Способ выявления легионелл в вегетативном и некультивируемом состояниях

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для выявления возбудителя пневмонии человека. Способ предусматривает выявление легионелл путем выращивания исследуемой пробы на плотной питательной, селективной среде СЭЛ с использованием средства реверсии. В качестве средства реверсии используется комменсальная культура Neisseria sp. РПЧИ К-25, которую наносят совместно с пробой на питательную среду и равномерно распределяют на ее поверхности. После этого образцы подсушивают в термостате при 37°С. Затем инкубируют в термостате при той же температуре 6-8 суток. При этом учет результатов проводят на 3-4 сутки инкубации с параллельным сравнением без участия ревертирующего средства. Если в исследуемой пробе присутствуют клетки легионелл в вегетативном состоянии, то число колоний на сравниваемых образцах одинаково. В вариантах присутствия клеток легионелл в некультивированном состоянии наблюдают рост их числа в толще «биопленки» комменсальной культуры Neisseria sp. РПЧИ К-25. Изобретение позволяет повысить эффективность выявления легионелл в вегетативном и некультивируемом состояниях. 1 табл.

 

Предлагаемое изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к микробиологии возбудителя пневмоний человека - грамотрицательных бактерий легионелл, и может быть использовано для выявления этих бактерий, находящихся как в вегетативном, так и в некультивируемых состояниях /НС/.

В настоящее время известны многочисленные факторы, которые при воздействии на бактерии индуцируют у них состояние, называемое некультивируемым, когда возбудитель, сохраняя жизнеспособность, не может расти на обычных питательных средах наилучшего качества, и следовательно, не поддается выделению классическим бактериологическим методом. Создание эффективных методов выделения бактерий в НС представляет актуальную задачу. Ее решение возможно при использовании факторов реверсии НС, которые, будучи введенными в питательную среду, позволяют переводить НС в вегетативное и получать их рост на обычных средах.

Наиболее близким по решаемой задаче является способ выделения некультивируемых форм микрококков посредством Micrococcus luteus (см. Kaprelyantz A.S., Mukamolova G.V., Kelle D.B. // Dormancy in stationary phase cultures of Micrococcus luteus: flow cytometric analysis of starvation and resuscitation // FEMS Microbiol. Lett - 1994 - 115 - p.347 - 352), где микроорганизм Micrococcus luteus, являясь средством реверсии в жидкой среде, восстанавливает рост некультивируемых состояний.

Однако для выделения легионелл в некультивированном состоянии данный микроорганизм малоэффективен, так как малоактивен по отношению к искомой бактерии. Кроме того, использование жидкой среды крайне затрудняет выделение чистой культуры легионелл.

Технической задачей предлагаемого изобретения является повышение эффективности способа выявления вегетативных и некультивируемых состояний легионелл.

Поставленная задача достигается тем, что в известном способе выявления легионелл в вегетативном и некультивируемом состояниях путем выращивания исследуемой пробы на питательной среде с использованием средства реверсии в качестве последней используют комменсальную культуру Neisseria sp. РПЧИ К-25, в концентрации 10⁹ кл/мл, которую наносят в количестве 0,05 мл совместно с пробой в объеме 0,1 мл на плотную, селективную питательную среду СЭЛ и равномерно распределяют на ее поверхности, после этого образцы 30 минут подсушивают в термостате при 37°С, а затем инкубируют в течение 6-8 суток при температуре 37°С, при этом учет результатов посевов проводят на 3-4 сутки инкубации с параллельным сравнением с образцами без участия ревертирующего средства, причем если в исследуемой пробе присутствуют клетки легионелл в вегетативном состоянии, то число колоний легионелл на сравниваемых образцах одинаково, а в вариантах присутствия клеток легирнелл в некультивированном состоянии наблюдают рост их числа в толще «биопленки» комменсальной культуры Neisseria sp. РПЧИ К-25.

Для осуществления способа используют комменсальную культуру Neisseria sp., которая хранится в коллекции музея живых культур Ростовского противочумного института (РПЧИ) под № К-25.

Кроме того, для проведения способа необходима селезеночно-элективная легионелезная плотная питательная среда (СЭЛ - агар).

Последняя разработана в РПЧИ (разрешение МИБП РФ на применение. Протокол №1 от 19.02.1998 г.).

Культурально - морфологические признаки Neisseria sp. РПЧИ К-25.

Культура выделена из воды системы горячего водоснабжения. Растет на плотной питательной среде СЭЛ, на которой на 2-3 сутки при инкубации при 37°С образуются мелкие, до 1 мм, круглые прозрачные с чуть выпуклым центром колонии. При обильном посеве культура образует на 2-е сутки газон - тонкую бесцветную полупрозрачную пленку - «биопленку». Пигментацией культура не обладает, на простых плотных средах (агар Хоттингера, мясо-пептонный агар, агар Мартена) не растет. В бульоне Хоттингера с 1% глюкозой обнаруживает очень медленный рост на 5-е сутки.

Морфологически культура представляет собой грамотрицательные кокки бобовидной формы, парные, размером 0,5 - 1,5 мкм (диплококки). К плеоморфизму культура не склонна.

Культура на среде СЭЛ каталазо- и оксидазопозитивна. Рост на данной среде усиливается в присутствии 0,1% этанола. Сахара (глюкозу, сахарозу, мальтозу, лактозу) в бульоне Хоттингера не разлагает. На кровяном агаре не растет, гемолитическими свойствами не обладает. На агаре Хоттингера с 5% желчью не растет. Нитриты восстанавливает, нитраты - нет, уреазоотрицательна, на среде Симмондса не растет, цитрат не утилизирует.

Культура резистентна к 15 ед. пенициллина, в присутствии 15 ед./мл полимиксина В и 10 мкг/мл ванкомицина растет.

Культура легко смывается дистиллированной водой с поверхности агара СЭЛ, сохраняет жизнеспособность во взвеси при температуре холодильника 6°С в течение года.

Культура невирулентна для белых мышей: внутрибрюшинное заражение 10⁹ кл не вызывает гибели животных. Согласно «Определителю бактерии Берджи» т.2, М.: Мир. - 1997, культура отнесена к роду Neisseria sp. К-25.

Реверсия НС легионелл происходит непосредственно в биопленке - газоне Neisseria sp. РПЧИ К-25 в процессе совместного культивирования обоих микроорганизмов в течение 3-4 сут. при 37°С на плотной среде СЭЛ. В тонкой пленке диплококков развиваются типичные колонии легионелл из клеток, первоначально находившихся в некультивируемом состоянии. Данные колонии можно наблюдать либо невооруженным глазом, либо с помощью стереомикроскопа с косым освещением сверху. Отсев колоний легионелл производится бактериологической иглой.

Характеристика питательной среды.

Селективность среды обеспечивается присутствием антибиотиков полимиксина В 30-40 ед/мл и ванкомицина 5-10 мкг/мл. Непременное условие эффективного применения: высокая чувствительность (прорастаемость) среды, когда при контрольном посеве 100 кл легионелл должно вырастать не менее 80 колоний легионелл в типичной форме. Скорость роста микроорганизма на среде СЭЛ - видимые колонии появляются на третьи сутки инкубации при 35-37°С, эффективность роста - через 72 часа роста колонии легионелл должны достигать размера 1-2 мм с типичной мелковолокнистой-зернистой микроструктурой с зеленоватым свечением при наблюдении в стереомикроскопе с косым освещением сверху. Культура - индуктор реверсии НС состояний легионелл должна образовывать тонкую биопленку на вторые сутки инкубации при посеве 10⁸-10⁹ кл Neisseria sp. РПЧИ К-25 на поверхности агара.

Способ осуществляется следующим образом.

Перед посевом пробы внешней среды и от больных должны подвергаться общепринятой обработке. Относительно чистые пробы - водопроводная вода, вода из систем горячего водоснабжения, различные конденсаты - концентрируются либо осаждением стерильным углем, либо фильтрованием. Бронхосмывы человека, являясь практически «чистыми», требуют разведения стерильной дистиллированной водой в 1:50-1:100 раз для снятия возможного ингибирующего действия антибиотиков. Пробы, сильно контаминированные посторонней микрофлорой - вода естественных водоемов, рек, озер, смывы с различных поверхностей, следует выдержать в кислотном буфере с рН 2,2 в течение 5-7 мин при соотношении объемов 1:10.

После подготовки пробы последние высевают на питательную среду СЭЛ в следующем порядке.

Для каждой пробы необходимо минимум две чашки Петри с разлитым по 30 мл селективным агаром СЭЛ, подсушенным при 37°С в течение 30-40 мин. На первую чашку с агаром наносят 0,1 мл пробы и распределяют ее шпаделем по поверхности агара. На вторую чашку с агаром наносят 0,1 мл пробы и в эту же каплю вносят 0,05 мл взвеси рабочей культуры Neisseria sp. РПЧИ К-25 с концентрацией 10⁹ кл/мл, смешивают их и распределяют шпаделем по всей поверхности агаровой пластинки. Обе чашки с агаром подсушивают в термостате до полного высыхания засеянных жидкостей и далее посевы инкубируют при 37°С в течение 8 суток. Отдельно высеивают на среду СЭЛ рабочую культуру Neisseria sp. РПЧИ К-25 для проверки ее специфической чистоты.

Учет результатов посева проводят на третьи-четвертые сутки инкубации, и затем чашки просматривают ежедневно.

Результаты исследования в виде роста культуры легионелл будут различны в зависимости от наличия или отсутствия в исследуемой пробе клеток легионелл в том или ином состоянии.

Если в исследуемой пробе находились клетки легионелл в вегетативном состоянии, число колоний легионелл, выросших на агаре СЭЛ при обычном посеве (т.е. без культуры-ревертанта) будет одинаковым с таковым на агаре, где посев производился совместно с культурой Neisseria sp. K-25. Следует отметить, что морфология колоний легионелл, выросших как на поверхности агара СЭЛ, так в тонкой «биопленке» K-25 не различаются.

Если в исследуемой пробе находились клетки легионелл в некультивируемом состоянии, то на первой чашке (без культуры-реверанта) роста колоний легионелл не будет, т.к. такие клетки не в состоянии расти на агаре СЭЛ, но на второй чашке будут появляться типичные колонии легионелл из клеток, реверсировавших в толще биопленки K-25. Численное выражение эффекта реверсии и роста легионелл на второй чашке будет зависеть от начального числа клеток в НС. Число выросших колоний может достигать десятков, сотен и даже тысяч, в то время как на первой чашке рост отсутствует.

Если в исследуемой пробе находились легионеллы в вегетативном состоянии и клетки в некультивируемом состоянии, то после посева и инкубации возможен рост колоний легионелл как на первой чашке с агаром СЭЛ, так и на второй, но число колоний в последнем случае будет закономерно больше, с превышением в несколько раз и более. Достоверным критерием нахождения клеток в НС в пробе может считаться превышение не менее чем на 50% и более.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет регистрировать и выявлять легионеллы из внешней среды и от больных людей как в вегетативной форме, так и в некультивируемом состоянии.

Эффективность описанного способа подтверждается следующими примерами.

Пример 1. Легионеллы в некультивируемом состоянии получают при помощи старвации (голодания) в дистиллированной воде. В качестве эталонного штамма взят типовой штамм Legionella pneumophila Philadelphia - 1. В стеклянную колбу объемом 100 мл, содержащую 50 мл стерильной дистиллированной воды, вносят культуру легионелл, чтобы начальная концентрация клеток была 10⁶ кл /мл, и инкубируют данный микрокосм при 37°С в течение пяти недель. Контрольные высевы из микрокосма проводят дважды: на 3,5 и 4-й неделе инкубации. Пробы жидкости, содержащие легионеллы, подвергшиеся выдерживанию и голоданию в дистиллированной воде, в результате чего клетки должны переходить в состояние некультивируемости, по 0,05 мл высевают на агаровые пластинки СЭЛ в двух чашках: на одной обычным методом, на другой, смешивая с каплей /0,05 мл/ культуры Neisseria sp. K-25, распределяют шпателем по поверхности чашек, подсушивают и инкубируют в течение 8 сут. Подсчитывают число колоний, выросших на агаре СЭЛ в той и другой чашках. В таблице представлены результаты исследования по примеру 1. Как видно из таблицы, способ позволяет определить, что в популяции микрокосма большая часть клеток легионелл перешла в состояние некультивируемости на 3,5 неделях инкубации, а на 4-й неделе уже вся популяция находилась в данном состоянии. Предлагаемый способ в отличие от классического метода исследования, т.е. посевом на обычную чашку агара СЭЛ, способен выявлять легионеллы в некультивируемом состоянии, индуцированном голоданием в дистиллированной воде.

Пример 2. Легионеллы в некультивируемом состоянии получают при помощи метода-системы, создающей поток свободных радикалов, являющейся аналогом фагоцитарной атаки на микроорганизм.

В микрокосм с дистиллированной водой вводят метионин - 0,015 М и рибофлавин - 5·10⁴ М, а затем культуру легионелл L. pneumophila Philadelphia - 1, чтобы начальная концентрация клеток также составляла 10⁶ кл/мл. Микрокосмы экспонируют при рассеянном дневном свете при комнатной температуре несколько часов. Пробы жидкости из микрокосмов по 0,05 мл отбирают через 1 и 2 часа инкубации, засевают на чашки с агаром СЭЛ, как описано раннее, т.е. на агар СЭЛ обычным способом и совместно с культурой К-25, подсушивают и инкубируют при 37°С в течение 8 сут. Далее учитывают рост легионелл. Результаты представлены в таблице. Как видно из таблицы, уже через один час инкубации большая часть популяции легионелл находилась в некультивируемом состоянии, которое, тем не менее, можно было зарегистрировать с помощью предлагаемого метода. Указанный метод дал возможность определить, что на втором часу инкубации уже вся популяция практически находилась в некультивируемом состоянии.

Пример 3. Легионеллы в некультивируемом состоянии получают посредством индуцирования дезинфектантом - 0,01% хлорной известью. Начальная концентрация легионелл в микрокосме на этот раз составляла 10³ кл/мл. Объем высеваемых проб - 0,05 мл, время взятия проб - через 1 час и 1,5 часа инкубации. По результатам, представленным в таблице, видно, что процесс некультивируемости на первом часу инкубации у легионелл активно развивался, а к полутора часам вся популяция находилась в НС.

Таким образом, примеры 1, 2, 3 демонстрируют, что предлагаемый способ легко обнаруживает легионеллы, находящиеся как в вегетативной форме, так и в некультивируемом состоянии, индуцированном тремя различными методами, моделирующими сходные ситуации во внешней среде.

Пример 4. Предлагаемый метод проверен нами при плановых обследованиях системы горячего водоснабжения ТЭЦ - 2 г.Ростова-на-Дону. Всего исследовано 60 проб воды, которые засевались одновременно классическим методом, т.е. обычно на агар СЭЛ, и описанным способом, т.е. применением культуры-индуктора реверсии НС Neisseria sp. РПЧИ К-25. На обычной среде СЭЛ выделено 53 культуры, во втором случае - 86, т.е. на 40% больше. Данные результаты свидетельствуют, что в горячей воде легионеллы способны переходить в некультивируемое состояние, откуда их можно выделить лишь с применением техники реверсии НС.

Предлагаемый способ может быть использован при обследовании различных объектов внешней среды и больных, что позволит повысить его эффективность в выделении вегетативных и некультивируемых состояний легионелл, а также улучшить качество эпидемиологического надзора за легионеллезом.

№ примера	Метод индукции некультивируемого состояния у легионелл	Срок взятия проб	Число колоний легионелл, выросших на среде СЭЛ при посеве проб
классич. методом	с применением «биопленки» К-25
1.	Старвация в водопроводной воде	3,5нед.,	80	300
4 нед	нет	300
2.	Воздействие свободных радикалов /метионин, рибофлавин, дневной свет/	1 ч	72	300
2 ч	нет	300
3.	Хлорная известь 0,01%	1 ч	4	86
1,5 ч	нет	60

Способ выявления легионелл в вегетативном и некультивируемом состояниях путем выращивания исследуемой пробы на питательной среде с использованием средства реверсии, отличающийся тем, что в качестве ревертирующего средства используют комменсальную культуру Neisseria sp. РПЧИ К-25, в концентрации 10⁹ кл/мл, которую наносят в количестве 0,05 мл совместно с пробой в объеме 0,1 мл на плотную селективную питательную среду СЭЛ и равномерно распределяют на ее поверхности, после этого образцы 30 мин подсушивают в термостате при 37°С, а затем инкубируют в течение 6-8 сут при температуре 37°С, при этом учет результатов посевов проводят на 3-4 сут инкубации с параллельным сравнением с образцами без участия ревертирующего средства, причем если в исследуемой пробе присутствуют клетки легионелл в вегетативном состоянии, то число колоний легионелл в сравниваемых образцах одинаково, а в вариантах присутствия клеток легионелл в некультивированном состоянии наблюдают рост их числа в толще биопленки комменсальной культуры Neisseria sp. РПЧИ К-25.