Способ получения растений-регенерантов в культуре пыльников проса (panicum miliaceum l.) с использованием теплового стресса
Владельцы патента RU 2312491:
Всероссийский научно-исследовательский институт зернобобовых и крупяных культур (RU)
Изобретение относится к биотехнологии, в частности получению эмбриогенных каллусов и растений-регенерантов в культуре пыльников проса. Изолированные пыльники высаживают на поверхность агаризованной среды MSB, дополненную 2 мг/л 2,4-Д. Культуру пыльников in vitro выдерживают в термостате +32°С в течение 1 суток. После теплового стресса пыльники культивируют при +24°С и 16 часовом световом дне. Сформированные эмбриогенные каллусные ткани для стимулирования регенерационного процесса помещают на среду MSB с 10 мг/л БАП и 0,5...1 мг/л НУК. Регенерирующие каллусные ткани переносят на среду MSB без регуляторов роста. Полученные в условиях этой среды корнесобственные растения-регенеранты высотой 1,5 см переводят в почву. Изобретение позволяет эффективно получать растения-регенеранты. 2 табл.
Изобретение относится к биотехнологии, в частности получению эмбриогенных каллусных тканей и растений-регенерантов в культуре пыльников проса, и может быть использовано в генетике, физиологии и селекции.
Впервые в культуре пыльников растения-регенеранты получены у вида Datura inoxia Mill. [1, 2]. Предобработка бутонов холодом (+4°С) обеспечила увеличение числа растения-регенерантов в культуре пыльников Nicotiana tabacum L. и Datura innoxia Mill. в несколько раз [3]. Обработка холодом является наиболее распространенным стрессовым воздействием на микроспоры таких злаковых культур, как пшеница, ячмень, рис, кукуруза.
Для формирования культуры пыльников проса использовали изолированные метелки, подвергшиеся стрессу низких положительных (+4°С) температур в течение 1...5 суток. Тепловой стресс ранее не применялся к культуре пыльников проса. Использование обработки метелок холодом с последующим культивированием изолированных пыльников в условиях улучшенных вариантов среды N6 давало положительный эффект, однако частота формирования эмбриогенных каллусов не превышала 4% [4].
Предложенное стрессовое воздействие теплом на изолированные пыльники проса позволяет заметно повысить эффективность получения эмбриогенных каллусов и растений-регенерантов. В отдельных вариантах частота эмбриогенного каллусогенеза достигает 28,3%. В вариантах с тепловым стрессом на 30 высаженных пыльников получено 61,3 зеленых растения-регенеранта, в то время как после обработки холодом 46, а в контроле 19.
Изолированные пыльники высаживают на поверхность агаризованной среды MSB (среда MS с витаминами В5), дополненную 2 мг/л 2,4-Д. Культуру пыльников in vitro выдерживают в термостате +32°С в течение 1 суток. После теплового стресса пыльники культивируют при +24°С и 16 часовом световом дне. Сформированные эмбриогенные каллусные ткани для стимулирования регенерационного процесса помещают на среду MSB с 10 мг/л БАП и 0,5...1 мг/л НУК. Регенерирующие каллусные ткани переносят на среду MSB без регуляторов роста. Полученные в условиях этой среды корнесобственные растения-регенеранты высотой 1,5 см переводят в почву.
Пример. Использовали пыльники растущих в тепличном боксе растений сорта Благодатное и гибридов F2: Могарообразное 2172 × Благодатное, Могарообразные веточки 1904 × Благодатное, Могарообразные веточки 1904 × Соргообразное 2171, Соргообразное 2171 × Благодатное, Соргообразное 2171 × Могарообразное 2172, Соргообразный могарообразный димутант 2083 × Благодатное.
Использовали изолированные пыльники с пыльцой на mid-uninucleate ...early dinucleate стадиях развития. Изучали два типа стрессовых воздействия: тепло и холод. Обработке холодом (+4°С) в течение 6 суток подвергали срезанные метелки. Тепловой (+32°С) стресс различной продолжительности применяли к изолированным пыльникам in vitro, помещенным на поверхность агаризованных сред. В контрольном варианте пыльники изолировали из цветков свежесрезанных метелок и не подвергали стрессовым воздействиям. Каллусогенная среда была основана на протоколе MSB: MS [5] с витаминами В5 [6] и дополнительно содержала 2 мг/л 2,4-Д (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота). Для стимулирования регенерационного процесса эмбриогенные каллусы переносили на среду MSB с 0,5...1,0 мг/л НУК-α-нафтилуксусная кислота и 10 мг/л БАП - 6-бензиламинопурин. Регенерация корнесобственных растений проса продолжалась в условиях среды MSB без регуляторов роста [7].
В 2004 г. изучали влияние теплового стресса (+32°С) различной продолжительности на эффективность эмбриогенного каллусогенеза. В варианте без стрессового воздействия (контроль) частота каллусогенеза составила 1,1% (табл.1). В варианте с обработкой пыльников теплом в течение 1 суток средняя частота формирования эмбриогенных каллусов составила 14%. При этом в варианте гибрида Соргообразное 2171 × Благодатное частота равнялась 5% (3,3% в контроле). В варианте сорта Благодатное частота была равна 3,3% (0% в контроле). Наибольшее число эмбриогенных каллусов (28,3%) наблюдали в варианте гибрида Соргообразный могарообразный димутант 2083 × Благодатное. Стрессовое воздействие на культуру пыльников теплом в течение 2 суток обеспечивало среднюю частоту эмбриогенного каллусогенеза 3,3%. В варианте сорта Благодатное частота равнялась 6,7%. Однако у гибрида Соргообразное 2171 × Благодатное она была равна нулю. Обработка пыльников теплом в течение 3 суток в варианте гибрида Соргообразное 2171 × Благодатное определила частоту 1,7%, что соответствовало контрольному варианту.
В 2005 г. изучали влияние двух видов стрессовых воздействий: обработку пыльников теплом (+32°С) in vitro и метелок проса холодом (+4°С) на эффективность эмбриогенного каллусогенеза и регенерации. Всего в контроле было высажено 300 пыльников. В вариантах с тепловым и холодовым стрессами высажено, соответственно, 750 и 210 пыльников. С каждого гибридного растения изолировали и помещали на каллусогенную агаризованную среду 30 пыльников. Для того чтобы уменьшить влияние на результат неподходящих для эмбриогенеза стадий развития пыльцы анализировали только те посадки по 30 пыльников, в которых было не менее 1 эмбриогенного каллуса. В опыте использовали генетически близкие гибриды (табл.2).
Средняя частота формирования эмбриогенных каллусов в варианте с обработкой теплом (120 пыльников) составила 9,2%. Средняя частота эмбриогенного каллусогенеза в варианте с обработкой холодом (90 пыльников) равнялась 4,4%. В контроле (30 пыльников) частота была равна 3,3%.
Среднее число всех регенерантов, приходящееся на 30 пыльников, в варианте с тепловым стрессом равнялось 78,3. В варианте с холодом среднее число регенерантов составило 43,3. В контрольном варианте получено 38 регенерантов. После обработок теплом, холодом и в контроле получено, соответственно, 61,3; 42; 19 зеленых регенерантов на 30 пыльников. Процент зеленых регенерантов был, соответственно, равен 78,3; 96,9; 50.
По результатам опытов 2004 и 2005 гг. установили, что тепловая обработка изолированных пыльников при температуре +32°С в течение 1 суток заметно повышает эффективность эмбриогенного каллусогенеза и регенерации в культуре пыльников проса в сравнении с контролем и другими стрессовыми воздействиями. Особого внимания заслуживает факт массового (28,3%) формирования эмбриогенных каллусов в варианте с тепловым стрессом.
Источники информации
1. Guha S., Maheshwari S.C. In vitro production of embryos from anthers of Datura//Nature. - 1964. - V.204.
2. Guha S., Maheshwari S.C. Development of embryoids from pollen grains of Datura in vitro. Phyromorphalogy. - 1967. - V.17.
3. Nitsch С., Noreel В. Effet d'um choc thermiquesur le pouvoir embryogenedu pollende Datura innoxia cultive dansl'anthere ou isole de l'anthere. //C.R.Acad. Sci. (Paris). Ser. D. - 1973. - V.276.
4. Патент РФ на изобретение №2217907. Способ получения регенерантных растений в культуре пыльников проса (Panicum miliaceum L.) /С.В.Бобков/ Заявка №2001121609/13. Приоритет 31.07.2001. Зарегистрирован 10.12.2003. Бюл. №34.
5. Murashige Т., Skoog F.A revised medium for rapid growth and bioasseys with tobacco tissue cultures//Physil. Plant. - 1962. - V.15. - №13. - P.473-497.
6. Gamborg O., Eveleigh D.E. Culture methods and detection of gluconases in cultures of wheat and barley//Can. J. Biochem. - 1968. - V.46. - №5. - Р.417-421.
7. Бобков С.В. Получение регенерантов проса и просовых культур. //Доклады Россельхозакадемии. - 2005. - №6. - С.5-7.
| Таблица 1 Влияние теплового стресса на эффективность эмбриогенного каллусогенеза в культуре пыльников проса (2004 г.) | ||||
| Тепловой стресс 32°С, сутки | Гибрид F2, сорт | Высажено пыльников | Получено эмбриогенных каллусов | % эмбриогенного каллусогенеза |
| 0(контроль) | Соргообразное 2171 × Благодатное | 30 | 1 | 3,3 |
| Благодатное | 60 | 0 | 0 | |
| Итого: | 90 | 1 | 1,1 | |
| 1 | Соргообразное 2171 × Благодатное | 60 | 3 | 5 |
| Благодатное | 30 | 1 | 3,3 | |
| Соргообразный могарообразный димутант 2083 × Благодатное | 60 | 17 | 28,3 | |
| Итого: | 150 | 21 | 14 | |
| 2 | Соргообразное 2171 × Благодатное | 30 | 0 | 0 |
| Благодатное | 30 | 2 | 6,7 | |
| Итого: | 60 | 2 | 3,3 | |
| 3 | Соргообразное 2171 × Благодатное | 60 | 1 | 1,7 |
| Итого: | 60 | 1 | 1,7 | |
| ВСЕГО: | 360 | 25 | 6,9 |
| Таблица 2 Эффективность эмбриогенного каллусогенеза и регенерации растений в культуре пыльников проса (2005 г.) | |||||||||
| Тип стресса | Гибрид | Метелка | Число пыльников | Получено каллусов | Получено регенерантов | % зеленых регенерантов | |||
| Всего | % | Всего | Зеленых | Альбиносов | |||||
| Контроль | Соргообразное 2171 × Могарообразное 2172 | 12 | 30 | 1 | 3,3 | 38 | 19 | 19 | 50 |
| Итого: | 30 | 1 | 3,3 | 38 | 19 | 19 | 50 | ||
| На 30 пыльников: | 30 | 1 | 3,3 | 38 | 19 | 19 | 50 | ||
| 32°С, 1 сутки | Соргообразное 2171 × Могарообразное 2172 | 14 | 30 | 2 | 6,6 | 90 | 75 | 15 | 83,3 |
| Могарообразные веточки 1904 × Соргообразное 2171 | 15 | 30 | 1 | 3,3 | 10 | 5 | 5 | 50 | |
| Могарообразные веточки 1904 × Благодатное | 30 | 30 | 1 | 3,3 | 99 | 90 | 9 | 90,9 | |
| Могарообразные веточки 1904 × Благодатное | 31 | 30 | 7 | 23,3 | 114 | 75 | 39 | 65,8 | |
| Итого: | 120 | 11 | 9,2 | 313 | 245 | 68 | 78,3 | ||
| На 30 пыльников: | 30 | 2,8 | 9,3 | 78,3 | 61,3 | 17 | 78,3 | ||
| 4°С, 6 суток | Могарообразные веточки 1904 × Благодатное | 32 | 30 | 1 | 3,3 | 43 | 43 | 0 | 100 |
| Могарообразные веточки 1904 × Благодатное | 34 | 30 | 1 | 3,3 | 62 | 58 | 4 | 93,5 | |
| Могарообразные веточки 1904 × Соргообразное 2171 | 36 | 30 | 2 | 6,6 | 25 | 25 | 0 | 100 | |
| Итого: | 90 | 4 | 4,4 | 130 | 126 | 4 | 96,9 | ||
| На 30 пыльников: | 30 | 1,3 | 4,3 | 43,3 | 42 | 1,3 | 96,9 | ||
| ВСЕГО: | 240 | 16 | 6,7 | 481 | 390 | 91 | 81,1 |
Способ получения растений-регенерантов в культуре пыльников проса (Panicum miliaceum L.) с использованием теплового стресса, включающий получение эмбриогенных каллусных тканей и растений-регенерантов, отличающийся тем, что для эффективного формирования эмбриогенных каллусов изолированные пыльники in vitro в условиях питательной среды MSB с 2 мг/л 2,4-Д выдерживают в термостате при температуре +32°С в течение 1 сут, а затем культивируют при +24°С и 16-часовом световом дне, для стимулирования регенерационного процесса каллусы переносят на среду MSB с 10 мг/л БАП и 0,5...1 мг/л НУК, а для получения корнесобственных растений-регенерантов регенерирующие каллусные ткани помещают на среду MSB без регуляторов роста.
