы в случае тотальной или диффузной алопеции.