Способ оздоровления от вирусов растений, выращиваемых in vitro
Владельцы патента RU 2277771:
Государственное научное учреждение Всероссийский селекционно-технологический институт садоводства и питомниководства Россельхозакадемии (ГНУ ВСТИСП) (RU)
Изобретение относится к сельскому хозяйству и может быть использовано для обеззараживания растений, выращиваемых in vitro. Растения, выращиваемые in vitro, после высадки на питательную среду подвергаются облучению импульсами магнитной индукции с амплитудным значением 0,05 Тл в диапазоне частот от 6,4 до 12,8 Гц и числом импульсов от 1280 до 2560. В процессе обработки растений импульсами магнитной индукции и синхронно с ним производят импульсное подсвечивание растений инфракрасным и газоразрядным ксеноновым излучателями, причем инфракрасным излучателем облучают базальную часть растений, а газоразрядным ксеноновым излучателем - апикальную часть растений. Это позволяет полностью оздоровить от вирусов растения, выращиваемые в культуральных сосудах. 1 ил., 2 табл.
Изобретение относится к сельскому хозяйству и может быть использовано для обеззараживания от вирусов растений, выращиваемых in vitro.
Известен способ оздоровления от неповирусов и вирусов кустистой карликовости малины путем обязательного сочетания суховоздушной термотерапии (37-38°С на протяжении не менее 40 дней) и культуры in vitro с использованием эксплантов величиной не более 0,3-0,4 мм исключительно из терминальных почек прогретых побегов (См. Технологический процесс получения безвирусного посадочного материала плодовых и ягодных культур. Методические указания под общей редакцией акад. РАСХН / В.И.Кашина, М., ВСТИСП, 2001, с.39).
Однако, поскольку некоторые вирусы, например, кустистой карликовости малины Raspberry bushy dwarf virus (RBDV) распространяются путем переноса пыльцы с большой скоростью, характеризуются термотолерантностью и способностью проникать в меристематические ткани, эффективность оздоровления все же остается довольно низкой.
Кроме этого, суховоздушная термотерапия является энергозатратным процессом, многие растения плохо переносят повышенные температуры, формируют слабые побеги, на листьях образуются ожоги.
Наиболее близким техническим решением из известных является способ обработки растений, включающий воздействие на них электромагнитного облучения (См. Авт. св-во СССР №1371613, 1984 г. М. кл. A 01 G 7/04, опубл. Бюл. №5, 1988 г. - прототип).
Однако этот известный способ обработки растений направлен главным образом на увеличение скорости роста растений, выращиваемых в горшках, требует обязательной и длительной обработки каждого отдельно растущего растения и для оздоровления растений от вирусов мало пригоден.
Задачей, на решение которой направлено изобретение, является сокращение длительности процесса обработки, снижение гибели эксплантов и повышение эффективности оздоровления от вирусов растений, выращиваемых in vitro.
Поставленная задача решается тем, что в способе оздоровления от вирусов растений, выращиваемых in vitro, включающем воздействие на них электромагнитным облучением, согласно изобретению облучение ведут импульсами магнитной индукции с амплитудным значением 0,05 Тл в диапазоне частот от 6,4 до 12,8 Гц и числом импульсов от 1280 до 2560, при этом в процессе обработки импульсами магнитной индукции и синхронно с ним производят импульсное подсвечивание растений инфракрасным и газоразрядным ксеноновым излучателями, причем инфракрасным излучателем облучают базальную часть растений, а газоразрядным ксеноновым излучателем - апикальную часть растений.
Технический результат выражается в том, что согласно предложенному способу, работу можно проводить по оздоровлению уже растущих в культуре in vitro растений, увеличить размер эксплантов с 0,3-0,4 мм до 5-10 мм, что позволяет снизить до минимума гибель эксплантов, а также снизить энергозатраты и себестоимость получаемых растений.
Отличительными признаками предлагаемого способа по сравнению с прототипом, является обработка растений, выращиваемых in vitro, импульсами магнитной индукции с амплитудным значением 0,05 Тл в диапазоне частот от 6,4 до 12,8 Гц и числом импульсов от 1280 до 2560, при этом в процессе обработки растений синхронно с ним производят импульсное подсвечивание инфракрасным и газоразрядным ксеноновым излучателями соответственно базальной и апикальной частей растений.
Все это обеспечивает более эффективное оздоровление растений от вирусов.
Проведенный анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации и выявление источников, содержащих сведения об аналогах заявленного изобретения, позволил установить, что заявитель не обнаружил источник, характеризующийся признаками, тождественными существенным признакам заявленного изобретения. Определение из перечня выявленных аналогов прототипа как наиболее близкого по совокупности признаков аналога позволило установить совокупность существенных по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков в заявленном способе, изложенных в формуле изобретения. Следовательно, заявленное изобретение соответствует условию «новизна».
Результаты проверки соответствия заявленного изобретения условию «изобретательский уровень» показали, что заявленное изобретение не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, а является результатом творческого труда авторов изобретения.
Описываемое изобретение не основано на применении количественных признаков, представлении таких признаков во взаимосвязи либо изменении ее вида.
Следовательно, заявленное изобретение соответствует условию «изобретательский уровень».
На чертеже изображена схема, иллюстрирующая способ.
Схема содержит индуктор 1, выполненный в виде многовитковой цилиндрической катушки с открытыми торцевыми частями, электрически связанный с генератором 2 импульсов магнитной индукции, который имеет электрическую связь с электронными блоками 3 и 4 синхронного включения, установленными по открытым торцам индуктора 1, источника инфракрасного излучения 5 и газоразрядного ксенонового источника излучения 6, вблизи каждого из упомянутых источников излучения установлены зеркальные сферические отражатели 7 и 8. Экспланты растений 9 на питательной среде размещены внутри индуктора 1.
Способ осуществляют следующим образом.
Пример. С целью оздоровления растений от вируса RBDV брали экспланты малино-ежевичного гибрида Краснодарская, зараженные в сильной степени данным вирусом, величиной 10-12 мм, высаживали их на питательную среду Мурасиге и Скуга (1962), дополненную 6-БАП (бензиламинопурина) в концентрации 1,0 мг/л и ИМК (индолилмасляной кислотой) 0,1 мг/л, агар-агаром 6 г/л, сахарозой 30 г/л. После высадки на питательную среду экспланты растений 9 помещали внутрь индуктора 1 и с помощью генератора 2 обрабатывали импульсами магнитной индукции с амплитудным значением 0,05 Тл в диапазоне частот от 6,4 до 12,8 Гц и числом импульсов от 1280 до 2560, при этом с помощью электронных блоков 3 и 4 синхронно с процессом обработки импульсами магнитной индукции производили импульсное подсвечивание эксплантов растений 9 источником инфракрасного излучения 5 (использовали галогенную лампу накаливания) и газоразрядным ксеноновым источником излучения 6 (использовали лампу типа ИФК-120), импульсы излучения которых с помощью зеркальных сферических отражателей 7 и 8 направлялись внутрь индуктора 1 для облучения соответственно базальной и апикальной частей растений. Спустя 6 месяцев после обработки экспланты растений 9 извлекали из сосудов и тестировали методом иммуноферментного анализа (ИФА, ELJSA - тест), используя его сэндвич-вариант по методике M.Clark, A.Adams, 1977. Использовали набор для ИФА фирмы BJORAD (Франция). Иммуноглобулины растворяли в покрывающем буфере и наносили по 100 мкл в каждую лунку микроплаты, затем инкубировали при температуре +4°С в течение 4 ч. После инкубации осуществляли 3-кратную промывку лунок и наносили тестируемые образцы, гомогенизированные в экстрагирующем буфере в соотношении 1:10, по 100 мкл, после чего инкубировали 15 ч при температуре +4°С. Затем микроплаты 4-кратно промывали промывающим буфером и наносили койюгат А и конъюгат В по 100 мкл каждого на 10 мл коньюгатного буфера; микроплаты ставили на инкубацию на 2 ч при температуре 37°С. Позже микроплаты 3-кратно промывали, растворяли в субстратном буфере (10 мл) 10 мг 4 - нитрофенилфосфата и наносили данный раствор субстрата по 100 мкл в каждую лунку, инкубировали 1-2 ч при температуре +20...+25°С и измеряли результаты на спектрофотометре Униппан-2000 при длине волны 450 нм. Оптическая плотность продукта ферментативной реакции прямо пропорциональна концентрации вируса. В качестве отрицательного контроля брали сок тестируемого растения, заведомо свободного от определяемого вируса. Оптическую плотность тестируемого образца сравнивали путем деления с оптической плотностью серо-отрицательного контроля и устанавливали наличие вируса: в тестируемых пробах реакция считается положительной (указывающей на присутствие вируса), если отношение оптической плотности образца к отрицательному контролю более 2,0.
| Таблица 1. | ||||
| Оптическая плотность образцов растений малино-ежевичного гибрида сорта Краснодарская в процессе их оздоровления от вируса кустистой карликовости малины (RBDV) с использованием обработки импульсами магнитной индукции | ||||
| Число / частота, Гц (импульсов) | № п/п растения в варианте | Оптическаяплотность образца, А0 | Отнош. оптической плотности образца к оптич. плотности сероотрицательного контроля, А0/Ак | |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Прототип (без | 1 | 0,160 | 3,4 | |
| обработки) | 2 | 0,201 | 4,3 | 4,0 |
| 3 | 0,207 | 4,4 | ||
| 1 | 0,059 | 1,3 | ||
| 40/0,2 | 2 | 0,166 | 3,5 | 2,1 |
| 3 | 0,073 | 1,6 | ||
| 1 | 0,131 | 2,8 | ||
| 80/0,4 | 2 | 0,217 | 4,6 | 3,6 |
| 3 | 0,164 | 3,5 | ||
| 1 | 0,161 | 3,4 | ||
| 320/1,6 | 2 | 0,183 | 3,9 | 3,6 |
| 3 | 0,164 | 3,5 | ||
| 1 | 0,133 | 2,8 | ||
| 640/3,2 | 2 | 0,145 | 3,1 | 3,1 |
| 3 | 0,161 | 3,4 | ||
| 1 | 0,058 | 1,2 | ||
| 1280/6,4 | 2 | 0,044 | 0,9 | 1,1 |
| 3 | 0,060 | 1,3 | ||
| 1 | 0,051 | 1,1 | ||
| 2560/12,8 | 2 | 0,047 | 1,0 | 1,8 |
| 3 | 0,161 | 3,4 | ||
| 1 | 0,046 | 1,0 | ||
| 5120/25,6 | 2 | 0,155 | 3,3 | 2,8 |
| 3 | 0,186 | 4,0 | ||
| * Примечание: при отношении оптической плотности образца к серо-отрицательному контролю, равном 2,0 и более, образец считается зараженным вирусом (оптическая плотность сероотрицательного контроля Ак=0,047). |
| Таблица 2. | |||
| Зараженность растений малино-ежевичного гибрида сорта Краснодарская вирусом кустистой карликовости малины (RBDV) и оздоровление от него в зависимости от обработки импульсами магнитной индукции на основании данных иммуноферментного анализа | |||
| Число / частота, Гц (импульсов) | Число тестированных растений | Число растений зараженных вирусом | Процент оздоровления, % |
| Прототип (без обработки) | 3 | 3 | 0,0 |
| 40/0,2 | 3 | 1 | 66,7 |
| 80/0,4 | 3 | 3 | 0,0 |
| 320/1,6 | 3 | 3 | 0,0 |
| 640/3,2 | 3 | 3 | 0,0 |
| 1280/6,4 | 3 | 0 | 100,0 |
| 2560/12,8 | 3 | 1 | 66,7 |
| 5120/25,6 | 3 | 2 | 33,3 |
В каждом варианте опыта тестировали по 3 пробирочных растения, каждое растение - в 2-х химических повторностях. Результаты показали, что наиболее высокий процент оздоровления растений малино-ежевичного гибрида от вируса RBDV отмечен в диапазоне с числом импульсов магнитной индукции 1280-2560 и частотой следования импульсов 6,4-12,8 Гц и составил 66,7-100% (табл.1, 2). Более низкие и более высокие значения числа импульсов магнитной индукции и частоты следования импульсов оказались менее эффективными режимами в отношении оздоровления эксплантов от вируса RBDV.
Способ оздоровления от вирусов растений, выращиваемых in vitro, включающий воздействие на них электромагнитным облучением, отличающийся тем, что облучение ведут импульсами магнитной индукции с амплитудным значением 0,05 Тл в диапазоне частот от 6,4 до 12,8 Гц и числом импульсов от 1280 до 2560, при этом в процессе обработки растений импульсами магнитной индукции и синхронно с ним производят импульсное подсвечивание растений инфракрасным и газоразрядным ксеноновым излучателями, причем инфракрасным излучателем облучают базальную часть растений, а газоразрядным ксеноновым излучателем - апикальную часть растений.
