Рекомбинантный штамм bacillus anthracis сти тпа-1 (pub110pa-1)-продуцент протективного антигена сибиреязвенного микроба

Изобретение относится к биотехнологии. Предложенный рекомбинантный штамм В. anthracis СТИΔТПА-1 (pUB110РА-1) продуцирует протективный антиген сибиреязвенного микроба. Штамм получен путем трансформации штамма В. anthracis СТИΔТ ДНК гибридной плазмиды pUB110PA-1 и депонирован в ГК патогенных бактерий «Микроб» под номером КМ-96. Штамм характеризуется стабильностью гибридного репликона и высоким уровнем продукции протективного антигена - основного компонента химических сибиреязвенных вакцин, безопасен в использовании.

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологии, генетике, биохимии и производстве для получения протективного антигена Bacillus anthracis, являющегося основным компонентом химических сибиреязвенных вакцин и диагностических препаратов.

Известны штаммы-продуценты сибиреязвенных антигенов: в России - штамм B. anthracis СТИ-1, в США - B. anthracis V770-NP1-R, в Англии - B. anthracis Sterne 34F₂ [1]. Данные аттенуированные штаммы не содержат плазмиды капсулопродукции (рХO2), обуславливающей вирулентность штамма, но содержат плазмиду токсинообразования (рХO1), кодирующую синтез экзотоксина бинарного действия, состоящего из протективного антигена, отечного и летального факторов. Протективный антиген сибиреязвенного микроба обладает основным иммуногенным потенциалом и используется в производстве химических вакцин. Отечный и летальный факторы, взаимодействуя с протеолитически активированным протективным антигеном, образуют токсичные комплексы, запускающие патогенетические механизмы инфекционного процесса и обуславливающие специфическое повреждение тканей макроорганизма. Все компоненты сибиреязвенного токсина имеют очень близкие значения молекулярных масс (83-89 кДа), что является препятствием для их полного хроматографического разделения. Примеси отечного и летального факторов в препарате протективного антигена, выделенного из аттенуированных штаммов, отражаются на реактогенности изготовляемой на его основе химической вакцины. При использовании подобных средств для специфической профилактики людей нередко возникают побочные реакции в виде аллергии или даже некротических реакций на месте введения препарата.

С развитием генно-инженерных технологий стало возможным получение рекомбинантных штаммов, продуцирующих только протективный компонент сибиреязвенного токсина.

Известны штаммы Escherichia coli HB101, содержащие клонированный ген синтеза протективного антигена (pag) в составе гибридных плазмид pSE24 и pSE36 [2] и штаммы E.coli JM103, содержащие клонированный ген pag в составе рРА1, рРА2 и рРА4 [3]. Гибридные репликоны сконструированы посредством встраивания по сайтам рестрикции BamH1 участка плазмиды рХO1, содержащего ген pag, в векторы pBR322 или pUC19 (для рРА2 и рРА4). Однако данные рекомбинантные плазмиды отличались нестабильностью при функционировании в клетках Е.coli и обеспечивали крайне низкие уровни синтеза протективного антигена. Количество биологически активного белкового продукта, выделяемого из соответствующих штаммов, не превышало 5-10 нг/мл культуры или 1-2 мкг/мл - в случае использования рРА2. Для сравнения продукция протективного антигена аттенуированным штаммом B. anthracis Sterne 34F₂ составляет 15-20 мкг/мл.

Известен штамм E.coli, в котором структурный ген синтеза протективного антигена клонирован под транскрипционным регулированием промотора фага Т5 [4]. Такой подход позволил существенно повысить уровень синтеза протективного антигена, однако и в этом случае количество полученного из рекомбинантного штамма протективного антигена не превысило значения 2 мкг/мл.

Известен штамм E.coli DH5α с клонированным геном pag, синтезирующий протективный антиген [5]. Увеличения выхода очищенного препарата протективного антигена до 125 мкг/мл удалось достичь с помощью оптимизации процесса культивирования в ферментере. Однако E.coli не является оптимальной моделью для клонирования протективного антигена сибиреязвенного микроба, что связано с внутриклеточным механизмом секреции данного белка. Преимущество представителей рода Bacillus в качестве бактериальных хозяев клонированной ДНК заключается в их способности к секретируемому синтезу белкового антигена. Процедура выделения протективного антигена из среды культивирования микроорганизма значительно менее трудоемка.

Известны штаммы B. subtilis IS53, несущие гибридные плазмиды рРА101 и рРА102 с включенным в их состав геном pag и продуцирующие в среду культивирования протективный антиген в количестве 20,5-41,9 мкг/мл [6]. Авторы использовали BamH1 фрагмент ДНК рХO1, содержащий ген синтеза протективного антигена, из гибридной плазмиды pSE36, сконструированной М.Vodkin и S.Leppla, встроив его в мультикопийный бациллярный вектор pUB110. Рестрикционный анализ плазмид рРА101 (7,8 т.п.н.) и рРА102 (6,1 т.п.н.), выделенных из рекомбинантных культур, выявил наличие у них обширных делеций в области негативной регуляции pagR. Однако штаммы были получены на основе реципиента, обладающего высокой активностью протеолитических ферментов. Синтезируемый рекомбинантными штаммами протективный антиген сибиреязвенного микроба под действием бациллярных протеаз частично деградировал, что приводило к значительным потерям белкового продукта во время его выделения и очистки. Кроме того, гибридные плазмиды рРА101 и рРА102 в данной экспрессирующей системе были нестабильными.

Известен штамм B. subtilis WB600, содержащий дериват плазмиды рРА101-pPA101-1 [7, 8]. В репликоне pPA101-1, в отличие от исходного варианта, делегирован участок размером 1,7 т.п.н., в результате чего плазмида приобрела сходство с полученной В.Ivins и S.Welkos рРА102. Сравнение нуклеотидных последовательностей pPA101-1 и рРА102 выявило различие лишь в одном кодоне. В рецепиентном штамме B. subtilis WB600, дефектном по синтезу 6 протеаз, авторы индуцировали мутации в регуляторной системе B. subtilis - генах ccpA и abrB. Это привело к увеличению продукции протективного антигена в 3 и 8 раз, соответственно. Выход очищенного ПА из сконструированного рекомбинантного штамма составил 7 мкг/мл. В 2001 г. авторами получен патент на метод получения протективного антигена из штамма B. subtilis WB600 рРА101-1 [9]. Однако усовершенствование экспрессирующей системы в этом случае происходило за счет множественных мутаций в хромосомных генах. Это не всегда благоприятно сказывается на жизнеспособности и стабильности микроорганизма, предполагаемого к использованию в условиях масштабируемого производства.

Известны штаммы B. subtilis DB104, содержащие гибридные плазмиды рРА3 и рРА10 [3]. Авторы встроили BamH1 фрагменты плазмид рРА2 и рРА4, содержащие ген pag, в бирепликонный вектор pOLYA15. Гибридные репликоны при функционировании в клетках B. subtilis DB104 обеспечивали продукцию протективного антигена на уровне 20 мкг/мл. Однако максимальный выход протективного антигена достигался только на определенном, сравнительно кратковременном этапе стационарной фазы роста культуры, после чего наблюдалось быстрое разрушение белка накапливающимися протеазами.

Известны штаммы B. anthracis ΔSterne и B. anthracis ΔANR с гибридными плазмидами pJB1, pJB2 и pJB3, способными реплицироваться в грам+ и грам- бактериях [10]. Бирепликонные (pBLKSPPA + pUB110 или рС194) векторы содержали в своем составе последовательности, кодирующие протективный антиген сибиреязвенного микроба, однако его экспрессия в клетках B. anthracis была невысокой и, в зависимости от ориентации гена pag, варьировала в пределах от 2,7 до 21 мкг/мл.

Создание стабильных генетических конструкций с высокой продукцией протективного антигена сибиреязвенного микроба неизбежно сталкивается с преодолением трудностей, возникающих из-за ограничения экспрессии гена pag за счет слабого собственного промотора, наличия позитивного (atxA) и негативного (pagR) регуляторов в составе плазмиды pXO1.

Известны штаммы B. anthracis MASC-10 и B. subtilis WB600 с клонированным структурным геном pagA под сильным α-амилазным промотором [11]. Они сконструированы на основе реципиентов B. anthracis M770-NP1-R и B. subtilis WB600, обладающих низкой активностью протеолитических ферментов. Уровни продукции протективного антигена рекомбинантными штаммами достигали значений 100-120 мкг/мл. Авторы сообщают о стабильности данных генно-инженерных штаммов. Однако попытки дальнейшего их усовершенствования за счет использования еще более мощных промоторов не увенчались успехом [13]. Гиперсекреция протективного апнтигена, с одной стороны, сопровождалась нестабильностью гибридных плазмид, с другой - вела к «секретируемому стрессу», выражающемуся в значительном снижении выработки антител к протективному антигену при иммунизации лабораторных животных.

Задачей изобретения является конструирование безопасного рекомбинантного бациллярного штамма, сохраняющего свойства при хранении и культивировании и обладающего высоким уровнем продукции протективного антигена сибиреязвенного микроба.

Сущность изобретения заключается в получении стабильного рекомбинантного штамма-продуцента протективного антигена сибиреязвенного микроба.

Заявляемый штамм создан на основе бесплазмидного производного B. anthracis СТИΔТ (номер в Государственной коллекции патогенных бактерий "Микроб", Саратов - КМ56 (1), авторы: Болотникова М.Ф., Степанов А.С.), полученного в результате температурной элиминации плазмиды рХO1 из вакцинного штамма B. anthracis СТИ-1. Гибридная плазмида pUB110РА-1, содержащая ген синтеза протективного антигена, введена в реципиентный штамм с помощью электростимулируемой трансформации. Плазмида pUB110РА-1 является дериватом плазмиды pUB110PA, сконструированной нами посредством встраивания участка плазмиды рХO1, содержащего ген pag, в мультикопийный вектор pUB110 по сайгам рестрикции BamH1.

Сконструированный штамм получил обозначение B. anthracis СТИΔТПА-1 (pUB110РА-1) и депонирован в Государственной коллекции патогенных бактерий "Микроб" (Саратов) под номером КМ96.

Морфологические признаки: неподвижные, грамположительные, образующие споры палочки, капсулы не имеют.

Культуральные признаки: штамм при высеве на твердых питательные среды образует колонии с шероховатой поверхностью и неровным краем (в R-форме); при высеве в питательный бульон - конгломерат клеток в виде комочка ваты на фоне прозрачной среды.

Резистентность к антибиотикам: рекомбинантный штамм резистентен к канамицину. Селективная концентрация антибиотика 25 мкг/мл.

Антигенные свойства - штамм содержит основной иммуногенный антиген сибиреязвенного микроба - протективный антиген, а также споровые и поверхностные антигены.

Биохимическая активность штамма и другие свойства: для штамма характерна низкая активность протеолитических ферментов. Штамм синтезирует протективный антиген, вызывающий формирование специфических иммунологических реакций в живом организме. На основании экспериментальных данных установлено, что уровень продукции протективного антигена сконструированным штаммом в 4-6 раз превышает продукцию протективного антигена контрольным вакцинным штаммом B. anthracis СТИ-1.

Плазмидный состав: в геноме сконструированного штамма отсутствуют собственные плазмиды рХO1 и рХO2. Штамм содержит гибридную плазмиду pUB110PA-1 с включенным в ее состав геном pag, детерминирующим синтез протективного антигена сибиреязвенного микроба. Размер гибридного репликона 6,5 т.п.н. Плазмида pUB110PA-1 содержит по одному сайту для ферментов Bam HI, Hind III, и два - для Eco RI. В делегированной области оказалось по одному сайту для Bam HI и Hind III. Гибридный репликон несет также детерминанту устойчивости к канамицину.

Патогенные и иммуногенные свойства: рекомбинантный штамм вследствие отсутствия в его геноме основных детерминантов патогенности: капсулы, отечного и летального факторов, не может вызывать развитие инфекционного процесса в восприимчивом макроорганизме. В экспериментах на лабораторных животных установлены значения LD₅₀ для мышей линии BALB/c >3×10⁸, для морских свинок >5×10⁸; и значения индексов иммунитета: для мышей линии BALB/c - 100,0, для морских свинок - 25117,4.

Отличительные свойства штамма B. anthracis СТИΔТПА-1 (pUB110PA-1):

- наличие гибридной плазмиды pUB110PA-1 с включенным в ее состав геном pag, детерминирующим синтез основного иммуногена сибиреязвенного микроба - протективного антигена;

- отсутствие собственных плазмид B. anthracis: рХO1, детерминирующей синтез отечного и летального токсинов, и рХO2, детерминирующей синтез капсулы - основных факторов патогенности сибиреязвенного микроба;

- высокий уровень продукции (около 70-80 мкг/мл) протективного антигена сибиреязвенного микроба, являющегося компонентом химических вакцин;

- низкая активность протеолитических ферментов, разрушающих протективный антиген в процессе выделения и очистки;

- стабильность гибридной плазмиды при хранении штамма, культивировании на питательных средах и после пассажей через организм лабораторных животных.

Возможность использования штамма иллюстрируется примером 1.

Пример 1 - выделение и очистка протективного антигена из рекомбинантного штамма B. anthracis СТИΔТПА-1 (pUB110PA-1).

Суточную агаровую культуру штамма B. anthracis СТИΔТПА-1 (pUB110PA-1) засевают в 5 л L-бульона с добавлением канамицина - 25 мкг/мл; выращивают при температуре 37°С с аэрацией 18 часов. После инкубации добавляют ингибитор протеаз (до 1 ммоль ЭДТА) и фильтруют через мембранные фильтры (Millipore, США) с диаметром пор 0,22 мкм. Охлажденный фильтрат концентрируют в 10 раз на установке "Амикон" (США) с картриджем (Millipore, США) с пределом исключения белков с молекулярной массой 30 кДа и диализуют 18 часов против 10 объемов буфера, содержащего 25 ммоль диэтаноламина, 50 ммоль NaCl, 2 ммоль ЭДТА, 30 ммоль KCl (рН 8,9). После диализа осуществляют ионобменную хроматографию препарата на колонке с Macro Prep 50Q (Bio-Rad, США). Затем вновь концентрируют в 10 раз на установке "Амикон", диализуют при тех же условиях и фильтруют через мембранные фильтры. Полученный препарат доочищают с использованием гель фильтрации на Sephacryl 300HR (Sigma-Aldrich, США). Образцы хранят при температуре минус 70°С. Из 5 л бульонной культуры получается около 400 мкг очищенного препарата протективного антигена.

Основные свойства рекомбинантного штамма, экспрессия клонированного гена pag и стабильность гибридной плазмиды pUB110PA-1 иллюстрируются следующими примерами:

Пример 2 - скрининг плазмидных ДНК.

Культуру рекомбинантного штамма B. anthracis СТИΔТПА-1 (pUB110PA-1) выращивают 16 часов в BHI-бульоне с добавлением 0,4% глицерина и канамицина (25 мкг/мл) с аэрацией при температуре 37°С. Клетки осаждают центрифугированием при скорости вращения ротора 10000 об/мин и суспендируют в 100 мкл Е-буфера (0,04 М трис-ОН; 0,002М ЭДТА; 15% сахароза, рН 7,9), хорошо перемешивают и добавляют 200 мкл лизирующего буфера (0,05М трис-ОН; 15% сахароза; SDS - 0,03 г/мл в 5N NaOH). Смесь инкубируют на водяной бане при температуре 60°С в течение 30 минут, после чего помещают в ледяную баню на 10 минут и добавляют 50 мкл охлажденного 2М Трио-ОН, а затем 600 мкл охлажденного фенол-хлороформа (1:1), осторожно переворачивают не менее 40 раз. Переносят все содержимое в центрифужные пробирки и центрифугируют в течение 30 минут при скорости вращения ротора 10000 об/мин и температуре 5°С. Отбирают верхнюю жидкую фазу и хранят при температуре 4°С.

Препараты плазмидных ДНК и маркеры молекулярных масс (MBI Fermentas) вносят в лунки 0,7% агарозного геля и проводят электрофорез в 0,089 М трис-боратном буфере при силе тока 80 мА в течение 90 минут. По окончании электрофореза гель окрашивают раствором бромистого этидия в концентрации 0,5 мкг/мл в течение 20 минут. Визуализацию ДНК проводят с использованием источника ультрафиолетового света и регистрируют с помощью системы гель-документирования ViTran (ДНК-технология, Россия).

На электрофореграмме образца ДНК, выделенного из тестируемого рекомбинантного штамма B. anthracis КМ96, отмечают отсутствие собственных плазмид сибиреязвенного микроба рХO1 и рХO2 и присутствие гибридной плазмиды pUB110РА-1 на уровне миграции молекулярного маркера около 6,5 т.п.н.

Пример 3 - определение протеолитической активности рекомбинантного штамма.

Культуру рекомбинантного - B. anthracis СТИΔТПА-1 (pUB110PA-1) и контрольного - B. anthracis Sterne 34F₂ штаммов высевают уколом на поверхность специальной среды, содержащей (г/л): бакто-агар - 15,0; дрожжевой экстракт - 4,0; казеин - 2,0; трис-HCl - 1,21; K₂HPO₄ - 0,5; MnSO₄·H₂O - 0,03; MgSO₄·7H₂O - 0,4; CaCl₂ - 0,08; ZnSO₄·7Н₂О - 0,005; CuSO₄·5H₂O - 0,005; (NH₄)₂SO₄ - 2,0; и выращивают в термостате при температуре 37°С в течение 24 часов. Оценивают ширину зоны просветления вокруг колоний.

Вокруг колоний рекомбинантного штамма B. anthracis СТИΔТПА-1 (pUB110PA-1) зоны протеолитической деградации белковых субстратов не превышают 1 мм. Вокруг колоний контрольного штамма, с высокой активностью протеолитических ферментов, на мутном фоне среды образуются зоны просветления шириной до 10 мм.

Пример 4 - определение экспрессии клонированного гена pag на основании реакции преципитации на среде с сибиреязвенным γ-глобулином или антителами к протективному антигену.

Изолированные колонии с суточных агаровых культур рекомбинантного и контрольного вакцинного штаммов переносят уколом на полусинтетическую среду, содержащую (мг/л): CaCl₂·2H₂O - 14,7; MgSO₄·7H₂O - 9,8; MnSO₄·H₂O - 0,85; КН₂PO₄ - 680,0; К₂HPO₄ - 871,0; аденин - 2,1; урацил - 1,4; L-триптофан - 52,0; L-цистин - 12,0; глицин - 15,0; тиамин-гидрохлорид - 10,0; казаминовые кислоты - 3,6 (рН 6,9); в которую добавляют (г/л): агарозу - 7,5; глюкозу - 20,0; бикарбонат натрия - 72,0 и канамицин (для рекомбинантного штамма) - 25 мкг/мл. Непосредственно во время розлива чашек Петри вносят (мл/25 мл среды): нормальную лошадиную сыворотку - 0,6; сибиреязвенный γ-глобулин - 1,0 или кроличьи антитела к протективному антигену - 2,0. Инкубируют в атмосфере СО₂ в течение 18 часов при температуре 37°С. Результаты регистрируют в проходящем свете, отмечая ширину зон преципитации вокруг посевов уколом.

Ширина зоны преципитации у рекомбинантного штамма B. anthracis СТИΔТПА-1 (pUB110PA-1) составляет около 5,0 мм, у контрольного вакцинного штамма B. anthracis СТИ-1 - 1,5 мм.

Пример 5 - определение экспрессии клонированного гена pag на основании исследования белкового состава культуральных фильтратов.

Суточные агаровые культуры тестируемого и контрольного штаммов засевают в 5 мл бульона, содержащего (г/л): триптон - 33,0; дрожжевой экстракт - 20,0; L-гистидин - 2,0; NaCl - 7,4; Na₂HPO₄ - 8,0; КН₂PO₄ - 4,0 (рН 7,4). В готовую среду добавляют бикарбонат натрия - 7,2 г/л и канамицин (для рекомбинантного штамма) - 25 мкг/мл. Культуры выращивают на ротационной качалке при 37°С 18 часов, затем центрифугируют при скорости вращения ротора 10000 об/мин и температуре 5°С в течение 30 минут. Супернатант фильтруют через мембранные фильтры (Millipore, США) с диаметром пор 0,22 мкм и концентрируют с использованием центриконов-30. После центрифугирования при скорости вращения ротора 13000 об/мин в течение 10 минут надосадочную жидкость удаляют, а осадок разводят буфером для электрофореза, содержащим 0,125 моль Трис-HCl, 4% SDS, 20% глицерола, 2% 2-меркаптоэтанола, 0,03 мМоль бромфенола синего (рН 6,8). Образцы по 15 мкл вносят в лунки 10% полиакриламидного геля. Для определения электрофоретической подвижности используют коммерческие маркеры молекулярных масс (Sigma, США). Электрофорез осуществляют в вертикальной камере (Amersham, США) при силе тока 70 мА в течение 5 часов. Полиакриламидные гели окрашивают по инструкции фирмы Amersham и сканируют.

В концентрированных культуральных фильтратах штаммов B. anthracis СТИΔТПА-1 (pUB110PA-1) и B. anthracis СТИ-1 (контроль) присутствует белок с электрофоретической подвижностью, установленной для протективного антигена (83 кДа). На основании интенсивности полос, соответствующих протективному антигену, продукция данного белка штаммом B. anthracis СТИΔТПА-1 (pUB110PA-1) в несколько раз превосходит продукцию протективного антигена вакцинным штаммом B. anthracis СТИ-1.

Пример 6 - определение экспрессии клонированного гена pag на основании результатов иммуноблота с антителами к протективному антигену.

Приготовление культуральных фильтратов тестируемых штаммов и белковый электрофорез осуществляют как описано выше (см. пример 5). Перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану (Hybond-C, Amersham, США) проводят при силе тока 0,4 А и напряжении 100 В в течение 1 часа. После переноса мембрану отмывают в течение 10 минут в буфере (TBS), содержащем 20 мМ трис-ОН, 500 мМ NaCl (pH 7,5), и инкубируют в течение 1 часа в блокирующем растворе, содержащем 1% бычий сывороточный альбумин (БСА) в TBS. Затем мембрану выдерживают дважды по 10 минут в буфере (TTBS), содержащем 0,05% твин-20 в TBS (pH 7,5). Инкубацию мембраны со специфическими антителами к протективному антигену в разведении 1:2000 проводят в течение 1,5 часов, после чего дважды по 10 минут отмывают в TTBS. Взаимодействие с мечеными пероксидазой иммуноглобулинами диагностическими против кроличьих иммуноглобулинов (Sigma, США) в разведении 1:2000 осуществляют в течение 2 часов. После инкубации мембрану выдерживают дважды по 10 минут в TTBS и один раз в TBS. Окрашивание проводят раствором диаминобензидина в течение 30 минут.

В результате на уровне, соответствующем электрофоретической подвижности для белка с молекулярной массой 83 кДа, отмечается специфическое взаимодействие с антителами к протективному антигену. Взаимодействие белков культуральных фильтратов со специфическими антителами к протективному антигену происходит интенсивнее у рекомбинантного штамма.

Пример 7 - сравнение уровней продукции протективного антигена рекомбинантным и контрольным штаммами с использованием дот-анализа.

Препараты культуральных фильтратов готовят как описано выше (см. пример 5) и наносят по 3 мкл в двукратных разведениях на нитроцеллюлозную мембрану Hybond-C (Amersham, США), инкубируют в течение 1 часа в блокирующем растворе, содержащем 1% БСА в TBS. Мембрану отмывают в буфере TTBS и инкубируют в течение 1 часа с кроличьими антителами к протективному антигену в разведении 1:100, затем в течение того же промежутка времени с мечеными пероксидазой антителами диагностическими против кроличьих иммуноглобулинов (Sigma, США) в разведении 1:2000. После 15 минут отмывки в буфере TTBS окрашивают раствором диаминобензидина в течение 30 минут.

По результатам дот-анализа рекомбинантный штамм B. anthracis СТИΔТПА-1 (pUB110РА-1) продуцирует протективного антигена в 4-6 раз больше, чем контрольный вакцинный штамм B. anthracis СТИ-1.

Пример 8 - определение стабильности гибридной плазмиды in vitro.

Культуру рекомбинантного штамма выращивают в бульоне под селективным давлением (10 мкг/мл канамицина) до середины логарифмической фазы. Затем разводят 1:100 средой без антибиотиков и продолжают выращивать до конца логарифмической фазы. Через 10-12 подобных чередующихся пассажей клеточную суспензию разбавляют средой для споруляции, не содержащей антибиотики, и инкубируют 3-е суток до образования спор. Споровую взвесь прогревают при температуре 65°С, высевают на агаровую среду до изолированных колоний. По 100 клонов переносят методом реплик параллельно на среды с добавлением антибиотика и без селективного давления. Подсчитывают процент клонов, выросших на чашках с селективной средой.

В процессе чередующихся пассажей 100% тестированных клонов штамма B. anthracis СТИΔТПА-1 (pUB110РА-1) сохраняют устойчивость к канамипину. После спорообразования 90% тестированных клонов остаются резистентными к канамипину в концентрации 25 мкг/мл.

Таким образом, получен безопасный, стабильный и эффективный продуцент протективного антигена, являющегося основным компонентом химических сибиреязвенных вакцин. Штамм содержит гибридную плазмиду pUB110PA-1 с клонированным геном pag, обеспечивающую продукцию протективного антигена сибиреязвенного микроба, превышающую в 4-6 раз уровень продукции этого антигена контрольным вакцинным штаммом B. anthracis СТИ-1. Штамм B. anthracis СТИΔТПА-1 (pUB110PA-1) не содержит собственных плазмид рХO1 и рХO2 и, вследствие этого, не синтезирует основные факторы вирулентности возбудителя сибирской язвы - капсулу, отечный и летальный факторы. Штамм B. anthracis СТИΔТПА-1 (pUB110PA-1) обладает низкой активностью собственных протеаз, приводящих к деградации белковых антигенов в процессе выделения и очистки. Указанные свойства полученного штамма свидетельствуют о том, что он может использоваться для получения протективного антигена Bacillus anthracis, являющегося компонентом химических сибиреязвенных вакцин и диагностических препаратов.

Источники информации:

1. Онищенко Г.Г., Васильев Н.Т., Литусов Н.В., Харечко А.Т., Васильев П.Г., Садовой Н.В., Кожухов В.В. Сибирская язва: актуальные аспекты микробиологии, эпидемиологии, клиники, диагностики, лечения и профилактики - М.: ВУНМЦ МЗ РФ, 1999. - 447 с.

2. Vodkin M., Leppla S. Cloning of the protective antigen gene of Bacillus anthracis // Cell. - 1983. - Vol.34. - P.693-697.

3. Тедиков В.М., Добрица А.П. Клонирование и экспрессия детерминанты протективного антигена Bacillus anthracis в клетках Escherichia coli, Bacillus subtilis и Bacillus anthracis // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 1993. - №2. - С.13-16.

4. Gupta P., Waheed S., Bhatnagar R. Expression and purification of the recombinant protective antigen of Bacillus anthracis // Protein Expr. Purif - 1999. - Vol.16. - P.369-376.

5. Chauhan V., Singh A., Waheed S.M., Singh S., Bhatnagar R. Constitutive expression of protective antigen gene of Bacillus anthracis in Escherichia coli // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2001. - Vol.283. - №2. - P.308-315.

6. Ivins В., Welkos S. Cloning and expression of the Bacillus anthracis protective antigen gene in Bacillus subtilis // Infect. Immun. - 1986. - Vol.54. - P.537-542.

7. Baillie L., Moir A., Manchee R. The expression of the protective antigen of Bacillus anthracis in Bacillus subtilis // J. Applied Microbiol. - 1998. - Vol.84. - P.741-746.

8. Miller J., McBride В., Manchee R., Moore P., Baillie L. Production and purification of recombinant protective antigen and protective efficacy against Bacillus anthracis // Letters in Applied Microbiol. - 1998. - Vol.26. - P.56-60.

9. United States Patent: 6267966. Vaccine production of the Bacillus anthracis protective antigen // Baillie L., Leslie W.J. - №242846. - 25.02.99. - 31.07.01.

10. Barnard J., Friedlander A. Vaccination against anthrax with attenuated recombinant strains of Bacillus anthracis that produce protective antigen // Infect. Immun. - 1999. - Vol.67. - P.562-567.

11. Cohen S., Mendelson I., Altboum Z., Kobiler D., Elhanany E., Bino Т., Leitner M., Inbar I., Rosenberg H., Gozes Y., Barak R., Fisher M., Kronman C., Velan В., Shafferman A. Attenuated nontoxinogenic and nonencapsulated recombinant Bacillus anthracis spore vaccines protect against anthrax // Infect. Immun. - 2000. - Vol.68. - №8. - P.4549-4558.

12. Gat O., Ihbar I., Aloni-Grinstein R., Zahavy E., Kronman C., Mendelson I., Cohen S., Velan В., Shafferman A. Use of a promoter trap system in Bacillus anthracis and Bacillus subtilis for the development of recombinant protective antigen-based vaccines // Infect. Immun. - 2003. - Vol.71. - P.801-813.

Рекомбинантный штамм Bacillus anthracis СТИΔТПА-1 (pUB110РА-1), депонированный в Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» под номером КМ96 - продуцент протективного антигена сибиреязвенного микроба.