Аспорогенный рекомбинантный штамм bacillus anthracis 55 тпа-1spo-(pub110pa-1)-продуцент протективного антигена сибиреязвенного микроба

Изобретение относится к биотехнологии. Аспорогенный рекомбинантный штамм В. anthracis 55ΔТПА-1Sро^- (pUB110РА-1), продуцирующий протективный антиген сибиреязвенного микроба, получен путем трансформации штамма В. anthracis 55ΔTspo^- ДНК гибридной плазмиды pUB110РА-1. Штамм депонирован ГК патогенных бактерий «Микроб» под номером КМ-97 и характеризуется отсутствием способности к образованию спор, стабильностью гибридного репликона и высоким уровнем продукции протективного антигена - основного компонента химических сибиреязвенных вакцин.

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологии, генетике, биохимии и производстве для получения протективного антигена Bacillus anthracis, являющегося основным компонентом химических сибиреязвенных вакцин и диагностических препаратов.

Известны штаммы-продуценты сибиреязвенных антигенов: в России - штамм В. anthracis СТИ-1, в США - В. anthracis V770-NP1-R, в Англии - В. anthracis Sterne 34F₂ [1]. Данные аттенуированные штаммы не содержат плазмиды капсулопродукции (рХO2), обуславливающей вирулентность штамма, но содержат плазмиду токсинообразования (рХO1), кодирующую синтез экзотоксина бинарного действия, состоящего из протективного антигена, отечного и летального факторов. Протективный антиген сибиреязвенного микроба обладает основным иммуногенным потенциалом и используется в производстве химических вакцин. Отечный и летальный факторы, взаимодействуя с протеолитически активированным протективным антигеном, образуют токсичные комплексы, запускающие патогенетические механизмы инфекционного процесса и обуславливающие специфическое повреждение тканей макроорганизма. Все компоненты сибиреязвенного токсина имеют очень близкие значения молекулярных масс (83-89 кДа), что является препятствием для их полного хроматографического разделения. Примеси отечного и летального факторов в препарате протективного антигена, выделенного из аттенуированных штаммов, отражаются на реактогенности изготовляемой на его основе химической вакцины. При использовании подобных средств для специфической профилактики людей нередко возникают побочные реакции в виде аллергии или даже некротических реакций на месте введения препарата.

С развитием генно-инженерных технологий стало возможным получение рекомбинантных штаммов, продуцирующих только протективный компонент сибиреязвенного токсина.

Известны штаммы Escherichia coli HB101, содержащие клонированный ген синтеза протективного антигена (pag) в составе гибридных плазмид pSE24 и pSE36 [2] и штаммы Е.coli JM103, содержащие клонированный ген pag в составе рРА1, рРА2 и рРА4 [3]. Гибридные репликоны сконструированы посредством встраивания по сайтам рестрикции BamH1 участка плазмиды pXO1, содержащего ген pag, в векторы pBR322 или pUC19 (для рРА2 и рРА4). Однако данные рекомбинантные плазмиды отличались нестабильностью при функционировании в клетках Е.coli и обеспечивали крайне низкие уровни синтеза протективного антигена. Количество биологически активного белкового продукта, выделяемого из соответствующих штаммов, не превышало 5-10 нг/мл культуры или 1-2 мкг/мл - в случае использования рРА2. Для сравнения продукция протективного антигена аттенуированным штаммом В. anthracis Sterne 34F₂ составляет 15-20 мкг/мл.

Известен штамм Е.coli DH5α с клонированным геном pag, синтезирующий протективный антиген [4]. Увеличения выхода очищенного препарата протективного антигена до 125 мкг/мл удалось достичь с помощью оптимизации процесса культивирования в ферментере. Однако Е.coli не является оптимальной моделью для клонирования протективного антигена сибиреязвенного микроба, что связано с внутриклеточным механизмом секреции данного белка. Преимущество представителей рода Bacillus в качестве бактериальных хозяев клонированной ДНК заключается в их способности к секретируемому синтезу белкового антигена. Процедура выделения протективного антигена из среды культивирования микроорганизма значительно менее трудоемка.

Известны штаммы В. subtilis DB104, содержащие гибридные плазмиды рРА3 и рРА10 [3]. Авторы встроили BamH1 фрагменты плазмид рРА2 и рРА4, содержащие ген pag, в бирепликонный вектор pOLYA15. Гибридные репликоны при функционировании в клетках В. subtilis DB104 обеспечивали продукцию протективного антигена на уровне 20 мкг/мл. Однако максимальный выход протективного антигена достигался только на определенном, сравнительно кратковременном этапе стационарной фазы роста культуры, после чего наблюдалось быстрое разрушение белка накапливающимися протеазами.

Известны штаммы В. anthracis MASC-10 и В. subtilis WB600 с клонированным структурным геном pagA под сильным α-амилазным промотором [5]. Они сконструированы на основе реципиентов В. anthracis M770-NP1-R и В. subtilis WB600, обладающих низкой активностью протеолитических ферментов. Уровни продукции протективного антигена рекомбинантными штаммами достигали значений 100-120 мкг/мл. Авторы сообщают о стабильности данных генно-инженерных штаммов. Однако недостатком перечисленных выше рекомбинантных бациллярных штаммов является то, что они, как и все представители рода Bacillus, являются спорообразующими. Способность сибиреязвенного микроба к образованию спор при культивировании в лабораторных или промышленных условиях требует соблюдения строгих правил безопасности работы, пренебрежение которыми может привести к обсеменению помещения и оборудования спорами возбудителя опасного инфекционного заболевания. Споры - основная форма сохранения В. anthracis в объектах внешней среды. В воде они сохраняются до 18 лет, в почве - до 300 лет и более. При попадании в благоприятные условия споры прорастают и образуют полноценные вегетативные клетки. При температуре 120-140°С споры погибают только через 2-3 часа. Обычные обеззараживающие средства, принятые для работы с необразующими спор видами, на них не действуют. С позиций биологической и экологической безопасности для производства химических вакцин оптимальным является использование штаммов-продуцентов, не образующих спор.

Известны единичные случаи получения аспорогенных продуцентов протективного антигена сибиреязвенного микроба на основе бациллярных штаммов.

Известны аспорогенные продуценты сибиреязвенных антигенов: В. anthracis 55Spo^- (номер в Государственной коллекции патогенных бактерий "Микроб" - КМ92) и В. anthracis Sterne 34F₂Spo^- (номер в Государственной коллекции патогенных бактерий "Микроб" - КМ89) [6]. Однако штаммы, являяющиеся спонтанными аспорогенными мутантами вакцинных штаммов В. anthracis 55 и В. anthracis СТИ-1 и содержащие рХO1, синтезируют, помимо протективного антигена, целый ряд антигенов, включая компоненты сибиреязвенного токсина - отечный и летальный факторы.

Известны аспорогенные штаммы В. subtilis IS53, несущие гибридные плазмиды рРА101 и рРА102 с включенным в их состав геном pag и продуцирующие в среду культивирования протективный антиген в количестве 20,5-41,9 мкг/мл [7]. Авторы использовали BamH1 фрагмент ДНК рХO1, содержащий ген синтеза протективного антигена, из гибридной плазмиды рSЕ36, сконструированной М.Vodkin и S.Leppla, встроив его в мультикопийный бациллярный вектор pUB110. Рестрикционный анализ плазмид рРА101 (7,8 т.п.н.) и рРА102 (6,1 т.п.н.), выделенных из рекомбинантных культур, выявил наличие у них обширных делеций, в области негативной регуляции pagR. Однако штаммы были получены на основе реципиента, обладающего высокой активностью протеолитических ферментов. Синтезируемый рекомбинантными штаммами протективный антиген сибиреязвенного микроба под действием бациллярных протеаз частично деградировал, что приводило к значительным потерям белкового продукта во время его выделения и очистки. Кроме того, гибридные плазмиды рРА101 и рРА102 в данной экспрессирующей системе были нестабильными.

Наиболее близким аналогом является аспорогенный дериват генно-инженерного штамма В. anthracis ΔSterne-1, содержащего гибридный репликон рРА102 с включенным в его состав геном синтеза протективного антигена [8]. Продукция протективного антигена, при выращиваниии в условиях повышенного содержания триптона и дрожжевого экстракта, находилась в пределах 20-30 мкг/мл. Спонтанный аспорогенный мутант был селектирован авторами на среде с добавлением конго красного. В 2002 г. в США зарегистрирован патент на метод приготовления химической вакцины на основе протективного антигена, продуцируемого этим штаммом [9]. Однако штамм обладал выраженной активностью протеолитических ферментов, лишь частично купировавшейся за счет подбора ингредиентов среды.

Задачей изобретения является конструирование экологически безопасного аспорогенного рекомбинантного бациллярного штамма, сохраняющего свойства при хранении и культивировании на питательных средах и обладающего высоким уровнем продукции протективного антигена сибиреязвенного микроба.

Сущность изобретения заключается в получении стабильного аспорогенного рекомбинантного штамма-продуцента протективного антигена сибиреязвенного микроба.

Заявляемый штамм создан на основе бесплазмидного производного В. anthracis 55ΔТ (номер в Государственной коллекции патогенных бактерий "Микроб", Саратов - КМ92(2), авторы: Микшис Н.И., Кудрявцева О.М., Болотникова М.Ф., Попов Ю.А.), полученного в результате температурной элиминации плазмиды рХО1 из вакцинного штамма В. anthracis 55, используемого в ветеринарной практике. В популяции штамма В. anthracis КМ92(2) отобран спонтанный аспорогенный мутант. В его геном посредством электростимулируемой трансформации введена гибридная плазмида pUB110РА-1, содержащая ген синтеза протективного антигена. Плазмида pUB110РА-1 является дериватом плазмиды pUB110РА, сконструированной нами посредством встраивания участка рХO1, содержащего ген pag, в мультикопийный вектор pUB110 по сайтам рестрикции BamH1.

Сконструированный штамм получил обозначение В. anthracis 55ΔТПА-1Sро^- (pUB110РА-1) и депонирован в Государственной коллекции патогенных бактерий "Микроб" (Саратов) под номером КМ97.

Морфологические признаки: неподвижные, грамположительные, необразующие спор палочки, капсулы не имеют.

Культуральные признаки: штамм при высеве на твердых питательные среды образует колонии с шероховатой поверхностью и неровным краем (в R-форме); при высеве в питательный бульон - придоный осадок и помутнение среды.

Резистентность к антибиотикам: рекомбинантный штамм резистентен к канамицину. Селективная концентрация антибиотика 25 мкг/мл.

Антигенные свойства - штамм содержит основной иммуногенный антиген сибиреязвенного микроба - протективный антиген, а также поверхностные антигены.

Биохимическая активность штамма и другие свойства: для штамма характерна низкая активность протеолитических ферментов. Штамм синтезирует протективный антиген, вызывающий формирование специфических иммунологических реакций в живом организме. Уровень продукции протективного антигена сконструированным штаммом в 4 раза превышает продукцию протективного антигена контрольными вакцинными штаммами В. anthracis СТИ-1 и В. anthracis 55.

Плазмидный состав: в геноме сконструированного штамма отсутствуют собственные плазмиды рХO1 и рХO2. Штамм содержит гибридную плазмиду pUB110РА-1 с включенным в ее состав геном pag, детерминирующим синтез протективного антигена сибиреязвенного микроба. Размер гибридного репликона 6,5 т.п.н. Плазмида pUB110PA-1 содержит по одному сайту для ферментов Bam HI, Hind III и два - для Eco RI. В делегированной области оказалось по одному сайту для Bam HI и Hind III. Гибридный репликон несет также детерминанту устойчивости к канамицину.

Патогенные и иммуногенные свойства: рекомбинантный штамм вследствие отсутствия в его геноме основных детерминантов патогенности: капсулы, отечного и летального факторов, не может вызывать развитие инфекционного процесса в восприимчивом макроорганизме.

Отличительные свойства штамма В. anthracis 55ΔТПА-1Sро^- (pUB110PA-1):

- аспорогенность - дает преимущество при его использовании в качестве продуцента протективного антигена - основного компонента сибиреязвенных вакцин и диагностических препаратов, так как отсутствует вероятность обсеменения рабочих помещений, лабораторного и промышленного оборудования спорами возбудителя сибирской язвы;

- наличие гибридной плазмиды pUB110PA-1 с включенным в ее состав геном pag, детерминирующим синтез основного иммуногена сибиреязвенного микроба - протективного антигена;

- отсутствие собственных плазмид В. anthracis: рХO1, детерминирующей синтез отечного и летального токсинов, и рХO2, детерминирующей синтез капсулы - основных факторов патогенности сибиреязвенного микроба;

- высокий уровень продукции (около 70 мкг/мл) протективного антигена сибиреязвенного микроба, являющегося компонентом химических вакцин;

- низкая активность протеолитических ферментов, разрушающих протективный антиген в процессе выделения и очистки;

- стабильность гибридной плазмиды при хранении штамма, культивировании на питательных средах и после пассажей через организм лабораторных животных.

Возможность использования штамма иллюстрируется примером 1.

Пример 1 - выделение и очистка протективного антигена из аспорогенного рекомбинантного штамма.

Суточную агаровую культуру штамма В. anthracis 55ΔТПА-1Sро^- (pUB110PA-1) засевают в 5 л L-бульона с добавлением канамицина - 25 мкг/мл; выращивают при температуре 37°С с аэрацией 18 часов. После инкубации добавляют ингибитор протеаз (до 1 ммоль ЭДТА) и фильтруют через мембранные фильтры (Millipore, США) с диаметром пор 0,22 мкм. Охлажденный фильтрат концентрируют в 10 раз на установке "Амикон" (США) с картриджем (Millipore, США) с пределом исключения белков с молекулярной массой 30 кДа и диализуют 18 часов против 10 объемов буфера, содержащего 25 ммоль диэтаноламина, 50 ммоль NaCl, 2 ммоль ЭДТА, 30 ммоль KCl (рН 8,9). После диализа осуществляют ионобменную хроматографию препарата на колонке с Macro Prep 50Q (Bio-Rad, США). Затем вновь концентрируют в 10 раз на установке "Амикон", диализуют при тех же условиях и фильтруют через мембранные фильтры. Полученный препарат доочищают с использованием гель фильтрации на Sephacryl 300HR (Сигма-Алдрич, США). Образцы хранят при температуре минус 70°С. Из 5 л бульонной культуры рекомбинантного аспорогенного штамма получается около 300 мкг очищенного протективного антигена.

Основные свойства рекомбинантного штамма, экспрессия клонированного гена pag и стабильность гибридной плазмиды pUB110PA-1 иллюстрируются следующими примерами:

Пример 2 - определение способности к спорообразованию.

Способность к споруляции определяют сравнением жизнеспособности прогретых и непрогретых культур. Колонии с посевов, инкубировавшихся при температуре 37°С в течение пяти суток на L-агаре, суспендируют в физиологическом растворе. Пробирки с культурой помещают в водяную баню и прогревают при температуре 65°С в течение 30 минут. До и после прогрева делают высев по 0,1 мл культуры на L-агар. Через 24 часа инкубации при температуре 37°С по отсутствию роста на посевах прогретой культуры судят о неспособности клеток сибиреязвенного микроба к образованию спор. Дополнительно способность к образованию спор проверяют при микроскопическом исследовании мазков, окрашенных фуксином Циля. В опытном мазке отмечается отсутствие характерно окрашенных спор.

Пример 3 - определение стабильности свойства аспорогенности.

Рекомбинантный аспорогенный штамм В. anthracis 55ΔТПА-1Sро^- (pUB110РА-1) несколько раз (не менее 10) пассируют на питательной среде (L-агар) при температуре 37°С в течение 18-20 часов. После последнего пассажа делают высев на L-агар и проверяют способность к спорообразованию у 20 изолированных клонов. Отсутствие спорообразования у всех тестированных клонов свидетельствует о стабильности признака аспорогенности.

Пример 4 - скрининг плазмидных ДНК.

Культуру рекомбинантного аспорогенного штамма В. anthracis 55ΔТПА-1Sро^- (pUB110РА-1) выращивают 16 часов в BHI-бульоне с добавлением 0,4% глицерина и канамицина (25 мкг/мл) с аэрацией при температуре 37°С. Клетки осаждают центрифугированием при скорости вращения ротора 10000 об/мин и суспендируют в 100 мкл Е-буфера (0,04 М трис-ОН; 0,002М ЭДТА; 15% сахароза, рН-7,9), хорошо перемешивают и добавляют 200 мкл лизирующего буфера (0,05М трис-ОН; 15% сахароза; SDS - 0,03 г/мл в 5N NaOH). Смесь инкубируют на водяной бане при температуре 60°С в течение 30 минут, после чего помещают в ледяную баню на 10 минут и добавляют 50 мкл охлажденного 2М Трис-ОН, а затем 600 мкл охлажденного фенол-хлороформа (1:1), осторожно переворачивают не менее 40 раз. Переносят все содержимое в центрифужные пробирки и центрифугируют в течение 30 минут при скорости вращения ротора 10000 об/мин и температуре 5°С. Отбирают верхнюю жидкую фазу и хранят при температуре 4°С.

Препараты плазмидных ДНК и маркеры молекулярных масс (MBI Fermentas) вносят в лунки 0,7% агарозного геля и проводят электрофорез в 0,089 М трис-боратном буфере при силе тока 80 мА в течение 90 минут. По окончании электрофореза гель окрашивают раствором бромистого этидия в концентрации 0,5 мкг/мл в течение 20 минут. Визуализацию ДНК проводят с использованием источника ультрафиолетового света и регистрируют с помощью системы гель-документирования ViTran (ДНК-технология, Россия).

На электрофореграмме образца ДНК, выделенного из тестируемого аспорогенного рекомбинантного штамма В. anthracis 55ΔTHA-1Spo^- (pUB110РА-1), отмечают отсутствие собственных плазмид сибиреязвенного микроба рХO1 и рХO2 и присутствие гибридной плазмиды pUB110PA-1 на уровне миграции молекулярного маркера около 6,5 т.п.н.

Пример 5 - определение протеолитической активности рекомбинантного штамма.

Культуру рекомбинантного - В. anthracis 55ΔТПА-1Sро^- (pUB110РА-1), и контрольного - В. anthracis Sterne 34F₂, штаммов высевают уколом на поверхность специальной среды, содержащей (г/л): бакто-агар - 15,0; дрожжевой экстракт - 4,0; казеин - 2,0; трис-HCl - 1,21; К₂HPO₄ - 0,5; MnSO₄·H₂O - 0,03; MgSO₄·7H₂O - 0,4; CaCl₂ - 0,08; ZnSO₄·7H₂O - 0,005; CuSO₄·5H₂O - 0,005; (NH₄)₂SO₄ - 2,0; и выращивают в термостате при температуре 37°С в течение 24 часов. Оценивают ширину зоны просветления вокруг колоний.

Вокруг колоний рекомбинантного штамма В. anthracis 55ΔТПА-1Sро^- (pUB110PA-1) зоны протеолитической деградации белковых субстратов не превышают 1 мм. Вокруг колоний контрольного штамма, с высокой активностью протеолитических ферментов, на мутном фоне среды образуются зоны просветления шириной до 10 мм.

Пример 6 - определение экспрессии клонированного гена pag на основании реакции преципитации на среде с сибиреязвенным γ-глобулином или антителами к протективному антигену.

Изолированные колонии с суточных агаровых культур рекомбинантного и контрольного вакцинного штаммов переносят уколом на полусинтетическую среду, содержащую (мг/л): CaCl₂·2Н₂O - 14,7; MgSO₄·7H₂O - 9,8; MnSO₄·H₂O - 0,85; KH₂PO₄ - 680,0; К₂HPO₄ - 871,0; аденин - 2,1; урацил - 1,4; L-триптофан - 52,0; L-цистин - 12,0; глицин -15,0; тиамин-гидрохлорид - 10,0; казаминовые кислоты - 3,6 (рН 6,9); в которую добавляют (г/л): агарозу - 7,5; глюкозу - 20,0; бикарбонат натрия - 72,0 и канамицин (для рекомбинантного штамма) - 25 мкг/мл. Непосредственно во время розлива чашек Петри вносят (мл): нормальную лошадиную сыворотку - 0,6; сибиреязвенный γ-глобулин - 1,0 или кроличьи антитела к протективному антигену - 2,0. Инкубируют в атмосфере CO₂ в течение 18 часов при температуре 37°С. Результаты регистрируют в проходящем свете, отмечая ширину зон преципитации вокруг посевов уколом.

Ширина зоны преципитации у аспорогенного рекомбинантного штамма В. anthracis 55ΔТПА-1Sро^- (pUB110РА-1) составляет около 5,0 мм, у контрольного вакцинного штамма B. anthracis СТИ-1 - 1,5 мм.

Пример 7 - определение экспрессии клонированного гена pag на основании исследования белкового состава культуральных фильтратов.

Суточные агаровые культуры тестируемого В. anthracis 55ΔТПА-1Sро^- (pUB110РА-1) и контрольного штаммов засевают в 5 мл бульона, содержащего (г/л): триптон - 33,0; дрожжевой экстракт - 20,0; L-гистидин - 2,0; NaCl - 7,4; Na₂HPO₄ - 8,0; KH₂PO₄ - 4,0 (рН - 7,4). В готовую среду добавляют бикарбонат натрия - 7,2 г/л и канамицин (для рекомбинантного штамма) - 25 мкг/мл. Культуры выращивают на ротационной качалке при 37°С 18 часов, затем центрифугируют при скорости вращения ротора 10000 об/мин и температуре 5°С в течение 30 минут. Супернатант фильтруют через мембранные фильтры (Millipore, США) с диаметром пор 0,22 мкм и концентрируют с использованием центриконов-30. После центрифугирования при скорости вращения ротора 13000 об/мин в течение 10 минут надосадочную жидкость удаляют, а осадок разводят буфером для электрофореза, содержащим 0,125 моль Трис-HCl, 4% SDS, 20% глицерола, 2% 2-меркаптоэтанола, 0,03 мМоль бромфенола синего (рН 6,8). Образцы по 15 мкл вносят в лунки 10% полиакриламидного геля. Для определения электрофоретической подвижности используют коммерческие маркеры молекулярных масс (Sigma, США). Электрофорез осуществляют в вертикальной камере (Amersham, США) при силе тока 70 мА в течение 5 часов. Полиакриламидные гели окрашивают по инструкции фирмы Amersham и сканируют.

В концентрированных культуральных фильтратах штаммов В. anthracis 55ΔТПА-1Spo^- (pUB110PA-1) и В. anthracis СТИ-1 (контроль) присутствует белок с электрофоретической подвижностью, установленной для протективного антигена (83 кДа). На основании интенсивности полос, соответствующих протективному антигену, продукция данного белка штаммом В. anthracis 55ΔТПА-1Sро^- (pUB110PA-1) в несколько раз превосходит продукцию протективного антигена вакцинным штаммом В. anthracis СТИ-1.

Пример 8 - определение экспрессии клонированного гена pag на основании результатов иммуноблота с антителами к протективному антигену.

Приготовление культуральных фильтратов тестируемых - аспорогенного и контрольного, штаммов и белковый электрофорез осуществляют как описано выше (см. пример 7). Перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану (Hybond-C, Amersham, США) проводят при силе тока 0,4 А и напряжении 100 В в течение 1 часа. После переноса мембрану отмывают в течение 10 минут в буфере (TBS), содержащем 20 мМ трис-ОН, 500 мМ NaCl (рН 7,5) и инкубируют в течение 1 часа в блокирующем растворе, содержащем 1% бычий сывороточный альбумин в TBS. Затем мембрану выдерживают дважды по 10 минут в буфере (TTBS), содержащем 0,05% твин-20 в TBS (рН 7,5). Инкубацию мембраны со специфическими антителами к протективному антигену в разведении 1:2000 проводят в течение 1,5 часов, после чего дважды по 10 минут отмывают в TTBS. Взаимодействие с мечеными пероксидазой иммуноглобулинами диагностическими против кроличьих иммуноглобулинов (Sigma, США) в разведении 1:2000 осуществляют в течение 2 часов. После инкубации мембрану выдерживают дважды по 10 минут в TTBS и один раз в TBS. Окрашивание проводят раствором диаминобензидина в течение 30 минут.

На уровне, соответствующем электрофоретической подвижности для белка с молекулярной массой 83 кДа, отмечается специфическое взаимодействие с антителами к протективному антигену. Взаимодействие белков культуральных фильтратов со специфическими антителами к протективному антигену происходит интенсивнее у аспорогенного рекомбинантного штамма В. anthracis 55ΔТПА-1Sро^- (pUB110PA-1).

Пример 9 - сравнение уровней продукции протективного антигена рекомбинантным и контрольным штаммами с использованием дот-анализа.

Препараты культуральных фильтратов готовят как описано выше (см. пример 7) и наносят по 3 мкл в двукратных разведениях на нитроцеллюлозную мембрану Hybond-C (Amersham, США), инкубируют в течение 1 часа в блокирующем растворе, содержащем 1% БСА в TBS. Мембрану отмывают в буфере TTBS и инкубируют в течение 1 часа с кроличьими антителами к протективному антигену в разведении 1:100, затем в течение того же промежутка времени с мечеными пероксидазой антителами диагностическими против кроличьих иммуноглобулинов (Sigma, США) в разведении 1:2000. После 15 минут отмывки в буфере TTBS окрашивают раствором диаминобензидина в течение 30 минут.

По результатам дот-анализа рекомбинантный штамм В. anthracis 55ΔТПА-1Sро^- (pUB110PA-1) продуцирует протективного антигена в 4 раза больше, чем контрольные вакцинные штаммы В. anthracis СТИ-1 и В. anthracis 55.

Пример 10 - определение стабильности гибридной плазмиды in vitro.

Стабильность гибридной плазмиды оценивают согласно следующим методикам: 1) выращиванием в течение нескольких генераций в бульоне с добавлением селективного антибиотика или без него; 2) чередованием циклов развития в присутствии канамицина (25 мкг/мл) и без него. Во втором случае культуру штамма В. anthracis 55ΔТПА-1Sро^- выращивают в бульоне с добавлением канамицина (25 мкг/мл) до середины логарифмической фазы, затем разводят 1:100 средой без антибиотиков и продолжают выращивать до конца логарифмической фазы. После периода инкубации культуру высевают на твердую питательную среду для образования изолированных колоний. По 100 клонов переносят методом реплик параллельно на среды с добавлением антибиотика и без селективного давления. Подсчитывают процент клонов, выросших на чашках с селективной средой.

В процессе пассажей (10 и более суточных пересевов) на средах с антибиотиком 100% тестированных клонов штамма В. anthracis 55ΔТПА-1Sро^- (pUB110PA-1) сохраняют устойчивость к канамицину. В процессе чередующихся пассажей на средах с антибиотиком и без него частота элиминации гибридного репликона не превышает 5-10%.

Таким образом, получен штамм В. anthracis 55ΔТПА-1Sро^- (pUB110PA-1), являющийся стабильным экологически безопасным аспорогенным продуцентом протективного антигена. Уровень продукции протективного антигена штамма В. anthracis 55ΔTSpo^- pUB110РА-1 превосходит в 4 раза уровень продукции протективного антигена контрольными вакцинными штаммами - В. anthracis 55 и В. anthracis СТИ-1. Заявляемый штамм не содержит собственных плазмид рХO1 и рХO2 и, следовательно, не синтезирует основные факторы вирулентности возбудителя сибирской язвы - капсулу, отечный и летальный факторы. Штамм В. anthracis 55ΔТПА-1Sро^- обладает низкой активностью собственных протеаз, приводящих к деградации белковых антигенов в процессе выделения и очистки. Указанные свойства полученного штамма свидетельствуют о том, что он может использоваться в качестве не образующего спор эффективного продуцента протективного антигена, являющегося основным компонентом химических сибиреязвенных вакцин и диагностических препаратов.

Источники информации

1. Онищенко Г.Г., Васильев Н.Т., Литусов Н.В., Харечко А.Т., Васильев П.Г., Садовой Н.В., Кожухов В.В. Сибирская язва: актуальные аспекты микробиологии, эпидемиологии, клиники, диагностики, лечения и профилактики - М.: ВУНМЦ МЗ РФ, 1999. - 447 с.

2. Vodkin M., Leppla S. Cloning of the protective antigen gene of Bacillus anthracis // Cell. - 1983. - Vol.34. - P.693-697.

3. Тедиков В.М., Добрица А.П. Клонирование и экспрессия детерминанты протективного антигена Bacillus anthracis в клетках Escherichia coli, Bacillus subtilis и Bacillus anthracis // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 1993. - №2. - С.13-16.

4. Chauhan V., Singh A., Waheed S.M., Singh S., Bhatnagar R. Constitutive expression of protective antigen gene of Bacillus anthracis in Escherichia coli // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2001. - Vol.283. - №2. - P.308-315.

5. Cohen S., Mendelson I., Altboum Z., Kobiler D., Elhanany E., Bino Т., Leitner M., Inbar I., Rosenberg H., Gozes Y., Barak R., Fisher M., Kronman C., Velan В., Shafferman A. Attenuated nontoxinogenic and nonencapsulated recombinant Bacillus anthracis spore vaccines protect against anthrax // Infect. Immun. - 2000. - Vol.68. - №8. - P.4549-4558.

6. Патент РФ №2180916, МКИ: C12N 1/20, A61K 39/07, опубл 27.03.02. Бюл. №9,

Патент РФ №2180349, МКИ: С12N 1/20, А61К 39/02 // (C12N 1/20, C12R 1/07), опубл. 10.03.02. Бюл. №7.

7. Ivins В., Welkos S. Cloning and expression of the Bacillus anthracis protective antigen gene in Bacillus subtilis // Infect. Immun. - 1986. - Vol.54. - P.537-542.

8. Farchaus J., Ribot W., Jendrek S., Little S. Fermentation, purification, and characterization of protective antigen from a recombinant, avirulent strain of Bacillus anthracis // Applied and Environmental Microbiol. - 1998. - Vol.64. - №3. - P.982-991.

9. United States Patent: 20020034512. Method of making a vaccine // Ivins В., Worsham P., Friedlander A., Farchaus J., Welkos S. - №520215. - 07.03.00. - 21.03.2002.

Аспорогенный рекомбинантный штамм Bacillus anthracis 55ΔТПА-1Sро^- (pUB110РА-1), депонированный в Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» под номером КМ97 - продуцент протективного антигена сибиреязвенного микроба.