Способ получения гепатопротективного средства, обладающего антиоксидантной активностью

Изобретение относится к фармацевтической промышленности. В качестве растительного сырья используют надземную часть репешка волосистого (Agrimonia pilosa L.), которую экстрагируют 70% этиловым спиртом в батарее из 5 перколяторов с интервалом слива 24 часа при соотношении сырье - этанол 1:1. Изобретение позволяет реализовать указанное назначение. 4 табл.

 

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и касается способов получения лекарственного средства из растительного сырья.

Известен способ получения аналогичных лекарственных средств (карсил, силибор), обладающих гепатопротективным действием, заключающийся в экстракции плодов расторопши пятнистой 80% этиловым спиртом методом реперколяции с последующим упариванием, обработкой 50% этанолом, обезжириванием четыреххлористым углеродом и обработкой спиртоводного раствора хлороформно-спиртовой смесью с последующим высушиванием [1].

Недостатком известного способа является использование при экстракции 80% этилового спирта при повышенной температуре, применение токсичных растворителей, дефицит природного сырья в Российской Федерации, малая биомасса плодов и использование интродуцируемого сырья [2].

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения водорастворимых экстрактов путем экстракции целого или измельченного до состояния порошка растения рода Agrimonia с водой и нагревания смеси при 20-30°С в течение 7 дней и более или до 55°С и выше с последующим удалением полученных экстрактов нерастворимых в воде компонентов [3].

Недостатком этого метода является длительное воздействие нагревания и использование в качестве экстрагента воды, что приводит к уменьшению выхода целевого продукта и снижению гепатопротективной активности.

Новая техническая задача - расширение арсеналов способов получения лекарственного средства из растительного сырья, обладающего выраженной гепатопротективной активностью.

Для решения поставленной задачи в способе получения гепатопротективного средства, обладающего антиоксидантной активностью путем экстракции растительного сырья надземной части репешка волосистого (Agrimonia pilosa L.), сырье экстрагируют 70% этанолом в батарее из 5 перколяторов с интервалам слива 24 часа при соотношении сырье - этанол 1:1.

Сущность изобретения заключается в следующем. Измельченные воздушно-сухие листья и стебли репешка волосистого, собранные в фазе цветения, просеивают через сито с диаметром отверстий 5-7 мм, заливают 70% этанолом и экстрагируют методом реперколяции в батарее из 5 перколяторов при соотношении сырье - экстрагент (1:1).

Полученное извлечение отстаивают и удаляют растворитель под вакуумом. Сгущенный экстракт досушивают под термовентилятором. Сухой экстракт представляет собой бурый гигроскопичный порошок. Выход целевого продукта по загруженному сырью составляет 19,3%.

Фармакологические испытания.

Для проведения фармакологических испытаний из жидких экстрактов экстрагент удаляли под вакуумом.

Эксперименты проведены на белых крысах-самцах массой 280-340 г (в каждой опытной группе 12 крыс). Животные находились в стандартных условиях вивария при естественном световом режиме и свободном доступе к воде и пище. Все манипуляции (взвешивание, введение препаратов и тетрахлорметана и забой крыс) осуществляли с 9 до 12 ч.

Для изучения динамики фармакологических и биохимических показателей у крыс вызывали токсическое поражение печени с помощью тетрахлорметана, который вводили в течение 6 дней в дозе 1 мл/кг массы в виде 20% раствора на рафинированном, дезодорированном подсолнечном масле. Терапию проводили сухими экстрактами, полученными реперколяцией 40 и 70% этанолом измельченной надземной части репешка волосистого, в дозе 140 мг/кг массы животного.

В качестве препарата сравнения использовали наиболее часто применяемый в гепатологии препарат карсил в дозе 1,2 г/кг или 100 мг действующего вещества силимарика. Препараты вводили внутрижелудочно с помощью зонда в виде суспензий на 1% крахмальной слизи.

Исследования проводили через сутки после последнего введения препаратов.

Определяли выживаемость животных, динамику массы тела в течение срока наблюдения, удельную массу печени (отношение массы печени в г к массе тела в г), длительность сна, наступающего после внутрибрюшинной инъекции гексенала (80 мг/кг). До 80% этого вещества метаболизируется в печени, что позволяет судить об ее антитоксической функции (таблица 2 Приложения) [4].

Для оценки гепатотоксичности тетрахлорметана и гепатозащитного действия препаратов изучали активность ферментов в сыворотке крови - аланинаминотрансферазы (АЛАТ) и аспартатаминотрансферазы (АСАТ), а также уровень общего билирубина (таблица 2 Приложения) [4].

Биохимические испытания.

Известно, что одним из звеньев сложной системы защитных реакций организма против воздействия чужеродных соединений является антиоксидантная система, включающая механизмы обезвреживания свободных радикалов и перекисных соединений.

О состоянии процессов перекисного окисления липидов в печени судили по содержанию одного из первичных продуктов - диеновых конъюгатов (ДК), а также по накоплению уровня спонтанного малонового диальдегида (МДА) и индуцированного ионами железа. Была также проведена оценка общей антиокислительной активности.

Содержание диеновых конъюгатов определяли спектрофотометрически при длине волны 232 нм и выражали в условных единицах D232/г ткани. Содержание малонового диальдегида определяли также спектрофотометрически в красной области спектра при длине волны 532 нм. Расчет проводили в ммоль/г ткани с учетом коэффициента молярной экстинкции k=1,56·10^-5 М^-1см^-1.

Общую антиокислительную активность (АОА) изучали по величине торможения переокисления суспензии липопротеинов куриного желтка. Измеряли оптическую плотность контрольной и опытных проб против соответствующего контроля при λ=532 нм. Общую АОА рассчитывали в процентах (таблица 3 Приложения) [5].

Результаты исследований показали, что при развитии токсического поражения печени у крыс отмечается интенсификация процессов перекисного окисления липидов за счет увеличения содержания диеновых конъюгатов и уровня малонового диальдегида в ткани печени, обусловленное снижением общей антиокислительной активности почти в 2 раза. При введении экстрактов из надземной части репешка волосистого, в особенности 70% экстракта, аналогично введению препарата карсил, выявлена нормализация общей антиокислительной активности в ткани печени, что, в свою очередь, способствует снижению уровня диеновых конъюгатов и радонового диальдегида.

Испытания на острую токсичность.

Определяли на белых беспородных мышах по методу Buchty (Buchty Е., 1963). Каждую дозу испытывали на пяти мышах. 70% экстракт вводили внутрижелудочно в виде суспензии на 1% крахмальной слизи в дозе 5 и 10 г/кг массы животных. В течение первых двух часов после введения исследуемого препарата отмечали двигательную реакцию животных, нервно-мышечную возбудимость, болевой и роговичный рефлекс, вегетативные реакции. Регистрировали гибель животных и определяли LD₅₀ (таблица 4 Приложения) [6].

Острую токсичность (LD₅₀) экстрактов репешка волосистого определяли по методу Литчфилда и Уилкоксона в модификации Фота. Широту терапевтического действия оценивали на мышах по отношению LD₅₀/ЭД по МЭШ.

Экстракт не токсичен и обладает большой широтой терапевтического действия: LD₅₀ составляет 5,99 г/кг.

Обработку результатов фармакологических и биохимических исследований проводили с помощью пакета программ Statistica 5.0 по t-критерию Стьюдента.

Примеры конкретного выполнения способа.

Сырье собрано в фазу цветения в Красноярском крае в 30 км зоне от г. Железногорска и использовано во всех примерах.

Пример 1.

В каждый перколятор загружают 120 г воздушно-сухих измельченных листьев и стеблей репешка волосистого. Первую порцию замачивают равным объемом 70% этилового спирта (120 мл), набухшее сырье загружают в головной перколятор, заливают двойным объемом экстрагента до "зеркала" и оставляют на сутки. На следующий день собирают два отпуска: один для намачивания второй порции сырья в объеме, равном его массе, другой - в двойном количестве (для настаивания сырья в перколяторе №2). Одновременно в перколятор №1 подают чистый экстрагент в количестве, равном объемам взятых отпусков. На третий день из перколятора №2 собирают два отпуска для работы с третьей порцией сырья, предназначенной для загрузки в перколятор №3.

В перколятор №2 подают отпуски из перколятора №1, а в него снова подают чистый экстрагент. На 4-й день из перколятора №3 собирают два отпуска для работы с четвертой порцией сырья, предназначенной для загрузки в перколятор №4, в перколятор №3 подают отпуски из перколятора №2, в перколятор №2 подают отпуски из перколятора №1, а в него снова подают чистый экстрагент. На пятый день из перколятора №4 собирают два отпуска для работы с пятой порцией сырья, предназначенной для загрузки в перколятор №5, в перколятор №4 подают отпуски из перколятора №3, в перколятор №3 подают отпуски из перколятора №2, в перколятор №2 подают отпуски из перколятора №1, а в него снова подают чистый экстрагент.

Одновременно из перколятора №4 собирают весь отпуск и подают его в перколятор №5, из перколятора №3 собирают весь отпуск и подают его в перколятор №4, из перколятора №2 собирают весь отпуск и подают его в перколятор №3, из перколятора №1 собирают весь отпуск и подают в перколятор №2, сырье в перколяторе №1 отжимают и заливают в перколятор №2, а перколятор №1 заливают водой для рекуперации этанола.

Аналогичные последовательные циклы осуществляют ежесуточно, одновременно продолжая собирать готовый продукт из перколятора №5 [7].

Объем полученного извлечения равен количеству загруженного сырья. Полученное извлечение упаривают под вакуумом. Сгущенный экстракт досушивают под термовентилятором. Выход целевого продукта 19,3%.

По результатам биохимических исследований содержание диеновых конъюгатов в гомогенате печени исследуемых животных при применении 70% сухого экстракта на фоне токсического поражения тетрахлорметаном составило 8,0 у.е./г, спонтанного малонового диальдегида - 3,29 ммоль/г, индуцированного малонового диальдегида - 8,04 ммоль/г, АЛАТ сыворотки - 1,3 ммоль/л·ч, АСАТ сыворотки - 1,5 ммоль/л·ч, билирубин - 2,7 мг%. Общая антиокислительная активность составила 64% (таблицы 2 и 3 Приложения).

Фармакологические испытания показали, что масса тела животных при применении 70% сухого экстракта репешка на фоне токсического поражения печени тетрахлорметаном изменилась на 35,0 г, удельная масса печени составила 12,45%, а длительность гексобарбиталового сна - 13,67 мин (таблица 2 Приложения).

Пример 2.

В каждый перколятор загружают 120 г воздушно-сухих измельченных листьев и стеблей репешка волосистого. Первую порцию накачивают равным объемом 40% этилового спирта (120 мл), набухшее сырье загружают в головной перколятор, заливают двойным объемом экстрагента "до зеркала" и оставляют на сутки. На следующий день собирают два отпуска: один для намачивания второй порции сырья в объеме, равном его массе, другой - в двойном количестве (для настаивания сырья в перколяторе №2). В это время в перколятор №1 подают чистый экстрагент в количестве, равном объемам взятых отпусков. На третий день из перколятора №2 собирают два отпуска для работы с третьей порцией сырья, предназначенной для загрузки в перколятор №3.

В перколятор №2 подают отпуски из перколятора №1, а в него снова подают чистый экстрагент. На 4-й день из перколятора №3 собирают два отпуска для работы с четвертой порцией сырья, предназначенной для загрузки в перколятор №4, в перколятор №3 подают отпуски из перколятора №2, в перколятор №2 подают отпуски из перколятора №1, а в него снова подают чистый экстрагент. На пятый день из перколятора №4 собирают два отпуска для работы с пятой порцией сырья, предназначенной для загрузки в перколятор №5, в перколятор №4 подают отпуски из перколятора №3, в перколятор №3 подают отпуски из перколятора №2, в перколятор №2 подают отпуски из перколятора №1, а в него снова подают чистый экстрагент. Через сутки после загрузки последнего перколятора №5 начинается рабочий период с получением первой порции готового продукта в объеме, равном массе загруженного сырья.

Одновременно из перколятора №4 собирают весь отпуск и подают его в перколятор №5, из перколятора №3 собирают весь отпуск и подают его в перколятор №4, из перколятора №2 собирают весь отпуск и подают его и перколятор №3, из перколятора №1 собирают весь отпуск и подают в перколятор №2, сырье в перколяторе №1 отжимают и заливают в перколятор №2, а перколятор №1 заливают водой для рекуперации этанола.

Аналогичные последовательные циклы осуществляют ежесуточно, одновременно продолжая собирать готовый продукт из перколятора №5 [5].

Объем полученного извлечения равен общему количеству сырья в перколяторах. Полученное извлечение упаривают под вакуумом. Сгущенный экстракт досушивают под термовентилятором. Выход целевого продукта 18,2%.

По результатам биохимических исследований содержание диеновых конъюгатов в гомогенате печени исследуемых животных при применении 40% сухого экстракта на фоне токсического поражения тетрахлорметана составило 7,38 у.e./г, спонтанного малонового дикальдегида - 4,49 ммоль/г, индуцированного малонового диальдегида - 12,63 ммоль/г, АЛАТ сыворотки - 1,6 ммоль/л·ч, АСАТ сыворотки - 1,8 ммоль/л·ч, билирубин - 3,8 мг%. Общая антиокислительная активность составила 82% (таблицы 2 и 3 Приложения).

Фармакологические испытания показали, что масса тела животных при применении 40% сухого экстракта репешка на фоне токсического поражения печени четыреххлористым углеродом изменилась на 20,0 г, удельная масса печени составила 13,08%, а длительность гексобарбиталового сна - 19,33 мин (таблица 2 Приложения).

Пример 3.

В каждый перколятор загружают 120 г воздушно-сухих измельченных листьев и стеблей репешка волосистого. Первую порцию замачивают равным объемом 20% этилового спирта (120 мл), набухшее сырье загружают в головной перколятор, заливают двойным объемом экстрагента до "зеркала" и оставляют на сутки. На следующий день собирают два отпуска: один для намачивания второй порции сырья в объеме, равном его массе, другой - в двойном количестве (для настаивания сырья в перколяторе №2). Одновременно в перколятор №1 подают чистый экстрагент в количестве, равном объемам взятых отпусков. На третий день из перколятора №2 собирают два отпуска для работы с третьей порцией сырья, предназначенной для загрузки в перколятор №3.

В перколятор №2 подают отпуски из перколятора №1, а в него снова подают чистый экстрагент. На 4-й день из перколятора №3 собирают два отпуска для работы с четвертой порцией сырья, предназначенной для загрузки в перколятор №4, в перколятор №3 подают отпуски из перколятора №2, в перколятор №2 подают отпуски из перколятора №1, a в него снова подают чистый экстрагент. На пятый день из перколятора №4 собирают два отпуска для работы с пятой порцией сырья, предназначенной для загрузки в перколятор №5, в перколятор №4 подают отпуски из перколятора №3, в перколятор №3 подают отпуски из перколятора №2, в перколятор №2 подают отпуски из перколятора №1, а в него снова подают чистый экстрагент. Через сутки после загрузки последнего перколятора начинается рабочий период с получением первой порции готового продукта в объеме, равном массе загруженного сырья.

Одновременно из перколятора №4 собирают весь отпуск и подают его в перколятор №5, из перколятора №3 собирают весь отпуск и подают его в перколятор №4, из перколятора №2 собирают весь отпуск и подают его в перколятор №3, из перколятора №1 собирают весь отпуск и подают в перколятор №2, сырье в перколяторе №1 отжимают и заливают в перколятор №2, а перколятор №1 заливают водой для рекуперации этанола.

Аналогичные последовательные циклы осуществляют ежесуточно, одновременно продолжая собирать готовый продукт из перколятора №5 [5].

Объем полученного извлечения равен количеству загруженного сырья. Полученное извлечение упаривают под вакуумом. Сгущенный экстракт досушивают под термовентилятором. Выход целевого продукта 14.8%.

Пример 4.

В каждый перколятор загружают 120 г воздушно-сухих измельченных листьев и стеблей репешка волосистого. Первую порцию замачивают равным объемом 95% этилового спирта (120 мл), набухшее сырье загружают в головной перколятор, заливают двойным объемом экстрагента до "зеркала" и оставляют на сутки. На следующий день собирают два отпуска: один для намачивания второй порции сырья в объеме, равном его массе, другой - в двойном количестве (для настаивания сырья в перколяторе №2). Одновременно в перколятор №1 подают чистый экстрагент в количестве, равном объемам взятых отпусков. На третий день из перколятора №2 собирают два отпуск для работы с третьей порцией сырья, предназначенной для загрузки в перколятор №3.

В перколятор №2 подают отпуски из перколятора №1, а в него снова подают чистый экстрагент. На 4-день из перколятора №3 собирают два отпуска для работы с четвертой порцией сырья, предназначенной для загрузки в перколятор №4, в перколятор №3 подают отпуски из перколятора №2, в перколятор №2 подают отпуски из перколятора №1, а в него снова подают чистый экстрагент. На пятый день из перколятора №4 собирают два отпуска для работы с пятой порцией сырья, предназначенной для загрузки в перколятор №5, в перколятор №4 подают отпуски из перколятора №3, в перколятор №3 подают отпуски из перколятора №2, в перколятор №2 подают отпуски из перколятора №1, а в него снова подают чистый экстрагент. Через сутки после загрузки последнего перколятора начинается рабочий период с получением первой порции готового продукта в объеме, равном массе загруженного сырья.

Одновременно из перколятора №4 собирают весь отпуск и подают его в перколятор №5, из перколятора №3 собирают весь отпуск и подают его в перколятор №4, из перколятора №2 собирают весь отпуск и подают его в перколятор №3, из перколятора №1 собирают весь отпуск и подают в перколятор №2, сырье в перколяторе №1 отжимают и заливают в перколятор №2, а перколятор №1 заливают водой для рекуперации этанола.

Аналогичные последовательные циклы осуществляют ежесуточно, одновременно продолжая собирать готовый продукт из перколятора №5 [5].

Объем полученного извлечения равен количеству загруженного сырья. Полученное извлечение упаривают под вакуумом. Сгущенный экстракт досушивают под термовентилятором. Выход целевого продукта 16,8%.

Обоснование режимов

В процессе поиска оптимальных условий получения экстракта из репешка волосистого было изучено влияние следующих факторов: использование различных растворителей, соотношение сырье - экстрагент, температура и время экстракции на выход целевого продукта и гепатопротекторную и антиоксидантную активность.

При этом установлено, что экстракцию следует вести методом реперколяции в батарее из пяти перколяторов, без нагревания, так как при применении экстракции при нагревании занижен выход действующих веществ.

Найдено, что 40 и 70% этиловый спирт обладают практически равной экстрагирующей способностью, однако, учитывая несколько меньшую фармакологическую активность и более низкий выход продукта при 40% этиловом спирте, предпочтительно использование для экстракции 70% этилового спирта.

Экстракты, полученные из надземной части репешка волосистого на 40% и 70% этиловом спирте, обладают гепатопротекторными и антиокислительными свойствами и способствуют нормализации свободнорадикального окисления липидов. Указанные эффекты получены за счет увеличения общей антиокислительной активности, обусловленной снижением уровня продуктов перекисного окисления липидов у крыс с токсическим поражением печени тетрахлорметаном, причем 70% экстракт показал наибольшую активность.

Приложение

Таблица 1
Влияние концентрации этанола на выход целевого продукта
№ п/п	Экстрагент	Кратность экстракции	Внешний вид	Выход целевого продукта, %
1	40% этанол	3	Бурый порошок со специфическим запахом и слабогорьким вкусом, очень гигроскопичен	18,2±0,2
2	70% этанол	3	Темно-бурый порошок со специфическим запахом и слабогорьким вкусом, очень гигроскопичен	19,3±0,3
3	20% этанол	3	Бурый порошок со специфическим запахом и слабогорьким вкусом, очень гигроскопичен	14,8±0,2
4	95% этанол	3	Темно-бурый, почти черный порошок со специфическим запахом и слабогорьким вкусом, очень гигроскопичен	16,8±0,15

Таблица 2
Гепатопротективная активность 40% и 70% этанольных экстрактов из надземной части репешка волосистого и препарата карсил при токсическом поражении печени крыс тетрахлорметаном (М±m).
	Исследуемые группы (n=12)
Изучаемые показатели	Интактные	CCl4 - гепатит	CCl4 - гепатит + 40% экстракт	CCl4 - гепатит + 70% экстракт	CCl4 - гепатит + карсил
Изменение массы тела, г	32,67±5,7	32,69±8,8	20,0±0,0	35,0±5,8	26,6±5,7
Удельная масса печени, %	12,06±0,59	14,90±0,72*	13,08±0,41	12,45±0,55*/**	14,49±0,54*
Длительность гексеналового сна, мин	15,5±1,28	19,0±1,8	19,33±1,33	13,67±3,32	15,8±1,85
Активность АЛАТ сыворотки, ммоль/л·ч	1,1±0,04	1,9±0,21*	1,6±0,09*	1,3±0,07/**	1,4±0,11/**
Активность АСАТ сыворотки, ммоль/л·ч	1,2±0,04	2,5±0,23*	1,8±0,05*	1,5±0,06/**	1,2±0,07/**
Билирубин сыворотки, мг %	1,5±0,24	4,6±0,51*	3,8±0,42*/**	2,7±0,32*/**	2,9±0,25*/**
Примечание: * - р <0,05 достоверные различия по отношению к соответствующему контролю;
** - р <0,05 достоверные различия по отношению к интактной группе;
n - количество животных в группе.

Таблица 3
Действие экстрактов репешка на 40% и 70% этаноле и карсила на показатели перекисного окисления липидов в печени крыс при токсическом поражении печени тетрахлорметаном (М±m).
	Исследуемые группы (n=6)
Изучаемые показатели	Интактные	CCl4 - гепатит	CCl4 - гепатит + 40% экстракт	CCl4 - гепатит + 70% экстракт	CCl4 - гепатит + карсил
Диеновые конъюгаты (у.е./г)	10,2±0,62	17,2±1,06*	7,88±0,21*	8,0±0,52*	9,56±0,89*
МДА спонтанный (мМ/г)	2,64±1,06	4,47±0,43*	4,49±0,67/**	3,29±0,66/**	3,78±0,37/**
МДА индуцированный (мМ/г)	9,29±1,35	13,11±1,05	12,63±1,12	8,04±1,35	8,33±0,97
АОА (в %)	0,60±0,04	0,32±0,02*	0,82±0,04*/**	0,64±0,061*	0,64±0,08*
Примечание: * - р <0,05 достоверные различия по отношению к соответствующему контролю;
** - р <0,05 достоверные различия по отношению к интактной группе;
n - количество животных в группе.

Таблица 4
Регистрация токсических эффектов сухого 70% экстракта репешка волосистого в дозах 5 г/кг и 10 г/кг
№ животного	1	2	3	4	5
Вес, г	47	41	48	44,5	45	32	46	41	43	40,5
Двигательная активность	N				N				N
Возбудимость	N				N				N
Судороги	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Судорожные подергивания	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Мышечный тонус			-	-			-	N
Рефлексы: болевой	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
роговичный	+	+	-	+	+	+	-	+	-	+
Сон	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Сонливость	-	+	+	+	-	+	+	+	-	+
Саливация	-	+	+	+	-	+	+	+	-	+
Диурез	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Птоз	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Гибель	-	+	-	+	-	+	+	+	-	+
Примечание: N - норма, ↓ - снижение функции относительно нормы, «-« - отсутствие эффекта, «+» - наличие эффекта.

Источники информации, принятые во внимание.

1. Беленький М.Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. / М.Л.Беленький. - Л.: Наука, 1963. - 149 с.

2. Владимиров Ю.А. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. / Ю.А.Владимиров, А.И.Арчаков. - М.: Наука, 1972. - 239 с.

3. Камышников B.C. Клинические методы диагностики в биохимии. / B.C.Камышников. - М.: Наука, 2002. - 568 с.

4. Муравьева Д.А. Фармакогнозия. / Д.А.Яковлева, И.А.Самылина, Г.П.Яковлев. - М.: Медицина, 2002. - 654 с.

5. Технология лекарственных форм: В 2-х т. / Под ред. Кондратьевой Т.С. [и др.] - М.: Наука, 1991. - Т.1. - 496 с.; Т.2. - 534 с.

6. Промышленная технология лекарств: Учебник в 2-х т. Том 2 / В.И.Чуенков, М.Ю.Чернов, Л.М.Хохлова и др.; Под ред. профессора В.И.Чуенкова. - Харьков: Изд-во МТК-Книга; НФАУ, 2002. - С.158-159.

Способ получения гепатопротективного средства, обладающего антиоксидантной активностью путем экстракции растительного сырья надземной части репешка волокнистого (Agrimonia pilosa L.), отличающийся тем, что сырье экстрагируют 70% этанолом в батарее из 5 перколяторов с интервалом слива 24 ч при соотношении сырье - этанол 1:1.