Способ раннего выявления риска формирования тромбоцитарных нарушений у животных
Владельцы патента RU 2316767:
Медведев Илья Николаевич (RU)
Беспарточный Борис Дмитриевич (RU)
Изобретение относится к ветеринарии, к области гематологии. Сущность способа: из венозной крови новорожденных телят выделяют тромбоциты, определяют в них активность каталазы, супероксиддисмутазы (СОД), содержание малонового диальдегида (МДА) и рассчитывают фактор антиоксидантного состояния тромбоцитов (ФАСТ), по значениям которого прогнозируют развитие тромбоцитарных нарушений. Использование способа позволяет проводить своевременную и эффективную профилактику тромбоцитопатии у новорожденных телят. 3 табл., 2 ил.
Изобретение относится к медицине и ветеринарии, к области гематологии, а именно к гемостазу, и может быть использовано для раннего выявления риска формирования тромбоцитарных нарушений у людей и животных.
Известен способ диагностики тромбоцитопатий (Шитикова А.С. Алгоритм диагностики тромбоцитопатий высвобождения. // Казанский медицинский журнал 1990, №3. - С.206-212), который позволяет диагностировать тромбоцитопатию у различного контингента больных. Имеется способ Ермолаевой Т.А. и соавт. (1992) (Ермолаева Т.А., Головина О.Г., Морозова Т.В., Пономаренко В.М., Лубо-Лесинченко И.Ф. Программа клинико-лабораторного обследования больных тромбоцитопатиями. // Методические рекомендации. СПБ.: 1992. - 25 с.), позволяющий выявлять нарушения тромбоцитарных функций при различных патологических состояниях. Однако в данных способах не предусматривается раннее выявление риска формирования тромбоцитарных нарушений, а констатируется их наличие, что не позволяет проводить своевременную профилактику, а осуществлять только лечение. Прототипом может быть назван следующий литературный источник: Медведев И.Н. и др. Внутрисосудистая активность тромбоцитов у больных артериальной гипертензией с метаболическим синдромом и ее коррекция с помощью Сиофора и немедикаментозных методов. Фарматека, 2004, №5, с.58-62.
Целью изобретения является раннее выявление риска формирования тромбоцитарных нарушений у людей и новорожденных телят.
Сущность заявляемого способа заключается в том, что для раннего выявления риска формирования тромбоцитарных нарушений у людей и новорожденных телят из вены берется кровь в пробирку для последующего выделения из нее тромбоцитов, определения в них активности каталазы, супероксиддисмутазы (СОД), содержания малонового диальдегида (МДА) и расчета фактора антиоксидантного состояния тромбоцитов (ФАСТ).
По полученным значениям ФАСТ у каждого конкретного больного возможно прогнозировать развитие тромбоцитарных нарушений. По состоянию ФАСТ регистрируется риск их возникновения как обязательное следствие повреждающего влияния на структуры тромбоцитов возрастающего количества продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) кровяных пластинок при ослаблении в них активности каталазы и СОД.
Способ отличается тем, что с применением нескольких технически простых и не требующих дорогостоящих реактивов, оборудования, затрат сил и времени методов возможно раннее выявление риска формирования тромбоцитарных нарушений у людей и новорожденных телят, способного привести без применения мер профилактики к тромбофиллической тромбоцитопатии с возникновением тромбозов различных сосудов.
По завершению профилактических мероприятий возможно повторное обследование с определением ФАСТ с целью контроля адекватности проводимых мер.
Заявляемый способ осуществляется следующим образом. Взятие крови производят в утренние часы после 14 часового голодания. Кровь берут из вены в количестве 20 мл через толстую иглу самотеком в пробирку. В качестве консерванта используют 5% раствор трилона Б из расчета 1,5 мл консерванта на 20 мл цельной крови. Затем кровь с консервантом осторожно и тщательно перемешивают и для осаждения эритроцитов и лейкоцитов центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочный слой, который содержит основную массу тромбоцитов, отсасывают в отдельную пробирку и центригируют при 1000 об/мин в течение 10 мин. При этом оставшиеся в надосадочном слое эритроциты и лейкоциты оказываются в осадке. Осадок удаляют, а супернатант помещают в отдельную пробирку и центифугируют при 2200 об/мин в течение 15 мин. В результате получают осадок, состоящий из одних тромбоцитов. Выход тромбоцитов составляет 1,5×109-2,5×109 клеток из 20 мл цельной крови. Полученные тромбоциты отмывают следующим образом. Недосадочную жидкость после третьего центрифугирования удаляют, а к осадку тромбоцитов добавляют 6 мл 0,85% раствора натрия хлорида, приготовленного на 2,7% растворе трилона Б. Осадок кровяных пластинок осторожно перемешивают и центрифугируют при 2200 об/мин в течение 10 мин. Затем супернатант удаляют, а к осадку вновь добавляют физиологический раствор на трилоне Б в тех же количествах. Эту процедуру повторяют трижды. Следует отметить, что выделение и отмывание тромбоцитов проводят при комнатной температуре. Часть клеток в процессе отмывания теряется и количество тромбоцитов, выделенных из 20 мл цельной крови, в итоге составляет в среднем 1,8x109 клеток. В каждом конкретном случае количество тромбоцитов подсчитывается в камере Горяинова.
Последующая оценка активности каталазы и СОД осуществляется следующим способом.
Определение каталазы в крови. Принцип метода состоит в том, что каталаза разрушает субстрат Н2О2, а оставшуюся неразрушенной часть перекиси водорода измеряют с помощью молибдата натрия. Как известно, для молибдена характерно образование при взаимодействии с перекисью водорода перекисных соединений состава Na2MoO6, которые имеют желтую окраску. Интенсивность окраски образующихся перекисных соединений молибдена зависит от количества перекиси водорода в растворе, т.е. от активности каталазы в пробе.
Реагенты.
(1) 0,3% водный раствор перекиси водорода (1 мл концентрированного раствора перекиси водорода доводят дистиллированной водой до 100 мл).
(2) 4% водный раствор молибдата натрия.
| Таблица 1. | ||
| Схема определения каталазы в крови | ||
| Вводимые реагенты | Холостая проба | Исследуемая проба |
| Раствор Н2О2, мл | 2,000 | 2,000 |
| Суспензия тромбоцитов, мл | ------ | 0,010 |
| Раствор молибдата, мл | 1,000 | 1,000 |
В табл.1 приведено описание методики.
Раствор молибдата добавляют к каждой пробе по отдельности и сразу же после перемешивания реакционной смеси измеряют экстинкцию при 410 нм против дистиллированной воды. Экстинкция холостой пробы около 0,350. Чем больше в пробе каталазы, тем меньше перекиси водорода остается неразрушенной и тем меньше образуется перекисей молибдата. Результат оценивают по степени разрушения перекиси водорода каталазой или степени блокирования образования конечных продуктов перекисей молибдата и выражают в процентах. Расчет проводят по формуле:
где Ех.пр и Еисс.пр - экстинкция соответственно холостой и исследуемой проб. С помощью калибровочной кривой, построенной для стандартных растворов каталазы (фиг.1), оценивают активность каталазы в пробе на основании рассчитанного процента разрушения перекиси водорода. Активность каталазы относят к концентрации тромбоцитов (в МЕ/109 тр.) в исследуемой взвеси тромбоцитов.
По оси абсцисс схемы отложена активность каталазы в МЕ/109 тр., по оси ординат - блокирование реакции в %.
Определение СОД. Принцип определения основан на восстановлении нитротетразолия супероксидными радикалами, которые образуются при реакции между феназинметасульфатом и восстановленной формой никотинамиддинуклеотида (NAD·H). Образование нитроформазана, продукта восстановления нитротетразолия, блокируется наличием в пробе СОД. Так, на основании количества нитроформазана можно оценить активность СОД.
Реагенты.
(1) 0,15 М фосфатный буфер (рН 7,8) (4,48 г Na2HPO4, 0,25 г КН2РО4 растворяют в 500 мл дистиллированной воды).
(2) Инкубационная смесь 37 мг ЭДТА-Na2, 330 мг нитротетразолия голубого, 55 мг феназинметасульфата смешивают с 300 мл фосфатного буфера, оставляют стоять на ночь. Утром фильтруют.
(3) Раствор NAD·Н (152 мг NAD·H растворяют в 10 мл трис-ЭДТА-буфера).
(4) Трис-ЭДТА-буфер, рН 8,0 (37 мг ЭДТА-Na, 24 мг трис растворяют в 100 мл дистиллированной воды).
В суспензии тромбоцитов определяют СОД (табл.2).
| Таблица 2. | ||
| Схема определения СОД | ||
| Добавляемые реагенты | Холостая проба | Исследуемая проба |
| Инкубационная смесь, мл | 1,500 | 1,500 |
| Дистиллированная вода, мл | 0,100 | ----- |
| Суспензия тромбоцитов, мл | ----- | 0,100 |
| Раствор NAD·Н, мл | 0,050 | 0,050 |
Смешивают при комнатной температуре и измеряют экстинкцию холостой и исследуемой проб при 540 нм на спектрофотометре. Экстинкция холостой пробы составляет около 0,680. Расчет производят по формуле:
Активность СОД определяют с помощью калибровочной кривой (фиг.2). Активность СОД в крови выражают в ME/109 тр. По оси абсцисс схемы отложены активность СОД в МЕ/109 тр., по оси ординат - блокирование восстановления нитротетразолия в %.
Определение МДА. Уровень МДА определяли тиобарбитуровым методом в отмытых и ресуспендированных тромбоцитах, принцип метода Smith I.B., Jngerman С.М., Silver M.I. Malondialdehyde formation as an indicator of prostaglandin production by human platelet.// J. Lab. Clin. Med. - 1976. - Vol.88. - №1. - P.167-172 в модификации Кубатиев А.А., Андреев С.В. Перекиси липидов и тромбоз. // Бюллетень экспериментальной биологии. - 1979. - №5. - С.414-417.
Продукция МДА в суспензии клеток индуцировалась внесением в 0,5 мл суспензии в условиях перемешивания раствора 10-20 мкл тромбина (концентрация тромбина 4 мг/мл). Пробу инкубировали с тромбином 5 мин. Затем добавляли 0,5 мл 50% трихлоруксусной кислоты на 1 N HCl и 0,5 мл 0,9% тиобарбитуровой кислоты. Сразу после смешивания реактивов проба помещалась на кипящую водяную баню на 15-30 мин. После этого ее охлаждали при комнатной температуре и центрифугировали при 3000 об/мин.
Супернатант фотометрировали при λ=532 нм. Контролем служила проба, которую вносили 0,5 мл физиологического раствора. Для оценки исходного уровня МДА определяли экстинкцию пробы без добавления тромбина. Расчет велся по формуле:
ε - экстинкция пробы;
1,5·105 - коэффициент молярной экстинкции;
3 - коэффициент учитываемого разведения;
109 - коэффициент перехода в нМ.
Концентрация МДА в пересчете на 109 тромбоцитов определялась следующим образом:
| С (нМ·109 тромбоцитов)=ε·2·102/N |
N - число тромбоцитов в мкл, деленное на 100000.
Оценка полученных результатов.
Для характеристики антиоксидантного состояния тромбоцитов применяется расчетно определяемый фактор, величина которого комплексно оценивает активность важных антиоксидантных энзимов и уровень сдерживаемого ими перекисного окисления липидов кровяных пластинок (С.Чевари, Т.Андял, Я.Штрегер. Определение антиоксидантных параметров крови и их диагностическое значение в пожилом возрасте. // Лабор. дело. 1991. - №10. - С.9-13). Этот фактор антиоксидантного состояния (Ф) выражается формулой:
По полученным значениям ФАСТ у каждого конкретного больного возможно прогнозировать развитие тромбоцитарных нарушений, регистрируя по состоянию ФАСТ риск их возникновения как обязательное следствие повреждающего влияния на тромбоциты возрастающего в них количества продуктов перекисного окисления липидов тромбоцитов при ослаблении активности каталазы и СОД.
Раннее выявление риска формирования тромбоцитарных нарушений у людей и новорожденных телят осуществляется по величине фактора антиоксидантного состояния тромбоцитов, который в норме у здоровых людей составляет 52,5×106-14,1×106 МЕ2/нмоль × 109 тр., у здоровых новорожденных телят 82,8×106-16,1×106 МЕ2/нмоль × 109 тр.
При нахождении фактора антиоксидантного состояния тромбоцитов у людей в границах 14,0×106-4,9×106 МЕ2/нмоль × 109 тр. можно регистрировать риск развития у них тромбоцитарных нарушений, начинающих проявляться при значении фактора антиоксидантного состояния тромбоцитов 4,8×106 МЕ2/нмоль × 109 тр. и ниже.
У новорожденных телят при нахождении фактора антиоксидантного состояния тромбоцитов в границах 16,0×106-6,5×106 МЕ2/нмоль × 109 тр. можно регистрировать риск развития у них тромбоцитарных нарушений, начинающих проявляться при значении фактора антиоксидантного состояния тромбоцитов 6,4×106 МЕ2/нмоль × 109 тр. и ниже.
При проведении профилактических мероприятий возможно повторное обследование с определением ФАСТ с целью контроля адекватности проводимых мер.
| Таблица 3 | |||||
| Антиоксидантные параметры крови у обследованных людей и телят | |||||
| Категория обследованных | Число наблюдений | Каталаза МЕ/109 тр. | СОД МЕ/109 тр. | МДА нмоль/109 тр. | ФАСТ МЕ2/нмоль × 109 тр. |
| Здоровые люди | 21 | 10500,0-8900,0 | 2000,0-1350,0 | 0,40-0,85 | 52,5×106-14,1×106 |
| Люди с артериальной гипертонией и метаболическим синдромом с риском развития тромбоцитарных нарушений | 32 | 5200,0-8901,0 | 1150,0-1349,0 | 0,86-1,20 | 14,0×106-4,9× 106 |
| Люди с артериальной гипертонией и метаболическим синдромом с тромбоцитарными нарушениями | 135 | 3700,0-5199,0 | 820,0-1149,0 | 1,21-1,60 | 4,8×106 и ниже |
| Здоровые новорожденные телята | 40 | 11600,0-9050,0 | 2500,0-1750,0 | 0,35-0,98 | 82,8×106-16,1×106 |
| Новорожденные телята с диспепсией и риском тромбоцитарных нарушений | 52 | 9049,0-6500,0 | 1749,0-1500,0 | 0,99-1,49 | 16,0×106-6,5× 106 |
| Новорожденные телята с диспепсией и тромбоцитарными нарушениями | 49 | 6499,0-4800,0 | 1499,0-1200,0 | 1,50-2,20 | 6,4×106 и ниже |
Таким образом, с применением нескольких технически простых и не требующих дорогостоящих реактивов, оборудования, затрат сил и времени методов возможно раннее выявление риска формирования тромбоцитарных нарушений у людей и новорожденных телят, способного привести без применения мер профилактики к тромбофиллической тромбоцитопатии с возникновением тромбозов различных сосудов.
Внедрение данного способа раннего выявления риска формирования тромбоцитарных нарушений у людей и животных в лечебных и ветеринарных учреждениях позволит проводить своевременную и эффективную профилактику тромбоцитопатии у людей и новорожденных телят в каждом конкретном случае, сократив сроки временной нетрудоспособности, обеспечив профилактику инсультов и инфарктов, уменьшив число выходов на инвалидность и снизив смертность у людей и ускорив рост и развитие, оздоровить молодняк крупного рогатого скота.
Пример 1. Больная М., 42 года, страдающая артериальной гипертонией с метаболическим синдромом на протяжении 3 лет обследована во время профилактического осмотра. У больной была взята и исследована кровь с оценкой внутрисосудистой активности тромбоцитов (ВАТ), агрегационной активности тромбоцитов с рядом индукторов и с определением адгезивно-агрегационной способности тромбоцитов, активности каталазы, СОД и содержания МДА в тромбоцитах с вычислением ФАСТ.
У больной не было выявлено нарушений в тромбоцитарном гемостазе: адгезивно-агрегационная активность (36,0%), агрегация тромбоцитов с рядом индукторов находились в пределах нормы (АДФ 42,0 с., коллаген 34,2 с., тромбин 56,8 с., Н2О2 49,5 с., адреналин 96,6 с., АДФ + адреналин 37,2 с., АДФ + коллаген 28,6 с., адреналин + коллаген 29,2 с.), нормальная ВАТ (дискоциты 82%, диско-эхиноциты 11%, сфероциты 3%, сферо-эхиноциты 2%, биополярные формы 2%) при снижении активности каталазы 6100,0 МЕ/109 тр., СОД 1200,0 МЕ/109 тр., повышение содержания МДА в тромбоцитах (1,02 нмоль/109 тр.). ФАСТ составил 7,18×106 МЕ2/нмоль × 109 тр., что указывало на риск развития тромбоцитарных нарушений. Назначенные больной диета, богатая антиоксидантами и витаминами, и токоферола ацетат по 1 капсуле 3 раза в день способствовали в течение 2 нед. полной коррекции активности каталазы (10000,0 МЕ/109 тр.), СОД (1650,0 МЕ/109 тр.) и нормализации содержания МДА в тромбоцитах (0,5 нмоль/109 тр.), уровня ФАСТ (33,0×106 ME2 /нмоль × 109 тр.), что предотвратило развитие тромбоцитопатии.
Больной было рекомендовано соблюдать данную диету и далее для поддержания достигнутого эффекта.
Пример 2. Больной Т., 58 лет, страдающий артериальной гипертонией с метаболическим синдромом на протяжении 12 лет. Обследован во время госпитализации. У больного была взята и исследована кровь с оценкой ВАТ, агрегационной активности тромбоцитов с рядом индукторов, определением адгезивно-агрегационной способности тромбоцитов, активности каталазы, СОД и содержания МДА в тромбоцитах с вычислением ФАСТ.
У больного была диагностирована тромбоцитопатия с повышением адгезивно-агрегационной активности тромбоцитов (45,3%), их агрегации под влиянием ряда индукторов (АДФ 35,1 с., коллаген 27,2 с., тромбин 45,1 с., H2O2 39,6 с., адреналин 78,3 с., АДФ + адреналин 26,5 с., АДФ + коллаген 24,2 с., адреналин + коллаген 20,0 с.) и усиления ВАТ (дискоциты 62%, диско-эхиноциты 25%, сфероциты 9%, сферо-эхиноциты 2%, биополярные формы 2%) с ослаблением активности каталазы 3800,0 МЕ/109 тр., СОД 900,0 МЕ/109 тр., повышением в тромбоцитах МДА 1,52 нмоль/109 тр. ФАСТ составил 2,25×106 МЕ2/нмоль × 109 тр.).
Больному назначен комплекс немедикаментозного лечения, состоящий из индивидуально подобранной гипокалорийной диеты (1854,2 ккал), рациональных дозированных физических нагрузок. Это позволило нормализовать у него исследуемые параметры тромбоцитарного гемостаза - каталазы 9100,0 МЕ/109 тр., СОД 1400,0 МЕ/109 тр., МДА тромбоцитов (0,8 нмоль/109 тр.) через 4 мес. лечения, устранив тромбоцитопатию и обеспечив нормализацию ФАСТ (15,9×106 МЕ2/нмоль × 109 тр.). Дальнейшее соблюдение пациенотом данных ему рекомендаций исключило рецидивирование тромбофиллической тромбоцитопатии под контролем состояния ФАСТ.
Пример 3. Новорожденный теленок №25, 5 сутки жизни, с диспепсией 1 день обследован в условиях телятника. У теленка была взята и исследована кровь с оценкой адгезивно-агрегационной способности тромбоцитов (35%), агрегационной активности тромбоцитов с рядом индукторов (АДФ 40,0 с., коллаген 35,0 с., тромбин 56,0 с., Н2О2 48,2 с., адреналин 102,6 с., АДФ + адреналин 38,8 с., АДФ + коллаген 30,2 с., адреналин+коллаген 32,1 с.) и нормальной ВАТ (дискоциты 80%, диско-эхиноциты 10%, сфероциты 4%, сферо-эхиноциты 4%, биополярные формы 2%). Оценена активность каталазы 7500,0 МЕ/109 тр., СОД 1500,0 МЕ/109 тр., МДА тромбоцитов 10,6 нмоль/109 тр. ФАСТ составил 1,06×106 МЕ2/нмоль × 109 тр.), что указывало на риск развития тромбоцитарных нарушений. Теленку назначен Биопаг-Д 0,01% 100,0 внутрь 2 раза в сутки, что позволило через 1,5 суток полностью купировать диспепсию, нормализовать ФАСТ 32,4×106 ME2/нмоль × 109 тр. (каталаза 10500,0 МЕ/109 тр., СОД 1850,0 МЕ/109 тр., МДА тромбоцитов 0,6 нмоль/109 тр.), исключив риск развития тромбоцитарных нарушений.
В дальнейшем выпаивать данного теленка было рекомендовано с добавлением Биопага-Д 0,01% по 50,0 в сутки в течение недели для профилактики рецидива диспепсии и риска возникновения тромбоцитарных нарушений.
Пример 4. Новорожденный теленок №48, 9 суток, с диспепсией 3 суток обследован в условиях телятника. У больного теленка была взята и исследована кровь с оценкой адгезивно-агрегационной способности тромбоцитов (25%), агрегационной активности тромбоцитов с рядом индукторов (АДФ 35,0 с., коллаген 27,3 с., тромбин 42,4 с., Н2О2 32,0 с., адреналин 75,6 с., АДФ + адреналин 30,0 с., АДФ + коллаген 18,0 с., адреналин + коллаген 26,3 с.) и усиления ВАТ (дискоциты 62%, диско-эхиноциты 18%, сфероциты 12%, сферо-эхиноциты 6%, биополярные формы 2%), что позволило у него диагностировать тромбоцитопатию с наклонностью к гиперагрегации. В тромбоцитах зарегистрирована следующая активность каталазы 6600,0 МЕ/109 тр., СОД 1300,0 МЕ/109 тр., содержание МДА 1,8 нмоль/109 тр. Рассчитано ФАСТ 4,7×106 МЕ2/нмоль × 109 тр.
Теленку назначен Биопаг-Д 0,01% по 200,0 3 раза в день. Это позволило купировать у него диспепсию в течение 1 суток, нормализовать исследованные параметры тромбоцитарного гемостаза на 2-й день лечения, нормализовав ФАСТ - 27,6×106 МЕ2/нмоль × 109 тр. (каталаза 9600,0 МЕ/109 тр., СОД 2300,0 МЕ/109 тр., МДА тромбоцитов 0,8 нмоль/109 тр.), что исключило риск развития тромбоцитопатии.
Дальнейшее выпаивание теленка Биопагом-Д 0,01% по 100,0 2 раза в день в течение 1 недели закрепило полученный эффект, исключая рецедивирование тромбоцитопатии.
Способ раннего выявления риска формирования тромбоцитарных нарушений, включающий взятие крови, ее стабилизацию, выделение из крови тромбоцитов, оценку активности в них каталазы и супероксиддисмутазы и содержания малонового диальдегида, отличающийся тем, что диагностику осуществляют у новорожденных телят по величине фактора антиоксидантного состояния тромбоцитов, который в норме у здоровых новорожденных телят составляет 82,8·106-16,1·106 МЕ2/нмоль·109 тр., при этом риск развития тромбоцитарных нарушений регистрируют при значении ФАСТ 16,0·106-6,5·106 ME2 /нмоль·109 тр., а собственно тромбоцитарные нарушения диагностируют при значении ФАСТ 6,5·106 МЕ2/нмоль·109 тр. и ниже.
