Применение ряски в высокопроизводительном скрининге
Изобретение относится к биологии и медицине и касается способа высокопроизводительного скрининга с использованием ряски. В одном аспекте эти способы используют для идентификации нуклеотидных последовательностей, кодирующих представляющие интерес полипептиды. В другом аспекте эти способы используют для идентификации последовательностей, которые модулируют экспрессию нуклеотидной последовательности - мишени. Изобретение обеспечивает автоматизацию процесса и повышение эффективности идентификации. 16 з.п. ф-лы.
Область техники, к которой относится изобретение
Данное изобретение относится к способам высокопроизводительного скрининга с использованием ряски.
Уровень техники
Ряски являются единственными членами семейства однодольных растений Lemnaceae. Четыре рода и 34 вида представлены мелкими, свободно плавающими пресноводными растениями, географическое распространение которых охватывает весь земной шар (Landolt (1986) Biosystematic Investigation on the Family of Duckweeds: The Family of Lemnaceae-A Monograph Study Geobotanischen Institut ETH, Stiftung Rubel, Zurich). Хотя и известные как наиболее морфологически редуцированные растения, большинство видов ряски имеют все ткани и органы гораздо более крупных растений, в том числе корни, стебли, цветки, семена и талломы. Виды ряски интенсивно исследовались, и существует значительная литература, подробно описывающая их экологию, систематику, жизненный цикл, метаболизм, чувствительность к заболеваниям и вредителям, их репродуктивную биологию, генетическую структуру и клеточную биологию (Hillman (1961) Bot. Review 27: 221; Landolt (1986) Biosystematic Investigation on the Family of Duckweeds: The Family of Lemnaceae-A Monograph Study Geobotanischen Institut ETH, Stiftung Rubel, Zurich).
Характер развития рясок является идеальным для способов культивирования микробов. Это растение быстро размножается посредством вегетативного отпочковывания новых талломов, являющегося макроскопическим аналогом асексуального размножения у дрожжей. Эта пролиферация происходит вегетативным почкованием из меристематических клеток. Меристематический район является небольшим и находится на вентральной поверхности таллома. Меристематические клетки лежат в двух сумках, по одной на каждой стороне от средней жилки таллома. Этот небольшой район средней жилки является также местом, из которого берет начало корень и возникает стебель, который соединяет каждый таллом с его материнским талломом. Меристематическая сумка защищена тканевым клапаном. Талломы отпочковываются поочередно из этих сумок. Время удвоения варьирует в зависимости от вида, и оно является таким коротким, как 20-24 ч (Landolt (1957) Ber. Schweiz. Bot. Ges. 67: 271; Chang et al. (1977) Bull. Inst. Chem. Acad. Sin. 24:19; Datko and Mudd (1970) Plant Physiol. 65:16; Venkataraman et al. (1970) Z. Pflanzenphysiol. 62:316).
Культуры растений ряски или клубеньков ряски могут быть эффективно трансформированы одним из множества способов, в том числе опосредованным Agrobacterium переносом генов, баллистической бомбардировкой или электропорацией. Стабильные трансформанты ряски могут быть выделены путем трансформации клеток ряски как представляющей интерес нуклеотидной последовательностью, так и геном, который придает устойчивость к селективному агенту, с последующим культивированием трансформированных клеток в среде, содержащей селективный агент. См. патент США №5040498 и предварительную заявку на патент США 60/221705, включенные здесь в их полном объеме путем ссылки.
Недавние успехи в секвенировании генома растений обеспечили изобилие информации, касающейся последовательности генов, кодирующих новые полипептиды, и ассоциированных с ними нуклеотидных последовательностей, которые могут служить для регуляции экспрессии этих кодирующих последовательностей. Однако эта информация о последовательностях не обеспечивает информации, касающейся точной роли этих нуклеотидных последовательностей в физиологически важных процессах.
Для определения или подтверждения функции новых генов обычно необходимо экспрессировать эти гены in vivo. При скрининге нуклеотидных последовательностей для определения их активности в растениях наивысший предсказательный успех получают из анализов на активность этой последовательности в целом растении. Однако оранжерейное испытание на интактных растениях, выращиваемых в почве, является отнимающим много времени и занимающим большое пространство. Подготовка, уход за объектами и оценка этих скринингов являются также трудоемкими, и эти стадии обычно не поддаются автоматизации.
Желательным является способ скрининга на нуклеотидные последовательности в системе, которая сочетает предсказательный успех скрининга на целых растениях с уменьшенными размером и стоимостью высокопроизводительного скрининга. Таким образом, данное изобретение обеспечивает способы проведения высокопроизводительных скринингов в системе на основе ряски.
Раскрытие изобретения
Обеспечены высокопроизводительные способы для определения биологической функции молекул нуклеиновых кислот и для идентификации представляющих интерес молекул нуклеиновых кислот в системе на основе ряски.
Способы данного изобретения пригодны для автоматизации с целью обеспечения быстрой и эффективной идентификации и характеризации молекул нуклеиновых кислот. Эти способы могут выполняться в формате высокой плотности, так что могут обрабатываться одновременно многочисленные пробы. Кроме того, множественные стадии этого способа могут выполняться в том же самом формате высокой плотности. Например, в одном воплощении трансформация, отбор и регенерация культуры ряски могут все выполняться в одном и том же планшете формата высокой плотности. Эти способы обеспечивают высокоскоростной скрининг нуклеотидных последовательностей, так что представляющая интерес молекула нуклеиновой кислоты может быть идентифицирована в укороченном диапазоне времени после трансформации культуры ряски. Наконец, эти способы обеспечивают высокую эффективность получения трансформированных линий ряски.
Эти способы включают в себя трансформацию культуры растений ряски, культуры клубеньков ряски, суспензионной культуры ряски или клеточной культуры протопластов ряски нуклеотидной последовательностью. Затем проводят манипуляции с этой системой на основе ряски для идентификации представляющей интерес молекулы нуклеиновой кислоты.
В одном воплощении культуру растений ряски, культуру клубеньков ряски, суспензионную культуру ряски или клеточную культуру протопластов ряски трансформируют тестируемой нуклеотидной последовательностью и определяют биологическую функцию этой тестируемой нуклеотидной последовательности для определения посредством этого, является ли эта тестируемая нуклеотидная последовательность представляющей интерес молекулой нуклеиновой кислоты.
В другом воплощении культуру растений ряски, культуру клубеньков ряски, суспензионную культуру ряски или клеточную культуру протопластов ряски трансформируют репортерной нуклеотидной последовательностью в таких условиях, что эта репортерная нуклеотидная последовательность интегрируется в ДНК культуры растений ряски, культуры клубеньков ряски, суспензионной культуры ряски или клеточной культуры протопластов ряски, и представляющую интерес молекулу нуклеиновой кислоты идентифицируют, определяя, интегрирована ли эта репортерная нуклеотидная последовательность в ДНК ряски таким образом, что она оказывается функционально связанной с представляющей интерес молекулой нуклеиновой кислоты.
Осуществление изобретения
Данное изобретение относится к способам высокопроизводительного скрининга молекулы нуклеиновой кислоты в системе на основе ряски для идентификации и характеризации представляющих интерес молекул нуклеиновых кислот. Эти способы объединяют предсказательный успех скрининга на целых растениях с экономичностью по масштабам, трудозатратам, времени и стоимости высокопроизводительного скрининга, обычно сопутствующей технологии на основе одноклеточных организмов.
Определения
Способы данного изобретения являются высокопроизводительными способами скрининга. Под «высокопроизводительным способом» в данном контексте имеют в виду способ, для которого верным является, по меньшей мере, один из следующих признаков.
(1) Способ выполняют в формате высокой плотности, т.е. в таком формате, что одновременно может обрабатываться более чем одна проба. Например, в некоторых воплощениях, по меньшей мере, 12 или более, по меньшей мере, 24 или более, по меньшей мере, 48 или более, по меньшей мере, 96 или более или, по меньшей мере, 384 или более проб могут обрабатываться в одном планшете или контейнере другого типа. Этот планшет или контейнер другого типа может быть специально адаптирован для выращивания, поддержания и автоматизированного манипулирования культур ряски посредством добавления пористой системы подложки в каждую лунку. См., например, предварительную заявку на патент США с номером 60/294430, поданную 30 мая 2001 г. и заявку на патент США, озаглавленную "Plate and Method for High Throughput Screening", поданную 28 мая 2002 г.
(2) Способ выполняют таким образом, что множественные стадии, например, трансформации, отбора и регенерации культуры ряски могут выполняться в одном и том же планшете или контейнере высокой плотности. В одном воплощении две или более стадий, выбранных из стадии трансформации, стадии отбора и стадии регенерации, выполняют в одном и том же планшете, так что между стадиями не требуется переноса культуры ряски.
(3) Способ поддается автоматизации, т.е. одна или более стадий данного способа могут выполняться с использованием лабораторной роботизированной станции.
(4) Этот способ обеспечивает возможность высокоскоростного скрининга нуклеотидных последовательностей. Например, в некоторых воплощениях данного изобретения трансформированная ряска может анализироваться с целью идентификации представляющей интерес молекулы нуклеиновой кислоты спустя всего лишь 4-16 недель после трансформации, например в пределах 4 недель или менее, в пределах 5 недель или менее, в пределах 6 недель или менее, в пределах 7 недель или менее, в пределах 8 недель или менее, в пределах 9 недель или менее, в пределах 10 недель или менее, в пределах 11 недель или менее, в пределах 12 недель или менее, в пределах 13 недель или менее, в пределах 14 недель или менее, в пределах 15 недель или менее, в пределах 16 недель или менее.
(5) Этот способ обеспечивает высокую эффективность получения трансформированных линий ряски, например, по меньшей мере, 30% или более, по меньшей мере, 35% или более, по меньшей мере, 40% или более, по меньшей мере, 45% или более, по меньшей мере, 50% или более, по меньшей мере, 55% или более, по меньшей мере, 60% или более, по меньшей мере, 65% или более, по меньшей мере, 70% или более, по меньшей мере, 75% или более, по меньшей мере, 80% или более, по меньшей мере, 85% или более, по меньшей мере, 90% или более, по меньшей мере, 95% или более культур ряски, трансформированных по этому способу, дают начало трансгенным линиям ряски, содержащим тестируемую нуклеотидную последовательность или репортерную нуклеотидную последовательность.
Термин "система на основе ряски" или "культура ряски", используемый здесь, включает в себя культуры растений ряски, культуры клубеньков ряски, суспензионные культуры ряски и клеточные культуры протопластов ряски.
Термин "культура растений ряски", используемый здесь, относится к культуре, содержащей, в основном, полностью дифференцированные растения ряски.
Термин "культура клубеньков ряски", используемый здесь, относится к культуре, содержащей клетки ряски, где, по меньшей мере, приблизительно 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% клеток являются дифференцированными клетками. "Дифференцированной клеткой" в данном контексте является клетка, имеющая, по меньшей мере, одну фенотипическую характеристику (например, характерную морфологию клетки или экспрессию маркерной нуклеиновой кислоты, или белок), которая отличает ее от неидентифицированных клеток или от клеток, обнаруживаемых в других типах тканей. В некоторых воплощениях культура клубеньков ряски содержит микроклубеньки ряски, описанные в другом месте данного текста.
Термин "суспензионная культура ряски", используемый здесь, относится к культуре, содержащей диспергированные клетки ряски, например диспергированные каллусные клетки ряски. Обычно суспензионная культура ряски будет содержать как одиночные клетки, так и неорганизованные клеточные агрегаты варьирующих размеров.
Термин "клеточная культура протопластов ряски" относится к культуре, содержащей клетки ряски, в которой, по меньшей мере, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% клеток ряски не имеют клеточной стенки. Способы получения клеток-протопластов из клеток растений описаны, например, в Eriksson (1995) в Plant Protoplasts, Fowke et al., eds., CRC Press, включенной здесь в качестве ссылки.
Термин «биологическая функция», используемый здесь, относится к биологической активности или свойству молекулы нуклеиновой кислоты или полипептида. Например, биологические функции молекул нуклеиновых кислот включают в себя модулирование биологических реакций, кодирование полипептидов и модулирование экспрессии нуклеотидных последовательностей - мишеней. Примеры биологических функций полипептидов включают в себя модулирование биологических реакций, придание представляющих интерес структурных свойств, придание представляющих интерес биохимических свойств и придание представляющих интерес регуляторных свойств. В частности, неограничивающие примеры модуляторных и регуляторных свойств включают в себя способность связывать представляющий интерес субстрат, способность связывать представляющий интерес лиганд, способность катализировать представляющую интерес реакцию, способность модулировать реакцию на растительный гормон, способность модулировать реакцию на регулятор роста растений, способность модулировать реакцию на нарушение условий окружающей среды, способность модулировать реакцию на нарушение физиологических условий, способность модулировать реакцию на один или более патогенов и способность модулировать реакцию на один или более токсинов.
Термин "экспрессия", используемый здесь, относится к транскрипции или трансляции нуклеотидной последовательности.
Термин «ряска» относится к членам семейства Lemnaceae. Это семейство в настоящее время подразделяется на четыре рода и 34 вида рясок следующим образом: род Lemna (L. aequinoctialis, L. disperma, L. ecuadoriensis, L. gibba, L. japonica, L. minor, L. miniscula, L. obscura, L. perpusilla, L. tenera, L. trisuica, L. turionifera, L. valdiviana); род Spirodela (S. intermedia, S. polyrrhiza, S. punctata); род Wolffia (Wa. angusta, Wa. arrhiza, Wa. australina, Wa. borealis, Wa. brasiliensis, Wa. columbiana, Wa. elongata, Wa. globosa, Wa. microscopica, Wa. neglecta) и род Wolfiella (Wl. caudata, Wl. denticulata, Wl. gladiata, Wl. hyalina, Wl. lingulata, Wl. repunda, Wl. rotunda и Wl. neotropica). Любые другие роды или виды Lemnaceae, если они существуют, являются также аспектами данного изобретения. Виды Lemna могут быть классифицированы с использованием таксономической схемы, описанной Landolt (1986) Biosystematic on the Family of Duckweeds: The family of Lemnaceae-A Monograph Study Geobotanischen Institut ETH, Stiftung Rubel, Zurich.
Термин «функционально связанные», относящийся здесь к нуклеотидным последовательностям, обозначает множественные нуклеотидные последовательности, которые помещены в функциональной связи друг с другом. Например, промоторная нуклеотидная последовательность функционально связана со второй нуклеотидной последовательностью, когда она расположена таким образом, что она запускает транскрипцию второй нуклеотидной последовательности.
Способы идентификации представляющей интерес молекулы нуклеиновой кислоты включают в себя стадию трансформации культуры растений ряски, культуры клубеньков ряски, суспензионной культуры ряски или клеточной культуры протопластов ряски нуклеотидной последовательностью. В некоторых воплощениях эта нуклеотидная последовательность является тестируемой нуклеотидной последовательностью или репортерной нуклеотидной последовательностью. Для трансформации культуры ряски может быть использован любой способ, известный в данной области. В одном воплощении стабильно трансформированную ряску получают одним из способов переноса генов, раскрытых в патенте США №6040498 (Stomp et al.) или заявке на патент США №60/221706, включенных здесь путем отсылки. Способы, описанные в этих ссылках, включают в себя перенос генов баллистической бомбардировкой микроснарядами, покрытыми нуклеиновой кислотой, содержащей представляющую интерес нуклеотидную последовательность (также известной как биолистическая бомбардировка, бомбардировка микроснарядами или бомбардировка микрочастицами), перенос генов электропорацией и перенос генов, опосредуемый Agrobacterium, содержащей вектор, включающий в себя представляющую интерес нуклеотидную последовательность. Отбор и регенерация трансгенных линий ряски описаны в этих ссылках, так же как и в других местах настоящего описания. В одном воплощении стабильно трансформированную ряску получают с использованием любого из опосредованных Agrobacterium способов, раскрытых в патенте США 6040498 (Stomp et al.). Используемой Agrobacterium является Agrobacterium tumefaciens или Agrobacterium rhizogenes. В другом воплощении культуру ряски траснформируют с использованием ПЭГ-опосредуемой трансформации. См., например, Lazerri (1995) Methods Mol. Biol. 49:95-106, Mathur et al. (1998) Methods Mol. Biol. 82:267-276 и Datta et al. (1999) Methods Mol. Biol. Ill:335-347, включенные здесь путем отсылки.
В одном воплощении культуру растений ряски, культуру клубеньков ряски, суспензионную культуру ряски или культуру протопластов ряски трансформируют в планшете или другом контейнере формата высокой плотности, например 24-луночном планшете, 48-луночном планшете или 96-луночном планшете. Этот планшет может быть приспособлен для автоматизированной обработки культур ряски путем добавления пористой подложки в каждую лунку. См., например, предварительную заявку на патент США с регистрационным номером 60/294430, поданную 30 мая 2001 г., и заявку на патент США, озаглавленную "Plate and Method for High Throughput Screening", поданную 28 мая 2002 г., включенные здесь путем отсылки. В других воплощениях культуру ряски трансформируют в отдельном контейнере, и затем ряску переносят в формат высокой плотности. Ряска может быть перенесена в формат высокой плотности вручную, или перенос растений ряски, клубеньков, суспензионных клеток или протопластов может быть автоматизирован с использованием способов, известных в данной области.
Данное изобретение обеспечивает способы получения культур клубеньков ряски, которыми можно легко манипулировать с использованием автоматизированных процедур. Эти способы предусматривают разрушение более крупных клубеньков ряски для получения культур «микроклубеньков» ряски. «Микроклубеньки» являются клубеньками ряски, которые имеют достаточно малый размер для того, чтобы их можно было аспирировать или разливать с использованием наконечника автоматизированного жидкостного манипулятора. В некоторых воплощениях автоматизированный жидкостной манипулятор или наконечник пипетки автоматизированного жидкостного манипулятора модифицируют так, чтобы увеличить размер ствола и отверстия наконечника таким образом, чтобы микроклубеньки могли свободно перемещаться в наконечник пипетки и из него. Может быть использован любой способ для разрушения клубеньков ряски для получения микроклубеньков, в том числе механические способы, ферментативные способы или способы выращивания ряски при условиях, стимулирующих образование микроклубеньков. В одном воплощении культуру микроклубеньков получают продавливанием клубеньков ряски через один или несколько слоев ячеистого сита. В конкретных воплощениях используют сита 30 меш. Затем эти микроклубеньки могут быть перенесены в планшет или другой контейнер формата высокой плотности. Концентрация микроклубеньков может быть подобрана таким образом, что большая часть лунок планшета или контейнера высокой плотности будет иметь только одно событие трансформации. Микроклубеньки данного изобретения обнаруживают эффективность регенерации таллома, сходную с эффективностью, наблюдаемой для клубеньков ряски, которые не были разбиты на более мелкие кусочки.
В некоторых воплощениях данного изобретения ряску трансформируют молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей тестируемую нуклеотидную последовательность. В конкретных воплощениях тестируемая нуклеотидная последовательность включена в экспрессионную кассету, имеющую район инициации транскрипции, функционально связанный с тестируемой нуклеотидной последовательностью. Район инициации транскрипции (например, промотор) может быть природным или гомологичным, или чужеродным или гетерологичным для хозяина, или может быть природно встречающейся последовательностью или синтетически созданной последовательностью. Под чужеродным имеется в виду, что этот район инициации транскрипции не встречается в хозяине дикого типа, в который вводится этот район инициации транскрипции.
Согласно данному изобретению может быть использован любой подходящий промотор, известный в данной области (в том числе бактериальный, дрожжевой, грибной промотор, промотор насекомых, млекопитающих и растений). Например, могут быть использованы промоторы растений, в том числе промоторы ряски. Примеры промоторов включают в себя, но не ограничиваются ими, промотор 35S вируса мозаики цветной капусты, промоторы опинсинтетазы (например, nos, mas, ocs и т.д.), промотор убиквитина, промотор актина, промотор малой субъединицы рибулозобисфосфат(Rubp)-карбоксилазы и промотор алкогольдегидрогеназы. Промотор малой субъединицы RubP-карбоксилазы ряски известен в данной области (Silverthrone et al., (1990) Plant Mol. Biol. 15:49). Другие промоторы из вирусов, которыми инфицируют растения, предпочтительно ряску, являются также пригодными и включают в себя, но не ограничиваются ими, промоторы, выделенные из вируса мозаики колоказии съедобной, вируса Chlorella (например, промотор аденинметилтрансферазы вируса Chlorella; Mitra et al. (1994) Plant Mol. Biol. 26:85), вируса бронзовости томата, вируса погремковости табака, вирус некроза табака, вирус кольцевой пятнистости табака, вирус кольцевой пятнистости томата, вирус мозаики огурца, вирус карликовости арахиса, вирус мозаики люцерны, бациллярный (палочковидный) баднавирус сахарного тростника и т.п.
Наконец, могут быть выбраны промоторы, которые дают желаемый уровень регуляции. Например, в некоторых случаях может быть выгодным использование промотора, который сообщает конститутивную экспрессию (например, промотор маннопинсинтазы из Agrobacterium tumefaciens). Альтернативно в других ситуациях может быть выгодным использование промоторов, которые активируются в ответ на специфические стимулы окружающей среды (например, промоторы гена теплового шока, промоторы индуцируемых засухой генов, промоторы индуцируемых патогенами генов, промоторы индуцируемых поранением генов и промоторы индуцируемых светом/темнотой генов) или регуляторы роста растений (например, промоторы из генов, индуцируемых абсцизовой кислотой, ауксинами, цитокининами и гибберелловой кислотой). В качестве другой альтернативы могут быть выбраны промоторы, обеспечивающие тканеспецифическую экспрессию (например, специфические для корня, листа и цветка промоторы).
На общую силу конкретного промотора может влиять комбинация и пространственная организация цис-действующих нуклеотидных последовательностей, таких как расположенные против хода транскрипции (up stream) активирующие последовательности. Например, активирующие нуклеотидные последовательности, полученные из гена октопинсинтазы Agrobacterium tumefaciens, могут усиливать транскрипцию с промотора маннопинсинтазы Agrobacterium tumefaciens (см. патент США 5955646, выданный Gelvin et al.). В данном изобретении экспрессионная кассета может содержать активирующие нуклеотидные последовательности, встроенные против хода транскрипции от промоторной последовательности, для усиления экспрессии тестируемой нуклеотидной последовательности. В одном воплощении эта экспрессионная кассета включает в себя три расположенные против хода транскрипции (слева) активирующие последовательности, происходящие из гена октопинситетазы Agrobacterium tumefaciens, функционально связанные с промотором, происходящим из гена маннопинсинтазы Agrobacterium tumefaciens (см. патент США 5955646, включенный здесь путем отсылки).
Экспрессионная кассета может дополнительно содержать район терминации транскрипции и трансляции, функциональный в растениях. В соответствии с данным изобретением может быть использована любая подходящая последовательность терминации, известная в данной области. Район терминации может быть природным для района инициации транскрипции, может быть природным для представляющей интерес нуклеотидной последовательности или может происходить из другого источника. Подходящие районы терминации доступны из Ti-плазмиды Agrobacterium tumefaciens, например районы терминации октопинсинтетазы и нопалинсинтетазы. См. также Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141; Proudfoot (1991) Cell 64:671; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261; Munroe et al. (1990) Gene 91:151; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891; и Joshi et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:9627. Дополнительными примерами последовательностей терминации являются последовательность терминации малой субъединицы RubP-карбоксилазы гороха и последовательность терминации 35S вируса мозаики цветной капусты. Другие подходящие последовательности терминации будут очевидными для специалистов в данной области.
Экспрессионные кассеты могут содержать более чем один ген или одну нуклеотидную последовательность для перенесения в трансформированное растение и экспрессии в нем. Таким образом, каждая нуклеотидная последовательность будет функционально связана с 5'-и 3'-регуляторными последовательностями. Альтернативно могут быть обеспечены множественные экспрессионные кассеты.
Обычно экспрессионная кассета будет содержать селективный маркерный ген для отбора трансформированных клеток или тканей. Селективные маркерные гены включают в себя гены, кодирующие устойчивость к антибиотику, такие как гены, кодирующие неомицинфосфотрансферазу II (NEO) и гигромицинфосфотрансферазу (НРТ), а также гены, придающие устойчивость к гербицидным соединениям. Гены устойчивости к гербицидам обычно кодируют модифицированный белок - мишень, нечувствительный к этому гербициду, или фермент, который деградирует или детоксицирует гербицид в растении до того, как он сможет действовать. См. DeBlock et al. (1987) EMBO J. 6:2513; DeBlock et al. (1989) Plant Physiol. 91:691; Fromm et al. (1990) BioTechnology 8:883; Gordon-Kamm et al. (1990) Plant Cell 2:603. Например, устойчивость к гербицидам - глифосату или сульфонилмочевине была получена с использованием генов, кодирующих мутантные белки - мишени, 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазу (EPSPS) и ацетолактатсинтазу (ALS). Устойчивость к глуфосинат-аммонию, боромоксинилу и 2,4-дихлорфеноксиацетату (2,4-D) была получена с использованием бактериальных генов, кодирующих фосфинотрицинацетилтрансферазу, нитрилазу или 2,4-дихлорфеноксиацетатмонооксигеназу, которые детоксицируют соответствующие гербициды.
Для целей данного изобретения селективные маркерные гены включают в себя, но не ограничиваются ими, гены, кодирующие неомицинфосфотрансферазу II (Fraley et al. (1986) CRC Critical Reviews in Plant Science 4:1); цианамидгидратазу (Maier-Greiner et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4350); аспартаткиназу; дигидродипиколинатсинтазу (Peri et al. (1993) BioTechnology 11:715); ген bar (Toki et al. (1992) Plant Physiol. 100:1503; Meagher et al. (1996) Crop Sci. 36:1367); триптофандекарбоксилазу (Goddijn et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22:907); неомицинфосфотрансферазу (NEO; Southern et al. (1982) J. Mol. Appl. Gen. 1:327); гигромицинфосфотрансферазу (НРТ или HYG; Shimizu et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:1074); дигидрофолатредуктазу (DHFR; Kwok et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4552); фосфинотрицинацетилтрансферазу (DeBlock et al. (1987) EMBO J. 6:2413); дегалогеназу 2,2-дихлорпропионовой кислоты (Buchanan-Wollatron et al. (1989) J. Cell. Biochem. 13D-330); синтазу ацетогидроксикислоты (патент США №4761373, выданный Anderson et al.; Haughn et al., (1988) Mol. Gen. Genet. 221:266); 5-енолпирувилшикиматфосфатсинтазу (aroA; Comai et al. (1985) Nature 317-741); галогенарилнитрилазу (WO 87/04181, выданный Stalker et al.); ацетил-кофермент А-карбоксилазу (Parker et al. (1990) Plant Physiol. 92:1220); дигидроптероатсинтазу (sull; Guerineau et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15:127) и полипептид 32 кДа фотосистемы II (psbA; Hirschberg et al. (1983) Science 222:1346 (1983).
Включены также гены, кодирующие устойчивость к: гентамицину (Саггег et al. (1991) Plant Mol. Biol. 17:301-303); хлорамфениколу (Herrera-Estrella et al. (1983) EMBO J. 2:987); метотрексату (Herrera-Estrella et al. (1983) Nature 303:209; Meijer et al. (1991) Plant Mol. Biol. 16:807); гигромицину (Waldron et al. (1985) Plant Mol. Biol. 5:103; Zhijian et al. (1995) Plant Science 108:219; Meijer et al. (1991) Plant Mol. Biol. 16:807); стрептомицину (Jones et al. (1987) Mol. Gen. Genet. 210:86); спектиномицину (Bretagne-Sagnard et al. (1996) Transgenic Res. 5:131); блеомицину (Hille et al. (1986) Plant Mol. Biol. 7:171); сульфонамиду (Guerineau et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15:127); бромоксинилу (Stalker et al. (1988) Science 242:419); 2,4-D (Streber et al. (1989) BioTechnology 7:811) и фосфинотрицину (DeBlock et al. (1987) EMBO J. 6:2513).
Ген bar сообщает устойчивость к гербицидам типа глуфосината, таким как фосфинотрицин (РРТ) или биалафос и т.п. Как отмечалось выше, другие селективные маркеры, которые могут быть использованы в этих векторных конструкциях, включают в себя, но не ограничиваются ими, ген pat, также придающий устойчивость к биалафосу и фосфинотрицину, ген ALS, придающий устойчивость к имидазолинону, гены НРН или HYG, придающие устойчивость к гигромицину, ген EPSP-синтазы для устойчивости к глифосату, ген Hml для устойчивости к Нс-токсину, и к другим селективным агентам, используемым рутинно и известным среднему специалисту в данной области. См. Yarranton (1992) Curr.Opin. Biotech. 3:506; Chistopherson et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6314; Yao et al. (1992) Cell 71:63; Reznikoff (1992) Mol. Microbiol. 6:2419; Barkley et al. (1980) The Operon 177-220; Hu et al. (1987) Cell 48:555; Brown et al. (1987) Cell 49:603; Figge et al. (1988) Cell 52:713; Deuschle et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5400; Fuerst et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2549; Deuschle et al. (1990) Science 248:480; Labow et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3343; Zambretti et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3952; Baim et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5072; Wyborski et al. (1991) Nuc. Acids Res. 19:4647; Hillenand-Wissman (1989) Topics in Mol. and Struc. Biol. 10:143; Degenkolb et al. (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35:1591; Kleinschmidt et al. (1988) Biochemitry 27:1094; Gatz et al. (1992) Plant J. 2:397; Gossen et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547; Oliva et al. (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:913; Hlavka et al. (1985) Handbook of Experimental Pharmacology 78 и Gill et al. (1988) Nature 334:721. Раскрытие этих работ включено здесь путем отсылки.
Приведенный выше перечень селективных маркерных генов не является ограничительным. Любой селективный маркерный ген может быть использован в данном изобретении.
Экспрессионную кассету, содержащую тестируемую нуклеотидную последовательность, трансформируют в культуру растений ряски, культуру клубеньков ряски, суспензионную культуру ряски или клеточную культуру протопластов ряски. Затем трансформированную ряску регенерируют и анализируют для определения, имеет ли тестируемая нуклеотидная последовательность представляющую интерес биологическую функцию. Признано, что системой на основе ряски можно манипулировать для определения биологической функции тестируемого нуклеотида.
В одном воплощении представляющей интерес биологической функцией является способность модулировать представляющую интерес биологическую или физиологическую реакцию. Этой биологической реакцией может быть любая реакция, в том числе реакция на изменения температуры, реакция на изменения длины дня, реакция на изменения водного потенциала, реакция на изменения освещенности, реакция на подвергание действию патогена (в том числе подвергание действию грибковых патогенов, вирусов, вироидов, нематод, насекомых-вредителей и бактериальных патогенов), реакция на подвергание действию токсина (например, на подвергание действию высоких уровней солей, металлов, в том числе тяжелых металлов, гербицидов или других веществ, которые препятствуют важным физиологическим функциям), реакция на гормоны растений, реакция на регуляторы роста растений или реакция на любое другое нарушение условий окружающей среды.
Для идентификации представляющей интерес молекулы нуклеиновой кислоты (например, нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, который модулирует представляющую интерес реакцию) анализируют реакцию ряски, содержащей анализируемую нуклеотидную тест-последовательность. В некоторых воплощениях реакцию ряски, содержащей тестируемую нуклеотидную последовательность, сравнивают с реакцией ряски, которая не содержит тестируемой нуклеотидной последовательности. Эта реакция может анализироваться по изменению любого фенотипического признака, в том числе, например, скорости роста. Детектируемые различия в этой реакции указывают на то, что тестируемая нуклеотидная последовательность является представляющей интерес молекулой нуклеиновой кислоты. Представляющая интерес молекула нуклеиновой кислоты (например, кодирующая полипептид, который модулирует представляющую интерес реакцию) может быть затем легко идентифицирована посредством корреляции трансгенной линии ряски, имеющей детектируемое различие в биологической реакции, с линией Е. coli или Agrobacterium, которая служила в качестве источника тестируемой нуклеотидной последовательности.
Скорость роста может быть определена любым способом, известным в данной области, например, по сухому или сырому весу или по содержанию азота. Культуры ряски могут быть выращены при селективных или рестриктивных условиях. Термины «селективные» или «рестриктивные» условия выращивания, используемые здесь, относятся к условиям, при которых скорость роста нетрансформированной ряски уменьшается в сравнении со скоростью роста при оптимальных условиях. Примеры селективных условий выращивания включают в себя ограничивающий уровень света, ограничивающие условия рН или присутствие патогенов или токсинов, которые ограничивают рост.
В некоторых воплощениях представляющей интерес молекулой нуклеиновой кислоты является нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид, имеющий представляющую интерес биологическую функцию. Представляющей интерес биологической функцией может быть любая биологическая функция, например способность придавать структурное или механическое свойство, способность связывать специфический субстрат, способность связывать специфический лиганд, способность связывать специфический рецептор или способность катализировать специфическую реакцию. В случаях, когда полипептид, кодируемый тестируемой нуклеотидной последовательностью, секретируется, культуральная среда ряски может быть удалена в отдельный контейнер и проанализирована на представляющую интерес биологическую функцию, например на специфическое структурное свойство, специфическую биологическую активность или способность образовывать комплекс со специфическим лигандом, субстратом или другим агентом. Когда полипептид, кодируемый тестируемой нуклеотидной последовательностью, остается в ткани ряски, эту ткань разрушают и белок экстрагируют и анализируют на экспрессию полипептида, имеющего представляющую интерес биологическую функцию. В некоторых воплощениях стадии разрушения, экстракции и/или анализа автоматизированы.
В некоторых воплощениях полипептидом, имеющим представляющую интерес биологическую функцию, является вариант природно встречающегося полипептида, и представляющая интерес биологическая функция является изменением, по меньшей мере, одного свойства полипептида, имеющего представляющую интерес биологическую функцию, в сравнении с природно встречающимся полипептидом. Способы получения таких вариантов известны в данной области и описаны в другом месте данного изобретения (см. пример 2 в экспериментальном разделе). Свойством, которое различается между полипептидом, имеющим представляющую интерес биологическую функцию (т.е. вариантом), и природно встречающимся полипептидом, может быть любое представляющее интерес свойство, в том числе, но не только, структурное свойство, способность связывать субстрат, способность связывать лиганд, способность катализировать представляющую интерес реакцию, способность функционировать в условиях за пределами биологического диапазона или способность модулировать биологическую реакцию. Полипептид, обладающий представляющим интерес свойством, может быть идентифицирован, как описано выше.
Каждая проба культуры ряски может быть трансформирована препаратом нуклеиновой кислоты, содержащим вариации последовательности только одной исходной последовательности. Альтернативно каждая проба может быть трансформирована препаратом гетерогенной нуклеиновой кислоты, содержащим пул нескольких тестируемых нуклеотидных последовательностей. Могут быть использованы пулы из приблизительно 3, приблизительно 5, приблизительно 10, приблизительно 15, приблизительно 20, приблизительно 25, приблизительно 30, приблизительно 40, приблизительно 50, приблизительно 60, приблизительно 70, приблизительно 90 или приблизительно 100 тестируемых последовательностей на одну культуру ряски. В этом подходе пулы тестируемых нуклеотидных последовательностей, содержащие нуклеотидную последовательность, имеющую представляющую интерес биологическую функцию, подвергают одному или более раундам субделения и скрининга для идентификации единственной представляющей интерес молекулы нуклеиновой кислоты. Общее число тестируемых нуклеотидных последовательностей, подвергаемых скринингу любым из подходов, может быть, по меньшей мере, 1 или более, по меньшей мере, 10 или более, по меньшей мере, 100 или более, по меньшей мере, 1000 или более, по меньшей мере, 10000 или более, по меньшей мере, 100000 или более, по меньшей мере, 500000 или более или, по меньшей мере, 1000000 или более.
В некоторых воплощениях данного изобретения представляющую интерес молекулу нуклеиновой кислоты идентифицируют трансформацией культуры растений ряски, культуры клубеньков ряски, суспензионной культуры ряски или клеточной культуры протопластов ряски репортерной нуклеотидной последовательностью при таких условиях, что эта репортерная нуклеотидная последовательность интегрируется в ДНК ряски. Репортерная нуклеотидная последовательность содержит последовательность, кодирующую репортерный полипептид. Репортерным полипептидом может быть любой известный в данной области репортерный полипептид, в том числе, но не только, β-глюкуронидаза (GUS), люцифераза, хлорамфениколацетилтрансфераза (CAT) или зеленый флуоресцентный белок (GFP). Способы обнаружения каждого из этих репортерных полипептидов хорошо известны в данной области.
В некоторых воплощениях репортерная нуклеотидная последовательность лишена нуклеотидной последовательности инициации транскрипции. В других воплощениях репортерная нуклеотидная последовательность содержит нуклеотидную последовательность инициации транскрипции. Нуклеотидной последовательностью инициации транскрипции может быть любая известная в данной области, в том числе описанная здесь. В некоторых воплощениях последовательность инициации транскрипции является минимальной промоторной последовательностью. Это позволяет идентифицировать нуклеотидные последовательности, служащие в качестве энхансеров транскрипции, когда репортерная нуклеотидная последовательность интегрируется в ДНК ряски таким образом, что она является функционально связанной с энхансерной последовательностью.
Репортерная нуклеотидная последовательность может содержать селективный маркер, описанный выше, для облегчения отбора трансгенных растений. Может быть использован любой селективный маркер, известный в данной области.
Репортерная нуклеотидная последовательность содержит также нуклеотидные последовательности, которые позволяют ей интегрироваться в ДНК ряски. В одном воплощении эти нуклеотидные последовательности являются последовательностями ДНК-переносчика (Т-ДНК). Эти последовательности являются сегментами большой Ti-плазмиды (индуцирующей опухоль), которую несут все вирулентные штаммы Agrobacterium. В одном воплощении последовательности несовершенных прямых повторов, обнаруживаемые на границах Т-ДНК-последовательности, встраиваются на 5'-и 3'-концах репортерной нуклеотидной последовательности. Нуклеотидные последовательности Т-ДНК данного изобретения предпочтительно содержат, по меньшей мере, одну последовательность повтора Т-ДНК. См., например, WO 93/17116, включенный здесь путем отсылки.
Мобилизация Т-области в клетку растения опосредована другой областью Ti-плазмиды, областью vir (вирулентности) (см. обзор Zambryski (1988) Annu Rev. Genet. 22:1-30; Zambryski et al. (1989) Cell 56:193-201 и Baron and Zambryski (1996) Curr.Biol. 6:1567-1569). Требующаяся область vir может быть обеспечена in trans, например, на второй плазмиде бинарной плазмидной системы (см., например, Hoekema et al. (1983) Nature 310:115-120 и Bevan (1984) Nucl. Acids Res. 22:8711-8721). В других воплощениях вектор, содержащий ДНК, которая должна быть перенесена, вводят в Agrobacterium трехродительским скрещиванием или электропорацией, и происходит гомологичная рекомбинация между этим вектором и акцепторной Ti-плазмидой.
Заявленные способы обеспечивают идентификацию различных представляющих интерес молекул нуклеиновых кислот. В одном воплощении представляющая интерес молекула нуклеиновой кислоты служит в качестве промотора или энхансера для модуляции транскрипции нуклеотидной последовательности - мишени. Таким образом, эти способы могут быть использованы для идентификации промоторов и энхансеров, которые участвуют в биологической реакции на представляющий интерес стимул. Неограничивающие примеры представляющих интерес стимулов включают в себя изменения освещенности, изменения температуры, изменения водного потенциала, изменения длины дня, изменения уровней гормонов растений, изменения уровней регуляторов роста, подвергание действию патогенов и подвергание действию токсинов. Для идентификации молекулы нуклеиновой кислоты, участвующей в биологической реакции на этот стимул, культуру ряски, содержащую интегрированную репортерную нуклеотидную последовательность, подвергают действию этого стимула и определяют экспрессию репортерного полипептида. В случаях, когда репортерная нуклеотидная последовательность интегрировалась в ДНК ряски таким образом, что она является функционально связанной с промотором или энхансером, активируемым этим стимулом, будет обнаруживаться экспрессия этого репортерного полипептида. Сайт интеграции репортерной нуклеотидной последовательности может быть идентифицирован с использованием частей репортерной нуклеотидной последовательности в качестве маркера для идентификации посредством этого нуклеотидной последовательности, которая проявляет модуляторную активность в ответ на данный стимул.
Способы данного изобретения могут быть использованы для идентификации нуклеотидных последовательностей, которые модулируют транскрипцию нуклеотидной последовательности-мишени тканеспецифическим образом. Трансгенные линии ряски подвергают скринингу для идентификации тех линий, которые экспрессируют репортерный полипептид только в специфических тканях ряски, например корнях, стеблях, цветках или талломах. Затем представляющая интерес молекула нуклеиновой кислоты может быть идентифицирована, как описано выше.
Молекулы нуклеиновых кислот, которые модулируют трансляцию нуклеотидной последовательности - мишени (например, репортерной нуклеотидной последовательности), включают в себя последовательности, которые увеличивают эффективность транскрипции, такие как лидерные последовательности, расположенные в 5'-нетранслируемой области нуклеотидной последовательности - мишени (например, последовательности, которые стимулируют связывание рибосом), и последовательности, которые увеличивают стабильность мРНК. Эти нуклеотидные последовательности могут располагаться в любом месте транскрибируемой части гена, в том числе в 5'-нетранслируемой области транскрипта, в интронных участках гена и в 3'-нетранслируемой области транскрипта. Эти последовательности идентифицируют при интеграции репортерной нуклеотидной последовательности в транскрибируемый сайт в гене. Модулирующее влияние на трансляцию контролируют путем анализа на экспрессию репортерного полипептида. Как описано для регуляторных последовательностей транскрипции, описанных выше, нуклеотидные последовательности, модулирующие трансляцию, могут регулироваться специфическими стимулами. Таким образом, экспрессия репортерного полипептида в ответ на представляющий интерес стимул может контролироваться с целью идентификации регуляторной нуклеотидной последовательности, которая активируется в ответ на этот стимул.
В некоторых воплощениях репортерная нуклеотидная последовательность интегрируется в ДНК ряски таким образом, что она функционально связана с кодирующей последовательностью гена, экспрессия которого (т.е. транскрипция и/или трансляция) регулируется представляющим интерес стимулом. Нуклеотидная последовательность, кодирующая репортерный полипептид, может транскрибироваться и транслироваться вместе с регулируемым геном с образованием химерного полипептида, который может быть обнаружен с использованием тех же самых способов, которые используются для идентификации репортерного полипептида. Экспрессия этого химерного полипептида в ответ на представляющий интерес стимул может быть использована для идентификации трансгенных линий ряски, в которых репортерная нуклеотидная последовательность является функционально связанной с регулируемым геном, который является представляющей интерес молекулой нуклеиновой кислоты. См. статью Springer (2000) Plant Cell 12:1007-1020, включенную здесь путем отсылки.
Экспериментальная часть
Следующие примеры приведены для целей иллюстрации, но не для ограничения.
Пример 1: Трансформация и регенерация ряски в формате высокой плотности
Применение жидкой среды
В описанных ранее экспериментах культивирование ряски проводили на твердых средах. Целью этого эксперимента было испытание, может ли ряска культивироваться на пористой подложке, насыщенной жидкой средой. Это позволило бы сделать стадии трансформации, отбора и регенерации поддающимися автоматизации и продемонстрировать, что система на основе ряски является пригодной для высокопроизводительного скрининга нуклеотидных последовательностей.
Культуры клубеньков ряски (полученных из штамма Lemna minor C016) трансформировали экспрессионной конструкцией GUS с использованием опосредованной Agrobacterium трансформации следующим образом.
Экспрессионным вектором, используемым для экспрессионной GUS-конструкции, был плазмидный вектор pBMSP-3. Этот экспрессирующий вектор получен из pBMSP-1, который описан в патенте США №5955646, включенном здесь путем отсылки. Транскрипционная кассета pBMSP-3 содержит три копии активирующей транскрипцию нуклеотидной последовательности, происходящей из гена октопинсинтазы Agrobacterium tumefaciens, дополнительную активирующую транскрипцию нуклеотидную последовательность, происходящую из гена маннопинсинтазы Agrobacterium tumefaciens, промоторный участок, происходящий из гена маннопинсинтазы Agrobacterium tumefaciens, полилинкерный сайт для встраивания нуклеотидной последовательности, кодирующей представляющий интерес полипептид, и последовательность терминации, происходящую из гена нопалинсинтазы Agrobacterium tumefaciens. Этот экспрессионный вектор содержит также нуклеотидную последовательность, кодирующую неомицинфосфотрансферазу II, в качестве селективного маркера. Транскрипция последовательности селективного маркера запускается промотором, происходящим из гена нопалинсинтазы Agrobacterium tumefaciens. pBMSP-3 дополнительно содержит нуклеотидную последовательность, соответствующую нуклеотидам 1222-1775 гена алкогольдегидрогеназы кукурузы (номер доступа GenBank X04049), встроенную между промотором и полилинкером. Чтобы получить экспрессионную конструкцию GUS, используемую в этом примере, в экспрессионный вектор pBMSP-3 встраивали кодирующую последовательность GUS и ген устойчивости к канамицину.
Штамм Agrobacterium tumefaciens Egs05, трансформированный экспрессионной конструкцией GUS, выращивали на среде YEB (1 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л мясного экстракта, 5 г/л пептона, 5 г/л сахарозы, 0,5 г/л MgSO4), содержащей 500 мг/л стрептомицина, 50 мг/л спектиномицина и 50 мг/л сульфата канамицина.
Культуры клубеньков ряски для трансформации готовили следующим образом. Талломы ряски отделяли, корни отрезали стерильным скальпелем и эти талломы помещали вентральной стороной вниз на среду Мурашиге и Скуга (номер по каталогу М-5519; Sigma Chemicals Corporation, St. Louis, МО) рН 5,6, дополненную 5 мкМ 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислотой, 0,5 мкМ 1-фенил-3-(1,2,3-тиадиазол-5-ил)-мочевина-тидиазуроном (Sigma P6186), 3% сахарозой, 0,4 бактоагаром Difco (Fisher Scientific) и 0,15% Гельритом (Sigma). Талломы выращивали в течение 5-6 недель. В это время появлялись клубеньки (небольшие, желтоватые клеточные массы), обычно из центральной части вентральной стороны. Эти клубеньковые кусочки ткани (средний размер 3-6 мг) отделяли от материнского таллома и культивировали в среде Мурашиге и Скуга, дополненной 3% сахарозой, 0,4% бактоагаром Difco, 1 мкМ 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислотой и 2 мкМ бензиладенином.
Культуры клубеньков ряски трансформировали следующим образом. Подходящий штамм Agrobacterium tumefaciens выращивали на чашке с агаром YEB с 50 мкг/л канамицина и 100 мкМ ацетосирингоном и полностью выросшую культуру ресуспендировали в 100 мл среды Мурашиге и Скуга, дополненной 0,6 М маннитом и 100 мкМ ацетосирингоном. Ткань культуры клубеньков инокулировали погружением в раствор ресуспендированных бактерий на 1-2 минуты, промокали для удаления избытка жидкости и высевали на среду для совместного культивирования, состоящую из среды Мурашиге и Скуга, дополненной ауксином и цитокинином для стимуляции роста клубеньков и 100 мкМ ацетосирингоном. Затем эти культуры клубеньков инкубировали в темноте в течение 2 дней.
Для отбора культуры клубеньков переносили на чашки с агаром (обработка 1, см. ниже) или в 24-луночные планшеты, снабженные полиэтиленовыми подложками, как описано в предварительной заявке на патент с регистрационным номером 60/294430, поданной 30 мая 2001 г., и заявке на патент США, озаглавленной "Plate and Method for High Throughput Screening", поданной 28 мая 2002 г. (обработка 2, см. ниже). Для приготовления полиэтиленовой подложки (фритты) 24-луночного планшета гидрофильный полиэтилен (толщиной 1/16 дюйма) нарезали размером, подходящим для вставления в 24-луночный планшет, и в середине просверливали отверстие для замены среды. Эти фритты автоклавировали, сушили и вставляли в лунки 24-луночного планшета гладкой поверхностью вверх. Фритты увлажняли 560 мкл среды Мурашиге и Скуга рН 5,6 с 3% сахарозой, 1 мкМ 2,4-дихлорфеноксиацетатом, 2 мкМ бензиладенином и подвергали одной из следующих обработок:
обработка 1: (чашки с агаром) 200 мг/л сульфата канамицина и 500 мг/л цефотаксима,
обработка 2: (24-луночный планшет) 200 мг/л сульфата канамицина и 500 мг/л цефотаксима,
и культивировали в течение четырех дней при непрерывном освещении (20-40 мкМ/м2·с). В день 4 трансформированные культуры клубеньков обработки 1 переносили на чашку, содержащую агаризованную 0,5Х среду Шенка и Гильдебрандта с 3% сахарозой, 200 мг/л сульфата канамицина и 500 мг/л цефотаксима. Для клубеньковых культур обработки 2 среду заменяли 0,5Х средой Шенка и Гильдебрандта, содержащей 3% сахарозу, 200 мг/л канамицина и 500 мг/л цефотаксима, для 12 лунок и 0,5Х средой Шенка и Гильдебрандта, содержащей 200 мг/л канамицина и 300 мг/л цетилпиридинийхлорида, для остальных 12 лунок. Эти культуры клубеньков инкубировали при полной освещенности. Спустя 6 дней ткань из нескольких проб окрашивали для контроля за экспрессией GUS. Результаты были следующими:
| Обработка 1 | |
| Номер пробы | Характер окрашивания |
| 2 | пятнистое |
| 5 | большие зоны окрашивания |
| 8 | 2 небольших голубых пятна |
| 11 | пятнистое голубое |
| Обработка 2 | |
| Номер пробы | Характер окрашивания |
| 18 | пятнистое голубое |
| 20 | нет голубого окрашивания |
| 24 | небольшие голубые пятна |
Культуры клубеньков инкубировали в течение 7 дополнительных недель и следили за регенерацией талломов ряски. Результаты по лункам обработки 2, росшим в присутствии цефотаксима, показаны ниже:
| Проба | Недели до регенерации | GUS-окрашивание |
| 1 | нет регенерированных | не определяли |
| талломов | ||
| 2 | 10 недель | не определяли |
| 3 | 7 недель | положительное |
| 4 | нет регенерированных | не определяли |
| талломов | ||
| 5 | 13 недель | положительное |
| 6 | 13 недель | положительное |
| 7 | 9 недель | положительное |
| 8 | 8 недель | положительное |
| 9 | 9 недель | положительное |
| 10 | 13 недель | отрицательное |
| 11 | 13 недель | отрицательное |
| 12 | нет регенерированных | не определяли |
| талломов |
Эффективность трансформации в этом эксперименте была, по меньшей мере, 50%. Наблюдали, что культуры ряски, росшие на полиэтиленовых подложках, давали регенерированные талломы быстрее, чем культуры, росшие на чашках с агаром, и обнаруживали более высокую эффективность трансформации. Таким образом, кроме демонстрации, что ряска может культивироваться в жидкой среде, этот эксперимент показывает, что применение полиэтиленовой подложки для культивирования ряски увеличивало эффективность трансформации и уменьшало время, необходимое для получения трансгенных линий ряски. Эти открытия показывают, что система на основе ряски обеспечивает ценный подход для скрининга нуклеотидных последовательностей на основе целого растения.
Пример 2: Трансформация и регенерация ряски в формате высокой плотности
Применение канамицина в качестве селективного маркера
В этом примере экспрессионные векторы, штаммы Agrobacterium и культуры клубеньков ряски были такими же, как и описанные в примере 1. Культуры клубеньков, используемые в этом эксперименте, были двухнедельными. Совместное культивирование выполняли, как описано в примере 1. Для деконтаминации и селекции культуры клубеньков переносили в 24-луночный планшет, снабженный полиэтиленовыми подложками, содержащий среду Мурашиге и Скуга рН 5,6 с 3% сахарозой, 1 мкМ 2,4-дихлорфеноксиацетатом, 2 мкМ бензиладенином, 500 мг/л цефотаксима и 200 мг/л сульфата канамицина.
На следующий день среду в 24-луночных планшетах заменяли следующим образом. Старую среду удаляли, добавляли 200 мкл свежей среды и избыток среды удаляли. Добавляли 200 мкл дополнительной среды и удаляли, как описано выше. Добавляли дополнительно 200 мкл среды. Если среда поднималась выше уровня полиэтиленовой подложки, избыток удаляли.
На следующий день среду в 24-луночных планшетах заменяли, как описано выше. Затем среду заменяли каждые два дня в течение приблизительно 2 дополнительных недель. В этот момент регистрировали рост культур клубеньков. 20 из 24 лунок содержали живые каллусные клетки.
Затем культуры клубеньков поддерживали в 0,5Х среде Шенка и Гильдебрандта, содержащей 3% сахарозу, 200 мг/л канамицина и 500 мг/л цефотаксима, и замену среды выполняли каждые два дня в течение приблизительно четырех недель и затем один раз в неделю в течение четырех дополнительных недель. Приблизительно спустя одну неделю после перехода на среду Шенка и Гильдебрандта клетки из 5 лунок окрашивали для детектирования экспрессии GUS. Результаты были следующими:
| Номер пробы | Окрашивание |
| 1 | большие и малые CUS+-пятна |
| 4 | большие и малые CUS+-пятна |
| 8 | большие и малые CUS+-пятна |
| 18 | ˜25% каллуса является CUS+ |
| 21 | большие CUS+-пятна |
После 8 недель в селективных условиях культуры ряски обнаруживали три картины роста. 16% культур обнаруживали быстрый рост, при котором лунка была почти полностью заполнена талломами ряски; 62% этих культур проявляли средний рост, при котором лунка была приблизительно наполовину заполнена талломами ряски, и 12% этих проб обнаруживали медленный рост, при котором менее половины лунки была заполнена талломами ряски.
После 11 недель в селективных условиях 18 из 24 культур ряски содержали регенерирующие талломы, что соответствует общей эффективности трансформации более 75%.
Пример 3: Трансформация и регенерация ряски в формате высокой плотности
Применение G418 в качестве селективного маркера
Целью данного эксперимента было испытание способов для дополнительного увеличения эффективности трансформации ряски и уменьшения времени, необходимого для регенерации трансгенных линий ряски.
В этом примере экспрессионные векторы и штаммы Agrobacterium были такими же, как и описанные в примере 1. Клубеньки ряски получали из штамма L. minor 8627. Культуры клубеньков получали, по существу, как описано в примере 1, за исключением того, что некоторые пробы тканей клубеньков культивировали в среде Мурашиге и Скуга, дополненной 3% сахарозой, 0,4% бактоагаром Difco, 1 мкМ 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислотой и 2 мкМ бензиладенином (называемые "контрольными" пробами), и некоторые пробы тканей клубеньков выращивали на 0,5Х среде Шенка и Гильдебрандта, содержащей те же самые добавки (называемые "предобработанными" пробами).
Совместное культивирование выполняли, как описано в примере 1. Для деконтаминации и селекции культуры клубеньков переносили в 24-луночный планшет, снабженный пористыми полиэтиленовыми подложками, содержащий 560 мкл на лунку среды Мурашиге и Скуга рН 5,6 с 3% сахарозой, 1 мкМ 2,4-дихлорфеноксиацетатом, 2 мкМ бензиладенином, 500 мг/л цефотаксима и G418 в концентрации 25 мг/л, 50 мг/л, 100 мг/л или 200 мг/л.
Среду ряски заменяли, как описано в примере 2. G418 обеспечивал сильное селективное давление, так что нетрансформированный каллус убивался после 3 недель селекции. Большое число регенерированных талломов ряски наблюдали после всего лишь шести недель селекции. После восьми недель определяли эффективность трансформации, которая показана ниже:
| Обработка | Число полученных трансгенных линий (из 12) | % трансформации |
| G418-25 | 8 | 66 |
| G418-50 | 10 | 83 |
| G418-100 (предобраб.) | 10 | 83 |
| G418-100 (контроль) | 9 | 75 |
| G418-200 | 9 | 75 |
Этот пример демонстрирует, что способы данного изобретения могут быть использованы для получения трансгенных линий ряски всего лишь за шесть недель с эффективностью трансформации, большей, чем 80%.
Пример 4: Идентификация белковых вариантов, имеющих представляющую интерес биологическую функцию
Следующий пример относится к идентификации варианта природно встречающегося полипептида, где этот вариант отличается от природно встречающегося полипептида, по меньшей мере, одним свойством.
Для получения таких вариантов кодирующую последовательность полипептида подвергают насыщающему мутагенезу для получения популяции нуклеотидных последовательностей, каждая из которых кодирует аминокислотный вариант исходного кодируемого полипептида. Такие способы известны в данной области и описаны, например, в патентах США с номерами 6096548, 6117679, 6132970, 6165793 и 6180406, включенных здесь путем отсылки.
Для идентификации нуклеотидной последовательности, кодирующей вариант, имеющий представляющее интерес свойство, получают популяцию вариантных нуклеотидных последовательностей, как описано выше, клонируют в бинарный вектор Agrobacterium и трансформируют в Е. coli. Приблизительно 5000-10000 колоний отбирают из этой библиотеки и соответствующими плазмидами трансформируют E.coli способом электропорации. Отдельные колонии Agrobacterium отбирают для применения в трансформации ряски с использованием автоматического способа отбора, известного в данной области (см., например, Uber et al. (1991) Biotechniques 11(5):642-647 и Watson et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20:4599-4606, включенные здесь путем отсылки).
Препараты одиночных колоний Agrobacterium добавляют к лункам (одна, две или три лунки на одну колонию Agrobacterium) 24-луночного планшета, который специально приспособлен для манипуляций с культурами ряски посредством добавления фильтра-подложки в каждую лунку (см. предварительную заявку на патент США с регистрационным номером 60/294430, поданную 30 мая 2001 г., и заявку на патент США, озаглавленную "Plate and Method for High Throughput Screening", поданную 28 мая 2002 г., включенные здесь путем отсылки), и в каждую лунку добавляют растения ряски, клубеньки ряски или клетки суспензии ряски. Стадии совместного культивирования, селекции и регенерации проводят в специально приспособленном 24-луночном планшете, как описано в предыдущем примере. Все переносы жидкостей выполняют с использованием автоматизированных процедур манипулирования планшетом и манипулирования жидкостями.
После регенерации трансгенные растения ряски анализируют на экспрессию вариантного полипептида, имеющего представляющее интерес свойство. В некоторых случаях исходно кодируемый полипептид содержит последовательность, управляющую его секрецией. В этих случаях среду после культивирования трансгенной ряски удаляют и анализируют для определения присутствия вариантного полипептида, имеющего представляющее интерес свойство. Такие анализы проводят с использованием высокопроизводительных способов скрининга, хорошо известных в данной области.
В случаях, когда полипептид экспрессируется в ткани ряски, используют автоматизированную технологию для разрушения ткани ряски и экстракции экспрессируемого полипептида. Затем этот экстракт анализируют на присутствие вариантного полипептида, имеющего представляющее интерес свойство.
Если лунка, содержащая ряску, экспрессирующую представляющий интерес вариант, содержит множественные трансгенные линии, талломы из этой лунки разделяют на отдельные индивидуумы и затем анализируют для определения, экспрессирует ли индивидуальная линия вариантный полипептид, имеющий представляющее интерес свойство.
Пример 5: Скрининг экспрессионных библиотек кДНК в ряске
Этот пример относится к скринингу кДНК-библиотек на нуклеотидные последовательности, модулирующие представляющую интерес биологическую реакцию.
Экспрессионную кДНК-библиотеку трансформируют в Agrobacterium электропорацией и культуры Agrobacterium получают из отдельных колоний и поддерживают в 1534-луночных планшетах. Трансформированную Agrobacterium совместно культивируют с культурами ряски, как описано в предыдущем примере. Трансгенные растения ряски регенерируют, как описано, и затем анализируют их реакцию на изменения в окружающей среде, например изменения температуры, изменения длины дня, изменения водного потенциала, изменения освещенности, подвергание действию патогенов и подвергание действию токсинов. Единственная коллекция трансгенных клеточных линий ряски может быть использована для скрининга на кодируемые белки, вовлеченные в ряд различных реакций.
Все публикации и патентные заявки, упоминаемые в данном описании, определяют уровень специалистов в области, к которой относится данное изобретение. Все публикации и патентные заявки включены здесь путем отсылки в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация или патентная заявка было особо и индивидуально указана как включенная путем отсылки.
Хотя приведенное выше изобретение было описано в некоторых деталях при помощи примеров для целей ясности понимания, должно быть очевидно, что могут осуществляться некоторые изменения и модификации, лежащие в рамках прилагаемой формулы изобретения.
1. Высокопроизводительный способ идентификации молекулы нуклеиновой кислоты с представляющей интерес биологической функцией, предусматривающий стадии:
(a) трансформация культуры растений ряски, культуры клубеньков ряски, суспензионной культуры ряски или клеточной культуры протопластов ряски тестируемой нуклеотидной последовательностью, содержащей кодирующую последовательность для полипептида;
(b) выращивание культуры растений ряски, культуры клубеньков ряски, суспензионной культуры ряски или клеточной культуры протопластов ряски в таких условиях, что полипептид, кодируемый тестируемой нуклеотидной последовательностью, экспрессируется; и
(c) определение того, модулирует ли полипептид, кодируемый тестируемой нуклеотидной последовательностью, биологическую реакцию, где тестируемую нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, который модулирует биологическую реакцию, идентифицируют как молекулу нуклеиновой кислоты с представляющей интерес биологической функцией.
2. Способ по п.1, в котором указанная биологическая реакция выбрана из группы, включающей в себя реакцию на изменения температуры, реакцию на изменения в длине дня, реакцию на изменения водного потенциала, реакцию на изменения освещенности, реакцию на подвергание действию патогенов, реакцию на подвергание действию токсинов, реакцию на гормоны растений или реакцию на регуляторы роста растений.
3. Способ по п.1, в котором скорость роста культуры растений ряски, культуры клубеньков ряски, суспензионной культуры ряски или клеточной культуры протопластов ряски, которая трансформирована указанной молекулой нуклеиновой кислоты, является измененной в сравнении со скоростью роста культуры растений ряски, культуры клубеньков ряски, суспензионной культуры ряски или клеточной культуры протопластов ряски, которая не трансформирована указанной молекулой нуклеиновой кислоты, и в котором способность полипептида модулировать биологическую реакцию определяют путем определения скорости роста культуры растений ряски, культуры клубеньков ряски, суспензионной культуры ряски или клеточной культуры протопластов ряски, трансформированной указанной тестируемой нуклеотидной последовательностью.
4. Способ по п.3, в котором скорость роста культуры растений ряски, культуры клубеньков ряски, суспензионной культуры ряски или клеточной культуры протопластов ряски, которая трансформирована указанной молекулой нуклеиновой кислоты, является увеличенной в сравнении со скоростью роста культуры растений ряски, культуры клубеньков ряски, суспензионной культуры ряски или клеточной культуры протопластов ряски, которая не трансформирована указанной молекулой нуклеиновой кислоты, при тех же самых селективных условиях роста, и скорость роста культуры растений ряски, культуры клубеньков ряски, суспензионной культуры ряски или клеточной культуры протопластов ряски, трансформированной указанной тестируемой нуклеотидной последовательностью, определяют при селективных условиях роста.
5. Способ по п.3, в котором скорость роста культуры растений ряски, культуры клубеньков ряски, суспензионной культуры ряски или клеточной культуры протопластов ряски, которая трансформирована указанной молекулой нуклеиновой кислоты, является уменьшенной в сравнении со скоростью роста культуры растений ряски, культуры клубеньков ряски, суспензионной культуры ряски или клеточной культуры протопластов ряски, которая не трансформирована указанной молекулой нуклеиновой кислоты, при тех же самых селективных условиях роста, и скорость роста культуры растений ряски, культуры клубеньков ряски, суспензионной культуры ряски или клеточной культуры протопластов ряски, трансформированной указанной тестируемой нуклеотидной последовательностью, определяют при селективных условиях роста.
6. Способ по п.4, в котором селективные условия роста содержат, по меньшей мере, одно условие из следующих: высокую концентрацию соли, ограничивающие уровни света, ограничивающий рН, присутствие патогенов и присутствие токсинов.
7. Способ по п.1, в котором культура растений ряски, культура клубеньков ряски, суспензионная культура ряски или клеточная культура протопластов ряски трансформирована инокуляцией Agrobacterium, содержащей указанную тестируемую нуклеотидную последовательность.
8. Способ по п.1, в котором культура растений ряски, культура клубеньков ряски, суспензионная культура ряски или клеточная культура протопластов ряски трансформирована баллистической бомбардировкой.
9. Способ по п.1, в котором культура растений ряски, культура клубеньков ряски, суспензионная культура ряски или клеточная культура протопластов ряски трансформирована электропорацией.
10. Способ по п.1, в котором клеточная культура протопластов ряски трансформирована, и способом трансформации является опосредованная полиэтиленгликолем (ПЭГ) трансформация.
11. Способ по п.1, в котором культура растений ряски, культура клубеньков ряски, суспензионная культура ряски или клеточная культура протопластов ряски выбраны из группы, состоящей из рода Spriodela, рода Wolffia, рода Wolfiella и рода Lemna.
12. Способ по п.11, в котором указанное растение ряски или клубенек ряски выбраны из группы, состоящей из Lemna minor, Lemna miniscula, Lemna aequinocitalis и Lemna gibba.
13. Способ по п.1, в котором способность полипептида модулировать биологическую реакцию определяют биохимическим способом анализа.
14. Способ по п.1, в котором способность полипептида модулировать биологическую реакцию определяют физиологическим способом анализа.
15. Способ по п.1, в котором способность полипептида модулировать биологическую реакцию определяют по фенотипическому изменению.
16. Способ по п.1, в котором полипептид, модулирующий биологическую реакцию, имеет сайт связывания для агента, и присутствие полипептида, модулирующего биологическую реакцию, определяют путем детектирования образования комплекса между указанным полипептидом, модулирующим биологическую реакцию, и указанным агентом.
17. Способ по п.5, в котором селективные условия роста содержат, по меньшей мере, одно условие из следующих: высокую концентрацию соли, ограничивающие уровни света, ограничивающий рН, присутствие патогенов и присутствие токсинов.
