Способ получения l-аминокислот с использованием бактерии, принадлежащей к роду escherichia

Авторы патента:

Сливинская Екатерина Александровна (RU)

Рыбак Константин Вячеславович (RU)

СУЗУКИ Томоко (JP)

Козлов Юрий Иванович (RU)

C12P13/04 - альфа- или бета-аминокислоты

C12N1/21 - модифицированные введением чужеродного генетического материала

Владельцы патента RU 2311454:

Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU)
Аджиномото Ко., Инк. (JP)

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения L-аминокислоты с использованием бактерии рода Escherichia, в котором указанная бактерия модифицирована таким образом, что активность пермеазы L-арабинозы в данной бактерии повышена. Изобретение позволяет получать L-аминокислоты с высокой степенью эффективности. 2 н. и 7 з.п. ф-лы, 2 ил., 2 табл.

Область техники

Настоящее изобретение относится к способу получения L-аминокислоты методом ферментации, и более конкретно, к генам, положительно влияющим на результат данной ферментации. Данные гены важны для улучшения продукции L-аминокислоты, например, для продукции L-треонина, L-лизина, L-гистидина, L-фенилаланина, L-аргинина, L-триптофана и L-глутаминовой кислоты.

Описание предшествующего уровня техники

Традиционно L-аминокислоты в промышленном масштабе получают методом ферментации с использованием штаммов микроорганизмов, выделенных из природных источников, или их мутантов, специально модифицированных для того, чтобы увеличить продукцию L-аминокислот.

Описано множество методов увеличения продукции L-аминокислот, например трансформация микроорганизмов рекомбинантной ДНК (см., например, патент США 4278765). Другие методы увеличения продукции включают повышение активности ферментов, вовлеченных в биосинтез аминокислот, и/или уменьшение чувствительности целевого фермента к ингибированию продуцируемой L-аминокислотой по типу обратной связи (см., например, заявку РСТ WO 95/16042 или патенты США 4346170; 5661012 и 6040160).

Известны различные штаммы, использующиеся для производства L-треонина методом ферментации, в том числе штаммы с увеличенными активностями ферментов, вовлеченных в биосинтез L-треонина (патенты США 5175107; 5661012; 5705371; 5939307; европейский патент ЕР0219027), штаммы, устойчивые к некоторым химических реагентам, таким как L-треонин и его аналоги (заявка РСТ WO 01/14525 A1, европейская заявка ЕР 301572 А2, патент США 5376538), штаммы, в которых устранена чувствительность целевого фермента к ингибированию продуцируемой аминокислотой или ее побочными продуктами по типу обратной связи (патенты США 5175107 и 5661012), штаммы с инактивированными ферментами системы деградации треонина (патенты США 5939307 и 6297031).

В настоящее время известный штамм ВКПМ В-3996 (патенты США 5175107 и 5705371) является одним из лучших продуцентов треонина. Для создания штамма ВКПМ В-3996 в родительский штамм Е.coli K-12 (ВКПМ В-7) были введены несколько мутаций и плазмида, описанная ниже. Мутантный ген thrA (мутация thrA442) кодирует белок аспартокиназагомосериндегидрогеназу I и устойчив к ингибированию треонином по типу обратной связи. Мутантный ген ilvA (мутация ilvA442) кодирует белок треониндеаминазу, обладающую пониженной активностью, результатом чего является пониженный уровень биосинтеза изолейцина и фенотип с недостатком по изолейцину типа "leaky". В бактериях с мутацией ilvA442 транскрипция оперона thrABC не репрессируется изолейцином, поэтому такие штаммы очень эффективны для продукции треонина. Инактивация гена tdh приводит к предотвращению деградации треонина. В указанный штамм была введена генетическая детерминанта ассимиляции сахарозы (гены scrKYABR). Для увеличения экспрессии генов, контролирующих биосинтез треонина, в промежуточный штамм TDH6 была введена плазмида pVIC40, содержащая мутантный треониновый оперон thrA442BC. Количество треонина, накопленного в ходе ферментации этого штамма, достигает 85 г/л.

Для оптимизации основного пути биосинтеза желаемого соединения дальнейшее улучшение штаммов-продуцентов L-аминокислоты может быть осуществлено путем снабжения бактерии повышенными количествами сахаров в качестве источников углерода, например глюкозы. Несмотря на эффективность транспорта глюкозы системой PTS, доступность источника углерода у высокопродуктивного штамма может быть недостаточной.

Известно, что активный транспорт сахаров и других метаболитов в бактериальные клетки осуществляется при помощи нескольких транспортных систем.

Среди известных транспортных систем для утилизации L-арабинозы используются две индуцируемые транспортные системы. Низкоспецифичная пермеаза (К_м примерно 0.1 мМ) кодируется геном araE, расположенным на 61.3 минуте, и высокоспецифичная система (К_м - от 1 до 3 мкМ) кодируется опреоном araFG, расположенным на 44.8 минуте хромосомы Е.coli. Ген araF кодирует периплазматический связывающий белок (306 аминокислот) с функцией рецептора хемотаксиса, а локус araG кодирует как минимум один белок, расположенный на внутренней стороне мембраны. Как высоко-, так и низкоспецифичная системы транспорта находятся под контролем продукта гена araC и, таким образом, являются частью регулона ara (Escherichia coli and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F.C.Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996). Исследования в мембранных везикулах показали, что пермеаза L-арабинозы может транспортировать L-арабинозу с низкой эффективностью (140-320 мкМ), и что транспорт арабинозы сопряжен с транспортом протонов (Daruwalla, K.R. et al., Biochem. J., 200(3); 611-27 (1981)). Пермеаза L-арабинозы является членом Major Facilitator Superfamily (MFS) транспортеров (Griffith, J.K. et al., Curr. Opin. Cell Biol. 4(4); 684-95 (1992)). Поглощенная арабиноза катаболизируется в ксилулозо-5-фосфат группой ферментов, кодируемых опероном araBAD, и далее через пентозо-фосфатный путь (Escherichia coli and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F.C.Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996).

Тем не менее, в настоящее время нет сообщений, описывающих использование бактерии семейства Enterobacteriaceae с повышенной активностью пермеазы L-арабинозы для повышения продукции L-аминокислот.

Краткое описание чертежей

На Фиг.1 представлена структура хромосомной области Е.coli перед геном araE и структура интегрированного фрагмента ДНК, содержащего ген cat и гибридный промотор P_L-tac.

Фиг.2 представлено выравнивание аминокислотных последовательностей пермеаз арабинозы Escherichia coli (Ec), Shigella flexneri (Sf), Salmonella typhimurium (Sf), Klebsiella oxytoca (Ко) и Bacillus sublilis (Bs). Выравнивание производилось с использованием программы множественного выравнивания PIR Multiple Alignment (http://pir.georgetown.edu). Идентичные аминокислоты помечены звездочкой (*), похожие аминокислоты помечены двоеточием (:).

Описание изобретения

Целями настоящего изобретения являются повышение продуктивности штаммов-продуцентов L-аминокислоты и предоставление способа получения неароматических или ароматических L-аминокислот с использованием указанных штаммов.

Данные цели были достигнуты путем обнаружения того факта, что повышение экспрессии гена araE, кодирующего пермеазу арабинозы, может повысить продукцию L-аминокислот, таких как L-треонин, L-лизин, L-гистидин, L-фенилаланин, L-аргинин, L-триптофан и L-глутаминовая кислота.

Целью настоящего изобретения является предоставление бактерии-продуцента L-аминокислоты семейства Enterobacteriaceae, при этом указанная бактерия модифицирована таким образом, что активность пермеазы L-арабинозы в этой бактерии повышена.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, в которой активность указанной пермеазы L-арабинозы повышена путем усиления экспрессии гена, кодирующего пермеазу L-арабинозы.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, в которой активность указанной пермеазы L-арабинозы повышена путем модификации последовательности, контролирующей экспрессию гена, кодирующего пермеазу L-арабинозы, таким образом, что экспрессия указанного гена повышена, или путем увеличения количества копий указанного гена, кодирующего пермеазу L-арабинозы.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная бактерия дополнительно модифицирована таким образом, что активность глюкокиназы в ней повышена.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная бактерия выбрана из группы, состоящей из родов Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Pantoea, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella и Morganella.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, в которой вышеупомянутый ген кодирует пермеазу L-арабинозы, выбранную из группы, состоящей из:

(A) белка, включающего в себя аминокислотную последовательность, представленную в Списке последовательностей под номером 2 (SEQ ID NO:2); и

(B) варианта белка с аминокислотной последовательностью, представленной в Списке последовательностей под номером 2 SEQ ID NO:2, который обладает активностью пермеазы L-арабинозы.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, в которой вышеупомянутый ген, кодирующий пермеазу L-арабинозы, включает в себя ДНК, выбранную из группы, состоящей из:

(a) ДНК, которая включает в себя нуклеотидную последовательность с 1 по 1419 нуклеотид, представленную в Списке последовательностей под номером 1 (SEQ ID NO:1);

(b) ДНК, которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеотидной последовательностью с 1 по 1419 нуклеотид, представленной в Списке последовательностей под номером 1 (SEQ ID NO:1), или с зондом, который может быть синтезирован на основе указанной нуклеотидной последовательности, и кодирует белок, обладающий активностью премеазы L-арабинозы.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанные жесткие условия включают в себя такие условия, когда отмывка производится при 60°С и концентрации солей 1×SSC и 0.1% SDS в течение 15 минут.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная бактерия является бактерией-продуцентом L-треонина.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная бактерия далее модифицирована таким образом, что у указанной бактерии усилена экспрессия одного или нескольких генов, выбранных из группы, состоящей из:

- мутантного гена thrA, кодирующего аспартокиназагомосериндегидрогеназу I, и устойчивого к ингибированию треонином по типу обратной связи;

- гена thrB, кодирующего гомосеринкиназу;

- гена thrC, кодирующего треонинсинтазу.

- гена rhtA, предположительно кодирующего трансмембранный белок.

- гена asd, кодирующего аспартат-β-семиальдегиддегидрогеназу;

- гена aspC, кодирующего аспартатаминотрансферазу (аспартаттрансаминазу).

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная бактерия модифицирована таким образом, что у указанной бактерии усилена экспрессия указанного мутантного гена thrA, указанного гена thrB, указанного гена thrC и указанного гена rhtA.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная бактерия является бактерией-продуцентом L-лизина.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная бактерия является бактерией-продуцентом L-гистидина.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная бактерия является бактерией-продуцентом L-фенилаланина.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная бактерия является бактерией-продуцентом L-аргинина.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная бактерия является бактерией-продуцентом L-триптофана.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная бактерия является бактерией-продуцентом L-глутаминовой кислоты.

Также целью настоящего изобретения является предоставление способа получения L-аминокислоты, который включает в себя выращивание описанной выше бактерии в питательной среде, что приводит к накоплению L-аминокислоты в питательной среде, и выделение указанной L-аминокислоты из культуральной жидкости.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше метода, при этом указанной L-аминокислотой является L-треонин.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше метода, при этом указанной L-аминокислотой является L-лизин.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше метода, при этом указанной L-аминокислотой является L-гистидин.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше метода, при этом указанной L-аминокислотой является L-фенилаланин.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше метода, при этом указанной L-аминокислотой является L-аргинин.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше метода, при этом указанной L-аминокислотойа является L-триптофан.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше метода, при этом указанной L-аминокислотой является L-глутаминовая кислота.

Наилучший способ осуществления настоящего изобретения

Согласно настоящему изобретению, «бактерия-продуцент L-аминокислоты» означает бактерию, обладающую способностью к накоплению L-аминокислоты в питательной среде, когда указанная бактерия выращивается в указанной питательной среде. Способность к продукции L-аминокислоты может быть придана или улучшена путем селекции. Используемый здесь термин «бактерия-продуцент L-аминокислоты» также означает бактерию, которая способна к продукции L-аминокислоты и вызывает накопление L-аминокислоты в ферментационной среде в больших количествах, по сравнению с природным или родительским штаммом Е.coli, таким, как штамм Е.coli К-12, и предпочтительно означает, что указанный микроорганизм способен накапливать в среде целевую L-аминокислоту в количестве не менее, чем 0.5 г/л, более предпочтительно не менее, чем 1.0 г/л. Термин "L-аминокислоты" включает в себя L-аланин, L-аргинин, L-аспарагин, L-аспартат, L-цистеин, L-глутаминовую кислоту, L-глутамин, L-глицин, L-гистидин, L-изолейцин, L-лейцин, L-лизин, L-метионин, L-фенилаланин, L-пролин, L-серин, L-треонин, L-триптофан, L-тирозин и L-валин. Наиболее предпочтительны L-треонин, L-лизин, L-гистидин, L-фенилаланин, L-аргинин, L-триптофан и L-глутаминовая кислота.

Семейство Enterobacteriaceae включает в себя бактерии, принадлежащие к родам Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Pantoea, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella, Morganella и т.д. В частности, могут быть использованы бактерии, классифицированные как относящиеся к семейству Enterobacteriaceae, в соответствии с таксономией, используемой в базе данных NCBI (Национальный Центр Биотехнологической Информации - National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbinpost/Taxonomy/wgetorg?mode=Tree&id=1236&lvl=3&keep=1&srchmode=l&unlock). Бактерия, принадлежащая к роду Escherichia или Pantoea, предпочтительна.

Термин «бактерия, принадлежащая к роду Escherichia» означает, что бактерия относится к роду Escherichia в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. Примеры микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, использованного в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются Escherichia coli (E.coli).

Круг бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, не ограничен каким-либо образом, однако, например, бактерии, описанные в книге Neidhardt, F.C. et al. (Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Таблица 1), могут быть включены в число бактерий согласно настоящему изобретению.

Термин «бактерия, принадлежащая к роду Pantoea» означает, что бактерия относится к роду Pantoea в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. Недавно несколько видов Enterobacter agglomerans были классифицированы как Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis, Pantoea stewartii или подобные им, на основе анализа нуклеотидной последовательности 16S рРНК и т.д. (Int. J. Syst. Bacteriol., 43, 162-173 (1993)).

Бактерия согласно настоящему изобретению включает в себя штамм семейства Enterobacteriaceae, обладающий способностью к продукции L-аминокислоты и модифицированный таким образом, что активность пермеазы L-арабинозы в нем повышена. Кроме того, бактерия согласно настоящему изобретению включает в себя штамм семейства Enterobacteriaceae, обладающий способностью к продукции L-аминокислоты и не имеющий природной активности пермеазы L-арабинозы, который трансформирован фрагментом ДНК, кодирующим пермеазу L-арабинозы.

Термин "активность пермеазы L-арабинозы" означает активность транспорта сахаров, таких как L-арабиноза и L-глюкоза, в клетку. Активность пермеазы L-арабинозы может быть обнаружена и измерена с помощью метода, описанного у Henderson P.J. и Macpherson A.J. (Methods Enzymol., 125, 387-429 (1986)).

Термин "модифицирована таким образом, что активность пермеазы L-арабинозы повышена" означает, что удельная активность указанного белка в указанной бактерии выше, чем у немодифицированного штамма, например природного. Примеры такой модификации включают увеличение количества молекул пермеазы L-арабинозы на бактериальную клетку, повышение специфической активности молекулы пермеазы L-арабинозы и так далее. Кроме того, природный штамм, используемый для сравнения, включает, например, штамм Escherichia coli К-12. Согласно настоящему изобретению, в результате повышения внутриклеточной активности пермеазы L-арабинозы может быть повышено количество накопленной в культуральной жидкости L-аминокислоты, например L-треонина, L-лизина, L-гистидина, L-фенилаланина, L-аргинина, L-триптофана или L-глутаминовой кислоты.

Повышение в бактериальной клетке активности пермеазы L-арабинозы может быть достигнуто за счет усиления экспрессии гена araE, кодирующего пермеазу L-арабинозы. В качестве гена пермеазы L-арабинозы согласно настоящему изобретению могут быть использованы: любой ген araE, полученный из бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, также как и любой ген araE, полученный из других бактерий, таких как бактерии, принадлежащие к родам Bacillus, Klebsiella, Pantoea, Salmonella или Shigella. Гены araE, полученные из бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, предпочтительны.

Термин "усиление экспрессии гена" означает, что экспрессия данного гена выше, чем у немодифицированного штамма, например природного. Примеры такой модификации включают увеличение количества копий экспрессируемого гена(ов) в бактериальной клетке, повышение уровня экспрессии гена(ов) и так далее. Количество копий экспрессируемого гена можно измерить, например, с помощью рестрикции хромосомной ДНК с последующей гибридизацией по Саузерну с использованием зонда, синтезированного на основе нуклеотидной последовательности указанного гена, флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) и подобных им. Уровень экспрессии гена может быть измерен с помощью известных методов, включающих Нозерн блоттинг, количественный обратный ПЦР (RT-PCR) и подобные им. Кроме того, природные штаммы, которые можно использовать в качестве контроля, включают, например, штамм Escherichia coli К.-12 или штамм Pantoea ananatis FERM ВР-6614. В результате повышения внутриклеточной активности пермеазы L-арабинозы наблюдается накопление в питательной среде L-аминокислоты, например L-треонина, L-лизина, L-гистидина, L-фенилаланина, L-триптофана или L-глутаминовой кислоты.

Ген araE, кодирующий пермеазу L-арабинозы, а именно симпортер L-арабинозы/протона, из Escherichia coli уже известен (нуклеотиды, комплементарные нуклеотидам с номерами с 2978786 по 2980204 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1 в базе данных GenBank; gi:49175990). Ген araE расположен между открытой рамкой считывания ydeA и геном kduD на хромосоме Е.coli К-12. Также известны другие гены araE, кодирующие пермеазу L-арабинозы: ген araE из Shigella flexneri (нуклеотиды, комплементарные нуклеотидам с номерами с 2935806 по 2937224 в последовательности с инвентарным номером NP_838353.1 в базе данных GenBank; gi:30064182); ген araE из Salmonella typhimurium LT2 (нуклеотиды, комплементарные нуклеотидам с номерами с 3175802 по 3177220 в последовательности с инвентарным номером NP_461933.1 в базе данных GenBank; gi:16766318), ген araE из Klebsiella oxytoca (локус Р45598; gi:1168483) и подобные им. Ген araE из Escherichia coli согласно настоящему изобретению представлен последовательностью, приведенной в Списке последовательностей под номером 1 (SEQ ID NO:1).

При транспортировке в клетку глюкоза фосфорилируется с помощью глюкокиназы, кодируемой геном glk. Следовательно, также желательно модифицировать указанную бактерию таким образом, чтобы активность глюкокиназы в ней была повышена. Ген glk, кодирующий глюкокиназу из Escherichia coli, известен (номера нуклеотидов с 2506481 по 2507446 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1 в базе данных GenBank; gi:16127994). Ген glk расположен на хромосоме штамма Е.coli K-12 между открытыми рамками считывания b2387 и b2389.

При соответствующих условиях изомераза ксилозы, кодируемая геном xylA, также эффективно катализирует превращение D-глюкозы в D-фруктозу (Wovcha, M.G. et al., Appi Environ Microbiol. 45(4): 1402-4 (1983)). Следовательно, также желательно модифицировать указанную бактерию таким образом, чтобы активность изомеразы ксилозы в ней была повышена. Ген xylA, кодирующий изомеразу ксилозы из Escherichia coli, известен (номера нуклеотидов с 3728788 по 3727466 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank; gi:49175990). Ген xylA расположен на хромосоме штамма Е.coli K-12 между генами xylB и xylF.

Таким образом, гены araE, glk и xylA могут быть получены с помощью ПЦР (полимеразная цепная реакция; по White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)) с использованием праймеров, синтезированных на основе известной нуклеотидной последовательности данных генов. Гены, кодирующие пермеазу L-арабинозы из других микроорганизмов, могут быть получены сходным образом.

Ген araE, полученный из Escherichia coli, представлен ДНК, которая кодирует следующие белки (А) или (В):

(А) белок, аминокислотная последовательность которого представлена в последовательности, приведенной в Списке последовательностей под номером 2 (SEQ ID NO:2); или

(В) вариант белка, аминокислотная последовательность которого представлена в аминокислотной последовательности под номером 2 (SEQ ID NO:2) и который обладает активностью пермеазы L-арабинозы.

Используемый в настоящем изобретении термин "вариант белка" обозначает белок, с изменениями в аминокислотной последовательности, будь то делеции, вставки, добавки либо замены аминокислот, но при этом сохраняет полезный уровень желаемой активности, например полезный для повышения продукции L-аминокислоты. Количество аминокислотных изменений в варианте белка зависит от положения или типа аминокислотного остатка в трехмерной структуре белка. Оно может быть от 2 до 30, предпочтительно от 2 до 15 и более предпочтительно от 2 до 5 для белка (А). Такие изменения в вариантах могут иметь место в областях белка, не критичных для его функционирования. Это связано с тем, что некоторые аминокислоты обладают высокой гомологией друг к другу, поэтому такие изменения не вызывают значительных изменений в трехмерной структуре белка или его активности. Эти изменения в варианте белка имеют место в областях белка, которые не критичны для его функционирования. Таким образом, вариант белка (В) может быть представлен белком с гомологией не менее 70%, предпочтительно не менее 80%, предпочтительно не менее 90% и наиболее предпочтительно не менее 95% по отношению к полной аминокислотной последовательности пермеазы L-арабинозы, приведенной в Списке последовательностей под номером 2 (SEQ ID NO:2), до тех пор, пока сохраняется активность пермеазы L-арабинозы. Гомология между двумя аминокислотными последовательностями может быть определена с помощью хорошо известных способов, например компьютерной программы BLAST 2.0, которая учитывает три параметра: счет, идентичность и схожесть.

Для того, чтобы сохранялась активность белка, замены, делеции, вставки или добавки одного или нескольких аминокислотных остатков в указанном белке должны являться консервативной мутацией(ями). Пример консервативной мутации - это консервативная замена. Примеры консервативных замен включают замену Ala на Ser или Thr, замену Arg на Gin, His или Lys, замену Asn на Glu, Gin, Lys, His или Asp, замену Asp на Asn, Glu или Gin, замену Cys на Ser или Ala, замену Gin на Asn, Glu, Lys, His, Asp или Arg, замену Glu на Asn, Gin, Lys или Asp, замену Gly на Pro, замену His на Asn, Lys, Gin, Arg или Туг, замену Не на Leu, Met, Val или Phe, замену Leu на ile, Met, Val или Phe, замену Lys на Asn, Glu, Gin, His или Arg, замену Met на Ile, Leu, Val или Phe, замену Phe на Trp, Tyr, Met, Ile или Leu, замену Ser на Thr или Ala, замену Thr на Ser или Ala, замену Trp на Phe или Tyr, замену Tyr на His, Phe или Trp и замену Val на Met, Ile или Leu.

Ранее было показано, что транспортеры сахаров MFS, такие как D-ксилоза/Н+симпортер (XylE), Е-арабиноза/Н+симпортер (AraE) и D-галактоза/Н+симпортер (GalP), обладают высокой гомологией, выравнивания этих белков имеют минимум 28% идентичных консервативных аминокислотных остатков (Henderson, P.J. and Maiden M.C., Philos Trans R Soc Lond В Biol Sci., 30, 326 (1236), 391-410 (1990)). Сравнение аминокислотных последовательностей пермеазы арабинозы из Escherichia coli, Shigella flexneri, Salmonella typhimurium, Klebsiella oxytoca и Bacillus subtilis также демонстрирует высокую степень гомологии между указанными белками (смотри Фиг.2). С этой точки зрения замены или делеции аминокислотных остатков, идентичных во всех вышеупомянутых белках, могут серьезно повлиять на их функции, в то время как модификации других неконсервативных аминокислотных остатков могут не приводить к изменению активности пермеазы L-арабинозы.

ДНК, которая кодирует практически такой же белок, как описанная выше пермеаза L-арабинозы, может быть получена, например, модификацией нуклеотидной последовательности ДНК, кодирующей пермеазу L-арабинозы (SEQ ID NO:1), например, при помощи сайт-направленного мутагенеза, включающего в себя делецию, замену, вставку или добавку одного и более аминокислотного остатка в специфическом сайте указанного белка. Описанная выше модифицированная ДНК может также быть получена традиционным мутагенезом. Такие способы могут включать обработку гидроксиламином ДНК, кодирующей белки согласно настоящему изобретению, или обработку бактерии, содержащей указанную ДНК, УФ-излучением или химическими веществами, такими как N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин или азотистая кислота.

ДНК, кодирующая практически такой же белок, как пермеаза L-арабинозы, может быть получена путем экспрессии ДНК, содержащей описанные выше мутации в подходящей клетке, и изучения активности любого экспрессируемого продукта. ДНК, кодирующая практически такой же белок, как пермеаза L-арабинозы, также может быть получена путем выделения ДНК (из геномной ДНК), которая гибридизуется в жестких условиях с зондом с нуклеотидной последовательностью, включающей, например, нуклеотидную последовательность, приведенную в Списке последовательностей как последовательность 1 (SEQ ID NO:1), которая кодирует белок, обладающий активностью пермеазы L-арабинозы. Термин «жесткие условия», упомянутый здесь, означает условия, при которых образуются так называемые специфические гибриды, а неспецифические - не образуются. Например, к жестким условиям относятся условия, при которых гибридизуются ДНК, обладающие высокой степенью гомологии, к примеру ДНК, обладающие гомологией не менее 50% друг относительно друга, а ДНК, обладающие гомологией менее 50%, не гибридизуются друг с другом. С другой стороны, примером жестких условий являются условия, при которых ДНК гибридизуются друг с другом, при концентрации солей, соответствующей стандартным условиям отмывки при гибридизации по Саузерну, например, 1×SSC, 0.1% SDS, предпочтительно 0.1×SSC, 0.1% SDS при 60°С. Продолжительность отмывки зависит от вида фильтра, используемого для гибридизации и, как правило, от рекомендаций изготовителя. Например, рекомендованная продолжительность отмывки нейлонового фильтра Hybond™ N+(Amersham) в жестких условиях составляет 15 минут.

В качестве зонда может быть использована часть нуклеотидной последовательности под номером 1 (SEQ ID NO:1). Зонд подобного рода может быть получен в результате ПНР с использованием в качестве праймеров олигонуклеотидов, полученных на основе нуклеотидной последовательности под номером 1, и фрагмента ДНК, содержащего нуклеотидную последовательность под номером 1 (SEQ ID NO:1), в качестве матрицы. В случае, когда в качестве зонда используется фрагмент ДНК длиной около 300 пар оснований, условия отмывки при гибридизации соответствуют, например, 50°С, 2×SSC и 0.1% SDS.

Замены, делеции, вставки или добавки нуклеотидов, описанные выше, также включают мутации, которые существуют в природе (мутанты или варианты), например, ввиду индивидуальной разницы или видовых и родовых различий в бактериях, содержащих пермеазу L-арабинозы.

«Трансформация бактерии с помощью ДНК, кодирующей белок» означает введение указанной ДНК в клетку бактерии, например, традиционными методами. Трансформация указанной ДНК приводит к увеличению экспрессии указанного гена, кодирующего белок согласно настоящему изобретению, и к увеличению активности указанного белка в клетке бактерии. Способы трансформации бактерии включают все опубликованные на сегодняшний день способы. Например, может быть использован способ обработки клеток-реципиентов с помощью хлорида кальция для увеличения проницаемости ДНК через клеточную мембрану, описанный для Escherichia coli K-12 (Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)).

Методы увеличения экспрессии гена включают в себя методы увеличения числа копий гена. Введение гена в вектор, способный к функционированию в бактерии, принадлежащей к семейству Enterobacteriaceae, увеличивает число копий этого гена. Для этой цели предпочтительно использовать низкокопийные векторы. Примерами низкокопийных векторов являются векторы pSC101, pMW118, pMW119 и подобные им. Используемый здесь термин «низкокопийный вектор» используется для векторов, количество которых не превышает 5 копий на клетку.

Кроме того, увеличение экспрессии гена может быть достигнуто путем введения множественного числа копий указанного гена в хромосому бактерии, например методом гомологичной рекомбинации, Mu интеграции и подобными им методами. Например, один раунд Mu интеграции позволяет встроить в бактериальную хромосому до 3 копий интегрируемого гена.

Увеличение числа копий гена пермеазы L-арабинозы может быть также достигнуто путем введения множественного числа копий гена пермеазы L-арабинозы в хромосомную ДНК бактерии. Для введения множественного числа копий гена пермеазы L-арабинозы в хромосомную ДНК бактерии применяется гомологичная рекомбинация с использованием в качестве мишеней последовательностей, присутствующих в нескольких копиях в хромосомной ДНК. Последовательности, присутствующие в хромосомной ДНК в нескольких копиях, включают, но не ограничиваются ими, повторяющиеся фрагменты ДНК, а также инвертированные повторы, присутствующие на концах мобильных элементов. Так же, как это описано в патенте США 5595889, возможно ввести ген пермеазы L-арабинозы в транспозон, для последующей переноса с целью введения множества копий указанного гена в хромосомную ДНК.

Также увеличение экспрессии гена может быть достигнуто путем помещения ДНК согласно настоящему изобретению под контроль сильного промотора. В качестве сильных промоторов известны, например, lac промотор, trp промотор, trc промотор, P_R или P_L промоторы фага лямбда. Использование сильного промотора может комбинироваться с увеличением числа копий гена.

С другой стороны, промотор может быть усилен, например, путем введения мутации в указанный промотор с целью повышения уровня транскрипции гена, расположенного на хромосоме после промотора. Далее, известно, что замена нескольких нуклеотидов в участке между местом связывания рибосомы (RBS) и старт-кодоном, а в особенности в последовательности непосредственно перед старт-кодоном, в значительной степени влияет на транслируемость мРНК. Например, было обнаружено 20-кратное изменение уровня экспрессии в зависимости от природы трех нуклеотидов, предшествующих старт-кодону (Gold et al., Annu. Rev.Microbiol., 35, 365-403, 1981; Hui et al., EMBO J, 3, 623-629, 1984). Предварительно было установлено, что мутация rhtA23 является заменой А на G положении - 1 относительно старт-кодона ATG (ABSTRACTS of 17^th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No.457). Поэтому было высказано предположение, что мутация rhtA23 усиливает экспрессию гена rhtA и, как следствие, увеличивает уровень устойчивости к треонину, гомосерину и некоторым другим субстратам, экспортируемым из клетки.

Более того, возможно ввести нуклеотидные замены в промоторный участок гена пермеазы L-арабинозы в хромосоме бактерии таким образом, что указанный промотор станет более сильным. Изменение последовательности, контролирующей экспрессию, может быт осуществлено, например, таким же методом, как замена гена с использованием плазмиды, чувствительной к температуре, как это описано в международной патентной заявке WO 00/18935 или патентной заявке Японии №1-215280.

Методы получения плазмидной ДНК включают, но не ограничиваются ими, разрезание и лигирование ДНК, трансформацию, выбор олигонуклеотидов в качестве праймеров и подобные им или другие методы, хорошо известные специалисту в данной области. Эти методы описаны, например, в книге Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, Т., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).

Бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем введения вышеуказанных ДНК в бактерию, уже обладающую способностью к продукции L-аминокислоты. С другой стороны, бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем придания бактерии, уже содержащей указанные ДНК, способности к продукции L-аминокислоты.

Бактерия-продуцент L-треонина

Примеры родительского штамма, используемого для получения бактерии-продуцента L-треонина согласно настоящему изобретению, включают, но не ограничены штаммами-продуцентами треонина, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli TDH-6/p VIC40 (ВКПМ В-3996) (патенты США 5175107 и 5705371), штамм Е.coli NRRL-21593 (патент США 5939307), штамм Е.coli FERM ВР-3756 (патент США 5474918), штаммы Е.coli FERM ВР-3519 и FERM BP-3520 (патент США 5376538), штамм Е.coli MG442 (Гусятинер и др., Генетика, 14, 947-956 (1978)), штаммы Е.coli VL643 и VL2055 (Европейская патентная заявка ЕР1149911А) и подобные им.

Штамм TDH-6 является дефицитным по гену thrC, способен ассимилировать глюкозу и содержит ген IlvA с мутацией типа "leaky". Указанный штамм содержит также мутацию в гене rhtA, которая обуславливает устойчивость к высоким концентрациям треонина и гомосерина. Штамм В-3996 содержит плазмиду pVIC40, которая была получена путем введения в вектор, производный от вектора RSF1010, оперона thrA*BC, включающего мутантный ген thrA, кодирующий аспартокиназагомосериндегидрогеназу I, у которой существенно снижена чувствительность к ингибированию треонином по типу обратной связи. Штамм В-3996 был депонирован 19 ноября 1987 года во Всесоюзном научном центре антибиотиков (РФ, 113105, Москва, Нагатинская ул., 3-А) с инвентарным номером РИА 1867. Указанный штамм также был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (РФ, 113545, Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) с инвентарным номером В-3996.

Предпочтительно, чтобы бактерия согласно настоящему изобретению была далее модифицирована для того, чтобы иметь повышенную экспрессию одного или нескольких следующих генов:

- мутантного гена thrA, кодирующего аспартокиназагомосериндегидрогеназу I, устойчивую к ингибированию треонином по типу обратной связи;

- гена thrB, кодирующего гомосеринкиназу;

- гена thrC, кодирующего треонинсинтазу;

- гена rhtA, предположительно кодирующего трансмембранный белок;

- гена asd, кодирующего аспартат-β-семиальдегиддегидрогеназу;

- гена aspC, кодирующего аспартатаминотрансферазу (аспартаттрансаминазу).

Последовательность гена thrA, кодирующего аспартокиназагомосериндегидрогеназу I из Escherichia coli, известна (номера нуклеотидов с 337 по 2799 в последовательности с инвентарным номером NC_000913,2 в базе данных GenBank, gi:49175990). Ген thrA расположен на хромосоме штамма Е.coli К-12 между генами thrL и thrB. Последовательность гена thrB, кодирующего гомосеринкиназу из Escherichia coli, известна (номера нуклеотидов с 2801 по 3733 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank, gi:49175990). Ген thrB расположен на хромосоме штамма Е.coli К-12 между генами thrA и thrC. Последовательность гена thrC, кодирующего треонинсинтазу из Escherichia coli, известна (номера нуклеотидов с 3734 по 5020 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank, gi:49175990). Ген thrC расположен на хромосоме штамма Е.coli К-12 между геном thrB и открытой рамкой считывания yaaX. Все три указанных гена функционируют как один треониновый оперон.

Мутантный ген thrA, кодирующий аспартокиназугомосериндегидрогеназу I, устойчивую к ингибированию треонином по типу обратной связи, так же, как и гены thrB и thrC, могут быть получены в виде единого оперона из хорошо известной плазмиды pVIC40, которая представлена в штамме-продуценте Е.coli ВКПМ В-3996. Плазмида pVIC40 подробно описана в патенте США 5705371.

Ген rhtA расположен в области 18 мин на хромосоме Е.coli рядом с опероном glnHPQ, который кодирует компоненты системы транспорта глутамина. Ген rhtA идентичен открытой рамке считывания ORF1 (ген ybiF, номера нуклеотидов с 764 по 1651 в последовательности с инвентарным номером ААА218541 в базе данных GenBank, gi: 440181) и расположен между генами рехВ и ompX. Единица экспрессии белка, кодируемого ORF1, обозначается как ген rhtA (rht: resistance to homoserine and threonine - устойчивость к гомосерину и треонину). Также было обнаружено, что мутация rhtA23 представляет собой замену А на G в позиции - 1 относительно старт-кодона ATG (тезисы 17^th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology; тезисы Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California, August 24-29, 1997, abstract No. 457, европейская заявка ЕР 1013765 А).

Ген asd E. coli уже известен (комплементарный нуклеотидам с номерами с 3571798 по 3572901 в последовательности с инвентарным номером NP_000913.2 в базе данных GenBank; gi:16131307) и может быть получен методом ПЦР (полимеразная цепная реакция; White, T.J. et al., Trends Genet., 1989, 5:185) с использованием праймеров, нкулеотидная последовательность которых комплементарна фрагментам нуклеотидной последовательности гена. Гены asd других микроорганизмов могут быть получены сходным образом.

Ген aspC E. coli также уже известен (номера нуклеотидов с 983742 по 984932 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1 в базе данных GenBank, gi: 16128895) и может быть получен методом ПЦР. Гены aspC других микроорганизмов могут быть получены сходным образом.

Бактерия-продуцент L-лизина

Примеры бактерий-продуцентов L-лизина, принадлежащих к роду Escherichia, включают мутантов, обладающих устойчивостью к аналогу L-лизина. Аналог L-лизина ингибирует рост бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, но это ингибирование полностью или частично снимается, когда в среде также присутствует L-лизин. Примеры аналога L-лизина включают, но не ограничиваются, оксализином, лизингидроксаматом, S-(2-аминоэтил)-L-цистеином (АЕС), γ-метиллизном, α-хлорокапролактамом и так далее. Мутанты, обладающие устойчивостью к указанным аналогам лизина, могут быть получены путем обработки бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, традиционными мутагенами. Конкретные примеры бактериальных штаммов, используемых для получения L-лизина, включают штамм Escherichia coli АЛ 1442 (PERM BP-1543, NRRL В-12185; смотри патент США 4346170) и штамм Escherichia coli VL611. В этих микроорганизмах аспартокиназа устойчива к ингибированию L-лизином по принципу обратной связи.

Штамм WC196 может быть использован в качестве бактерии-продуцента L-лизина Escherichia coli. Данный бактериальный штамм был получен путем селекции фенотипа устойчивости к АЕС у штамма W3110, производного от штамма Escherichia coli K-12. Полученный штамм был назван Escherichia coli AJ13069 и был депонирован в Национальном Институте Биологических Наук и Человеческих Технологий, Агенство Промышленной Науки и Технологии, Министерство Международной Торговли и Промышленности (National Institute ofBioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry) (в настоящее время называющийся Национальный Институт Прогрессивной Промышленной Науки и Технологии, Международный Депозитарий Организмов для Целей Патентования, Централ 6, 1-1, Хигаши 1-Чоме, Тсукуба-ши, Ибараки-кен, 305-8566, Япония (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan) 6 декабря 1994 г. и получил инвентарный номер PERM P-14690. Затем было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора 29 сентября 1995 г., и штамм получил инвентарный номер FERM ВР-5252 (смотри патент США 5827698).

Примеры родительских штаммов для получения бактерий, продуцирующих L-лизин согласно настоящему изобретению, также включают штаммы, в которых усилена экспрессия одного или нескольких генов, кодирующих ферменты биосинтеза L-лизина. Примеры ферментов, вовлеченных в биосинтез L-лизина, включают, но не ограничиваются ими, дигидродипиколинатсинтазу (dapA), аспартокиназу (lysC), дигидродипиколинатредуктазу (dapB), диаминопимелатдекарбоксилазу (lysA), диаминопимелатдегидрогеназу (ddh) (патент США. 6040160), фосфоенолпируваткарбоксилазу(ppc), аспартатсемиальдегиддегидрогеназу (asd), никотинамидадениндинуклеотидтрансгидрогеназу (pntAK) и аспартазу (aspA) (европейская заявка ЕР 1253195 А).

Примеры родительских штаммов для получения бактерий, продуцирующих L-лизин согласно настоящему изобретению, также включают штаммы, в которых снижена или отсутствует активность ферментов, которые катализируют реакции образования отличных от L-лизина соединений, ответвляющихся от основного пути биосинтеза L-лизина. Примеры ферментов, которые катализируют реакции образования отличных от L-лизина соединений, ответвляющихся от основного пути биосинтеза L-лизина, включают гомосериндегидрогеназу и лизиндекарбоксилазу (патент США 5827698).

Бактерия-продуцент L-гистидина

Примеры родительского штамма, используемого для получения бактерий-продуцентов L-гистидина согласно настоящему изобретению, включают, но не ограничены штаммами-продуцентами треонина, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli 24 (ВКПМ В-5945, патент РФ 2003677); штамм Е.coli 80 (ВКПМ В-7270, патент РФ 2119536); штаммы Е.coli NRRL B-12116-B12121 (патент США 4388405); штаммы Е.coli Н-9342 (FERM ВР-6675) и Н-9343 (FERM BP-6676) (патент США 6344347); штамм Е.coli H-9341 (FERM BP-6674) (Европейский патент ЕР 1085087); штамм Е.coli AI80/pFM201 (US6258554) и подобные им.

Примеры родительских штаммов для получения бактерий, продуцирующих L-гистидин согласно настоящему изобретению, также включают штаммы, в которых усилена экспрессия одного или нескольких генов, кодирующих ферменты биосинтеза L-гистидина. Примеры ферментов, вовлеченных в биосинтез L-гистидина, включают АТФ-фосфорибозилтрансферазу (hisG), фосфорибозил-АМФ-циклогидролазу (hisl), фосфорибозил-АТФ-фосфогидролазу (hisIE), фосфорибозилформимино-5-аминоимидазолкарбоксамидриботидизомеразу (hisA), амидотрансферазу (hisH), гистидинолфосфатаминотрансферазу (hisC), гистидинолфосфатазу (hisB), гистидинолдегидрогеназу (hisD) и т.д.

Известно, что гены, кодирующие ферменты биосинтеза L-гистидина (hisG, hisBHAFI), ингибируются L-гистидином, поэтому способность к продукции L-гистидина также может быть значительно усилена введением мутации, придающей устойчивость к ингибированию по типу обратной связи, в ген АТФ-фосфорибозидтрансферазы (hisG) (патенты РФ 2003677 и 2119536).

Специфические примеры штаммов, обладающих способностью к продукции L-гистидина, включают Е.coli FERM-P 5038 и 5048, в которые был введен вектор, содержащий ДНК, кодирующую фермент биосинтеза L-гистидина (заявка Японии 56-005099 А), штаммы Е.coli, в которые введен ген rht, для экспорта аминокислоты (европейская заявка ЕР 1016710 А), штамм Е.coli 80, которому придана устойчивость к сульфагуанидину, DL-1,2,4-триазол-3-аланину и стрептомицину (ВКПМ В-7270, патент РФ 2119536), и т.д.

Бактерия-продуцент L-фенилаланина

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-фенилаланина согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм AJ 12739 (tyrA::Тn10, tyrR) (ВКМП В-8197); штамм HW1089 (АТСС-55371), содержащий ген pheA34 (патент США 5,354,672); мутантный штамм MWEC101-b (KR 8903681); штаммы NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL В-12146 и NRRL В-12147 (патент США 4407952) и подобные им. Также в качестве родительских штаммов могут быть использованы бактерии, принадлежащие к роду Escherichia, - продуценты L-фенилаланина, такие как штамм E.coli K-12[W3110(tyrA)/pPHAB] (FERM BP-3566), штамм E.coli K-12[W3110(tyrA)/pPHAD] (PERM BP-12659), штамм E.coli K-12[W3110(tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662) и штамм E.coli K-12 [W3110(tyrA)/pBR-aroG4, рАСМАВ], названный как AJ 12604 (FERM BP-3579) (Европейский патент ЕР 488424 В1). Кроме того, также могут быть использованы бактерии-продуценты L-фенилаланина, принадлежащие к роду Escherichia с повышенной активностью белков, кодируемых геном yedA или геном yddG (патентные заявки США 2003/0148473 А1 и 2003/0157667 А1).

Бактерия-продуцент L-аргинина

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-аргинина согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как мутантные штаммы Е.coli, устойчивые к α-метилметионину, р-флуорофенилаланину, D-аргинину, аргинин гидроксамату, β-(2-аминоэтил)-цистеину, α-метилсерину, β-2-тиенилаланину или сульфагуанидину (выложенная патентная заявка Японии 56-106598); содержащими мутантную N-ацетилглутаматсинтазу (патентная заявка РФ 2001112869), штамм-продуцент аргинина, в который введен ген argA, кодирующий N-ацетилглутаматсинтетазу (Европейский патент 1170361 А1); штаммы 237 (ВКПМ В-7925) и 382 (ВКПМ В-7926), описанные в Европейском патенте ЕР 1170358 А1, и подобные им.

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-аргинина согласно настоящему изобретению, также включают в себя штаммы, в которых усилена экспрессия одного или нескольких генов, кодирующих ферменты биосинтеза L-аргинина. Примеры ферментов биосинтеза L-аргинина включают N-ацетилглутамилфосфатредуктазу (argC), орнитинацетилтрансферазу (argJ), N-ацетилглутаматкиназу (argB), ацетилорнитинтрансаминазу (argD), орнитинкарбамоилтрансферазу (argF), синтетазу аргининсукциниловой кислоты (argG), лиазу аргининсукциниловой кислоты (argH) и карбамоилфосфатсинтетазу. Данные гены биосинтеза аргинина расположены в Arg опероне (argCJBDFRGH) и регулируются репрессором аргинина, кодируемым геном argR (J Bacteriol. 2002 Dec; 184(23):6602-14). Разрушение репрессора аргинина ведет к увеличению экспрессии оперона Arg, и, таким образом, активность ферментов биосинтеза L-аргинина увеличивается (заявка США US 2002-0045223 A).

Бактерия-продуцент L-триптофана

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-триптофана согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами-продуцентами L-триптофана, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штаммы Е.coli JP 4735/pMU3028 (DSM10122) и JP6015/pMU91 (DSM10123), дефицитные по триптофанил-тРНК синтетазе, кодируемой мутантным геном trpS (патент США 5756345); штамм Е.coli SV164 (pGH5), содержащий аллель serA, не ингибирующийся серином по принципу обратной связи (патент США 6180373); штаммы Е.coli AGX17 (pGX44) (NRRL В-12263) и AGX6(pGX50)aroP (NRRL В-12264), дефицитные по ферменту триптофаназе (патент США 4371614); штамм Е.coli AGX17/pGX50, pACKG4-pps, в котором способность к продукции фосфоенолпирувата усилена (WO 9708333, патент США 6319696), и подобные им.

Ранее было показано, что ген yddG, кодирующий мембранный белок, не вовлеченный ни в один путь биосинтеза L-аминокислот, сообщает микроорганизму устойчивость к L-фенилаланину и нескольким аналогам аминокислот при амплификации природного аллеля данного гена на многокопийном векторе в указанном микроорганизме. Кроме того, ген yddG может положительно влиять на продукцию L-фенилаланина или L-триптофана, когда дополнительные копии этого гена введены в клетки соответствующего штамма-продуцента (WO 03044192). Таким образом, желательно, чтобы бактерия-продуцент L-триптофана была далее модифицирована таким образом, что экспрессия открытой рамки считывания yddG в указанной бактерии была усилена.

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-триптофана согласно настоящему изобретению, также включают в себя штаммы, в которых увеличена активность одного или нескольких ферментов, выбранных из группы, состоящей из антранилатсинтазы, фосфоглицератдегидрогеназы и триптофансинтазы. И антранилатсинтаза, и фосфоглицератдегидрогеназа подвержены ингибированию L-триптофаном и L-серином по типу обратной связи, так что в эти ферменты могут быть введены мутации, снижающие чувствительность к ингибированию по типу обратной связи. Специфические примеры штаммов с такой мутацией включают Е.coli SV164, антранилатсинтаза которой не чувствительна к ингибированию по типу обратной связи, и штамм-трансформант, полученный введением в Е.coli SV164 плазмиды pGH5 (заявка РСТ WO 94/08031), которая содержит мутантный ген serA, кодирующий фосфоглицератдегидрогеназу, которая не чувствительна к ингибированию по типу обратной связи.

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-триптофана согласно настоящему изобретению, также включают в себя штаммы, в которые введен триптофановый оперон, содержащий ген, кодирующий антранилатсинтазу, которая не чувствительна к ингибированию по типу обратной связи (заявка Японии 57-71397 А, заявка Японии 62-244382 А, патент США 4371614). Кроме того, способность к продукции L-триптофана может быть придана путем усиления экспрессии гена (из триптофанового оперона), кодирующего триптофансинтазу (trpBA). Триптофансинтаза состоит из двух субъединиц α и β, которые кодируются trpA и trpB соответственно.

Бактерии-продуценты L-глутаминовой кислоты

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-глутаминовой кислоты согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются ими, штаммы, в которых усилена экспрессия одного или нескольких генов, кодирующих ферменты биосинтеза L-глутаминовой кислоты. Примеры ферментов, вовлеченных в биосинтез L-глутаминовой кислоты, включают глутаматдегидрогеназу, глутаминсинтетазу, глутаматсинтетазу, изоцитратдегидрогеназу, аконитатгидратазу, цитратсинтазу, фосфоенолпируваткарбоксилазу, пируваткарбоксилазу, пируватдегидрогеназу, пируваткиназу, фосфоенолпируватсинтазу, енолазу, фосфоглицеромутазу, фосфоглицераткиназу, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу, триозофосфатизомеразу, фруктозобифосфатальдолазу, фосфофруктониназу и глюкозофосфатизомеразу.

Примеры штаммов, модифицированных таким образом, что усилена экспрессия гена цитратсинтетазы, гена фосфоенолпируваткарбоксилазы и/или гена глутаматдегидрогеназы, включают описанные в европейских заявках ЕР 1078989 А, ЕР 955368 А и ЕР 952221 А.

Примеры родительских штаммов для получения продуцирующих L-глутаминовую кислоту бактерий согласно настоящему исследованию также включают штаммы, в которых снижена или отсутствует активность ферментов, которые катализируют синтез отличных от L-глутаминовой кислоты соединений, ответвляющихся от основного пути биосинтеза L-глутаминовой кислоты. Примеры таких ферментов включают изоцитратлиазу, α-кетоглутаратдегидрогеназу, фосфотрансацетилазу, ацетаткиназу, синтазу ацетогидроксикислот, ацетолактатсинтазу, форматацетилтрансферазу, лактатдегидрогеназу и глутаматдекарбоксилазу,

Бактерии, принадлежащие к роду Escherichia, лишенные активности α-кетоглутаратдегидрогеназы или обладающие сниженной активностью α-кетоглутаратдегидрогеназы, и способы их получения описаны в патентах США 5378616 и 5573945. Конкретно, примеры таких штаммов включают в себя следующие штаммы:

E.coli W3110 sucA::Km^r

Е.coli АJ12624 (FERM ВР-3853)

Е.coli АJ12628 (FERM BP-3854)

Е.coli АJ12949 (FERM BP-4881)

Е.coli W3110 sucA::Km^r - это штамм, полученный в результате разрушения гена α-кетоглутаратдегидрогеназы (далее называемого "sucA ген") в штамме Е.coli W3110. У этого штамма активность α-кетоглутаратдегидрогеназы отсутствует полностью.

Другие примеры бактерии-продуцента L-глутаминовой кислоты включают в себя бактерии, принадлежащие к роду Escherichia и обладающие устойчивостью к антиметаболитам аспарагиновой кислоты и дефицитные по активности α-кетоглутаратдегидрогеназы, например штамм АJ13199 (FERM BP-5807) (патент США 5908768) или штамм FERM P-12379, дополнительно обладающий низкой активностью по расщеплению L-глутаминовой кислоты (патент США 5393671); штамм Е.coli АJ13138 (FERM BP-5565) (патент США 6110714) и подобные им.

Другие примеры бактерии-продуцента L-глутаминовой кислоты включают в себя бактерии, принадлежащие к роду Pantoea, которые лишены активности α-кетоглутаратдегидрогеназы или имеют сниженную активность α-кетоглутаратдегидрогеназы и могут быть получены описанным выше способом. Примерами таких штаммов являются штамм Pantoea ananatis АJ13356 (патент США 6331419), штамм Pantoea ananatis AJ13356, депонированный в Национальном Институте Биологических Наук и Человеческих Технологий, Агенство Промышленной Науки и Технологии, Министерство Международной Торговли и Промышленности (National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry) (в настоящее время называющийся Национальный Институт Прогрессивной Промышленной Науки и Технологии, Международный Депозитарий Организмов для Целей Патентования, Централ 6, 1-1, Хигаши 1-Чоме, Тсукуба-ши, Ибараки-кен, 305-8566, Япония - National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan) 19 февраля 1998 и получивший инвентарный номер FERM Р-16645. Затем было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора от 11 января 1999 г., и штамм получил инвентарный номер FERM BP-6615. Штамм Pantoea ananatis AJ13356 не имеет α-KGDH активности в результате разрушения гена αKGDH-E1 субъединицы (sucA). Вышеупомянутый штамм при выделении был идентифицирован как Enterobacter agglomerans и депонирован как штамм Enterobacter agglomerans AJ13356. Тем не менее, позднее он был классифицирован как Pantoea ananatis на основе нуклеотидной последовательности 16S рРНК и других доказательств. Несмотря на то, что штамм AJ13356, был депонирован в указанный выше депозитарий как Enterobacter agglomerans, для целей данного описания он будет упоминаться как Pantoea ananatis.

Получение L-аминокислот

Оксалоацетат (ОАА) служит субстратом для реакции, продуктом которой является синтез Thr и Lys. ОАА образуется из PEP, и эта реакция катализируется фосфоенолпируваткарбоксилазой (РЕРС). Следовательно, повышение внутриклеточной концентрации PEP может являться очень важным вкладом в получение указанных аминокислот с помощью ферментации. При использовании в ферментации в качестве источника углерода глюкозы глюкоза усваивается с помощью глюкозофосфотрансферазной системы (Glc-PTS). Эта система усваивает PEP, а белки PTS системы кодируются генами ptsG viptsHIcrr. В результате усвоения глюкозы из одной молекулы глюкозы образуется одна молекула PEP и одна молекула пирувата (Pyr).

Штамм-продуцент L-треонина и штамм-продуцент L-лизина, модифицированные таким образом, что получили способность усваивать сахарозу (Scr-PTS), обладают повышенной продуктивностью соответствующих аминокислот, по сравнению с ростом на глюкозе (ЕР 1149911 А2). Считается, что посредством Scr-PTS из одной молекулы сахарозы образуется три молекулы PEP и одна молекула Руг, повышая тем самым соотношение РЕР/Pyr и облегчая таким образом синтез Thr и Lys из сахарозы. Кроме того, сообщалось, что экспрессия системы Glc-PTS регулируется несколькими факторами (Postma P.W. et al., Microbiol Rev., 57(3), 543-94 (1993); dark В. et al. J. Gen. Microbiol., 96(2), 191-201 (1976); Plumbridge J., Curr. Opin. Microbiol., 5(2), 187-93 (2002); Ryu S. et al., J. Biol. Chem., 270(6):2489-96 (1995)), и, следовательно, возможно, что само по себе включение глюкозы в метаболизм может лимитировать скорость ферментации данных аминокислот.

Еще большее повышение соотношения РЕР/Pyr за счет усиления экспрессии гена araE в штамме-продуценте треонина, в штамме-продуценте лизина, в штамме-продуценте гистидина, в штамме-продуценте фенилаланина, в штамме-продуценте аргинина, в штамме-продуценте триптофана и/или в штамме-продуценте глутаминовой кислоты должно привести к дальнейшему росту продукции аминокислоты. Поскольку, для сравнения, четыре молекулы PEP образуются из двух молекул глюкозы, то ожидается значительное повышение соотношения РЕР/Pyr. Также из-за повышения экспрессии гена araE ожидается снятие экспрессионного контроля системы glc-PTS.

Способ получения L-аминокислоты согласно настоящему изобретению включает стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде, что вызывает накопление L-аминокислоты в питательной среде, и выделения L-аминокислоты из культуральной жидкости. Кроме того, способ согласно настоящему изобретению включает способ получения L-треонина, L-лизина, L-гистидина, L-фенилаланина, L-аргинина, L-триптофана или L-глутаминовой кислоты, включая стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде, что вызывает накопление L-треонина, L-лизина, L-гистидина, L-фенилаланина, L-аргинина, L-триптофана или L-глутаминовой кислоты в питательной среде, и выделения L-треонина, L-лизина, L-гистидина, L-фенилаланина, L-аргинина, L-триптофана или L-глутаминовой кислоты из культуральной жидкости.

Согласно настоящему изобретению выращивание, выделение и очистка L-аминокислоты из культуральной или подобной ей жидкости может быть осуществлена способом, подобным традиционным способам ферментации, в которых L-аминокислота продуцируется с использованием бактерии.

Питательная среда, используемая для выращивания, может быть как синтетической, так и натуральной, при условии, что указанная среда содержит источники углерода, азота, минеральные добавки и, если необходимо, соответствующее количество питательных добавок, необходимых для роста микроорганизмов. К источникам углерода относятся различные углеводы, такие как глюкоза и сахароза, а также различные органические кислоты. В зависимости от характера ассимиляции используемого микроорганизма могут использоваться спирты, такие как этанол и глицерин. В качестве источника азота могут использоваться различные неорганические соли аммония, такие как аммиак и сульфат аммония, другие соединения азота, такие как амины, природные источники азота, такие как пептон, гидролизат соевых бобов, ферментолизат микроорганизмов. В качестве минеральных добавок могут использоваться фосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат железа, сульфат марганца, хлорид кальция и подобные им соединения. В качестве витаминов могут использоваться тиамин и дрожжевой экстракт. При необходимости в среду также могут быть добавлены дополнительные компоненты. Например, если микроорганизму для роста требуется L-аминокислота (ауксотрофность по L-аминокислоте), в питательную среду может быть добавлено необходимое количество указанной L-аминокислоты.

Выращивание осуществляется предпочтительно в аэробных условиях, таких как перемешивание культуральной жидкости на качалке, взбалтывание с аэрацией, при температуре в пределах от 20 до 40°С, предпочтительно в пределах от 30 до 38°С. рН среды поддерживают в пределах от 5 до 9, предпочтительно от 6.5 до 7.2. рН среды может регулироваться аммиаком, карбонатом кальция, различными кислотами, основаниями и буферными растворами. Обычно выращивание в течение от 1 до 5 дней приводит к накоплению целевой L-аминокислоты в культуральной жидкости.

После выращивания твердые остатки, такие как клетки, могут быть удалены из культуральной жидкости методом центрифугирования или фильтрацией через мембрану, а затем L-аминокислота может быть выделена и очищена методами ионообменной хроматографии, концентрирования и кристаллизации.

Примеры

Настоящее изобретение будет более подробно описано ниже со ссылкой на следующие не ограничивающие настоящее изобретение Примеры.

Пример 1: Замена природной промоторной области гена araE в Е.coli гибридным P_L-tag промотором.

Для замены природной промоторной области гена araE фрагмент ДНК, содержащий гибридный P_L-tac промотор и маркер устойчивости к хлорамфениколу (Cm^R), кодируемый геном cat, может быть интегрирован в хромосому штамма Е.coli MG1655 (АТСС 700926) взамен природной промоторной области способом, описанным у Datsenko K.A. и Wanner B.L. (Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 2000, 97, 6640-6645), также известная как "Red-зависимая интеграция" и/или "интеграция посредством Red-системы". Рекомбинантная плазмида pKD46 (Datsenko, K.A., Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97, 6640-6645) с термочувствительным репликоном может служить донором генов, полученных из фага λ, ответственных за Red-зависимую систему рекомбинации. Штамм Escherichia coli BW25113, содержащий рекомбинантную плазмиду pKD46, может быть получен из Е.coli Genetic Stock Center, Yale University, New Haven, USA под инвентарным номером CGSC7630.

Гибридный промотор P_L-tac promoter может быть синтезирован химическим путем. Нуклеотидная последовательность замещающего промотора представлена в Списке последовательностей под номером 3 (SEQ ID NO:3). Синтезированный фрагмент ДНК, содержащий гибридный промотор P_L-tac, содержит в 5'-конце сайт узнавания рестриктазы BglII, который необходим для дальнейшего присоединения гена cat, и 36 нуклеотидов, гомологичных 5'-концу гена araE, введенных для последующей интеграции данного фрагмента в хромосому.

Фрагмент ДНК, содержащий маркер Cm^R, кодируемый геном cat, может быть получен при помощи ПЦР с использованием коммерчески доступной плазмиды pACYC184 (инвентарный номер Х06403 в GenBank/EMBL, "Fermentas", Литва) в качестве матрицы и праймеров P1 (SEQ ID NO:4) и Р2 (SEQ ID NO:5). Праймер Р1 содержит в своем 5'-конце сайт узнавания рестриктазы BglII, который необходим для дальнейшего присоединения к гибридному промотору Р_L-tac, и праймер Р2 содержит 36 нуклеотидов, гомологичных области, расположенной на хромосоме за 70 п.о. до старт-кодона гена araE, и введенные в праймер для дальнейшей интеграции промотора в бактериальную хромосому.

ПЦР может осуществляться на амплификаторе "TermoHybaid PCR Express". Реакционная смесь (общий объем - 50 мкл) состоит из 5 мкл 10×ПЦР буфера с 15 мМ MgCl₂ ("Fermentas", Литва), 200 мкМ каждой из dNTP, 25 пМ каждого из используемых праймеров и 1 ед. Taq-полимеразы ("Fermentas", Литва). Примерно 5 нг плазмидной ДНК может быть добавлено в реакционную смесь в качестве матричной ДНК для ПЦР амплификации. Может быть использован следующий температурный профиль: начальная денатурация ДНК в течение 5 минут при 95°С; затем 25 циклов денатурации при 95°С в течение 30 сек, отжиг при 55°С в течение 30 сек и полимеризация при 72°С в течение 30 сек и финальная полимеризация в течение 7 минут при 72°С. Затем амплифицированный фрагмент ДНК может быть очищен с помощью электрофореза в агарозном геле, выделен с использованием "GenElute Spin Columns" ("Sigma", США) и переосажен этанолом.

Каждый из двух описанных выше фрагментов ДНК может быть обработан рестриктазой BglII и лигирован. Продукт лигирования может быть амплифицирован с помощью ПНР с использованием праймеров Р2 (SEQ ID NO:5) и Р3 (SEQ ID NO:6). Праймер Р3 комплементарен 5'-концу области гена araE, которая также находится в гибридном промоторе P_L-tac (SEQ ID NO:3).

Амплифицированный фрагмент ДНК может быть очищен с помощью электрофореза в агарозном геле, выделен с использованием "GenElute Spin Columns" ("Sigma", США) и переосажен этанолом. Полученный фрагмент ДНК может быть использован для электропорации и Red-зависимой интеграции в бактериальную хромосому штамма Е.coli MG1655/pKD46.

Клетки MG1655/pKD46 могут быть выращены в течение ночи при 30°С в жидкой LB-среде с добавлением ампициллина (100 мкг/мл), затем могут быть разбавлены 1:100 SOB-средой (дрожжевой экстракт, 5 г/л; Nad, 0.5 г/л; триптон, 20 г/л; KCl, 2.5 мМ; MgCl₂, 10 мМ), содержащей ампициллин (100 мкг/мл) и L-арабинозу (10 мМ) (арабиноза используется для индукции плазмиды, содержащей гены Red-системы), и могут быть выращены с перемешиванием при 30°С до достижения OD₆₀₀≈0.4-0.7. Выросшие клетки из 10 мл бактериальной культуры отмывают 3 раза ледяной деионизированной водой, затем ресуспендируют в 100 мкл воды. 10 мкл фрагмента ДНК (100 нг), растворенной в деионизированной воде, добавляют к клеточной суспензии. Электропорация может быть осуществлена на электропораторе "Bio-Rad" (США) (№165-2098, версия 2-89) в соответствии с инструкциями производителя. Электропорированные клетки добавляют к 1-мл среды SOC (Sambrook et al., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), инкубироваться в течение 2 часов при 37°С и затем высеваться на L-агар, содержащий 25 мкг/мл хлорамфеникола. Колонии, выросшие в течение 24 часов, могут быть проверены на присутствие маркера Cm^R вместо природной промоторной области гена araE с помощью ПЦР с использованием праймеров Р4 (SEQ ID NO:7) и Р5 (SEQ ID NO:8). Для этой цели свежеизолированные колонии могут быть ресуспендированы в 20 мкл воды, после чего 1 мкл полученной суспензии может быть использован для ПЦР. Может быть использован следующий температурный профиль:начальная денатурация ДНК в течение 10 минут при 95°С; затем 30 циклов денатурации при 95°С в течение 30 сек, отжиг при 55°С в течение 30 сек и полимеризация при 72°С в течение 1 мин и финальная полимеризация в течение 7 минут при 72°С. Cm^R колонии должны содержать фрагмент ДНК˜1400 п.о., подтверждающий наличие Cm^R маркера ДНК вместо природной промоторной области в 45 п.о. гена araE (смотри Фиг.1). Один из этих штаммов может быть излечен от термочувствительной плазмиды pKD46 выращиванием при 37°С и полученный штамм может быть назван Е.coli М01655Р_L-tacaraE.

Пример 2. Эффект усиления экспрессии гена araE на продукцию треонина.

Для проверки эффекта влияния усиленной экспрессии гена araE под контролем промотора P_L-tac на продукцию треонина фрагменты ДНК из хромосомы описанного выше штамма Е.coli МG1655Р_L-tacaraE могут быть перенесены в штамм-продуцент треонина Е.coli VKPM В-3996 Р1 трансдукцией (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY).

Оба штамма, родительский В-3996 и полученный B-3996P_L-tacaraE, могут выращиваться в течение 18-24 часов при 32°С на чашках с L-агаром. Для получения посевной культуры каждый из штаммов может быть выращен на роторной качалке (250 об/мин) при 32°С в течение 18 ч в пробирках 20×200 мм, содержащих 2 мл L-бульона с 4% сахарозы. Затем в ферментационную среду может быть внесено 0.21 мл (10%) посевного материала. Ферментация может проводиться в 2 мл минимальной ферментационной среды в пробирках 20×200 мм. Клетки могут выращиваться в течение 48 часов при 32°С на роторной качалке - 250 об/мин.

После выращивания количество накопленного в среде L-треонина может быть определено с помощью бумажной хроматографии, при этом используется следующий состав подвижной фазы: бутанол:уксусная кислота:вода=4:1:1 (v/v). Раствор (2%) нингидрина в ацетоне может быть использован для визуализации. Пятна, содержащие L-треонин, могут быть вырезаны, L-треонин может быть элюирован 0.5% водным раствором CdCl₂, после чего количество L-треонина может быть оценено спектрофотометрическим методом при длине волны 540 нм.

Состав ферментационной среды (г/л):

Глюкоза	80.0
(NH₄)₂SO₄	22.0
NaCl	0.8
КН₂PO₄	2.0
MgSO₄×7H₂O	0.8
FeSO₄×7H₂O	0.02
MnSO₄×5H₂O	0.02
Тиамин HCl	0.0002
Дрожжевой экстракт	1.0
СаСО₃	30.0

Глюкозу и сульфат марганца стерилизуют отдельно. СаСО₃ стерилизуют сухим жаром при 180°С в течение 2 часов. рН доводят до 7.0. Антибиотик добавляют в среду после стерилизации.

Пример 3. Эффект усиления экспрессии гена araE на продукцию лизина (1).

Для проверки эффекта влияния усиленной экспрессии гена araE под контролем Р_L-tac промотора на продукцию лизина фрагменты ДНК из хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655P_L-tacaraE могут быть перенесены в хромосому штамма-продуцента лизина Е.coli WC196 (pCABD2) c помощью Р1 трансдукции (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY). pCABD2 - это плазмида, содержащая ген dapA, кодирующий мутантную дигидропиколинатсинтазу, устойчивую к ингибированию L-лизином по типу обратной связи, ген lysC, кодирующий мутантную аспартокиназу III, устойчивую к ингибированию L-лизином по типу обратной связи, ген dapB, кодирующий дигидропиколинатредуктазу, и ген ddh, кодирующий диаминопимелатдегидрогеназу (патент США 6040160).

Оба штамма Е.coli, родительский WC196(pCABD2)H полученный WC196(pCABD2)P_L-tacaraE, могут выращиваться в L-среде, содержащей 20 мг/л стрептомицина при 37°С, и 0.3 мл полученных культур может быть внесено в 20 мл ферментационной среды, содержащей необходимые антибиотики, в 500 мл-колбы. Культивирование может производиться при 37°С в течение 16 часов с использованием возвратно-поступательной качалки со скоростью перемешивания 115 об/мин. После выращивания количества L-лизина и остаточной глюкозы в среде могут быть измерены известным способом (Biotech-analyzer AS210, производитель - Sakura Seiki Co.). Затем для каждого из штаммов может быть рассчитан выход L-лизина в пересчете на потребленную глюкозу.

Состав ферментационной среды (г/л):

Глюкоза	40
(NH₄)2SO₄	24
К₂HPO₄	1.0
MgSO₄×7H₂O	1.0
FeSO₄×7Н₂O	0.01
MnSO₄×5H₂O	0.01
Дрожжевой экстракт	2.0

рН доводят до 7.0 в помощью КОН и среду автоклавируют при 115°С в течение 10 мин. Глюкозу и MgSO₄×7H₂O стерилизуют отдельно. Также добавляют 30 г/л СаСО₃, предварительно простерилизованного сухим жаром при 180°С в течение 2 часов.

Пример 4. Эффект усиления экспрессии гена araE на продукцию гистидина.

Для проверки эффекта влияния усиленной экспрессии гена araE под контролем Р_L-tac промотора на продукцию гистидина фрагменты ДНК из хромосомы описанного выше штамма Е.coli М01655Р_L-tacaraE могут быть перенесены в хромосому штамма-продуцента гистидина Е.coli 80 с помощью Р1 трансдукции (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY). Штамм 80 описан в патенте РФ 2119536 и депонирован во Всероссийской национальной коллекции промышленных микроорганизмов (Россия, 113545 Москва, 1-ый Дорожный проезд, 1) с инвентарным номером ВКПМ В-7270.

Оба штамма, родительский 80 и полученный 80 Р_L-tacaraE, могут выращиваться с перемешиванием при 29°С в течение 6 часов в питательном бульоне. Затем 0.1 мл полученных культур может быть внесено в 2 мл ферментационной среды в пробирки 20×200 мм, и выращивают при 29°С в течение 65 часов на роторной качалке (350 об/мин).

После выращивания количество накопленного в среде гистидина может быть определено с помощью бумажной хроматографии. Хроматограммы можно поместить в подвижную фазу следующего состава: n-бутанол:уксусная кислота:вода=4:1:1 (v/v). Раствор ((0.5%) нингидрина в ацетоне может быть использован для визуализации.

Состав ферментационной среды (рН 6.0) (г/л):

Глюкоза	100.0
Мамено (гидролизат соевых бобов)	0.2 общего азота
L-пролин	1.0
(NH₄)₂SO₄	25.0
КН₂PO₄	2.0
MgSO₄×7H₂O	1.0
FeSO₄×7H₂O	0.01
MnSO₄	0.01
Тиамин	0.001
Бетаин	2.0
СаСО₃	60.0

Глюкозу, пролин, бетаин и СаСО₃ стерилизуют отдельно. рН доводят до 6.0 перед стерилизацией.

Пример 5. Эффект усиления экспрессии гена araE на продукцию фенилаланина.

Для проверки эффекта влияния усиленной экспрессии гена araE под контролем Р_L-tac промотора на продукцию фенилаланина фрагменты ДНК из хромосомы описанного выше штамма Е.coli МG1655Р_L-tacaraE могут быть перенесены в хромосому штамма-продуцента фенилаланина Е.coli AJ12739 с помощью Р1 трансдукции (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY). Штамм AJ12739 депонирован в Российской Национальной Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) (Россия, 113545 Москва, 1^ый Дорожный проезд, 1) 6 ноября 2001 с инвентарным номером ВКПМ В-8197.

Оба штамма, родительский AJ 12739 и полученный AJ 12739 Р_L-tacaraE, могут выращиваться с перемешиванием при 37°С в течение 18 часов в питательном бульоне. 0.3 мл полученных культур может быть внесено в 3 мл ферментационной среды в пробирки 20×200 мм и выращивают при 37°С в течение 48 часов на роторной качалке. По окончании ферментации количество накопленного в среде фенилаланина может быть определено с помощью тонкослойной хроматографии (TLC). Для этой цели могут быть использованы TLC пластинки 10×15 см, покрытые слоями Сорбфил силикагеля в 0.11 мм без флуоресцентного индикатора (Акционерное Общество Сорбполимер, Краснодар, Россия). Пластинки Сорбфил могут прогоняться в подвижной фазе следующего состава: пропан-2-ол:этилацетат:25% водного аммиака:вода=40:40:7:16 (v/v). Раствор (2%) нингидрина в ацетоне может быть использован для визуализации.

Состав ферментационной среды (г/л):

Глюкоза	40.0
(NH₄)₂SO₄	16.0
К₂HPO₄	0.1
MgSO₄×7H₂O	1.0
FeSO₄×7H₂O	0.01
MnSO₄×5H₂O	0.01
Тиамин HCl	0.0002
Дрожжевой экстракт	2.0
Тирозин	0.125
СаСО₃	20.0

Глюкозу и сульфат марганца стерилизуют отдельно. СаСО₃ стерилизуют сухим жаром при 180°С в течение 2 часов. рН доводят до 7.0.

Пример 6. Эффект усиления экспрессии гена araE на продукцию аргинина.

Для проверки эффекта влияния усиленной экспрессии гена araE под контролем P_L-tac промотора на продукцию аргинина фрагменты ДНК из хромосомы описанного выше штамма Е.coli МС1655Р_L-tacaraE могут быть перенесены в хромосому штамма-продуцента аргинина Е.coli 382 с помощью Р1 трансдукции (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY). Штамм 382 депонирован в Российской Национальной Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) (Россия, 113545 Москва, 1-ый Дорожный проезд, 1) 10 апреля 2000 с инвентарным номером ВКПМ В-7926.

Оба штамма, родительский 382 и полученный 382 P_L-tacaraE, могут выращиваться с перемешиванием при 32°С в течение 18 часов в 2 мл питательного бульона LB. 0.3 мл полученных культур может быть внесено в 2 мл ферментационной среды в пробирки 20×200 мм и выращивают при 32°С в течение 48 часов на роторной качалке.

После выращивания количество накопленного в среде аргинина может быть определено с помощью бумажной хроматографии, при этом используется следующий состав подвижной фазы: бутанол:уксусная кислота:вода=4:1:1 (v/v). Раствор (2%) нингидрина в ацетоне может быть использован для визуализации. Пятна, содержащие L-аргинин, могут быть вырезаны, L-аргинин может быть элюирован 0.5% водным раствором CdCl₂, после чего количество L-аргинина может быть оценено спектрофотометрическим методом при длине волны 540 нм.

Состав ферментационной среды (г/л):

Глюкоза	48.0
(NH₄)₂SO₄	35.0
КН₂PO₄	2.0
MgSO₄×7H₂O	1.0
Тиамин HCl	0.0002
Дрожжевой экстракт	1.0
L-изолейцин	0.1
СаСО₃	5.0

Пример 7. Эффект усиления экспрессии гена araE на продукцию триптофана.

Для проверки эффекта влияния усиленной экспрессии гена araE под контролем промотора P_L-tac на продукцию триптофана, фрагменты ДНК из хромосомы описанного выше штамма Е.coli М01655Р_L-tacaraE могут быть перенесены в штамм-продуцент триптофана Е.coli SV164 (pGH5) PI трансдукцией (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY). Штамм SV164 (pGH5) подробно описан в патенте США 6180373 или Европейском патенте 0662143.

Оба штамма, полученный SV164(pGH5)P_L-tacaraE и родительский SV164(pGH5), могут выращиваться с перемешиванием при 37°С в течение 18 часов в 3 мл питательного бульона с добавлением тетрациклина (маркера плазмиды pGH5) 20 мг/мл. 0.3 мл полученных культур могут быть внесены в 3 мл ферментационной среды, содержащей тетрациклин (20 мг/мл), в пробирках 20×200 мм и могут выращиваться при 37°С в течение 48 часов на роторной качалке при 250 об/мин. После выращивания количество накопленного в среде триптофана может быть определено с помощью TLC, как описано в Примере 5. Состав ферментационной среды представлен в Таблице 1.

Таблица 1
Секция	Компонент	Конечная концентрация, г/л
А	КН₂PO₄	1.5
	NaCl	0.5
	(NH₄)₂SO₄	1.5
	L-метионин	0.05
	L-фенилаланин	0.1
	L-тирозин	0.1
	Мамено (общий N)	0.07
В	Глюкоза	40.0
	MgSO₄×7H₂O	0.3
С	CaCl₂	0.011
D	FeSO₄×7H₂O	0.075
	Натрий лимоннокислый	1.0
Е	Na₂MoO₄×2H₂O	0.00015
	Н₃ВО₃	0.0025
	CoCl₂×6Н₂O	0.00007
	CuSO₄×5H₂O	0.00025
	MnCl₂×4H₂O	0.0016
	ZnSO₄×7H₂O	0.0003
F	Тиамин HCl	0.005
G	СаСО₃	30.0
Н	Пиридоксин	0.03

рН 7.1 в Секции А доводили с помощью NH₄OH. Каждую из Секций А-Н стерилизовали отдельно.

Пример 8. Эффект усиления экспрессии гена araE на продукцию глутаминовой кислоты.

Для проверки эффекта влияния усиленной экспрессии гена araE под контролем Р_L-tac промотора на продукцию глутаминовой кислоты фрагменты ДНК из хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655P_L-tacaraE могут быть перенесены в хромосому штамма-продуцента глутаминовой кислоты Е.coli VL334thrC⁺с помощью Р1 трансдукции (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY). Штамм VL334thrC⁺ подробно описан в Европейской патентной заявке ЕР1172433.

Оба штамма, родительский VL334thrC⁺ и полученный VL334thrC⁺ Р_L-tacaraE, могут выращиваться с перемешиванием при 37°С в течение 18 часов в 3 мл питательного бульона. 0.3 мл полученных культур может быть внесено в 3 мл ферментационной среды в 20×200 мм пробирок и выращивают при 37°С в течение 48 часов на роторной качалке при 250 об/мин.

Состав ферментационной среды (рН 7.2) (г/л):

Глюкоза	60.0
Сульфат аммония	25.0
КН₂PO₄	2.0
MgSO₄	1.0
Тиамин	0.0001
L-изолейцин	0.05
СаСО₃	25.0

Глюкозу и мел стерилизуют отдельно.

Пример 9. Эффект усиления экспрессии гена araE на продукцию лизина (2)

(1) Конструирование продуцирующего L-лизин штамма, в котором разрушены гены лизиндекарбоксилазы

В E.coli имеются лизиндекарбоксилазы, которые кодируются генами cadA (инвентарный номер NP_418555 в базе данных GenBank) и ldcC (инвентарный номер NP_414728 в базе данных GenBank)(см. заявку РСТ WO 96/17930). В качестве родительского штамма использовали штамм E.coli WC196(FERM BP-5252). Штамм, в котором разрушены гены, кодирующие лизиндекарбоксилазы, впервые сконструировали с использованием метода, известного как "Red-зависимая интеграция", разработанного Datsenko, K.A. и Wanner, B.L. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(12), 6640-6645 (2000)) и системы вырезания фага λ (Cho E.H. et al., J.Bacteriol., 184(18):5200-3 (2002)). "Red-зависимая интеграция" позволяет конструировать штамм с разрушенным геном за одну стадию с использованием продукта ПЦР, полученного с использованием в качестве праймеров синтетических олигонуклеотидов, содержащих на 5'-конце фрагмент последовательности целевого гена и на 3'-конце фрагмент гена устойчивости к антибиотику. Сочетание с системой вырезания фага λ позволяет удалять ген устойчивости к антибиотику, который встроен в хромосому штамма с разрушенным геном (патентная заявка Японии JP 2005-058227A).

Ген cadA удаляли следующим образом. В качестве матрицы для ПЦР использовали плазмиду pMW118-attL-Cm-attR (патентная заявка Японии JP 2005-058227A). Плазмида pMWl 18-attL-Cm-attR получена вставкой attL и attR, сайтов аттачмента фага λ, и гена cat, гена устойчивости к антибиотику, в плазмиду pMWl 18 (Takara Bio), в порядке attL-cat-attR. Для проведения ПЦР использовали праймеры Р6 (SEQ ID NO:9) и Р7 (SEQ ID NO:10), имеющие на 3'-концах последовательности attL и attR соответственно и на 5'-концах последовательности, соответствующие части целевого гена cadA. Амплифицированный продукт ПЦР очищали в агарозном геле и посредством электропорации вводили в клетки E.coli WC196, содержащие плазмиду pKD46, репликация которой чувствительна к температуре. Плазмида pKD46 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(12), 6640-6645 (2000)) содержит фрагмент ДНК фага λ, длиной 2154 н.п., содержащий гены (γ, β и ехо), кодирующие Red рекомбиназу λ Red-гомологичной системы рекомбинации под контролем промотора P_araB, индуцируемого арабинозой (инвентарный номер J02459, номера нуклеотидов с 31088 по 33241 в базе данных GenBank/EMBL). Плазмида pKD46 необходима для интеграции продукта ПЦР в хромосому штамма Е, coli WC 196.

Электрокомпетентные клетки получали следующим образом: ночную культуру штамма E.coli WC196 выращивали при 30°С в среде LB с добавкой ампициллина (100 мг/л), разводили в 100 раз в 5 мл среды SOB (Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), содержащей ампициллин (20 мг/л) и L-арабинозу (1 мМ). Полученную культуру растили с перемешиванием при 30°С до достижения OD₆₀₀≈0.6, после чего делали клетки электрокомпетентными путем концентрирования в 100 раз и трехкратного отмывания 10%-ным раствором глицерина. Электропорацию проводили с использованием 70 мкл клеток и ≈100 нг ПНР-продукта. После электропорации клетки инкубировали в 1 мл среды SOC (Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) при 37°С в течение 2.5 часов, после чего высевали на чашки с L-агаром, содержащим хлорамфеникол (Cm) (25 мг/л), и выращивали при 37°С для отбора устойчивых к Cm рекомбинантов. Затем для удаления плазм иды pKD46 проводили 2 пассажа на L-агаре, содержащем Cm, при 42°С, полученные колонии проверяли на чувствительность к ампициллину, отбирали чувствительные к ампициллину штаммы, утратившие плазмиду pKD46. Делецию гена cadA в вариантах, содержащих ген устойчивости к Cm, подтверждали с помощью ПЦР. Полученный дефицитный по cadA штамм назвали WC196ΔcadA::att-cat.

На следующем этапе для удаления генов att-cat, встроенных в ген cadA, в качестве вспомогательной плазмиды использовали pMW-intxis-ts (патентная заявка Японии JP 2005-058227А). Плазмида pMW-intxis-ts содержит гены, кодирующие эксцизионазу (Xis) и интегразу (Int) фага λ, репликация данной плазмиды чувствительна к температуре. Компетентные клетки WC196ΔcadA::att-cat получали описанными выше обычными методами, трансформировали вспомогательной плазмидой pMW-intxis-ts и культивировали для отбора устойчивых к ампициллину штаммов при 30°С на L-агаре, содержащем ампициллин (50 мг/л). Далее для удаления плазмиды pMW-intxis-ts проводили 2 пассажа на L-агаре, содержащем Cm, при 42°С. Полученные колонии проверяли на устойчивость к ампициллину и хлорамфениколу и отобрали колонию клеток, чувствительных к хлорамфениколу и ампициллину. Этот штамм, в котором разрушен ген cadA и удалена pMW-intxis-ts, назвали WC196ΔcadA.

Затем ген ldcC в WC196ΔcadA удаляли с использованием праймеров Р8 (SEQ ID NO:11) и Р9 (SEQ ID NO:12) в соответствии с вышеописанным методом. Таким образом получили штамм с удаленными генами cadA и IdcC, штамм назвали WC196ΔcadAΔldcC.

WC196ΔcadAΔldcC трансформировали обычными методами с использованием плазмиды pCABD2 (заявка РСТ WO 01/53459). Плазмида pCABD2 содержит ген dapA, кодирующий дигидродипиколинатсинтазу и содержащий мутацию, благодаря которой происходит уменьшение чувствительности к обратному ингибированию L-лизином, ген lysC, кодирующий аспартокиназу III и содержащий мутацию, благодаря которой происходит уменьшение чувствительности к обратному ингибированию L-лизином, ген dapB, кодирующий дигидродипиколинатредуктазу, и ген ddh, кодирующий диаминопимелатдегидрогеназу (патент США 6040160). Таким образом сконструировали штамм WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2 (WC196LC(pCABD2)).

(2) Влияние усиления экспрессии гена araE на продукцию L-лизина.

Для проверки влияния усиления экспрессии гена araE под контролем Р_L-tac промотора на продукцию лизина фрагмент ДНК, содержащий ген araE, клонировали в pMW219 (Takara Shuzo, Япония). Специальные процедуры конструирования плазмиды для усиленния экспрессии гена araE были следующие: фрагменты ДНК, содержащие ген araE, амплифицировали методом ПЦР с использованием пары праймеров P10 (SEQ ID NO:13) и P11 (SEQ ID NO:14), которые включают сайты рестрикции Kpnl и Sacl соответственно. ПЦР осуществляли с использованием "Pyrobest DNA Polymerase" (Applied Takara Shuzo). В качестве ДНК-матрицы для ПЦР использовали приблизительно 20 нг геномной ДНК E.coli K-12MG1655.

Использовали следующий температурный профиль: начальная денатурация ДНК в течение 1 минуты при 94°С; затем 30 циклов денатурации при 98°С в течение 5 сек, отжига при 59°С в течение 30 сек и полимеризации при 72°С в течение 2 мин и финальная полимеризация в течение 10 мин при 72°С. Затем амплифицированные фрагменты ДНК очищали с помощью электрофореза в агарозном геле, выделяли с использованием "GenElute Spin Columns" ("Sigma", CLUA) и переосаждали этанолом. Продукт ПЦР и вектор pMW219 обрабатывали рестриктазами Kpnl и Sac, затем лигировали друг с другом с использованием 2xLigation Kit (Nippon Gene). Таким образом сконструировали плазмиду рМ-araE, содержащую ген araE под контролем Р_L-tac промотора.

Штамм-продуцент лизина Е.coli WC196 (pCABD2) трансформировали плазмидами pMW219 в качестве контроля и рМ-araE, таким образом сконструировали штаммы WC196 (pCABD2,pMW219) и WC196 (pCABD2, рМ-araE) соответственно.

Оба штамма Е.coli WC196 (pCABD2, pMW219) и WC196 (pCABD2, рМ-araE) выращивали в L-среде, содержащей 25 мг/л канамицина и 20 мг/л стрептомицина при 37°С до достижения OD₆₀₀≈0.6. Затем к каждой культуральной жидкости добавляли равный объем 40%-ного раствора глицерина, перемешивали, разделяли на соответствующие объемы и хранили при -80°С. Далее эти образцы упоминаются здесь как глицериновые пробы.

Глицериновые пробы этих штаммов размораживали, по 100 мкл каждой пробы высевали на L-агар, содержащий 25 мг/л канамицина и 20 мг/л стрептомицина, чашки инкубировали при 37°С в течение 24 ч. Приблизительно 1/8 часть собранных с чашки клеток инокулировали в 20 мл среды для ферментации, содержащей 25 мг/л канамицина и 20 мг/л стрептомицина (использовали колбы Sakaguchi объемом 500 мл), проводили культивирование при 37°С в течение 16 ч с использованием возвратно-поступательной качалки. После культивирования количество накопленного в среде лизина измеряли известным способом (Biotech-analyzer AS210, производитель - Sakura Seiki Co).

Состав ферментационной среды (г/л):

Глюкоза	40
(NH₄)₂SO₄	24
K₂HPO₄	1.0
MgSO₄×7Н₂O	1.0
FeSO₄×7H₂O	0.01
MnSO₄×5H₂O	0.01
Дрожжевой экстракт	2.0

рН доводили до 7.0 с помощью КОН и среду автоклавировали при 115°С в течение 10 мин. Глюкозу и MgSO₄×7H₂O стерилизовали отдельно. Также добавляли 30 г/л СаСО₃, предварительно простерилизованного сухим жаром при 180°С в течение 2 часов.

Как видно из результатов, представленных в Таблице 2, штамм Е.coli WC196 (pCABD2, pM-araE) накапливает большее количество L-лизина по сравнению со штаммом Е.coli WC196 (pCABD2, pMW219).

Таблица 2
Штамм	OD₆₀₀	Lys·HCl, г/л
WC196LC(pCABD2, pMW219)	6.5	3.8
WC196LC(pCABD2, pM-araE)	9.6	5.4

Хотя указанное изобретение описано в деталях со ссылкой на Наилучший способ осуществления изобретения, для специалиста в указанной области техники очевидно, что могут быть совершены различные изменения и произведены эквивалентные замены, и такие изменения и замены не выходят за рамки настоящего изобретения. Каждому из упомянутых выше документов соответствует ссылка, и все цитируемые документы являются частью описания настоящего изобретения.

1. Бактерия-продуцент L-аминокислоты, в частности L-лизина, принадлежащая к роду Escherichia, модифицированная таким образом, что активность низкоспецифичной пермеазы L-арабинозы в указанной бактерии повышена.

2. Бактерия по п.1, отличающаяся тем, что активность низкоспецифичной пермеазы L-арабинозы повышена за счет усиления экспрессии гена, кодирующего низкоспецифичную пермеазу L-арабинозы.

3. Бактерия по п.2, отличающаяся тем, что указанная активность низкоспецифичной пермеазы L-арабинозы повышена за счет модификации последовательности, контролирующей экспрессию гена, кодирующего пермеазу L-арабинозы, или за счет увеличения количества копий гена, кодирующего пермеазу L-арабинозы.

4. Бактерия по п.1, отличающаяся тем, что указанная бактерия дополнительно модифицирована таким образом, что активность глюкокиназы в данной бактерии повышена.

5. Бактерия по п.1, отличающаяся тем, что указанная бактерия дополнительно модифицирована таким образом, что активность изомеразы ксилозы в данной бактерии повышена.

6. Бактерия по п.1, отличающаяся тем, что указанный ген кодирует низкоспецифичную пермеазу L-арабинозы, выбранную из группы, состоящей из

(A) белка, включающего аминокислотную последовательность,

приведенную в Списке последовательностей под номером 2 (SEQ ID NO: 2); и

(B) варианта белка с аминокислотной последовательностью, представленной в Списке последовательностей под номером 2 SEQ ID NO: 2, и который обладает активностью низкоспецифичной пермеазы L-арабинозы.

7. Бактерия по п.1, отличающаяся тем, что указанный ген, кодирующий низкоспецифичную пермеазу L-арабинозы, включает в себя ДНК, выбранную из группы, состоящей из

(a) ДНК, которая включает в себя нуклеотидную последовательность с 1 по 1419 нуклеотид, представленной в Списке последовательностей под номером 1 (SEQ ID NO: 1); и

(b) ДНК, которая гибридизуется с нуклеотидной последовательностью с 1 по 1419 нуклеотид, представленной в Списке последовательностей под номером 1 (SEQ ID NO: 1), или с зондом, который может быть синтезирован на основе указанной нуклеотидной последовательности в жестких условиях, и кодирует белок, обладающий активностью низкоспецифичной пермеазы L-арабинозы.

8. Бактерия по п.7, отличающаяся тем, что указанные жесткие условия включают в себя отмывку при 60°С и концентрации солей 1×SSC и 0,1% SDS в течение 15 мин.

9. Способ получения L-аминокислоты, в частности L-лизина, включающий выращивание бактерии по п.1 в питательной среде, содержащей глюкозу в качестве источника углерода, приводящее к накоплению указанной L-аминокислоты в культуральной жидкости, и выделение указанной L-аминокислоты из культуральной жидкости.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения неароматической L-аминокислоты с использованием бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, которая модифицирована таким образом, что в указанной бактерии ген csrA инактивирован.

Способ получения l-треонина с использованием бактерии, принадлежащей к роду escherichia, в которой инактивирован оперон phobr // 2311452

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения L-треонина с использованием бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, которая модифицирована таким образом, что оперон phoBR в указанной бактерии инактивирован.

Гены corynebacterium glutamicum, кодирующие белки, участвующие в метаболизме углерода и продуцировании энергии // 2310686

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой выделенные молекулы нуклеиновой кислоты Corynebacterium glutamicum, которые кодируют полипептид, обладающий активностью 6-фосфоглюконолактоназы.

Способ получения l-аминокислоты // 2307165

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения L-аминокислоты. .

Гены corynebacterium glutamicum, кодирующие белки, участвующие в гомеостазе и адаптации // 2304616

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой выделенные молекулы нуклеиновой кислоты Corynebacterium glutamicum, которые кодируют полипептид с активностью сульфатаденилаттрансферазы.

Способ получения l-аминокислот с использованием бактерий, принадлежащих к роду escherichia // 2304615

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения L-аминокислот, таких как L-треонин, L-лизин, L-гистидин, L-фенилаланин, L-аргинин или L-глутаминовая кислота, с использованием бактерии рода Escherichia, причем бактерия модифицирована таким образом, что активность пермеазы D-ксилозы в указанной бактерии повышена.

Гены corynebacterium glutamicum, кодирующие белки резистентности и толерантности к стрессам // 2303635

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой выделенные молекулы нуклеиновой кислоты Corynebacterium glutamicum, которые кодируют полипептид с активностью белка резистентности к линкомицину.

Бактерия рода bacillus, продуцирующая l-аминокислоту, и способ получения l-аминокислоты // 2299907

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения L-аминокислоты посредством культивирования бактерии рода Bacillus, обладающей способностью продуцировать L-аминокислоту, в среде, содержащей метанол в качестве источника углерода, и сбора L-аминокислоты из среды или клеток указанной бактерии.

Способ получения l-аминокислот методом ферментации с использованием бактерий, обладающих повышенной экспрессией генов утилизации ксилозы // 2283346

Изобретение относится к биотехнологии. .

Способ получения производного глютамата (варианты) и способ получения монатина // 2280078

Изобретение относится к биотехнологии. .

Рекомбинантная днк, кодирующая функционально активный гибридный белок оксидазы d-аминокислот с хитинсвязывающим доменом (daocbd) рекомбинантная плазмида pvr1, обеспечивающая его синтез в клетках escherichia coli, и рекомбинантный штамм escherichia coli с 41(de3)/pvr1 - продуцент daocbd // 2310688

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и может быть использовано в микробиологической промышленности при получении полусинтетических бета-лактамных антибиотиков нового поколения.

Рекомбинантная плазмида pettvdao2, обеспечивающая синтез оксидазы d-аминокислот (dao) дрожжей trigonopsis variabilis в клетках escherichia coli и рекомбинантный штамм escherichia coli c41(de3)/pettvdao2 - продуцент dao // 2310687

Гены corynebacterium glutamicum, кодирующие белки, участвующие в метаболизме углерода и продуцировании энергии // 2310686

Кольцевая молекула днк, характеризующаяся зависимой от условий точкой начала репликации, способ их получения и их применение в генной терапии // 2307870

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой прокариотическую рекомбинантную клетку хозяина, содержащую гетерологичный белок инициации репликации, который активирует зависимую от условий точку начала репликации, и внехромосомную молекулу ДНК, содержащую гетерологичный терапевтический ген и зависимую от условий точку начала репликации.

Рекомбинантная фагмидная днк phen-tab, содержащая ген одноцепочечного антитела человека, способного связывать фактор некроза опухоли альфа человека; рекомбинантный штамм бактерий escherichia coli-продуцент одноцепочечного антитела человека против фактора некроза опухоли альфа человека; рекомбинантное растворимое одноцепочечное антитело человека против фактора некроза опухоли альфа человека // 2307163

Изобретение относится к генной инженерии и может быть использовано для получения растворимых одноцепочечных антител человека против фактора некроза опухоли альфа человека.

Гены corynebacterium glutamicum, кодирующие белки метаболических путей // 2306339

ob'-производная плазмида rsf1010, не содержащая гены устойчивости к антибиотикам, бактерия, содержащая указанную плазмиду, и способ получения полезных метаболитов // 2306338

Изобретение относится к генетической инженерии и может быть использовано для получения полезных метаболитов. .

Рекомбинантная плазмида, экспрессирующая клонированный ген гемагглютинин/протеазы vibrio cholerae, и штамм escherichia coli - продуцент гемагглютинин/протеазы vibrio cholerae // 2306337

Изобретение относится к биотехнологии, генной инженерии, медицинской микробиологии и представляет собой рекомбинантную плазмиду рНР61, экспрессирующую клонированный ген hapA (гемагглютинин/протеазы) Vibrio cholerae, а также штамм E.coli KM 192 Государстенной коллекции патогенных бактерий «Микроб», несущий рекомбинантную плазмиду рНР61, - продуцент гемагглютинин/протеазы (НА/Р) Vibrio cholerae.

Белки, вызывающие измененную иммуногенную реакцию, и способы их получения и использования // 2311458

Изобретение относится к биотехнологии и касается варианта белка субтилизина Bacillus amyloliguefaciens с заменой Y217L, содержащий Т-клеточный эпитоп, при этом указанный Т-клеточный эпитоп указанного варианта включает одну или несколько аминокислотных замен, выбранных из группы, состоящей из остатков, соответствующих положениям 76, 79 и 122, где указанный вариант субтилизина необязательно имеет замену в одном или нескольких из положений 3, 31, 40, 41, 46, 47, 48, 50, 76, 101, 104, 107, 111, 128, 147, 154, 181, 182, 183, 185, 206, 215, 216, 218, 238, 247, 248, 250, 254, 258, 262