Способ снижения доступности питательного вещества, способ подавления аппетита
Предложено: способ снижения доступности питательного вещества, способ подавления аппетита или снижения потребления пищи. Изобретение отличается тем, что в способе используется вещество PYY (пептид YY) или агонист PYY при периферическом введении. Способ обеспечивает значительное снижение потребления пищи у самок мышей, голодавших в течение ночи, а также снижение опустошения желудка, ингибирование секреции кислоты в желудке, предотвращение опорожнения желчного пузыря, ингибирование секреции амилазы поджелудочной железой. 2 н. и 33 з.п. ф-лы, 8 ил., 1 табл.
ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ
Данная заявка заявляет приоритет предварительной заявки на выдачу патента США No.60/256216, озаглавленной "Пептид YY и агонисты пептида YY для лечения ожирения, диабета и других метаболических расстройств", поданной 15 декабря 2000 г., содержание которой включено в данное описание в виде ссылки.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Данное изобретение относится к способам и композициям для лечения метаболических состояний или расстройств, в частности таких, которые можно облегчить путем снижения доступности калорийных веществ, например для лечения диабета, ожирения, расстройств питания, синдрома инсулиновой резистентности (синдрома Х), непереносимости глюкозы, дислипедимии и сердечно-сосудистых заболеваний.
ПРЕДПОСЫЛКА
Ряд родственных гормонов составляют семейство панкреатического полипептида (PP). Панкреатический полипептид был открыт в виде примеси в экстрактах инсулина и был назван, прежде всего, по органу своего происхождения, а не по функциональному значению (Kimmel, Pollock et al. Endocrinology 83: 1323-30, 1968). PP является 36-аминокислотным пептидом [SEQ ID NO: 1], содержащим характерные структурные мотивы. Позже родственный пептид был открыт в экстрактах кишечника и назван пептидом YY (PYY) из-за наличия N- и C-концевых тирозинов (Tatemoto. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 2514-8, 1982) [SEQ ID NO: 2]. Позднее в экстрактах головного мозга был обнаружен третий родственный пептид и назван нейропептидом Y (NPY) (Tatemoto. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 5485-9, 1982; Tatemoto, Carlquist et al. Nature 296: 659-60, 1982) [SEQ ID NO: 4].
Сообщалось, что три указанных пептида вызывают различные биологические эффекты. Эффекты PP включают ингибирование секреции поджелудочной железы и релаксацию желчного пузыря. При центральном введении PP вызывает умеренное увеличение потребления пищи, которое может быть опосредовано рецепторами, локализованными в гипоталамусе и стволе головного мозга (обзор (Gehlert. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 218: 7-22, 1998)).
Высвобождение PYY [SEQ ID NO: 2] происходит после приема пищи. Альтернативной молекулярной формой PYY является PYY[3-36] [SEQ ID NO: 3] (Eberlein, Eysselein et al. Peptides 10: 797-803, 1989) (Grandt, Schimiczek et al. Regul. Pept. 51: 151-9, 1994). Данный фрагмент составляет примерно от 40% суммарной PYY-подобной иммунореактивности в кишечных экстрактах человека и собаки и примерно 36% суммарной иммунореактивности PYY в плазме в состоянии голода до немногим более 50% после приема пищи. По-видимому, он является продуктом расщепления PYY дипептидилпептидазой-IV (DPP4). По имеющимся сообщениям PYY[3-36] представляет собой избирательный лиганд рецепторов Y2 и Y5, которые, по-видимому, являются фармакологически уникальными в отношении предпочтения укороченных на N-конце (т.е. C-концевых фрагментов) аналогов NPY. По имеющимся сообщениям при периферическом введении PYY снижает секрецию желудочной кислоты, моторику желудка, экзокринную секрецию поджелудочной железы (Yoshinaga, Mochizuki et al. Am. J. Physiol. 263: G695-701, 1992), (Guan, Maouyo et al. Endocrinology 128: 911-6, 1991), (Pappas, Debas et al. Gastroenterology 91: 1386-9, 1986), сокращение желчного пузыря и моторику кишечника (Savage, Adrian et al. Gut 28: 166-70, 1987). Влияние центральной инъекции PYY на опорожнение желудка, моторику желудка и секрецию желудочной кислоты, которое наблюдается после прямой инъекции в задний мозг/ствол головного мозга или вокруг указанного места (Chen and Rogers. Am. J. Physiol. 269: R787-R792, 1995), (Chen, Rogers et al. Regul. Pept. 61: 95-98, 1996), (Yang and Tache. Am. J. Physiol. 268: G943-8, 1995), (Chen, Stephens et al. Neurogastroenterol. Motil. 9: 109-116, 1997), может отличаться от влияния, наблюдаемого при периферической инъекции. Например, при центральном введении PYY оказывает некоторые воздействия, противоположные воздействиям, приведенным в данном описании в случае периферической инъекции PYY[3-36], при котором происходило не ингибирование, а стимуляция секреции желудочной кислоты. Моторика желудка подавлялась только вместе со стимуляцией TRH, но не подавлялась при отдельном введении, и в действительности стимулировалась при высоких дозах, предположительно благодаря взаимодействию с рецепторами PP. Показано, что PYY стимулирует потребление пищи и воды после центрального введения (Morley, Levine et al. Brain Res. 341: 200-203, 1985), (Corp, Melville et al. Am. J. Physiol. 259: R 317-23, 1990).
Подобным образом одним из центральных воздействий NPY [SEQ ID NO: 4] в самых ранних сообщениях было увеличение потребления пищи, в частности при воздействии на гипоталамус (Stanley, Daniel et al. Peptides 6: 1205-11, 1985). Сообщается, что PYY и PP имитируют указанные воздействия и что PYY является более эффективным или эффективным так же, как NPY (Morley, J.E., Levine, A.S., Grace, M., and Kneip, J. Brain Res. 341: 200-203, 1985), (Kanatani, Mashiko et al. Endocrinology 141: 1011-6, 2000), (Nakajima, Inui et al. J. Pharmacol. Exp. Ther. 268: 1010-4, 1994). Несколькими группами обнаружено, что значение индуцированного NPY потребления пищи выше, чем потребление, индуцированное каким-либо ранее тестированным фармакологическим средством, а также чрезвычайно долго продолжается. Индуцированная NPY стимуляция потребления пищи воспроизведена у ряда видов. Из трех основных питательных макроэлементов (жиры, белки и углеводы) предпочтительно стимулировалось поглощение углеводов. Не наблюдалось толерантности по отношению к возбуждающему аппетит воздействию NPY, и в том случае, когда введение пептида повторялось в течение 10 дней, наблюдалось заметное увеличение скорости прироста массы. После голодания концентрация NPY в гипоталамическом PVN увеличивалась с течением времени и быстро возвращалась к контрольным уровням после приема пищи.
Фармакологические исследования и попытки клонирования выявили ряд рецепторов пептидов семейства PP, имеющих семь трансмембранных доменов, и указанным рецепторам даны названия от Y1 до Y6 (и предполагаемый рецептор, предпочтительно взаимодействующий с PYY, или Y7). Обычные ответы по передаче сигнала указанных рецепторов сходны с ответами других рецепторов, связанных с Gi/Go, а именно - ингибирование аденилатциклазы. Даже при достаточно низкой гомологии последовательностей среди рецепторов, несомненно, что существует сходство в образовании кластеров аминокислотной последовательности между рецепторами Y1, Y4 и Y6, тогда как Y2 и Y5 имеют характеристики других семейств. Другие сайты связывания идентифицировали на основании порядка ранжирования эффективности различных пептидов. Рецептор, предпочтительно взаимодействующий с NPY, который не был клонирован, назван Y3, а также показано, что существует рецептор, предпочтительно взаимодействующий с PYY (предполагаемый Y7) (обзор в (Michel, Beck-Sickinger et al. Pharmacol. Rev. 50: 143-50, 1998), (Gehlert, D.R. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 218: 7-22, 1998)).
Предполагалось, что рецепторы Y5 и Y1 являются первичными медиаторами ответа, проявляющегося в виде потребления пищи (Marsh, Hollopeter et al. Nat. Med. 4: 718-21, 1998), (Kanatani, A., Mashiko, S., Murai, N., Sugimoto, N., Ito, J., Fukuroda, T., Fukami, T., Morin, N., MacNeil, D.J., Van der Ploeg, L.H., Saga, Y., Nishimura, S., and Ihara, M. Endocrinology 141: 1011-6, 2000). Преобладающей идей была идея о том, что эндогенный NPY через указанные рецепторы усиливает поведение, связанное с потреблением пищи. Предлагаемая терапия при ожирении неизменно была направлена на антагонизм рецепторов NPY, тогда как терапия в случае лечения анорексии была обращена к агонистам указанного семейства лигандов (смотри, например, патенты США No.5939462; 6013622 и 4891357). В общем, сообщалось, что PYY и NPY являются равносильными и в равной мере эффективными во всех проводимых анализах рецепторов Y1, Y5 (и Y2) (Gehlert, D.R. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 218: 7-22, 1998).
Основной характеристикой предполагаемых рецепторов Y3 является то, что они узнают NPY, тогда как PYY является, по меньшей мере, на порядок значений менее эффективным. Рецептор Y3 представляет собой рецептор с единственным сайтом связывания, который проявляет предпочтение по отношению к NPY.
Существует дополнительный сайт связывания/рецептор, который проявляет предпочтение по отношению к PYY, названный PYY-предпочитающим рецептором, который в данном описании упоминается как рецептор(ры) Y7. Имеются сообщения о различных порядках ранжирования связывания с указанным рецептором или классом рецепторов, что свидетельствует о том, что в данном семействе может существовать более одного рецептора. В большинстве случаев это наименование использовали для описания рецептора в том случае, когда PYY был в три-пять раз более эффективным, чем NPY. Рекомендации Международного союза в области фармакологии относительно номенклатуры рецепторов NPY, PYY и PP состоят в том, чтобы термин PYY-предпочитающий рецептор не использовали в том случае, если не наблюдается различие в эффективности между PYY и NPY, составляющее, по меньшей мере, двадцать раз. (Michel, M.C., Beck-Sickinger, A., Cox, H., Doods, H.N., Herzog, H., Larhammar, D., Quirion, R., Schwartz, T., and Westfall, T. Pharmacol. Rev. 50: 143-50, 1998). Однако в целях данного описания ссылка на рецептор Y7 или фармакологию PYY-предпочитающего рецептора означает, рецептор обладает некоторой степенью предпочтения для PYY по сравнению с NPY.
Ожирение и связанные с ним расстройства широко распространены и представляют собой очень серьезные проблемы для здравоохранения в Соединенных Штатах и во всем мире. Высокая степень ожирения тела является самым мощным известным фактором риска развития сахарного диабета типа 2 и является высоким фактором риска развития сердечно-сосудистого заболевания. Ожирение является общепризнанным фактором риска в случае гипертензии, атеросклероза, застойной сердечной недостаточности, удара, заболевания желчного пузыря, остеоартрита, апноэ во сне, репродуктивных расстройств, таких как синдром поликистозного яичника, злокачественные опухоли молочной железы, простаты и ободочной кишки и повышенная частота возникновения осложнений при общей анестезии (смотри, например, (Kopelman. Nature 404: 635-43, 2000)). Ожирение снижает продолжительность жизни и влечет за собой серьезный риск сочетания вышеприведенных заболеваний, а также таких заболеваний, как инфекции, варикозные вены, акантокератодермия, экзема, непереносимость физической нагрузки, резистентность к инсулину, гипертензия, гиперхолестеринемия, желчно-каменная болезнь, повреждение опорно-двигательного аппарата и тромбоэмболическое заболевание (Rissanen, Heliovaara et al. BMJ 301: 835-7, 1990).
Ожирение также является фактором риска для группы состояний, называемых синдромом инсулиновой резистентности или "синдромом X". Недавние оценки расходов на лечение ожирения и связанных расстройств составляют 150 миллиардов долларов во всем мире. Предполагается, что патогенез ожирения является многофакторным, но основная проблема состоит в том, что у субъектов с ожирением не достигается баланса между доступностью питательных веществ и затратами энергии до тех пор, пока существует избыток жировой ткани. Ожирение в настоящее время является плохо поддающимся лечению, хроническим, по существу трудноизлечимым метаболическим расстройством. Терапевтическое лекарственное средство, применимое для снижения массы людей с ожирением, может оказывать мощное целебное действие на их здоровье.
Все документы, которые упоминаются в данном описании, включены в данную заявку в виде ссылки, как будто полностью указаны в данном описании.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В противоположность сообщениям об активностях, проявляемых представителями семейства панкреатического полипептида при центральном введении, было обнаружено, что при периферическом введении агонисты PYY и PYY снижают доступность питательных веществ и применимы для лечения ожирения и родственных расстройств. В данной изобретении представлены композиции PYY и агонистов PYY и их применения для модулирования доступности питательных веществ у пациента для лечения метаболических расстройств, которые можно излечить путем снижения доступности питательных веществ. Указанные способы будут применимы, например, при лечении ожирения, диабета, включая, но не ограничивая указанным, диабет типа 2 или инсулиннезависимый диабет, расстройства питания, синдром инсулиновой резистентности и сердечно-сосудистое заболевание.
Термин "PYY" означает полипептид пептида YY, получаемый или производимый из любого вида. Таким образом, термин "PYY" включает как полноразмерный 36-аминокислотный пептид человека, указанный в SEQ ID NO: 2, так и видовые варианты PYY, включая, например, PYY мыши, хомячка, цыпленка, крупного рогатого скота, крысы и собаки. "Агонист PYY" означает любое соединение, которое вызывает эффект PYY, снижая доступность питательного вещества, например соединение (1), обладающее активностью в анализах поглощения пищи, опустошения желудка, секреции поджелудочной железы или потери массы, приведенных в данном описании в примерах 1, 2, 5 или 6, и (2), которое специфично связывается в анализе рецептора Y (пример 10) или в анализе конкурентного связывания с меченым PYY или PYY[3-36] из некоторых тканей, имеющих избыточное количество рецепторов Y, включая, например, area postrema (пример 9), при этом агонист PYY не является панкреатическим полипептидом. Предпочтительно агонисты PYY могут связываться в таких анализах с аффинностью, превышающей 1 мкМ, и более предпочтительно с аффинностью, превышающей 1-5 нМ.
Такие агонисты могут содержать полипептид, имеющий функциональный домен PYY, активный фрагмент PYY или химическую или малую молекулу. Агонисты PYY могут быть пептидными или непептидными соединениями и включают "агонистические аналоги PYY", и этот термин относится к любому соединению, сходному по структуре с PYY, которое обладает активностью обычно посредством связывания или другого прямого или непрямого взаимодействия с рецептором PYY или другим рецептором или рецепторами, с которыми может взаимодействовать сам PYY, вызывая биологический ответ. Такие соединения включают производные PYY, удлиненные молекулы PYY, имеющие более 36 аминокислот, укороченные молекулы PYY, имеющие менее 36 аминокислот, и замещенные молекулы PYY, имеющие одну или несколько других аминокислот, или любую комбинацию соединений, перечисленных выше. Такие соединения также могут быть модифицированы посредством такого способа, как амидирование, гликозилирование, ацилирование, сульфатирование, фосфорилирование, ацетилирование и циклизация.
Одним из таких агонистических аналогов PYY является PYY[3-36], идентифицированный в данном описании в виде SEQ ID NO: 3. Полипептиды с числами в скобках относятся к укороченным полипептидам, имеющим последовательность полноразмерного пептида на протяжении положений аминокислот, указанных в скобках. Таким образом, PYY[3-36] имеет последовательность, идентичную PYY на протяжении аминокислот с 3 по 36. Агонист PYY может связываться с рецептором PYY с более высокой и более низкой аффинностью, проявлять более длительное или более короткое время полужизни in vivo или in vitro, или является более эффективным или менее эффективным, чем нативный PYY.
Под термином "состояние или расстройство, которое можно облегчить посредством снижения доступности калорийных (или питательных) веществ", подразумевают любое состояние или расстройство у субъекта, которое либо вызвано, осложняется, либо обостряется относительно высокой доступностью питательных веществ, или которое можно облегчить путем снижения доступности питательных веществ, например, путем снижения потребления пищи. Такие состояния или расстройства включают, но не ограничены указанным, ожирение, диабет, включая диабет типа 2, расстройства питания и синдром инсулиновой резистентности.
В одном аспекте изобретение относится к способу лечения ожирения у субъекта с ожирением или избыточным весом путем введения терапевтически эффективного количества PYY или агониста PYY. Хотя "ожирение" обычно определяют как состояние, когда индекс массы тела превышает 30, в целях данного описания любой субъект, включая субъектов с индексом массы тела менее 30, который нуждается или хочет снизить массу тела, включен в рамки термина "ожирение". Пользу от такого способа могут получить субъекты, у которых имеется резистентность к инсулину, непереносимость глюкозы или любая форма сахарного диабета (например, диабет типа 1, 2 или диабет беременных).
В других аспектах отличительным признаком изобретения являются способы снижения потребления пищи, лечения сахарного диабета и улучшения липидного профиля (включая снижение уровней ЛНП-холестерина и триглицеридов и/или изменение уровней ЛВП-холестерина), включающие в себя введение субъекту терапевтически эффективного количества PYY или агониста PYY. В предпочтительном варианте способы согласно изобретению используют для лечения состояний или расстройств, которые можно облегчить путем снижения доступности питательных веществ у нуждающегося в этом субъекта, и способы включают введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества PYY или агониста PYY. Такие состояния и расстройства включают без ограничения гипертензию, дислипедимию, сердечно-сосудистое заболевание, расстройства питания, резистентность к инсулину, ожирение и сахарный диабет любого вида.
В способах согласно изобретению предпочтительными агонистами PYY являются агонисты, обладающие эффективностью в одном из анализов, приведенных в данном описании (предпочтительно в анализах потребления пищи, опорожнения желудка, секреции поджелудочной железы или снижения массы), которая превышает эффективность NPY в том же анализе.
При всех симптомах в предпочтительных вариантах предпочтительным агонистом PYY является PYY[3-36], и его предпочтительно вводят периферически в дозе, составляющей примерно от 1 мкг до 5 мг в сутки в виде однократной или разделенной доз, или примерно от 0,01 мкг/кг до 500 мкг/кг на дозу, более предпочтительно примерно от 0,05 мкг/кг до 250 мкг/кг, наиболее предпочтительно примерно ниже 50 мкг/кг. Дозирование в указанных пределах будет варьироваться в зависимости от эффективности каждого агониста, курса лечения и легко определяется специалистом в данной области.
В способах согласно данному изобретению PYY и агонисты PYY можно вводить отдельно или вместе с одним или несколькими другими соединениями и композициями, которые оказывают длительное или кратковременное действие, снижая доступность питательных веществ, включая, но не ограничивая указанным, другие соединения и композиции, которые содержат амилин или агонист амилина, холецистокинин (CCK) или агонист CCK, лептин (белок OB) или агонист лептина, эксендин или агонист эксендина или GLP-1 или агонист GLP-1. Подходящие агонисты амилина включают, например, [25, 28, 29 Pro-]амилин человека (также известный как "прамлинтид" и описанный в патентах США No.5686511 и 5998367) и кальцитонин лосося. Используемый CCK предпочтительно является октопептидом CCK (CCK-8). Лептин обсуждается, например, в (Pelleymounter, Cullen et al. Science 269: 540-543, 1995), (Halaas, Gajiwala et al. Science 269: 543-6, 1995) и (Campfield, Smith et al. Science 269: 546-549, 1995). Подходящие эксендины включают эксендин-3 и эксендин-4, а соединения агонистов эксендина включают, например, соединения, описанные в заявках PCT WO 99/07404, WO 99/25727 и WO 99/25728.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг.1 является графиком активности лигандов рецептора Y в анализе потребления пищи у мышей NIH/SW, голодавших в течение ночи.
Фиг.2 является графиком активности различных лигандов рецептора Y в анализе опустошения желудка у крыс HSD.
На фиг.3 показано ингибирование секреции желудочной кислоты у крыс при остром периферическом введении PYY[3-36]. Данные выражены в виде мкмоль секретированной кислоты/10 мин.
Фиг.4 является диаграммой, на которой показано, что острое периферическое введение PYY[3-36] предотвращает опустошение желчного пузыря у мышей. Указанное действие может быть обратимо при введении CCK-8.
На фиг.5 показано острое дозозависимое действие подкожно вводимого PYY[3-36], ингибирующего стимулированную CCK-8 экзокринную секрецию поджелудочной железы (анализ на основе активности амилазы) у крыс.
На фиг.6 показан сниженный прирост массы тела у мышей C57B1/6 с ожирением (ожирение, индуцированное диетой, или DIO) при непрерывной периферической инфузии PYY[3-36] в течение периода, равного четырем неделям.
На фиг.7 показано влияние непрерывной периферической инфузии PYY[3-36] на снижение эффективности калорийных веществ у мышей C57B1/6 с ожирением (ожирение, индуцированное диетой или DIO) в течение периода, равного четырем неделям.
На фиг.8 показано улучшение гликемического контроля, измеренное по изменению HbA1c в процентах в течение периода, равного 28 дням, у диабетических крыс с ожирением (ZDF) при непрерывной периферической инфузии PYY[3-36].
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Считалось общепринятым, что эндогенный NPY (обзор в (Schwartz, Woods et al. Nature 404: 661-71, 2000)) и PYY (Morley, J.E., Levine, A.S., Grace, M., and Kneip, J. Brain Res. 341: 200-203, 1985)) через свои рецепторы усиливают поведение, связанное с потреблением пищи. В способах, направленных на лечение ожирения, неизменно стремились оказать антагонистическое воздействие на рецепторы Y, тогда как заявленные способы для лечения анорексии были направлены на агонистов данного семейства лигандов. Однако, как описано и заявлено в данном изобретении, неожиданно было обнаружено, что периферическое введение PYY и его агонистов оказывает сильное воздействие, уменьшая доступность питательных веществ, а не увеличивая ее, как свидетельствуют сообщения в патентной и научной литературе (смотри, например, патенты США No.5912227 и 6315203, в которых заявлено об использовании агонистов рецепторов PYY для того, чтобы увеличить прирост массы). Спектр действий по ингибированию потребления пищи, замедлению опорожнения желудка, ингибированию секреции желудочной кислоты и ингибированию секреции ферментов поджелудочной железы полезен, обеспечивая клинические преимущества при метаболических заболеваниях, таких как сахарный диабет типа 1, типа 2 или сахарный диабет беременных, ожирение и другие проявления синдрома инсулиновой резистентности (синдрома X), и при любом другом применении для снижения доступности питательных веществ.
Применение PYY и агонистов PYY для снижения потребления пищи и доступности питательных веществ и при лечении таких расстройств, как диабет и ожирение, ранее не было заявлено. Действительно такое применение при диабете невозможно предсказать из-за отсутствия острого действия на уровень глюкозы в крови и исходя из сообщений об ингибировании секреции инсулина. Однако в данном описании показано, что группа лигандов и агонистических лигандов будет пригодна при таких состояниях и родственных состояниях.
Данные заявителя свидетельствуют о том, что эффекты периферически введенного PYY или PYY[3-36] в снижении потребления пищи и замедлении опустошения желудка определяются взаимодействием с одним или несколькими уникальными классами рецепторов семейства рецепторов с Y-упаковкой или сходных с ними рецепторов. Эти данные лучше всего объяснимы за счет взаимодействий с рецептором или рецепторами, подобными PYY-предпочитающим (или Y7) рецепторам, и хуже объяснимы за счет взаимодействий с другими известными рецепторами Y, такими как Y1-Y6. В таблице 1 (ниже) показаны опубликованные данные об эффективности лигандов семейства PP для известных рецепторов, а также некоторые неопубликованные данные заявителя и порядок ранжирования эффективности различных лигандов. Порядок ранжирования эффективности в приведенных в данном описании примерах не соответствует ни одним опубликованным фармакологическим данным о рецепторах и свидетельствует о новом механизме действия PYY в снижении доступности калорийных веществ.
В данном изобретении можно использовать любой PYY или агонист PYY. Предпочтительные агонисты PYY включают пептидные агонисты, в частности агонистические аналоги PYY, такие как PYY[3-36]. Аналоги, например, можно получить с помощью консервативной аминокислотной замены в последовательности PYY или ее части, и можно проверить в анализах, приведенных в примерах, или других подходящих анализах, которые отличают действия PYY от действия NPY или PP. Также предполагаются непептидные агонисты.
Спектр действий, проявляемых PYY, например, ингибирование потребления пищи, замедление опустошения желудка, ингибирование секреции желудочной кислоты и ингибирование секреции ферментов поджелудочной железы и т.д., осуществляется согласованно, ограничивая усвоение пищи и тем самым обеспечивая клиническое преимущество при таких метаболических заболеваниях, как сахарный диабет, ожирение, сердечно-сосудистое заболевание (атеросклероз, гипертензия, дислипидемия и т.д.) и проявления синдрома инсулиновой резистентности (например, синдрома X).
Последовательности пептидов человека в семействе лигандов PP, упоминаемых в данном описании, представляют собой следующие последовательности (указаны с помощью обычного однобуквенного кода аминокислот):
PP: APLEPVYPGDNATPEQMAQYAADLRRYINMLTRPRY (SEQ ID NO: 1)
PYY: YPIKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY (SEQ ID NO: 2)
PYY[3-36]: IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY (SEQ ID NO: 3)
NPY: YPSKPDNPGEDAPAEDMARYYSALRHYINLITRQRY (SEQ ID NO: 4)
Указанные пептиды амидируются на С-конце при физиологической экспрессии, но не нуждаются в амидировании в целях данного изобретения. Указанные пептиды также могут иметь другие посттрансляционные модификации.
PYY и агонисты на основе пептида PYY, представленные в данном описании, можно получить стандартными способами рекомбинантной экспрессии или химического синтеза пептидов, известными в данной области, например, с использованием автоматического или полуавтоматического синтезатора пептидов.
Твердофазный синтез пептидов можно проводить с помощью автоматического синтезатора пептидов (например, модель 430A, Applied Biosystems Inc., Foster City, CA), используя систему NMP/HOBt (вариант 1) и химию на основе tBoc или Fmoc (смотри, Applied Biosystems User's Manual for the ABI 430A Peptide Synthesizer, Version 1.3B July 1, 1988, section 6, pp.49-70, Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) и кэпирование. Пептиды также можно синтезировать с использованием синтезатора Advanced Chem Tech (модель MPS 350, Louisville, Kentucky). Пептиды можно очищать ОФ-ВЭЖХ (препаративной или аналитической), используя, например, систему Waters Delta Prep 3000 и препаративную колонку C4, C8 или C18 (10 мк, 2,2×25 см; Vydac, Hesperia, CA).
Пептидные соединения, применимые в изобретении, также можно получить с применением технологии рекомбинантной ДНК, используя способы, известные в данной области. Смотри, например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor (1989). Непептидные соединения, применимые в данном изобретении, можно получить известными в данной области способами. Например, можно получить содержащие фосфат аминокислоты и пептиды, содержащие такие аминокислоты, используя способы, известные в данной области. Смотри, например, Bartlett and Landen, Biorg. Chem. 14: 356-377 (1986).
Описанные выше соединения полезны с точки зрения их фармакологических свойств. В частности, соединения согласно изобретению обладают активностью в качестве агентов, снижающих доступность питательных веществ, включая уменьшение потребления пищи.
Композиции или фармацевтические композиции можно вводить любым путем, включая внутривенный, внутрибрюшинный, подкожный и внутримышечный путь, можно вводить перорально, местно, через слизистую оболочку или путем ингаляции легких. Композиции, применимые в изобретении, удобно поставлять в форме композиций, подходящих для парентерального (включая внутривенное, внутримышечное и подкожное), назального или перорального введения. В некоторых случаях удобно поставлять PYY или агонист PYY и другой агент, снижающий потребление пищи, снижающий уровень глюкозы в крови или изменяющий липидный состав плазмы, такой как амилин, агонист амилина, CCK или агонист CCK, или лептин или агонист лептина, или эксендин или агонист эксендина, в одной композиции или растворе для совместного введения. В других случаях предпочтительным может быть введение дополнительного агента отдельно от указанного PYY или агониста PYY.
Подходящую форму введения индивидуально для каждого пациента лучше всего может определить лечащий врач. Различные фармацевтически приемлемые носители и их композиции описаны в стандартных учебных пособиях по составлению композиций, например, Remington's Pharmaceutical Sciences, E.W.Martin. Смотри также Wang, Y.J. and Hanson, M.A. "Parenteral Formulations of Proteins and Peptides: Stability and Stabilizers," Journal of Parenteral Science and Technology, Technical Report No.10, Supp. 42: 2S (1988).
Соединения, применимые в изобретении, можно поставлять в виде парентеральных композиций, например, для инъекции или инфузии. Предпочтительно их суспендируют в водном носителе, например в изотоничном буферном растворе, при pH примерно от 3,0 до 8,0, предпочтительно при pH примерно от 3,5 до 7,4, от 3,5 до 6,0 или от 3,5 до примерно 5,0. Пригодные буферы включают буферы: цитрат натрия-лимонная кислота и фосфат натрия-фосфорная кислота и ацетат натрия-уксусная кислота. Форму препарата длительного действия или препарата замедленного высвобождения из "депо" можно использовать для того, чтобы терапевтически эффективные количества препарата доставлять в кровяное русло в течение многих часов или дней после трансдермальной инъекции или доставки.
Так как продукты согласно изобретению являются амфотерными, их можно использовать в виде свободных оснований, в виде кислотно-аддитивных солей или в виде солей металлов. Конечно соли должны быть фармацевтически приемлемыми, и они будут включать соли металлов, в частности соли щелочных и щелочноземельных металлов, например соли калия или натрия. Доступно широкое множество фармацевтически приемлемых кислотно-аддитивных солей. Такие продукты легко получают способами, хорошо известными специалистам в данной области.
Для применения врачом композиции будут предоставлены в дозированной лекарственной форме, содержащей некоторое количество PYY или агониста PYY в присутствии или без другого активного ингредиента, например агента, уменьшающего потребление пищи, снижающего уровень глюкозы в плазме или изменяющего липидный состав плазмы. Терапевтически эффективными количествами PYY или агониста PYY для применения в снижении доступности питательных веществ являются количества, которые подавляют аппетит до требуемого уровня. Как будет понятно специалистам в данной области, эффективное количество терапевтического средства будет варьироваться в зависимости от многих факторов, включая возраст и массу пациента, физическое состояние пациента, уровень сахара в крови, уровень массы, который необходимо получить, и других факторов.
Эффективная суточная подавляющая аппетит доза соединений обычно будет в пределах примерно от 1-30 мкг до примерно 5 мг/сутки, предпочтительно примерно от 10-30 мкг до 2 мг/сутки и более предпочтительно примерно от 5-100 мкг до 1 мг/сутки, наиболее предпочтительно примерно от 5 мкг до 500 мкг/сутки для пациента массой 50 кг при введении в виде однократной или разделенных доз. Предпочтительно дозы составляют примерно от 0,01 до 100 мкг/кг/дозу. Точную дозу, которую необходимо ввести, легко определит специалист в данной области, и она зависит от эффективности конкретного соединения, а также от возраста, массы и состояния индивидуума. Введение следует начинать всякий раз, когда требуется подавление доступности питательных веществ, потребления пищи, массы, понижение уровня глюкозы в крови или содержания липидов в плазме, например, при первом признаке симптомов или сразу после диагностирования ожирения, сахарного диабета или синдрома инсулиновой резистентности. Введение можно осуществлять любым путем, например, инъекцией, предпочтительно подкожной или внутримышечной, пероральным, назальным, трансдермальным и т.д. путями. Дозы при некоторых путях введения, например для перорального введения, должны быть увеличены, принимая во внимание пониженную биодоступность, например, примерно в 5-100 раз.
Оптимальная лекарственная форма и способ введения соединений согласно данной заявке пациенту зависят от факторов, известных в данной области, таких как конкретное заболевание или расстройство, требуемый эффект и тип пациента. Хотя, как правило, соединения будут использованы для лечения людей, их также можно использовать для лечения сходных или идентичных заболеваний у других позвоночных, таких как другие приматы, сельскохозяйственных животных, таких как свинья, корова и домашняя птица, и спортивных животных и домашних животных, таких как лошади, собаки и кошки.
Скрининг дополнительных агонистов PYY
Другие агонисты PYY можно идентифицировать с использованием анализов связывания с рецептором, описанных ниже (например, в примерах 9 и 10) или известных в данной области в комбинации с физиологическими скрининговыми исследованиями, описанными в примерах далее. Потенциальные агонисты PYY можно сравнить по активности с PYY или PYY[3-36].
Альтернативно, после того как охарактеризован и клонирован один или несколько PYY-предпочитающих (Y7) рецепторов, можно выполнить альтернативные анализы и высокопроизводительные скрининги, которые обсуждаются ниже или известны в данной области. Рецепторами Y7 являются рецепторы с аффинностью по отношению к PYY или PYY[3-36] выше, чем их аффинность по отношению к NPY. Способы скрининга соединений, которые модулируют активность рецептора PYY, включают в себя осуществление контакта тестируемых соединений с рецепторами PYY и анализ на наличие комплекса между соединением и рецепторами PYY. В таких анализах тестируемый лиганд обычно метят. После соответствующей инкубации свободный лиганд отделяют от лиганда, присутствующего в связанной форме, и количество свободной или не вошедшей в комплекс метки является мерой способности конкретного соединения связываться с рецепторами PYY. Альтернативно, можно измерить связанный меченый лиганд (например, используя экспрессированные связанные с мембраной рецепторы Y7).
В другом варианте изобретения применяют высокопроизводительный скрининг соединений, обладающих подходящей аффинностью связывания по отношению к рецепторам PYY. Например, на твердом субстрате синтезируют большое количество различных небольших пептидных тестируемых соединений. Осуществляют контакт тестируемых пептидных соединений с рецептором PYY и промывают. Затем связанный рецептор PYY регистрируют способами, хорошо известными в данной области. Очищенными тестируемыми соединениями также можно непосредственно покрыть планшеты для использования в вышеуказанных способах скрининга лекарственных средств. Кроме того, если тестируемые соединения являются белками, можно использовать антитела, чтобы захватить белок и иммобилизовать его на твердом носителе любыми способами, известными в данной области.
Другие варианты изобретения включают в себя использование анализов конкурентного скрининга, при котором нейтрализующие антитела, способные специфично связывать полипептид согласно изобретению, конкурируют с тестируемым соединением за связывание с полипептидом. Таким образом, антитела можно использовать для выявления присутствия любого пептида, который имеет один или несколько общих антигенных детерминант с агонистом PYY. Исследования конкурентного связывания с радиоактивным мечением описаны в A.H.Lin et al. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1997, vol.41, no.10. pp.2127-2131, описание которой включено в данное описание в виде ссылки в полном объеме.
Для облегчения понимания данного изобретения в описание включены следующие примеры. Конечно, эксперименты, имеющие отношение к данному изобретению, не следует рассматривать, как специально ограничивающие изобретение, и считают, что такие варианты изобретения, известные в настоящее время или разработанные позднее, которые могут быть в компетенции специалиста в данной области, входят в объем изобретения, которое представлено в данном описании и следующей далее формуле изобретения.
ПРИМЕРЫ
В описанных далее экспериментах в различных анализах использовали представителей семейства лигандов PP. Если не оговорено особо, все тестируемые пептидные соединения растворяли в физиологическом растворе до концентрации 1-5 мг/мл без измерения pH. Во всех случаях препараты были прозрачными на глаз перед введением.
Пример 1: Активность лигандов рецептора Y, влияющая на потребление пищи у голодавших в течение ночи мышей NIH/SW
Самок мышей NIH/Swiss (8-12-недельного возраста) содержали в группах в условиях цикла свет:темнота 12:12 с началом светового периода в 06-00. Воду и стандартный гранулированный корм для мышей был свободно доступен, кроме указанных случаев. Животные подвергали голоду и содержали отдельно, начиная примерно с 15-00 час за 1 день до эксперимента. Утром в день эксперимента (примерно в 06-30), всех животных взвешивали и разделяли на экспериментальные группы так, чтобы получить наиболее сходное распределение по массе между группами. В типичном исследовании n=10 для контрольной группы и, по меньшей мере, 5 для каждой группы обработки.
Во временной точке = 0 мин всем животным вводили внутрибрюшинную инъекцию носителя или соединения в объеме 5 мл/кг и сразу же давали предварительно взвешенное количество (10-15 г) стандартного корма. Вводили возрастающие дозы PYY[3-36] или PYY (от 0,1 мкг/кг до 500 мкг/кг) и NPY (100 и 500 мкг/кг) и однократные высокие дозы NPY[3-36] (100 мкг/кг), ацетилированного на N-конце Ac-PYY[22-36] (200 мкг/кг) и PP (500 мкг/кг), как показано на фиг.1. Пищу убирали и взвешивали в точке 1 час, чтобы определить количество потребленного корма (Morley, Flood et al. Am. J. Physiol. 267: R178-R184, 1994).
Анализы:
Потребление пищи рассчитывали вычитанием массы оставшейся пищи через один час из массы пищи, которую давали исходно во временной точке = 0. Влияние обработки на потребление пищи выражали в виде % изменения относительно контроля.
Значимые эффекты обработки идентифицировали с помощью ANOVA (p<0,05). В том случае, если существовали значимые различия, средние значения в тесте сравнивали со средним значением в контроле, используя тест Даннета (Prism v2.01, GraphPad Software Inc., San Diego, CA).
Результаты:
Как видно на фиг.1, PYY при периферическом введении (внутрибрюшинная инъекция) в дозах 10, 100 и 500 мкг/кг в значительной степени снижал потребление пищи, измеренное на протяжении 60 мин у самок мышей NIH/SW, голодавших в течение ночи. Указанные дозы PYY[3-36] имели приблизительно равную эффективность. Для PP и NPY тенденция к проявлению к активности наблюдалась при 500 мкг/кг. Но NPY и NPY[3-36] [SEQ ID NO: 5] были неактивными при 100 мкг/кг. Ac-PYY [22-36] [SEQ ID NO: 6] при 200 мкг/кг также был неактивным. Порядок ранжирования по эффективности был следующим: PYY[3-36]PYY≫NPY=NPY[3-36]=PP=Ac-PYY[22-36]. Порядок ранжирования и, в частности, отсутствие влияния NPY не отражает фармакологии ни одного из известных клонированных рецепторов.
Сообщалось, что PP при периферическом введении снижает потребление пищи (Asakawa, Inui et al. Peptides 20: 1445-8, 1999). Кроме того, по имеющимся сообщениям PP при периферическом введении мышам с ожирением снижал потребление пищи и прирост массы тела (Malaisse-Lagae, Carpentier et al. Experientia 33: 915-7, 1977). Сообщается, что мыши ob/ob гиперчувствительны к нескольким анорексигенам (Young and Bhavsar. Program and Abstracts, 10th International Congress of Endocrinology 419 (poster P2-58), 1996). Сообщалось, что у мышей, сверхэкспрессирующих PP, снижена масса тела и потребление пищи (Ueno, Inui et al. Gastroenterology 117: 1427-32, 1999). Заявители не могли снизить потребление пищи с помощью PP в тест-системе, указанной на фиг.1. Исследования Asakawa с соавторами представляли собой острые исследования при однократной инъекции, и не были представлены данные об изменении массы тела. Хотя в исследовании на трансгенных мышах PP (Ueno et al., Gastroenterology 117: 1427-32, 1999) заявлено, что показана сниженная масса тела и сниженное потребление пищи у сверхэкспрессирующих животных, половина животных погибла в перинатальном периоде, что может являться сигналом патофизиологии, кроме прямого объяснения сниженного потребления молока, приводящего к голоданию. Кроме того, система экспрессии генов не является специфичной для поджелудочной железы, а пептид экспрессируется в головном мозге, что создает помехи для какой-либо интерпретации данных по сверхэкспрессии. Ueno с соавторами на основании полученных ими данных пришли к выводу, что PP может быть вовлечен в регуляцию потребления пищи и массы тела в некоторой степени посредством регуляции GE, но данные, полученные в примерах 1 и 2 (ниже), показывают, что PP оказывает небольшое или не оказывает влияния на потребление пищи и по существу неактивен в замедлении опорожнения желудка. Важно, что PP только на 50% гомологичен PYY (или NPY), имеет другую первичную локализацию в тканях (поджелудочная железа, а не L-клетки кишечника и не нейроны) и явное предпочтение по отношению к рецептору Y4 по сравнению с Y1 и Y2. NPY, который на 70% гомологичен PYY, является сильнодействующим орексигеном при центральном введении. Он дает только умеренное снижение потребления пищи и полностью неактивен в анализе опорожнения желудка в примере 2 (ниже) при периферическом введении.
Пример 2: Активность пептидных лигандов Y, связанная с опорожнением желудка у крыс HSD
Самцов крыс HSD, 180-215 г, содержали в условиях цикла свет:темнота 12:12 и подвергали голоду в течение 20 час (в течение ночи). Во временной точке = 0 мин тестируемый пептид (PYY[3-36], PYY, Ac-PYY[22-36], NPY, NPY[3-36] или PP) или носитель в виде физиологического раствора инъецировали (внутрибрюшинно) крысам, находящимся в сознании (n=6/группу). При t=1 мин крыс, находящихся в сознании, через ротоглоточную трубку кормили 1 мл раствора стерильной воды, содержащей 5 мкКюри 3H-3-O-метилглюкозы. Образцы крови (10 мкл) собирали через 40 мин после кормления и анализировали радиоактивность в импульсах в минутах (CPM) в плазме. Чтобы обезболить при взятии пробы из хвостовой вены, инъецировали 2% лидокаин (0,1 мл) на расстоянии 3-4 см от кончика хвоста (Gedulin, Jodka et al. Gastroenterology 108: A604, 1995).
Анализ данных:
Эффекты тестируемого соединения выражали в виде изменения в процентах относительно контроля, которое рассчитывали как - 100*(1-(среднее значение у крыс в тесте/среднее значение контролей)).
Относительную активность определяли как значимую, если p<0,05 при определении с помощью ANOVA. В том случае, если имело место значимое различие, средние значения в тесте сравнивали со средним значением в контроле, используя тест Даннета (Prism v2.01, GraphPad Software Inc., San Diego, CA).
Результаты:
Как видно на фиг.2, PYY[3-36] при периферическом введении (внутрибрюшинная инъекция) в дозах, превышающих или равных 10 мкг/кг, значимо и зависимым от дозы образом снижал опустошение желудка, измеренное во временной точке 40 минут у крыс HSD. PYY при 100 и 500 мкг/кг также был эффективным. Напротив, NPY, NPY[3-36] или PP, инъецированные в дозе 500 мкг/кг, и Ac-PYY[22-36] в дозе 200 мкг/кг были неактивными. Порядок эффективности тестируемых соединений представляет собой следующее: PYY[3-36]PYY≫NPY=NPY[3-36]=PP=Ac-PYY[22-36]. Указанный профиль эффективности сходен с профилем, наблюдаемым в случае потребления пищи (фиг.1). Отсутствие эффекта NPY не отражает фармакологии ни одного из известных клонированных рецепторов. Важно, что Ac-PYY[22-36] был неактивным в обоих анализах, хотя Balasubramanian с соавторами, патент США 5604203, сообщали, что указанный субпептид является лигандом как для рецепторов PYY кишечника, так и для рецептора Y2.
Пример 3: Острое периферическое введение PYY[3-36] ингибирует секрецию желудочной кислоты у крыс
Самцов крыс Harlan Sprague Dawley содержали в условиях цикла свет:темнота 12:12. Все эксперименты проводили во время световой фазы цикла. Животные голодали примерно в течение 20 часов до проведения эксперимента, но имели свободный доступ к воде вплоть до начала эксперимента.
Крысам (11-16-недельного возраста с массой тела 291-365 г) хирургическим путем устанавливали фистулу желудка (Kato, Martinez et al. Peptides 16: 1257-1262, 1995). Крыс, голодавших в течение ночи, взвешивали и их желудочные фистулы открывали и прикрепляли к гибкой трубке Tygon (3/8×1/16), в которую вставляли кусочек трубки PE205, которая могла проходить внутрь желудка. Через более узкую трубку PE205 инъецировали физиологический раствор, а оттекающую жидкость собирали из трубки Tygon. Чтобы обеспечить надлежащий поток через фистулу и опустошение желудка, желудок несколько раз промывали ˜5 мл физиологического раствора комнатной температуры вплоть до того, как протекание становилось свободным, а оттекающая жидкость прозрачной. Секрецию желудочной кислоты измеряли с 10 минутными интервалами посредством инъекции 5 мл физиологического раствора с последующей инъекцией 3 мл воздуха и сбором оттекающей жидкости. 3 мл из каждого желудочного аспирата титровали до pH 7,0 с помощью 0,01 N гидроксида натрия, используя pH-метр. Необходимое количество основания, скорректированное относительно общего собранного объема, использовали для расчета молей кислоты в каждом образце.
После сбора образца исходного уровня и регистрации извлеченного объема животным вводили подкожную инъекцию 125 мкг/кг пентагастрина, чтобы стимулировать секрецию желудка. Пробы на секрецию желудочной кислоты отбирали каждые 10 минут. Через сорок минут после инъекции пентагастрина животные получали подкожную инъекцию 100 мкг/кг PYY[3-36] или физиологического раствора, и отбор проб на секрецию желудка продолжали каждые 10 минут всего в течение 2 час. Данные выражены в мкмоль кислоты, секретированной за 10-минутный интервал отбора проб (среднее ± SEM, n=4/группу).
Результаты:
На фиг.3 показано, что PYY[3-36] при остром введении посредством периферической (внутрибрюшинной) инъекции (100 г/кг) ингибировал стимулированную пентагастрином секрецию желудочной кислоты у крыс. ЭД50 для указанного эффекта составляла ˜20 мкг/кг.
Пример 4: Острое периферическое введение PYY[3-36] предотвращает опорожнение желчного пузыря у мышей, обратимое CCK-8
Мышей содержали в помещении в условиях цикла свет:темнота 12:12 со свободным доступом к воде и кормили вплоть до начала эксперимента. При t=0 мыши получали подкожную инъекцию 1, 10, 100 или 1000 мкг/кг PYY[3-36], 1 или 10 мкг/кг CCK-8, оба вещества или физиологический раствор (обработка и n/группу, как показано на фиг.4). Через тридцать минут животных анестезировали и извлекали их интактные желчные пузыри и взвешивали.
Анализ:
Данные выражены в виде массы органа в мг. Активность определяли как изменение по сравнению со средним значением в контрольной группе. Статистическую значимость определяли как p<0,05 с помощью ANOVA и/или теста Даннета.
Результаты:
Как видно на фиг.4, PYY[3-36] при введении с помощью острой периферической инъекции в дозах, превышающих или равных 10 мкг/кг, предотвращал опорожнение желчного пузыря у мышей. Указанное ингибирование опорожнения имело ЭД50 ˜ 31 мкг/кг и его можно было отменить с помощью CCK-8 даже при самых высоких тестированных дозах PYY[3-36].
Пример 5: Острое периферическое введение PYY[3-36] ингибирует стимулированную CCK-8 экзокринную секрецию поджелудочной железы (амилазы) у крыс
Самцов крыс Harlan Sprague Dawley содержали в условиях цикла свет:темнота 12:12. Все эксперименты выполняли в течение световой фазы цикла. Животные голодали примерно в течение 20 часов перед проведением эксперимента, но получали свободный доступ к воде вплоть до начала эксперимента.
Крыс анестезировали 5% галотаном, во время хирургической операции поддерживали анестезию 2% галотаном и после этого 1% галотаном. Проводили трахеотомию и введение канюли в правую бедренную артерию и температуру тела контролировали с помощью терморегулятора, который включал и выключал подогреваемый операционный стол. Систему для внутрисосудистого вливания в бедренную артерию, используемую для отбора проб крови, перфузировали гепаринизированным физиологическим раствором (2U/мл) и соединяли с датчиком давления для регистрации кровяного давления. Через надрез по средней линии в объединенный желчный проток - проток поджелудочной железы вставляли две полиэтиленовые канюли в точке примерно на 0,5 см выше того места, где проток входит в поджелудочную железу. Первую канюлю вставляли по направлению к печени, чтобы собрать желчь. Другой конец этой канюли помещали в двенадцатиперстную кишку через небольшой разрез в двенадцатиперстной кишке. Таким образом, желчь протекала непосредственно из печени в тонкий кишечник, при этом происходило полное шунтирование поджелудочной железы. Вторая полиэтиленовая канюля, вставленная в объединенный желчный проток - проток поджелудочной железы рядом с первой, была направлена к поджелудочной железе, чтобы собрать поджелудочный сок. На проток поджелудочной железы накладывали лигатуру при его вхождении в двенадцатиперстную кишку, вынуждая секретируемый поджелудочный сок стекать в канюлю для сбора.
Поджелудочный сок собирали с 15-минутными интервалами от t=-15 до +60 мин. Объем поджелудочного сока (измеренный по массе) и активности амилазы определяли в аликвотах, отбираемых каждые 15 минут (Taniguchi, Yazaki et al. Eur. J. Pharmacol. 312: 227-33, 1996). Поджелудочный сок перед анализом разбавляли 1:2000. Секрецию фермента выражали в единицах за 15 мин, получаемых умножением активности на собранный объем (Taniguchi, H., Yazaki, N., Yomota, E., Shikano, T., Endo, T., and Nagasaki, M. Eur. J. Pharmacol. 312: 227-33, 1996).
Статистический анализ:
Парные статистические анализы выполняли, используя t-критерий Стьюдента; множественные сравнения с контролем с использованием теста Даннета; общие эффекты тестировали с помощью однофакторного ANOVA. Результаты представлены в виде средней ± стандартная ошибка средней. В качестве уровня значимости используют P<0,05.
Результаты:
На фиг.5 показано, что PYY[3-36] при введении с помощью острой периферической (подкожной) инъекции в дозе 30 мкг/кг блокировал стимулируемую CCK-8 секрецию поджелудочной железы у крыс, которую измеряли по активности амилазы в поджелудочном соке. В отсутствии CCK-8, PYY[3-36] в дозе 300 мкг/кг не оказывал влияния на исходную активность амилазы при сравнении с контролями, в которых инъецировали физиологический раствор.
Пример 6: Непрерывная периферическая инфузия PYY[3-36] снижает прирост массы тела у мышей C57B1/6 с ожирением (DIO)
Самцов мышей C57B1/6 (4-недельного возраста в начале исследования) кормили кормом с высоким содержанием жира (HF; 58% ккал в пище в виде жира) или с низким содержанием жира (LF; 11% ккал в пище в виде жира). Через 7 недель кормления каждой мыши имплантировали осмотический насос (Alzet №2004), с помощью которого непрерывно доставляли указанную на фиг.6 дозу PYY[3-36] (30, 100, 300 или 1000 мкг/кг/сутки) в течение 4 недель. Еженедельно измеряли массу тела и потребление пищи (Surwit, Feinglos et al. Metabolism-Clinical and Experimental 44: 645-651, 1995).
Анализ данных:
Влияние тестируемого соединения выражали в виде средней ± sd изменения в граммах от исходной массы, по меньшей мере, для 14 мышей на группу обработки (p<0,05 ANOVA, тест Даннета (Prism v2.01, GraphPad Software Inc., San Diego, CA)).
Результаты:
На фиг.6 показано, что PYY[3-36] при введении посредством непрерывной периферической инфузии вызывал связанное с дозой снижение прироста массы тела у мышей с ожирением, индуцированным диетой (DIO). Эффекты были значимыми при дозе 300 мкг/кг/сутки в течение первых 3 недель и во всех временных точках в случае дозы 1000 мкг/кг/сутки.
Пример 7: Непрерывная периферическая инфузия PYY[3-36] снижает эффективную калорийность пищи у мышей C57B1/6 с ожирением (DIO)
Самцов мышей C57B1/6 (4-недельного возраста в начале исследования) кормили кормом с высоким содержанием жира (HF; 58% ккал в пище в виде жира) или с низким содержанием жира (LF; 11% ккал в пище в виде жира). Через 7 недель кормления каждой мыши имплантировали осмотический насос (Alzet №2004), с помощью которого непрерывно доставляли указанную на фиг.6 дозу PYY[3-36] (30, 100, 300 или 1000 мкг/кг/сутки) в течение 4 недель. Еженедельно измеряли массу тела и потребление пищи (Surwit, Feinglos et al. Metabolism-Clinical and Experimental 44: 645-651, 1995).
Анализ:
Влияние тестируемого соединения выражали в виде изменения массы тела в граммах от исходной массы относительно потребленных ккал. Потребленные ккал рассчитывали умножением массы потребленной пищи (г) на плотность калорий (ккал/г), указанную производителем. Обратите внимание, что указанные данные получены для животных, используемых в примере 3.
Активность определяли, как изменение средней ± sd при n, составляющем, по меньшей мере, 14 мышей/группу. Значимость определяли как p<0,05 в ANOVA или в тесте Даннета.
Результаты:
На фиг.7 показано, что PYY[3-36] при субхроническом введении посредством непрерывной периферической инфузии вызывал связанное с дозой снижение эффективности калорийных веществ (измеренной как прирост массы тела/потребленные ккал) у мышей с ожирением, индуцированным диетой (DIO). Эффекты были значимыми во всех временных точках в случае дозы 1000 мкг/кг/сутки и в некоторых временных точках при дозе 300 мкг/кг/сутки.
Пример 8: Непрерывная периферическая инфузия PYY[3-36] в течение 28 дней улучшает гликемический контроль у диабетических крыс с ожирением (ZDF)
Диабетических крыс Zucker с (ZDF) (7-недельного возраста) содержали в помещении в условиях цикла свет:темнота 12:12 и они имели свободный доступ к корму для грызунов с высоким содержанием жира и воде. После акклиматизации в течение 1 недели отбирали образцы крови и животных сортировали по исходному уровню HbA1c, чтобы обеспечить сходные пределы в каждой группе обработки.
Животным имплантировали осмотические насосы, с помощью которых непрерывно периферически доставляли указанные на фиг.8 дозы PYY[3-36] или физиологический раствор в течение 28 дней. HbA1c измеряли с недельными интервалами. Уровни HbA1c (%) откладывали на графике против времени (Brown, Henke et al. Diabetes 48: 1415-24, 1999).
Результаты:
Как показано на фиг.8, PYY[3-36] при непрерывном введении посредством периферической инфузии диабетическим крысам Zucker с ожирением (ZDF) приводил к зависимому от дозы улучшению долговременной регуляции уровня глюкозы в крови, измеряемого по уровню HbA1c. Степень улучшения гликемического контроля возрастала на протяжении периода обработки и была значимой при всех дозах PYY[3-36] на 28 день.
Приведенные выше примеры являются прямым свидетельством того, что агонисты PYY применимы для снижения доступности калорийных веществ и их можно использовать в качестве терапевтических средств для лечения состояний, при которых полезно снижение доступности калорийных веществ, таких как ожирение и диабет типа 2. Кроме того, примеры показывают, что эффекты агонистов PYY в снижении доступности калорийных веществ могут проявляться посредством нескольких механизмов и являются основой для идентификации агониста PYY. Так как сообщалось, что PYY и NPY являются равносильными и в равной мере эффективными во всех исследованиях в анализах рецепторов Y1 и Y2, данные в примерах 1 и 2, приведенных выше, свидетельствуют о том, что эффекты PYY и агонистов в снижении потребления пищи (фиг.1) и замедлении опустошения желудка (фиг.2) не опосредованы рецепторами Y1 или Y2. Полученные данные показывают, что эффекты PYY на потребление пищи и опустошение желудка нельзя сопоставить с сообщенными эффектами на рецепторы Y1 и Y2, так как NPY проявлял незначительную активность или не проявлял активности в указанных анализах.
Фиг.1 иллюстрирует один аспект изобретения. Известно, что центральное введение агониста PYY или NPY увеличивает потребление пищи (Clark, Kalra et al. Endocrinology 115: 427-9, 1984; Clark, Sahu et al. Regul. Pept. 17: 31-9, 1987). Неожиданно заявители обнаружили, что периферическое введение PYY или PYY[3-36] эффективно снижает потребление пищи. Заявители документально подтвердили, что PYY[3-36] снижал потребление пищи в долговременных исследованиях в других моделях на грызунах, включая мышь ob/ob и крысу fa/fa, результаты не представлены в данном описании. При периферическом введении другие представители семейства PP оказывают незначительное влияние или не влияют на потребление пищи. Порядок эффективности и, в частности, отсутствие влияния NPY не отражает фармакологические свойства ни одного из известных клонированных рецепторов Y. Уникальная фармакология агонистов PYY далее доказана на основе их эффективного воздействия, заключающегося в замедлении опорожнения желудка, по сравнению с другими представителями семейства PP, которые не активны в данном анализе (смотри, например, данные на фиг.2).
Характеристика PYY-агониста PYY[3-36] свидетельствует о дополнительных механизмах, которые могут снижать доступность калорийных веществ. Механизмы включают сниженную секрецию желудочной кислоты (фиг.3), сниженную экзокринную секрецию поджелудочной железы (фиг.5) и замедленное опорожнение желчного пузыря (фиг.4). Не связывая изобретение с какой-либо теорией, заявители выдвинули гипотезу о том, что указанный полный спектр воздействий на потребление пищи и функционирование желудочно-кишечного тракта способствует применимости агонистов PYY для снижения доступности калорийных веществ. Например, по имеющимся сообщениям PYY и PYY[3-36] ингибировали вагально стимулированную выработку желудочной кислоты у кроликов (Lloyd, Grandt et al. Am. J. Physiol. 270: G123-G127, 1996). PYY также ингибировал стимулированную пентагастрином секрецию желудочной кислоты у людей (Adrian, Ferri et al. Gastroenterology 89: 1070-7, 1985) и крыс (Greeley, Guo et al. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 189: 325-8, 1988) и индуцированную CRF секрецию желудочной кислоты у крыс (Gue, Junien et al. Br. J. Pharmacol. 118: 237-42, 1996). Также сообщалось, что PYY (Yoshinaga, Mochizuki et al. Am. J. Physiol. 263: G695-701, 1992), (Guan, Maouyo, et al. Endocrinology 128: 911-6, 1991), (Pappas, Debas et al. Am. J. Physiol. 248: G118-23, 1985) и PYY[3-36] (Deng, Guarita et al. Dig. Dis. Sci. 46: 156-65, 2001) ингибируют секрецию ферментов поджелудочной железы. Недавно сообщалось, что у людей в норме PPY снижает зависимую от головного мозга, но CCK-зависимую фазу опустошения желчного пузыря (Hoentjen, Hopman et al. Scand. J. Gastroenterol. 35: 166-71, 2000).
Заявители предположили, что агонист PYY посредством идентифицированных в данном исследовании механизмов будет снижать массу тела. Заявители в нескольких моделях ожирения у грызунов установили, что периферическое введение PYY[3-36] вызывает дозозависимое снижение массы тела и/или скорости прироста массы. В данном описании заявители показали действие в модели у мышей с ожирением, индуцированным диетой (DIO) (фиг.6).
Кроме того, как суммарно представлено на фиг.1, периферическое введение агониста PYY снижает потребление пищи. На основании расчета прироста массы тела на потребленную ккал в исследовании мышей DIO, очевидно, что периферическое введение агониста PYY снижает эффективность, с которой калории "превращаются" в массу тела (фиг.7). Таким образом, представленные примеры подтверждают действие агонистов PYY, выраженное в снижении прироста массы тела в связи с пониженной доступностью калорийных веществ.
В частности, PYY и агонисты PYY применимы для лечения заболеваний, при которых полезным будет снижение доступности калорийных веществ, таких как ожирение, диабет типа 2 и сердечно-сосудистое заболевание. Заявители исследовали антидиабетические активности PYY[3-36] у грызуна с диабетом и ожирением крысы ZDF. Периферическое введение агониста PYY вызывает значимое, сильное и связанное с дозой улучшение гликемического контроля, которое измеряли по уровням гемоглобина A1с (фиг.8). Хотя это и не представлено в примере, потребление пищи также снижалось при введении PYY[3-36].
Пример 9: Анализ area postrema.
Сообщалось, что PYY при периферическом введении активирует нейроны в area postrema (Bonaz, Taylor et al. Neurosci. Lett. 163: 77-80, 1993). Оценку агонистической активности PYY потенциальных соединений согласно изобретению можно осуществить, используя анализ area postrema, как изложено ниже, в комбинации с анализом влияния PYY, например анализами в примерах 1 и 2.
Приготовление мембран
В данном анализе мембраны area postrema готовили из ткани, полученной рассечением ствола головного мозга свиньи или коровы. Приготовление мембран area postrema начинали кратковременной (4-10 секунд) гомогенизацией тканей с использованием гомогенизатора тканей Polytron (Brinkman Instruments, NY) при температурах, получаемых при охлаждении льдом, в буферном растворе, таком как фосфатно-солевой буфер (138 мМ NaCl, 8,1 мМ Na2PO4, 2,5 мМ KCl, 1,2 мМ KH2PO4, 0,9 мМ CaCl2, 0,5 мМ MgCl2, pH 7,4). После разрушения ткани очистку от крупных частиц и остатков проводили центрифугированием (200×g, 5 минут, 4°C) и фракцию надосадка хранили на льду. Мембраны выделяли из фракции надосадка высокоскоростным центрифугированием (по меньшей мере, 40000×g, по меньшей мере, в течение 10 минут, 4°C). Обычно мембраны промывали, по меньшей мере, дважды с помощью повторной гомогенизации в свежем буфере и повторного центрифугирования для того, чтобы удалить эндогенные примеси. Промытые мембраны суспендировали в буфере, содержащем ингибиторы протеолитических ферментов, такие как фенилметилсульфонилфторид (PMSF) или бацитрацин. Буфер можно добавлять в объемах, достаточных для доведения конечной концентрации ткани до уровня, подходящего для конкретного используемого способа скрининга.
Реакции связывания
В одном варианте инкубационные смеси для способа скрининга готовят следующим образом. В стеклянные или полимерные пробирки добавляют небольшой объем буферной смеси ("HBBM"), состоящей из буферного раствора, такого как HEPES, содержащего ингибитор протеазы, такой как бацитрацин или PMSF, не содержащий протеаз сывороточный альбумин (предпочтительно фракцию V БСА, не содержащую протеаз) и необязательно Mg2+- или Ca2+-соль и EDTA. К буферной смеси добавляют небольшой объем буфера, содержащего немеченые молекулы, которые необходимо тестировать в отношении агонистической активности, в концентрациях примерно от 10-11 до 10-6 М. Контрольные пробирки содержат только один буфер. К полученной смеси добавляют количества меченого лиганда препарата area postrema (в данном случае PYY) в буфере, так, чтобы получить конечные концентрации примерно от 10 до 100 пМ. Вследствие достигаемых высоких удельных активностей и простоты химического мечения для мечения лигандов area postrema предпочтителен 125I. Лиганды можно выделить из тканей человека, из тканей животных или получить химическими, синтетическими или рекомбинантными способами. Меченые лиганды препарата area postrema растворяют в стерильной воде, содержащей фракцию V БСА без протеаз, и хранят в замороженном виде до использования.
Реакции начинают, например, добавлением мембран в каждую инкубационную пробирку. Необходимое количество мембранного белка на пробирку варьируют так, чтобы количество меченого лиганда, связанного мембранами в анализе, было меньше, чем, например, 10% общей концентрации лиганда в анализе (обычно примерно 100 мкг).
Реакционные смеси инкубируют в течение периода времени и при температуре, достаточных для достижения стационарных условий на протяжении периода времени. Подразумевается, что используемый в данном описании термин "стационарное состояние" охватывает общую сумму всех реакций и процессов, которые влияют на чистое количество связанного гормона. Термин может быть или может не быть синонимом "равновесие". Обычно пробирки инкубируют примерно в течение 60 минут при комнатной температуре.
Регистрация
В том случае, когда используют мембраны, их выделяют после связывания для того, чтобы определить количество связанного меченого лиганда после конкуренции между меченым и немеченым лигандами. Мембраны удобно собирать фильтрованием с помощью вакуумного сборщика клеток Brandel (Brandel Instruments, Gaithersburg, Maryland, модель M-24) через фильтры из стекловолокна (например, GF/B, Whatman), которые предварительно замачивают с реагентом, чтобы уменьшить неспецифичное связывание (NSB). Предпочтительным является замачивание фильтров в течение 5 часов в примерно 0,3% полиэтиленимине. Специалисту в данной области известны другие устройства для сбора мембран, такие как фильтровальный агрегат Millipore (модель 1225) или фильтровальный блок Sandbeck (Bennett, J.P., Neurotransmitter Receptor Binding, H.I. Yamura, et al.; Raven, New York 1978, Pages 57-90), собирающие фильтры и реагенты, снижающие NSB, которые можно использовать в анализах связывания рецепторов. Непосредственно перед, а также сразу после фильтрования фильтры промывают большими объемами (миллилитры) ледяного буфера, чтобы удалить загрязняющие вещества, например несвязанный меченый лиганд. Фильтры извлекают и количественно оценивают связанный с мембранами меченый лиганд. В том случае, когда меткой является 125I, радиоактивность можно оценить в счетчике гамма-лучей. В том случае, когда используют хемилюминесцентную репортерную молекулу (например, AMPPD, Tropix, Inc., Bedford, MA), количественно оценивают образуемое световое излучение с помощью люминометра. Также можно использовать ферментные и флуоресцентные метки.
Вместо фильтрования мембраны после инкубации можно выделить центрифугированием (например, в центрифуге Beckman-2-21-M с охлаждением при 21000 об/мин или микроцентрифуге Beckman 12 или Eppendorf), промыть ледяным буфером, затем подвергнуть счету в таком виде или после солюбилизации мембран детергентом или щелочью.
Анализ данных
Анализ кривой насыщения Скатчарда для результатов связывания, на которой связанный/свободный (B/F) меченый лиганд наносят в виде функции связанного количества, выполняют стандартными способами. Смотри, например, (Scatchard. Ann. NY Acad. Sci. 51: 660, 1949).
Кривые конкуренции, на которых связанное количество (B) наносят в виде функции log концентрации лиганда, можно анализировать с помощью компьютера, например, используя анализ с помощью нелинейной регрессии в соответствии с логистическим уравнением, содержащим 4 параметра (Prism Program; GraphPAD Software, San Diego, California), или программу ALLFIT (версия 2.7 (NIH, Bethesda, MD 20892)) (Munson and Rodbard. Anal. Biochem. 107: 220-39, 1980; de Lean, A., Munson, P.J. et al. 1988).
Чтобы определить константы связывания можно получить кривые насыщения Скатчарда и проанализировать согласно модификации способа Скатчарда, как описано Bylund, D.B., et al., "Methods for Receptor Binding" в H.I.Yamamura et al., eds., Methods in Neurotransmitter Analysis, Raven Press, New York, 1990 pp.1-35.
Чтобы экспериментально получить конкретные значения связывания, используют широкие пределы исследуемых концентраций меченого лиганда (обычно 1-150 пМ), чтобы получить общее связывание, и дублирующие пробирки анализируют повторно в присутствии очень высокой концентрации, например 100 нМ немеченого лиганда, чтобы получить неспецифичное связывание (NSM). Последнее значение вычитают из каждого значения общего связывания, получая специфичное связывание при каждой концентрации меченого лиганда.
Пример 10: Анализ связывания рецептора Y
Оценку агонистической активности по отношению к PYY потенциальных соединений согласно изобретению можно осуществить с помощью исследования их взаимодействия с любым из известных рецепторов Y, таких как Y1-Y6, или с одним или несколькими классами уникальных рецепторов, сходных с PYY-предпочитающими рецепторами (такими как Y7), экспрессированных в клетках, в комбинации с анализом влияния PYY, например анализами примеров 1 и 2. Указанные клетки могут эндогенно экспрессировать представляющий интерес рецептор Y (такие как клетки SK-N-MC, которые экспрессируют рецепторы Y1, или клетки SK-N-BE2, которые экспрессируют рецепторы Y2) или могут представлять собой другие клетки (такие как клетки COS-7 или HEK293), которые трансфицируют клоном представляющего интерес рецептора Y. В качестве примера используют связывание с клетками SK-N-BE2.
Культура клеток
Клетки SK-N-BE2 выращивают, например, на чашках диаметром 150 мм в среде для культуры ткани с добавками (модифицированная Дюльбекко среда Игла с 10% фетальной сыворотки теленка, 4 мМ глутамина, 100 единиц/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина) при 37°C во влажной атмосфере с 5% CO2. Исходные чашки трипсинизируют и клетки разделяют 1:6 каждые 3-4 дня.
Подготовка мембран
Клетки соскабливают с чашек в небольшой объем буферного раствора, такого как фосфатно-солевой буфер (138 мМ NaCl, 8,1 мМ Na2PO4, 2,5 мМ KCl, 1,2 мМ KH2PO4, 0,9 мМ CaCl2, 0,5 мМ MgCl2, pH 7,4), или трипсинизируют, промывают и ресуспендируют в буферном растворе. Подготовку мембран начинают кратковременной (10 секунд) гомогенизацией клеток, используя, например, гомогенизатор тканей Polytron (Brinkman Instruments, NY), при температурах, получаемых при охлаждении на льду. Далее мембраны готовят центрифугированием, как описано выше в примере 9. Реакции связывания, регистрация и анализ данных такие же, как описано в примере 9.
Кроме показанных и приведенных в данном описании модификаций для специалиста в данной области будут очевидными различные модификации изобретения, которые входят в объем нижеприведенной формулы изобретения.
1. Способ снижения доступности питательного вещества, включающий периферическое введение субъекту количества пептида YY (PYY) или агониста PYY, терапевтически эффективного для снижения доступности питательного вещества.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что субъектом является человек.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что снижение доступности питательного вещества включает снижение эффективной калорийности посредством периферического введения субъекту количества PYY или агониста PYY, эффективного для снижения эффективной калорийности.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что снижение доступности питательного вещества включает подавления аппетита посредством периферического введения количества PYY или агониста PYY для подавления аппетита для потребления пищи с низким содержанием жира или одновременно с высоким и низким содержанием жира.
5. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что агонист PYY имеет более высокую аффинность к Y2 рецептору в SK-N-BE2 клетках по сравнению с Y1 рецептором в SK-N-MC клетках и вводится периферически субъекту в количестве, терапевтически эффективном для снижения доступности питательного вещества.
6. Способ по п.1, отличающийся тем, что снижение доступности питательного вещества включает снижение эффективной калорийности или подавление аппетита посредством периферического введения субъекту агониста PYY, при этом агонист PYY имеет более высокую аффинность к Y2 рецептору в SK-N-BE2 клетках по сравнению с Y1 рецептором в SK-N-MC клетках в количестве, терапевтически эффективном для снижения калорийной эффективности или подавления аппетита.
7. Способ по п.5 или 6, отличающийся тем, что агонист PYY имеет более высокую аффинность к Y5 рецептору по сравнению с Y1 рецептором.
8. Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что PYY или агонист PYY вводят в количестве примерно от 1 мкг до 5 мг или примерно от 5 до 100 мкг в сутки в виде однократной или раздельных доз.
9. Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что PYY или агонист PYY вводят в количестве примерно от 0,1 до 10 мкг/кг в сутки в виде однократной или раздельных доз.
10. Способ по п.1, дополнительно включающий подавление аппетита посредством парентерального введения субъекту количества PYY или агониста PYY, эффективного для подавления аппетита, при этом указанное количество составляет примерно от 0,1 до 10 мкг/кг в сутки в виде однократной или раздельных доз.
11. Способ по п.1, дополнительно включающий подавление аппетита посредством парентерального введения субъекту количества PYY или агониста PYY, эффективного для подавления аппетита, причем указанное количество составляет примерно от 5 до 100 мкг в сутки в виде однократной или раздельных доз.
12. Способ по любому из пп.1-11, отличающийся тем, что агонистом PYY является PYY [3-36].
13. Способ по любому из пп.1-12, отличающийся тем, что агонист PYY, по меньшей мере, в одном из анализов потребления пищи или опустошения желудка обладает большей эффективностью, чем нейропептид Y (NPY).
14. Способ по любому из пп.1-13, дополнительно включающий введение GLP-1, эксендина, амилина, их агонистов или любой их комбинации.
15. Способ по любому из пп.1-14, отличающийся тем, что PYY или агонист PYY вводят парентерально, внутривенно, интраперитонеально, внутримышечно, подкожно, местно, назально или посредством легочной ингаляции.
16. Способ по п.1, отличающийся тем, что снижение доступности питательного вещества приводит к снижению массы.
17. Способ по п.1, отличающийся тем, что снижение доступности питательного вещества приводит к снижению увеличения массы тела.
18. Способ снижения потребления пищи или подавления аппетита, включающий периферическое введение субъекту количества пептида YY (РУУ) или агониста PYY, терапевтически эффективного для снижения потребления пищи или подавления аппетита.
19. Способ по п.18, отличающийся тем, что субъектом является человек.
20. Способ по п.18, отличающийся тем, что снижение потребления пищи или подавления аппетита включает снижение эффективной калорийности или доступности питательного вещества посредством периферического введения субъекту количества PYY или агониста PYY, эффективного для снижения эффективной калорийности или доступности питательного вещества.
21. Способ по п.18, отличающийся тем, что снижается потребление пищи с низким содержанием жира или одновременно с высоким и низким содержанием жира.
22. Способ по п.18, отличающийся тем, что подавляется аппетит для пищи с низким содержанием жира или одновременно с высоким и низким содержанием жира.
23. Способ, по любому из пп.18-22, отличающийся тем, что агонист PYY имеет более высокую аффинность к Y2 рецептору в SK-N-BE2 клетках по сравнению с Y1 рецептором в SK-N-MC клетках и вводится периферически субъекту в количестве, терапевтически эффективном для снижения потребления пищи или подавления аппетита.
24. Способ по любому из пп.18-22, отличающийся тем, что агонист PYY имеет более высокую аффинность к Y2 рецептору в SK-N-BE2 клетках по сравнению с У1 рецептором в SK-N-MC клетках и вводится в количестве, терапевтически эффективном для снижения калорийной эффективности или доступности питательного вещества.
25. Способ по п.23 или 24, отличающийся тем, что агонист PYY имеет более высокую аффинность к Y5 рецептору по сравнению с Y1 рецептором.
26. Способ по любому из пп.18-25, отличающийся тем, что PYY или агонист PYY вводят в количестве примерно от 1 мкг до 5 мг или примерно от 5 до 100 мкг в сутки в виде однократной или раздельных доз.
27. Способ по любому из пп.18-25, отличающийся тем, что PYY или агонист PYY вводят в количестве примерно от 0,1 до 10 мкг/кг в сутки в виде однократной или раздельных доз.
28. Способ по п.18, дополнительно включающий снижение калорийной эффективности или доступности питательного вещества посредством парентерального введения субъекту количества PYY или агониста PYY, эффективного для снижения калорийной эффективности или доступности питательного вещества, при этом указанное количество составляет примерно от 0,1 до 10 мкг/кг в сутки в виде однократной или раздельных доз.
29. Способ по п.18, дополнительно включающий снижения калорийной эффективности или доступности питательного вещества посредством парентерального введения субъекту количества PYY или агониста PYY, эффективного для снижения калорийной эффективности или доступности питательного вещества, при этом указанное количество составляет примерно от 5 до 100 мкг в сутки в виде однократной или раздельных доз.
30. Способ по любому из пп.18-29, отличающийся тем, что агонистом PYY является PYY [3-36].
31. Способ по любому из пп.18-30, отличающийся тем, что агонист PYY, по меньшей мере, в одном из анализов потребления пищи или опустошения желудка обладает большей эффективностью, чем NPY.
32. Способ по любому из пп.18-31, дополнительно включающий введение GLP-1, эксендина, амилина, их агонистов или любой их комбинации.
33. Способ по любому из пп.18-32, отличающийся тем, что PYY или агонист PYY вводят парентерально, внутривенно, интраперитонеально, внутримышечно, подкожно, местно, назально или посредством легочной ингаляции.
34. Способ по п.18, отличающийся тем, что снижение потребления пищи или подавления аппетита приводит к снижению массы тела.
35. Способ по п.18, отличающийся тем, что снижение потребления пищи или подавления аппетита приводит к снижению увеличения массы тела.
