Штамм бактерий bacillus spp. kr-083 в качестве средства для защиты растений от фитопатогенных микроорганизмов и стимуляции их роста

Изобретение относится к биотехнологии и касается нового штамма ризосферных бактерий Bacillus spp. KR-083, депонированного под №148 ВНИИСХИ-Д, в качестве средства для защиты сельскохозяйственных растений от фитопатогенных микроорганизмов и стимуляции их роста. Штамм Bacillus spp. KR-083 был выделен из корней риса, произрастающего в провинции Иенгнам Республики Южная Корея. Изобретение позволяет одновременно достичь защиты растений от фитопатогенных микроорганизмов и стимулировать рост растений. 6 табл.

 

Изобретение относится к биотехнологии и касается нового штамма ризосферных бактерий Bacillus spp. KR-083 в качестве средства для защиты сельскохозяйственных растений от фитопатогенных микроорганизмов и стимуляции их роста.

Известно и описано изобретение «Биопрепарат Фитоспорин для защиты растений от болезней» по патенту РФ №2099947 с приоритетом от 15.11.1996 г. на имя Института Микробиологии и вирусологии НАН Украины (UA) и Научно-производственного объединения "Башкирское" (RU), публикация 27.12.1997 г.

Основу биопрепарата «Фитоспорин» составляет штамм бактерий Bacillus Subtilis ВНИИСХМ 128 с концентрацией клеток 10⁹-10¹⁰ на 1 мл физраствора в количестве 92-98 об. % и наполнитель в количестве 2-8 об. %.

При этом штамм Bacillus Subtilis ВНИИСХМ 128 характеризуется высокой антагонистической активностью в отношении фитопатогенных бактерий и грибов, что позволяет использовать его для защиты различных видов сельскохозяйственных, декоративных, древесных растений (прототип).

Задачей заявленного изобретения является выявление штамма, пригодного для использования в сельском хозяйстве не только с целью защиты растений от фитопатогенных микроорганизмов, но и одновременно с целью стимуляции их роста.

Указанная задача решается за счет того, что для защиты сельскохозяйственных растений от фитопатогенных микроорганизмов и одновременно стимуляции их роста используется штамм ризосферных бактерий Bacillus spp. KR-083.

Сокращение «spp» в названии штамма означает, что бактерии принадлежат роду Bacillus, но не идентифицируются по виду, т.к. имеют значительные различия с имеющимися известными видами.

Штамм ризосферных бактерий Bacillus spp. KR-083 был выделен из корней риса, произрастающего в провинции Иенгнам Республики Южная Корея и депонирован под регистрационным номером «148 ВНИИСХМ-Д» от 14.07.2005 г.

Среда культивирования: картофельный агар (200 г картофеля, глюкоза 10 г, агар 20 г на 1 л среды). Температура 28°С, рН среды 6,8-7,0, микроаэрофил. Время культивирования при 28°С составляет 48 часов.

Штамм характеризуется следующими морфолого-культуральными и физиолого-биохимическими признаками.

Клетки имеют форму правильных палочек с закругленными концами и монополярным перитрихиальным расположением жгутиков. Размер клеток составляет (1,5-2,0)×(0,8-1,0) мкм. Через 24 часа роста на жидкой питательной среде наблюдается накопление поли-β-оксибутирата. Штамм образует споры, положительно окрашивается по Граму. Рост в жидкой и полужидкой питательной среде микроаэрофильный, метаболизм дыхательный.

На картофельно-декстрозном агаре образует круглые, непрозрачные, бесцветные, слизистые колонии с ровными краями. Диаметр колоний 3-5 мм. Оптимальная температура для роста (28-37)°С. При температуре более 45°С и менее 11°С рост замедленный. Оптимальное значение рН среды 6,8, рост происходит также при рН от 5,5 до 7,5.

Штамм KR-083 способен фиксировать молекулярный азот, не гидролизует казеин и крахмал, медленно коагулирует лакмусовое молоко с обесцвечиванием лакмуса. У штамма наблюдается рост при 4°С, наличии 7% NaCl и 0,001% лизоцима. Штамм обладает денитрифицирующей активностью до газообразного азота.

В качестве единственного источника углерода штамм KR-083 использует глюкозу, арабинозу, ксилозу, лактозу, галактозу, фруктозу, сахарозу, мальтозу, маннит с образованием кислоты, а также рамнозу декстрин и крахмал с образованием щелочи.

Выявлено и экспериментально установлено, что штамм KR-083 проявляет антагонистические свойства по отношению к возбудителям болезней сельскохозяйственных культур - фитопатогенных бактерий и грибов:

- для пшеницы озимой и яровой - штамм эффективен против мучнистой росы (Erysiphe graminis), бурой ржавчины (Puccinia recondita), фузариозной корневой гнили (Fusarium culmorum);

- для ячменя ярового - эффективен против плесневения семян (Penicillium, Alternaria), корневых гнилей (Bipolaris sorokiniana);

- для капусты белокочанной и цветной - эффективен против сосудистого бактериоза (Xanthomonas campestris), черной ножки (Rhizoctonia solani), питиозной корневой гнили (Pythium irregulare);

- для картофеля - эффективен против фитофтороза (Phytophtora infestans), ризоктониоза (Rhizoctonia solani), фузариозного увядания (Fusarium oxysporum);

- для винограда - эффективен против милдью (Plasmopara viticola), оидиума (Uncinula necator), серой гнили (Botrytis cinerea).

В таблице 1, 2 представлены сравнительные результаты по антагонистической активности двух штаммов бактерий: Bacillus subtilis ВНИИСХМ 128 (продуцента биопрепарата Фитоспорин) и заявляемого штамма Bacillus spp. KR083, по отношению к фитопатогенным микроорганизмам.

Таблица 1. Антагонистическая активность штаммов ризосферных бактерий по отношению к фитопатогенным бактериям
Штамм	Зона ингибирования роста, мм
	Erwinia carotovora А-1	Pseudomonas syringiae 8300	Pseudomonas syringiae 2314	Erwinia carotovora 3391	Clavibacter michiganense 17-1
Bacillus subtilis 128 (Фитоспорин)	14,2±1,3	18,9±1,6	11,8±0,9	28,8±2,1	16,0±1,2
Bacillus spp. KR-083 (заявленный)	27,0±1,8	26,0±2,1	18,0±1,3	32,0±2,8	28,0±2,2

Из данных, приведенных в таблице 1, видно, что заявленный штамм бактерий Bacillus spp. KR-083 обладает большей антагонистической активностью по отношению к фитопатогенным бактериям по сравнению с прототипом - штаммом Bacillus subtilis 128 ВНИИСХМ - продуцентом биопрепарата Фитоспорин.

Таблица 2. Антагонистическая активность штаммов ризосферных бактерий по отношению к фитопатогенным грибам.
Штамм	Зона ингибирования роста, мм
	Phytophtora capsici	Rhizoctonia solani	Fusarium culmorum	Fusarium solani	Pythium spp.
Bacillus subtilis 128 (Фитоспорин)	26,5±2,2	16,7±1,8	16,2±1,3	16,4±1,3	22,1±2,5
Bacillus spp. KR-083 (заявленный)	36,1±2,8	30,7±1,7	34,0±4,4	23,7±1,7	28,1±2,9

Из данных, приведенных в таблице 2, видно, что заявленный штамм бактерий Bacillus spp. KR-083 обладает большей антагонистической активностью по отношению к фитопатогенным грибам по сравнению с прототипом - штаммом Bacillus subtilis 128 ВНИИСХМ - продуцентом биопрепарата Фитоспорин.

Для развития растений им требуется азот.

Азотфиксация - это включение азота воздуха в соединение, доступное для использования растениями и другими организмами. Биологическая азотфиксация осуществляется азотфиксирующими микроорганизмами. В связи с этим азотфиксирующая активность штамма является важной характеристикой, оказывающей влияние на стимуляцию роста растений.

Заявленный штамм бактерий Bacillus spp. KR-083 обладает азотфиксирующими свойствами, т.е. ростстимулирующими свойствами, в отличие от прототипа - штамма бактерии Bacillus subtilis 128 ВНИИСХМ, который азот не фиксирует.

Поэтому для сравнения (за эталон) азотфиксирующей активности штамма бактерий Bacillus spp. KR-083 была взята чистая культура ризобактерии Herbas-pirillum seropedicae ATCC 35892, выделенная также из корней риса (типовой штамм, хранящийся в Американской Коллекции типовых культур).

В таблице 3 представлены данные по азотфиксирующей активности штамма бактерий Bacillus spp. KR-083 по сравнению с эталоном - азотфиксирующей бактерией Herbaspirillum seropedicae ATCC 35892 (типовой штамм, хранящийся в Американской Коллекции типовых культур).

Таблица 3. Азотфиксирующая (ацетиленредуктазная) активность чисты культур ризобактерий, выделенных из корней риса
Штамм	Азотфиксирующая (ацетиленредуктазная) активность (наномолей С2Н4/4 мл среды)
	через 12 ч	Через 24 ч	через 48 ч	через 72 ч	через 96 ч
Herbaspirillum seropedicae ATCC 35892 (эталон)	0,93	7,89	170,93	1025,44	1726,75
Bacillus spp. KR-083 (заявленный)	0,45	21,48	249,68	635,09	943,61

Из данных, приведенных в таблице 3, видно, что заявленный штамм бактерий Bacillus spp. KR-083 на начальном этапе (24-48) часов обладает большей азотфиксирующей активностью по сравнению с эталоном - типовым штаммом азотфиксирующей бактерии Herbaspirillum seropedicae ATCC 35892, выделенным так же, как и заявленный штамм, из корней риса.

Ростстимулирующая активность штамма Bacillus spp. KR-083 и штамма Bacillus subtilis ВНИИСХМ 128 определялась двумя методами:

а) методом стимуляции корней проростков кукурузы;

б) методом биотеста с хлореллой.

а) Определение ростстимулирующей активности штаммов методом стимуляции корней проростков кукурузы.

Семена кукурузы промывались в проточной воде в течение 2 часов, помещались в пластиковые подносы с влажной фильтровальной бумагой проростками вверх, укрывались влажной фильтровальной бумагой и помещались для проращивания в инкубатор при 28°С. Через 48 ч отбирались проростки длиной 1-1,5 см.

Кончики корней кукурузы на 2-3 мм погружались в бактериальную суспензию соответствующих штаммов бактерий (например, в рабочую культуру, полученную описанным ниже способом) различной концентрации на 1,5 часа.

В качестве контроля использовали стерильную питательную среду - среду культивирования штамма Bacillus spp. KR-083. Затем проростки кукурузы помещались в пластиковые подносы с увлажненной фильтровальной бумагой так, чтобы кончики корней находились на одной стартовой линии. Проростки укрывали влажной фильтровальной бумагой и помещали в инкубатор при 28°С. Через 24 ч корни проростков, пересекшие стартовую линию, отрезались и измерялась их длина. Ростстимулирующую активность сравниваемых штаммов Bacillus spp. KR-083 и Bacillus subtilis ВНИИСХМ 128 рассчитывали по отношению к контрольным проросткам.

б) Определение ростстимулирующей активности штаммов методом биотеста с хлореллой.

Во ВНИИСХМ был разработан метод оценки ростстимулирующей активности ризобактерий с помощью водоросли Chlorella vulgaris. Штамм Chlorella vulgaris 157 (получен от проф. Б.В.Громова, С.-Петербургский Госуниверситет) был выращен на модифицированной среде Хата (KNO₃ - 0,1 г/л, КН₂PO₄ - 0,07 г/л, MgSO₄×7H₂O - 0,033, пептон - 1 г/л, глюкоза - 1 г/л, дрожжевой экстракт - 0,1 г/л, агар - 10 г/л, рН 6,5) при 20°С и освещенности 2500 люкс. Пятидневная культура с одного косяка смешивалась со 150 мл агаровой среды Хата (t=50°C) и разливалась в чашки Петри. После застывания агара пробочным сверлом делали колодцы диаметром 4 мм, в которые помещались 100 мкл бактериальной суспензии (рабочей культуры), полученной на основе штамма бактерий Bacillus spp. KR-083, a также на основе штамма, взятого за прототип Bacillus subtilis ВНИИСХМ 128 - продуцента биопрепарата Фитоспорин.

В качестве контроля использовали питательную среду - среду культивирования штамма Bacillus spp. KR-083. Инокулированные чашки помещались на свет, и диаметр колоний подсчитывался на 5 день инкубации.

Данные по ростстимулирующей активности штамма Bacillus spp. KR-083 и штамма, взятого за прототип Bacillus subtilis ВНИИСХМ 128 - продуцента биопрепарата Фитоспорин, которая была определена двумя вышеописанными методами, представлены в таблице 4.

Таблица 4. Ростстимулирующая активность ризобактерий, выделенных из корней риса, определенная методом биотестов с хлореллой и методом стимуляции корней проростков кукурузы
Штамм	Рост хлореллы через 5 дней (⊘, мм)	Рост корней проростков кукурузы (% к контролю)*
		при разведении 1:1	при разведении 1:50	при разведении 1:100
Bacillus subtilis ВНИИСХМ 128 (Фитоспорин)	0	+7,9	+2,3	+1,2
Bacillus spp. KR-083 (заявленный)	3,0±0,2	-20,4	+26,3	+11,1
* - среднее из десяти повторностей (замеров)

Из данных, приведенных в таблице 4, видно, что заявленный штамм бактерий Bacillus spp. KR-083 обладает более сильной ростстимулирующей активностью по сравнению с прототипом - штаммом Bacillus subtilis ВНИИСХМ 128, в частности в методе стимуляции корней проростков кукурузы - при наиболее часто применяемом на практике разведении (концентрации) бактериальной суспензии (маточной культуры штамма) 1:50 и 1:100.

Влияние штамма бактерии Bacillus spp. KR-083 на повышение урожайности различных сельскохозяйственных культур (картофеля, яровой и озимой пшеницы, ячменя, риса, сахарной свеклы, подсолнечника, капусты, моркови, свеклы, салата, редиса) была экспериментально подтверждена.

Эффективность штаммов Bacillus spp.KR-083 и Bacillus subtilis ВНИИСХМ 128 в вегетационных опытах с редисом с.Жара (при обработке семян и по вегетации после всходов) представлена в таблице 5. При этом вегетационные опыты проводили по принятой методике (Доспехов, 1986 г.), причем под "% NPK" понимались агрономически рекомендуемые дозы внесения азота, фосфора и калия по действующему веществу при выращивании редиса.

Таблица 5. Эффективность штаммов ризобактерий в вегетационных опытах с редисом с.Жара
Вариант опыта	Редис с.Жара
	Урожай (г/сосуд)	% прибавки к контролю
Контроль 50% NPK	5,87	-
Контроль 100% NPK	8,05	36,7
Фон 50% NPK
Bacillus subtilis ВНИИСХМ 128 + (Фитоспорин)	6,83	16,4
Bacillus spp. KR-083 + (заявленный)	7,78	22,5
Bacillus subtilis ВНИИСХМ 128 +++ (Фитоспорин)	7,32	24,7
Bacillus spp. KR-083 +++ (заявленный)	9,31	58,6
Условные обозначения: + - обработка семян;
+++ - обработка семян и две обработки по вегетации через 7 и 15 дней после всходов

Из данных, приведенных в таблице 5, видно, что в вегетационных полевых опытах с редисом с.Жара инокуляция заявленным штаммом бактерий Bacillus spp. KR-083 способствует увеличению урожая редиса, причем в большей степени, чем аналогичная обработка штаммом Bacillus subtilis ВНИИСХМ 128 (прототипом) -продуцентом биопрепарата Фитоспорин.

Сравнительные данные, характеризующие влияние штаммов Bacillus spp. KR-083 и Bacillus subtilis ВНИИСХМ 128 на повышение урожайности картофеля с.Невский в производственных опытах в Ленинградской области (ГП ОПХ «Каложицы»), приведены в таблице 6.

Таблица 6. Урожайность картофеля с.Невский в производственных опытах в Ленинградской области (ГП ОПХ «Каложицы»)
Вариант опыта	Урожайность (ц/га)	Прибавка к контролю
		(ц/га)	(%)
Контроль	366,6	-	-
Bacillus subtilis ВНИИСХМ 128 (Фитоспорин)	387,4	20,8	5,7
Bacillus spp. KR-083 (заявленный)	483,3	116,7	31,8

Из данных, приведенных в таблице 6, видно, что инокуляция заявленным штаммом бактерий Bacillus spp. KR-083 в производственных опытах с картофелем с.Невский способствовала увеличению урожайности картофеля в большей степени, чем штаммом - прототипом Bacillus subtilis ВНИИСХМ 128 - продуцентом биопрепарата Фитоспорин.

То есть примеры, приведенные в таблицах 5 и 6, подтверждают, что инокуляция посевного материала и обработка всходов заявленным штаммом бактерий Bacillus spp. KR-083 способствует увеличению урожайности овощей на (15-32) %.

Таким образом, из данных, приведенных выше в таблицах следует, что заявленный штамм бактерий Bacillus spp. KR-083 обладает большей антагонистической активностью по отношению к фитопатогенным микроорганизмам (бактериям и грибам), а также более высокой ростстимулирующей активностью растений благодаря способности биологической азотфиксации по сравнению со штаммом-прототипом Bacillus subtilis ВНИИСХМ 128, а его применение в сельском хозяйстве способствует увеличению урожайности культур.

Важным является также и то, что при использовании указанного штамма в составе биопрепаратов бактерии Bacillus spp. KR-083 образуют споры, что позволяет сохранять эти препараты без потери жизнеспособности бактерий в течение длительного срока, не менее 12 месяцев с момента их получения.

Концентрация (количество жизнеспособных клеток и спор) штамма бактерии Bacillus spp. KR-083 для его эффективного использования в составе различных биопрепаратов должна составлять 10⁶-10⁸ клеток в 1 мл культуральной жидкости.

Экспериментально установлено, что использование штамма в концентрации менее 10⁶ кл/мл ведет к снижению антагонистического эффекта, а увеличение концентрации свыше 10⁹ кл/мл не приводит к увеличению эффективности защитного и ростостимулирующего действия.

Ниже приведен пример получения жидкой формы микробиологического препарата на основе заявляемого штамма ризосферных бактерий Bacillus spp. KR-083.

1. Чистая культура в колбах.

Для получения этой культуры для бактерий Bacillus spp. KR-083 готовят жидкую питательную среду следующего состава, г/л:

пептон - 20,0

глицерин - 10,0

K₂HPO₄ - 1,5

MgSO₄ - 1,5

Значение рН смеси подводят перед стерилизацией до значения 7,0. Полученную жидкую питательную среду разливают в 750 мл качалочные колбы по 100 мл и стерилизуют при 1 атм 30 минут. Инокуляцию колб проводят стерильно микробиологической петлей из пробирки со скошенным питательным агаром (200 г картофеля, 10 г глюкозы, 20 г агара на 1 л среды), содержащим чистую культуру бактерий Bacillus spp. KR-083, помещают на качалку (220 об/мин) и культивируют 48 часов при температуре 28°С.

2. Маточная культура в колбах.

Маточную культуру выращивают на среде и при условиях, указанных в п.1 для чистой культуры. Засев колб производят 5 мл чистой культуры и выращивают 48 часов. При этом достигается титр около 5×10⁹ кое/мл (колониеобразующих единиц в 1 мл).

Посевной материал (чистую и маточную культуры) хранят в холодильнике до 1 месяца при температуре (4-6)°С.

3. Рабочая культура

Рабочую культуру получают в бутылях или ферментерах на аналогичных средах, допускается разбавление питательной среды в 2 раза. Норма инокуляции маточной культурой составляет 2-5% объема среды. Продолжительность культивирования - 48 часов при температуре 28-30°С. При выращивании рабочих культур допускается повышение температуры до 33°С.

Таким образом, получают концентрат суспензии препарата.

4. Жидкая форма биопрепарата на основе штамма бактерии Bacillus spp. KR-083 KR-083.

Благодаря относительно высокой биологической активности используемого штамма и высокой скорости роста жидкий препарат в готовом виде, а также в производстве, практически не заражается посторонней микрофлорой. Тем не менее, необходим постоянный контроль всех этапов производства.

Для приготовления жидкой формы препарата необходимо использовать помещение площадью 20-40 м², отделанное кафелем и полами с твердым покрытием, пригодным для ежедневной мойки и стерилизации. Помещение должно содержаться в отличном санитарном состоянии, быть достаточно сухим и хорошо вентилируемым. В помещении ежедневно производится влажная уборка и обработка его антисептиками (0,5% раствором хлорной извести, хлорамином, фенолом или формалином).

Воздух помещения периодически очищается от микрофлоры путем осаждения ее стерильной водой, распыляемой с помощью гидропульта. Перед началом работы в помещении (за 2-3 часа) включается система бактерицидных ламп (БУВ, ПРК-2 или ПРК-4). УФ-лампы расположены в центре рабочего помещения над рабочими столами и под столами, имея в виду, что основная «грязь» поступает в основном с пола. Чистота воздуха контролируется микробиологическими пробами, взятыми после пятиминутной экспозиции на три чашки Петри с МПА + 0,5% глюкозы. Чашки с высевами просматриваются после выдержки в термостате при температуре 37°С в течение 3-5 суток. В случае выявления большого количества (10-15 колоний) микрофлоры в воздухе бокса производится дезинфекция.

Работа производится в чистых, накрахмаленных, хорошо проглаженных халатах и колпаках, отдельной обуви, которые находятся в тамбуре рабочего помещения, где работающие надевают их и снимают по окончании работы в помещении.

Полученный концентрат суспензии препарата на основе штамма KR-083 (рабочую культуру) разводят стерильной водой в соотношении 1:10 или 1:20, чтобы получить конечную концентрацию не менее 100 миллионов колониеобразующих единиц в 1 мл препарата (не менее 10⁸ кое/мл).

Жидкий препарат стерильно разливают в полиэтиленовые бутылки или канистры емкостью 0,25; 0,5; 1,0 и 10,0 литров. Полиэтиленовые бутылки или канистры ополаскивают спиртом. На бутылки или канистры размещают тарные этикетки и инструкции по применению.

Полученную жидкую форму препарата выдерживают в течение 3-5 дней при 20-25°С, после чего ее можно применять для обработки сельскохозяйственных культур. Строгий контроль и правильное ведение процесса приготовления жидкой формы предопределяют высокое качество биопрепарата на основе штамма KR-083 и его соответствующую активность при возделывании сельскохозяйственных культур.

Штамм ризосферных бактерий Bacillus spp. KR-083, депонированный под №148 ВНИИСХМ-Д, в качестве средства для защиты сельскохозяйственных растений от фитопатогенных микроорганизмов и стимуляции их роста.