Способ получения среды для выращивания микобактерий туберкулеза

Изобретение относится к области биотехнологии. Способ включает смешивание солевой основы, состоящей из минеральных солей, с глицерином, растворение смеси солевой основы и глицерина, приготовление раствора малахитового зеленого, приготовление яичной массы и смешивание полученных растворов с яичной массой. При этом растворение смеси солевой основы и глицерина осуществляют в 0,1%-ном растворе гумата натрия, а компоненты берут в следующем количестве: магний сернокислый (MgSO₄×7Н₂О) 0,5 г, натрий лимоннокислый (C₆H₅O₇Na₃×5,5Н₂O) 0,1 г, квасцы железоаммонийные (Fe(NH₄)(SO₄)₂×12Н₂О) 0,05 г, калий однозамещенный фосфорнокислый (КН₂PO₄) 20,0 г, аммоний лимоннокислый однозамещенный (С₆Н₁₁О₇Н) 5,0 г, натрий глутаминовокислый однозамещенный (C₅H₈NaO₄×Н₂О) 10,0 г, глицерин (С₃Н₈O₃) 20,0 мл, 0,1% раствор гумата натрия (C₃₉H₆₈O₂₆N₃)_n до 1000,0 мл. В результате использования среды, приготовленной предложенным способом, достигается получение первой генерации культур МБТ на три дня раньше и увеличение биомассы в 2,1 раза по сравнению с контролем. 6 ил.

 

Данное изобретение относится к медицине и ветеринарии, а именно к лабораторным методам диагностики туберкулеза.

Известные культуральные исследования диагностического материала традиционно осуществляются на плотных яичных средах. Существует большое количество плотных питательных сред и разные лаборатории используют различные среды. В настоящее время наиболее часто применяемой средой является питательная среда Финн-2 (приказ МЗ РФ №109 от 21. 03.03, стр.269).

Состав среды Финн-2 (в г/л):

1. Минеральные соли:

1.1. Магний сернокислый (MgSO4×7H2O) (ГОСТ4523-77)	0,15 г
1.2. Натрий лимоннокислый (С6H5О7Na3×5,5Н2О) (ГОСТ 22280)	0,3 г
1.3. Квасцы железоаммонийные (Fe(NH4)(SO4)2×12H2O)
(ГОСТ 4205-77)	0,02 г
1.4. Калий однозамещенный фосфорнокислый (КН2PO4)
(ТУ-6-09-5324-87)	6,0 г
1.5. Аммоний лимоннокислый однозамещенный (С6Н11O7N)
(ГОСТ 7234-79)	1,5 г
1.6. Натрий глутаминовокислый однозамещенный(С5Н8NaO4×Н2О)
(ТУ 6-09-337-70)	3,0 г
2. Глицерин С3Н8O3	6,0 мл
3. Вода дистиллированная	до 300,0 мл
4. 2% раствор малахитового зеленого (C35Н54O12N4) (ТУ-6-09-1557-77)	10 мл
5. Яичная масса	330 мл

Первичное культивирование микобактерий туберкулеза из диагностического материала затруднено тем, что существует ряд факторов, ограничивающих широкое применение культурального метода, в частности известные ограничения, связанные с медленным размножением микобактерий туберкулеза и их избирательное отношение к составу питательных сред. В связи с широким применением специфических противотуберкулезных препаратов наблюдаются изменения биологических свойств возбудителя, влияющее на способность микобактерий расти на питательных средах, что также снижает информативность культурального метода и диктует необходимость широкого поиска более совершенных питательных сред, которые позволили бы ускорить получение результатов и повысить эффективность и чувствительность метода. По данным микробиологической лаборатории ЯНИИТ, в 3,0-4,0% случаев из-за скудного роста культур МБТ не происходит накопления достаточной бактериальной массы для дальнейшей работы с выделенной культурой, возникает необходимость получения субкультур и, таким образом, удлиняются сроки выдачи результатов идентификации и определения чувствительности к противотуберкулезным препаратам.

С учетом вышеперечисленного предложена питательная среда на основе яичной среды Финн-2, минеральные солевые компоненты последней растворяются в растворе гумата натрия, а не в дистиллированной воде.

Состав предложенной питательной среды (в г/л):

1. Минеральные соли:

1.1. Магний сернокислый (MgSO4×7H2O) (ГОСТ4523-77)	0,5 г
1.2. Натрий лимоннокислый (С6H5O7Na3×5,5Н2O) (ГОСТ 22280)	0,1 г
1.3. Квасцы железоаммонийные (Fe(NH4)(SO4)2×12Н2O)
(ГОСТ 4205-77)	0,05 г
1.4. Калий однозамещенный фосфорнокислый (КН2PO4) (ТУ-6-09-5324-87)	20,0 г
1.5. Аммоний лимоннокислый однозамещенный (С6Н11O7N) (ГОСТ 7234-79)	5.0 г
1.6. Натрий глутаминовокислый однозамещенный (C5H8NaO4×Н2O)
(ТУ 6-09-337-70)	10,0 г
2. Глицерин С3Н8О3	20,0 мл
3. 0,1% раствор гумата натрия (C39H68O26N3)n (pH 6,7)	до 1000,0 мл

Приготовление питательной среды.

1. Приготовление 0,1% раствора гумата натрия.

Исходный раствор гумата натрия, полученный из сапропеля по общеизвестной методике, разводится стерильной дистиллированной водой в соотношении 1:10 для получения 0,1% раствора. Необходимое количество раствора на 1 л яичной массы до 1000,0 мл рН не коррегируют. Срок хранения 3-4 недели при комнатной температуре.

2. Приготовление солевой основы питательной среды. При слабом подогревании (не доводя до кипения) на водяной бане в приготовленном 0,1% - 1000,0 мл растворе гумата натрия растворяют минеральные соли и глицерин по росписи среды Финн-2, в указанной последовательности. Автоклавируют при 1 атм. 30 мин рН не коррегируют. Срок хранения 3-4 недели при комнатной температуре.

3. Приготовление яичной массы.

Свежие диетические куриные яйца со сроком не более 7 суток, без трещин и дефектов скорлупы моют в теплой проточной воде с помощью ручных щеток и мыла, оставляют на 30 мин в мыльном растворе. Тщательно промывают в проточной воде и погружают в 70% этиловый спирт на 30 мин. Затем в стерильном боксе яйца разбивают стерильным ножом в стерильную посуду, доводя общий объем яичной массы до 1 л. Для этого требуется 20-25 яиц в зависимости от их величины. Тщательно взбивают стерильным венчиком.

4. Приготовление 2,0% малахитового зеленого. Раствор малахитового зеленого:

Малахитовый зеленый - 2,0 г;

Стерильная дистиллированная вода- 100,0 мл.

Растворить в стерильной дистиллированной воде малахитовый зеленый, поместив раствор в термостат на 1-2 часа. Стерилизовать при 1 атм. 30 мин.

5. Приготовление среды.

В большую стерильную емкость, соблюдая правила стерильности, помещают растворы:

Раствор минеральных солей в 0,1% гумате натрия - 1000,0

Яичная масса - 1000,0

Тщательно перемешивают, фильтруют через 4-слойный марлевый фильтр.

Добавляют 30,0 мл 2,0% раствора малахитового зеленого, тщательно перемешивают в течение не более 15 мин, разливают в стерильные пробирки по 5,0.

6. Свертывание среды.

Свертывание среды проводят в специальных аппаратах при 85°С в течение 45 мин.

7. Питательные среды хранят в холодильнике, при температуре +4°С, в течение месяца.

Питательная среда, полученная предложенным способом, апробирована на музейных штаммах МБТ «Академия», «БЦЖ» и штаммах МБТ, выделенных от больных различными форами туберкулеза. Контролем служила стандартная питательная среда Финн-2 (Ф-2). Посев на пробирки со средами осуществляли путем внесения суспензии музейных культур, приготовленной по оптическому стандарту мутности - 500 млн. кл/мл в количестве 0,2 мл в каждую пробирку. Посевы клинических штаммов культур МБТ производили в разведении 50 млн. кл/мл в количестве 0,2 мл в каждую пробирку. Регистрировали: появление начального роста в сутках и массивность роста на 21 сутки наблюдения: до 20 колоний, от 20 до 50 колоний, от 50 до 100 колоний и более 100 колоний.

Способ иллюстрируется фиг.1-6.

Начальный рост МБТ «шт. Академия» на контрольной среде Ф-2 зарегистрирован на 10,6±0,5 сутки. В опытной среде на 8,1±0,4 сутки наблюдения (разница статистически достоверна р<0,005) (диаграмма 1).

Массивность роста учитывалась по количеству выросших колоний МБТ на 21 сутки наблюдения: от 50 до 100 колоний и более 100 колоний. На контрольной среде Ф-2 в 28,6% случаев дали рост от 50 до 100 колоний и 71,4% случаев более 100 колоний. В опытной среде регистрировалось следующее: рост от 50 до 100 колоний - не зарегистрирован; более 100 колоний - в 100% случаев (диаграмма 2).

Начальный рост МБТ «шт. БЦЖ» в контрольной среде Финн-2 зарегистрирован на 12,6±0,8 сутки, а в опытной среде на 6,9±0,5 сутки наблюдения (разница статистически достоверна р<0,001) (диаграмма 3).

Учитывалась массивность роста или накопление биомассы МБТ (шт. БЦЖ) на 21 сутки наблюдения: до 20 колоний, от 20 до 50, от 50 до 100 и более 100 колоний. Как видно из диаграммы 4, в контрольной среде Финн-2 в 35,7% массивность роста достигала до 20 колоний, в 35,7% рост от 20 до 50 колоний, в 28,6% массивность роста составляла более 100 колоний. В опытных средах в 35,7% рост от 20 до 50 колоний, в 14,3% от 50 до 100 колоний и в 50% случаях более 100 колоний (диаграмма 4).

Начальный рост штаммов МБТ, выделенных от больных различными формами туберкулеза, зарегистрирован на контрольной среде Ф-2 на 8,7±0,2 сутки наблюдения. В опытной среде начальный рост на 7,6±0,2 сутки наблюдения (диаграмма 5).

Массивность роста МБТ: на среде Ф-2 - до 20 колоний -10,6%; от 20 до 50 колоний - 56,1%; от 50 до 100 колоний-24,2%; более 100 колоний - 9,1%. В опытной среде до 20 колоний - 4,3%; от 20 до 50 колоний - 8,6%; от 50 до 100 колоний - 22,8% и более 100 колоний - 64,3% (диаграмма 6).

На основании проведенных исследований питательная среда, приготовленная предложенным способом, имеет ряд преимуществ:

1. Более выраженные питательно-ростовые свойства, что позволяет в 2,6 раза чаще получать массивный рост МБТ при малом числе микробных тел в посевном материале;

2. Длительное сохранение в пробирке конденсационной жидкости, что предохраняет среду от преждевременного засыхания;

3. Не содержит дорогостоящих компонентов.

Применение питательной среды, приготовленной предложенным способом:

1. Для культивирования возбудителя туберкулеза из диагностического материала человека и животных.

2. Для сохранения и выращивания лабораторных штаммов и выделенных культур микобактерий туберкулеза.

Описание гумата натрия

Гумат натрия - это водорастворимая форма ГВ, выделенных из озерных сапропелевых отложений. Обобщенная формула ГВ сапропеля может быть представлена как (C₃₉H₆₈O₂₆N₃)_n, где n - количество фрагментов. В составе гуминовых веществ в результате жесткого кислотного гидролиза обнаружены 16 аминокислот, главным образом, аспарагановая, глутаминовая кислоты, глицин, аланин, ряд углеводов, макро- и микроэлементы (азот, фосфор, калий, марганец, цинк и др.) (Мярикянов и др., 1991, Сазонов, 2000). Стандартность препарата достигается использованием сырья одного месторождения, постоянством цикла выделения. Применяемый для приготовления питательных сред исходный раствор гумата натрия (1%) представляет собой темнокоричневую вязкую жидкость, со специфическим запахом. Гумат натрия обладает способностью стимулировать биологические процессы в живых организмах и транспортировать к клеткам микроэлементы и другие ценные соединения. С учетом указанных характеристик предлагается использовать указанные биологически активные свойства гумата натрия при приготовлении питательных сред для выращивания микобактерий туберкулеза.

Способ получения среды для выращивания микобактерий туберкулеза, включающий смешивание солевой основы, состоящей из минеральных солей, с глицерином, растворение смеси солевой основы и глицерина, приготовление раствора малахитового зеленого, приготовление яичной массы и смешивание полученных растворов с яичной массой, отличающийся тем, что растворение смеси солевой основы и глицерина осуществляют в 0,1%-ном растворе гумата натрия, а компоненты берут в следующем количестве,:

Магний сернокислый (MgSO4×7Н2О)	0,5
Натрий лимоннокислый (C6H5O7Na3×5,5Н2О)	0,1
Квасцы железоаммонийные (Fe(NH4)(SO4)2×12H2O)	0,05
Калий однозамещенный фосфорнокислый (КН2PO4)	20,0
Аммоний лимоннокислый однозамещенный (C6H11O7N)	5,0
Натрий глутаминовокислый однозамещенный
(C5H8NaO4×H2O)	10,0
Глицерин (С3Н8О3), мл	20,0
0,1%-ный Раствор гумата натрия (C39H68O26N3)n, мл	До 1000,0