Способ получения рекомбинантного антагониста рецептора интерлейкина-1 человека "арил"


C07K1/16 - Пептиды (пептиды в пищевых составах A23, например получение белковых композиций для пищевых составов A23J, препараты для медицинских целей A61K; пептиды, содержащие бета-лактамовые кольца, C07D; циклические дипептиды, не содержащие в молекуле любого другого пептидного звена, кроме образующего их кольцо, например пиперазин-2,5-дионы, C07D; алкалоиды спорыньи циклического пептидного типа C07D519/02; высокомолекулярные соединения, содержащие статистически распределенные аминокислотные единицы в молекулах, т.е. при получении предусматривается не специфическая, а случайная последовательность аминокислотных единиц, гомополиамиды и блоксополиамиды, полученные из аминокислот, C08G 69/00; высокомолекулярные продукты, полученные из протеинов, C08H 1/00; получение

Владельцы патента RU 2326947:

Общество с ограниченной ответственностью "Цитокин" (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в фармацевтической промышленности. Антагонист рецептора интерлейкина-1 человека получают с помощью рекомбинантного штамма Е. coli, содержащего плазмиду, которая обеспечивает продукцию указанного белка. Для этого данный штамм культивируют. Затем из бактериальных клеток выделяют целевой продукт с использованием трехстадийной хроматографии и концентрирования на гидрофобном сорбенте. Причем первую и третью стадию указанной хроматографической очистки проводят на катионообменной смоле, а на втором этапе хроматографии используют анионообменную смолу. Применение изобретения позволяет получить антагонист рецептора интерлейкина-1 человека высокой чистоты. 6 з.п. ф-лы, 1 табл.

 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способам получения антагонистов рецептора интерлейкина-1 (IL-1) человека.

Интерлейкины-1 являются сильными воспалительными и пирогенными цитокинами, которые обычно имеют полезные эффекты, но могут также иметь эффекты, вредные для здоровья организма. Они могут, например, принимать участие в патогенезе симптомов аутоиммунных патологий, подобных красной волчанке, в частности они участвуют как медиаторы в провоцировании поражения тканей, как, например, при ревматоидном артрите.

Однако многие биологические эффекты IL-1 подобны тем, которые могут наблюдаться в случае сепсиса. Последние исследования продемонстрировали, что внутривенное введение IL-1 в дозах от 1 до 10 нг/кг вызывает лихорадочное состояние, сонливость, отсутствие аппетита, общую миалгию, артралгию и сильную головную боль. Так как IL-1 имеет плейотропные биологические свойства, многие из которых отрицательно воздействуют на организм, мощные эффекты IL-1 должны находиться под четким физиологическим контролем.

Синтез IL-1 ингибируется противовоспалительными цитокинами, простагландинами и глюкокортикоидами, и наличие множества уровней ингибирования IL-1 указывает на необходимость точного регулирования этого медиатора (WO 91/17249 А, 14.11.91.; S.HASKILL et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, v.88, 1991, p.3681-3685.; N.F.SANDER et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, v.85, 1988, p.2929-2933).

Белки IL-1 распознаются и связываются с рецептором на поверхности клетки (IL-1R). Вместе с тем проведенные исследования показали, что с тем же рецептором может связываться также полипептид, получивший название антагонист рецептора IL-1 (АР-1) (Cannon J.H. et all., J.Infect. Dis., 1990, 161, 79). АР-1 действует как чистый антагонист, блокируя связи молекулами IL-1 (как IL-1-альфа, так и IL-1-бета) и рецептором, что позволяет обеспечить реальный контроль за всей системой IL-1 в организме. При этом АР-1 практически не имеет агонистической активности и перспективен для использования в фармацевтических композициях, действенных против патологий, которые требуют ингибирования IL-1, например при септическом шоке, ревматоидном артрите, инсулинзависимом диабете, некоторых разновидностях лейкемии и т.д. (пат. РФ №2193064, 2002, Кл. C12N 15/24; Donarello C.A., Adv. Pharmacol., 1994, 25, p.1). Однако для достижения хороших клинических результатов необходимо использовать значительные количества АР-1 (Fisher C.J. et all., JAMA, 1994, 271, 1836), что делает актуальным технологию его получения.

В настоящее время препараты АР-1 производятся путем культивирования рекомбинантных штаммов Е. coli с выделением конечного продукта с помощью многоступенчатой очистки (Schreuder et al., Eur. J. Biochem., 227, 838-847, 1995). Согласно предлагаемой технологии сначала бактериальные клетки отделяют от культуральной жидкости центрифугированием, затем разрушают их ультразвуком, снова центрифугируют и удаляют остатки клеток. Полученный супернатант очищают на гидрофобном сорбенте (Phenyl-Sepharose Fast-Flow, Pharmacia) с элюцией градиентом солей. Фракции, содержащие АР-1, объединяют, диализируют и пропускают через анионит (MonoQ, Pharmacia), после чего обрабатывают сульфатом аммония, вновь пропускают через гидрофобный сорбент (Phenyl-Sepharose Fast-Flow, Pharmacia) и подвергают гель-фильтрации.

Известна технология очистки АР-1, при использовании которой супернатант после лизиса клеток и удаления остатков клеток очищают пропусканием через два анионита и гель-фильтрационную хроматографию (Carter D.V. et al. Nature, 344, (1990), рр.633-638) или последовательно с использованием анионообменной и гидрофобной матриц и гель-фильтрационной хроматографии (О.М.Р. Singh et al., Spec. PubL- R. Soc. Chem., (1994), 158 (Separations for Biotechnology 3), pp.474-481).

Недостатком указанных технологий является низкий выход АР-1.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ получения АР-1 на основе культивирования рекомбинантного штамма Е. coli, содержащего плазмиду, продуцирующую АР-1 (пат. РСТ №9747650, 1996, кл. С07К 14/54), включающий в себя культивирование штамма, отделение клеток центрифугированием и их гомогенизацию, очистку полученного после гомогенизации продукта с помощью двухстадийной ионообменной хроматографии - сначала на катионообменной, а затем на анионообменной смоле; и концентрирование с помощью ультра- и диафильтрации.

Хроматографическая очистка проводится в две стадии. На первой стадии гомогенизат с рН 5.0-6.2 (оптимально 6.0) пропускают сначала через катионообменную смолу на основе целлюлозы, декстрана, агарозы, силикатов или синтетических полимерных материалов. Сорбированный продукт промывают буферным раствором с рН 6.0, а затем элюируют буферным раствором с рН 7.5-9.0 (оптимально 8.0).

На второй стадии очистки полученный продукт пропускают через анионообменную смолу на основе целлюлозы, декстрана, агарозы, силикатов или синтетических полимерных материалов, на которую нанесены аминоалкильные или полиэтилениминные группировки (ДЕАЕ-Сефадекс, ДЕАЕ-Сефароза, Биорад и т.п.) при рН 6.0. Промывку ведут буферным раствором при рН 7.5-9.0 (оптимально рН 8.0), а элюцию - тем же раствором с добавкой NaCl для повышения ионной силы.

После хроматографической очистки АР-1 концентрируют с помощью ультрафильтрации на мембранах типа Амикон с последующей диафильтрацией. Получают продукт с чистотой более 95% и выходом по отношению к гомогенизату 0.6 мас.%.

Недостатком данного способа является относительно невысокий выход целевого продукта.

Задачей, решаемой авторами, являлось создание способа получения АР-1 с более высоким выходом и чистотой целевого продукта.

Было найдено, что указанная задача решается путем проведения процесса получения препарата АР-1, получившего условное наименование «АРИЛ» (св. на ТЗ №0236653), который включает в себя

- культивирование рекомбинантного штамма Е. coli, содержащего плазмиду, продуцирующую АР-1;

- отделение и гомогенизацию бактериальных клеток;

- очистку целевого продукта последовательной трехстадийной хроматографией, включающей в себя на первой и третьей стадии хроматографию на карбоксильном катионите, а на второй стадии - хроматографию на анионите;

- концентрирование хроматографией на гидрофобном сорбенте.

Гомогенизат может направляться непосредственно на стадию хроматографии, однако более целесообразна предварительная очистка его от остатков бактериальных клеток. Такая очистка осуществляется фильтрацией, центрифугированием или иными стандартными методами или их сочетанием, например сочетанием фильтрации на полых волокнах, центрифугированием и диафильтрацией.

Хроматографию на карбоксильном катионите проводят при рН 5.15-5.3, в результате чего проходит очистка продукта от нуклеиновых кислот и части белковых примесей. Элюцию проводят 0.1 М раствором трис-гидроксиметиламинометана (трис-буферный раствор).

В качестве сорбентов используют катионообменную смолу на основе целлюлозы, агарозы или синтетических полимерных материалов, например с использованием таких катионитов, как Sp-целлюлоза, Sp-Sephadex, Sp-Sepharose (Pharmacia); Солоза КГ (сополимер метакриловой кислоты, бутилметакрилата и метиленбисакриламида, полученный по авт. св СССР №1053477, 1982, Кл. C08F 220/18). Лучшие результаты достигались при использовании Sp-целлюлозы и Солозы КГ 20/30.

Очистку на анионообменной смоле проводят с использованием буферного раствора с рН 7.8-8.0, при этом элюцию проводят тем же буферным раствор с повышенной ионной силой за счет введения в него таких добавок, как NaCl, KCl и т.п.В качестве буферного раствора используют, в частности, 0.05 М трис-ацетатный буферный раствор.

В качестве анионообменной смолы используют смолы на основе целлюлозы, агарозы или синтетических полимеров, поверхность которых модифицирована диэтиламиноэтильными функциональными группами. В частности, могут использоваться такие сорбенты, как Сфероцелл-QAE, DEAE-целлюлоза, QAE-Sephadex C-50 и т.д. Лучшие результаты достигались при использовании DEAE-целлюлозы.

Концентрирование продукта проводят при рН 5.1-5.2 на гидрофобном сорбенте на основе целлюлозы, в частности Сфероцелл-октил (на основе микросферической целлюлозе, модифицированной октильными группами), DEAE-TSK 650S и т.п. При этом АР-1 проходит через сорбент, не сорбируясь на нем в режиме проскока, а содержащиеся в растворе примеси остаются на сорбенте.

Лучшие результаты достигались при использовании Сфероцелл-октил.

Основными существенными отличиями заявляемого способа от ближайшего аналога являются:

- проведение хроматографии на анионите при рН 7.8-8.0 вместо рН 6.0;

- введение третьей стадии хроматографической очистки на карбоксильном катионите при рН 5.1-5.2 с элюцией буферным раствором с рН 7.0-7.1;

- проведение концентрирования целевого продукта хроматографией на гидрофобном сорбенте при рН 5.1-5.2.

Дополнительными признаками являются:

- природа используемых сорбентов,

- проведение хроматографии на карбоксильном катионите в узком диапазоне рН 5.15-5.3 вместо оптимального 6.0, что позволяет провести более селективную очистку смеси от нуклеиновых кислот:

- проведение предварительной очистки гомогенизата.

Вышеприведенные отличия позволяют получить продукт с чистотой более 97% при выходе более 1.5 мас.%, т.е. повысить выход АР-1 в 2-2.5 раза.

Сущность и практическая применимость заявляемого способа иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1 (по способу-прототипу). 250 г биомассы были получены культивированием штамма Е. Coli K12 (АВ 1899). Биомассу суспендировали в 2,3 л лизисного буфера и дезинтегрировали в течение 2 часов. После 20-мин центрифугирования супернатант подвергали фильтрации на полых волокнах ВПУ-100. Полученные 3 л фильтрата разбавляли дистиллированной водой до 4,5 л, подкисляли уксусной кислотой до рН 5.1, центрифугировали и наносили на колонку с 400 мл сорбента SP-целлюлозы, уравновешенного 0.05 М фосфатным буферным раствором при рН 5.2. Элюцию АРИЛ вели 0.1 М трис-буфером. Элюат разбавляли водой в 2 раза и наносили на колонку с 400 мл ДЕАЕ-целлюлозы при рН 7.9. После промывки сорбента 1,2 л 0.05 М трис-ацетатного буферного раствора АР-1 элюировали 1,5 л того же буферного раствора с добавлением 0,05 N NaCl. Полученный элюат разводили водой в 2 раза, доводили рН до 5,2 и наносили на колонку с 220 мл Sp-целлюлозы, уравновешенной 0.05М трис-ацетатным буферным раствором с рН 5.15. Элюцию проводили 0.1 М трис-буферным раствором при рН 7.2. 550 мл элюата наносили на колонку с октил-целлюлозой, уравновешенной 0.08 М фосфатного буферного раствора с рН 5.2.

Смесь, содержащая АР-1, не сорбировалась на колонке и выходит в проскоке в объеме 0.65 л. Выход АР-1 - 3.3 г (1.4%) при чистоте 96% по данным электрофореза, активность (по степени подавления интерлейкина-1-бета соответствующим количеством ИР-1) 1:30.

Пример 2. 250 г биомассы Е. coli K12 (АВ 1899) суспендировали в 2.5 л лизисного раствора и подвергали дезинтеграции в проточном дезинтеграторе баллистического типа в течение 2 часов до достижения степени дезинтеграции 97.5%. Полученную суспензию центрифуговали при скорости 10000 об/мин в течение 30 мин. Супернатант фильтровали на разделительном аппарате АР-0.2 с полыми волокнами ВПУ-100. Полученные 3.15 л фильтрата разбавляли водой до 5 л, а затем подкисляли 50% уксусной кислотой до рН 5.2, после чего центрифуговали при скорости 10000 об/мин в течение 30 мин.

Супернатант наносили на колонку с 450 мл Sp-целлюлозы, после чего промыли 1.5 л 0.05 М трис-ацетатного буферного раствора с рН 5.2 и элюировали смесь, содержащую АР-1, 1.4 л 0.1 М трис-буферного раствора.

Элюат разбавили дистиллированной водой до 2.1 л и нанесли на 400 мл ДЕАЕ-целлюлозы при рН 7.8, после чего промыли сорбент 1.5 л 0.05 М трис-ацетатного буферного раствора с рН 7.8 и элюировали АР-1, 2 л того же раствора с 0.05 М NaCl. Полученный элюат разбавили дистиллированной водой до 3.0 л, подкислили 1 М уксусной кислотой до рН 5.2, а нанесли на 200 мл сорбента SP-целлюлоза, уравновешенного 0.05 М фосфатным буферным раствором при рН 5.2.

Элюат наносят на 100 мл сорбента октил-целлюлоза. Сорбент промыли 1.0 л 0.08 М фосфатного буферного раствора с рН 5.2. Смесь, содержащая АР-1, не удерживается гидрофобным сорбентом и выходит в проскоке в объеме 0.75 л.

Количество АР-1 - 4.2 г (1,7%) при чистоте 97% по данным электрофореза, концентрация 6 мг/мл, пирогенность менее 0.3 нг моносахаридов Е. coli на мг АР-1, активность (по степени подавления интерлейкина-1-бета соответствующим количеством ИР-1) 1:10.

Пример 3. Полученный культивированием генно-инженерного штамма Е. coli BL21-DE3 2 л лизата клеток штамма-продуцента с содержанием биомассы 70 г подвергали фильтрации на аппарате ВПУ 100 с диаметром полых волокон 100 кДа. После окончания фильтрации для промывания осадка проводили диафильтрацию. Фильтрат объемом 1,6-1,8 л, содержащий растворимую часть рецепторного антагониста ИЛ-1, поступал на хроматографическую очистку от балластных белков на сорбенте Солоза КГ 20/30.

Фильтрат объемом 1,6-1,8 л, содержащий растворимую фракцию АР-1 и балластные белки, разводили дистиллированной водой до объема 2 л и титровали раствором 50% уксусной кислоты до рН 5.2.

Полученный раствор наносили на колонку с 150 мл сорбента Солоза КГ 20/30. Элюцию проводили 0,1 М раствором трис-гидроксиметиламинометана в объеме 1 л. Первые 300 мл элюата, не содержащего белок, отбрасывали, остальные 700 мл собирали и определяли содержание белка спектрофотометрически по поглощению на λ=280 нм в кювете с толщиной слоя 1 см. Выход белка на данной стадии составлял 2 г.

К раствору объемом 700 мл, полученному на предыдущей стадии хроматографии, добавляли равный объем дистиллированной воды и титровали 1 М раствором трис-гидроксиметиламинометана до рН 7,8. Раствор белков наносили на колонку с 150 мл сорбента ДЕАЕ-TSK 650S со скоростью 100 мл/час. Сорбент промывали 600 мл 0.02М трис-ацетатного буферного раствора рН 7,8. Элюцию АР-1 вели градиентом натрия хлорида в буферном растворе 2 до концентрации 0,1 M NaCl. Объем градиента 1 л.

Первые 500 мл элюата, не содержащие АРИЛ, отбрасывали. Следующие, имеющие проводимость 4-8 мСм/см, собирали. В элюате объемом 500 мл определяли содержание белка спектрофотометрически по поглощению на λ=280 нм в кювете с толщиной слоя 1 см. Выход белка на данной стадии составлял 1,5 г.

Полученный раствор белков титровали 50% кислотой уксусной до рН 5,2 и наносили на колонку с 75 мл сорбента Солоза КГ 20/30, уравновешенного 0.05 М трис-ацетатным буферным раствором рН 5,2. Затем сорбент промывали 150 мл 0,05 М фосфатного буферного раствора рН 5,2. Элюцию проводили 500 мл 0,1 М фосфатным буферным раствором рН 7,0.

Первые 300 мл элюата отбрасывали, следующие 200 мл собирали. Определяли содержание белка спектрофотометрически по поглощению на λ=280 нм в кювете с толщиной слоя 1 см. Выход белка на данной стадии составлял 1,2 г.

Раствор, полученный на предыдущей стадии, титровали кислотой ортофосфорной до рН 5,2. Затем пробу объемом 150-200 мл наносили на колонку с 100 мл сорбента Сфероцелл QAE, уравновешенную 0,1 М фосфатным буферным раствором рН 5,2. Этим же раствором промывали колонку после нанесения раствора белка. Начальный объем 100 мл раствора отбрасывали, следующие 250 мл собирали (несорбирующаяся фракция, содержащая рецепторный антагонист ИЛ-1).

В полученном высокоочищенном растворе АР-1 объемом 250 мл спектрофотометрически по поглощению на λ=280 нм в кювете с толщиной слоя 1 см определяли содержание белка в мг/мл, общее содержание белка. Концентрация рецепторного антагониста ИЛ-1 по белку составляла 2,4 мг/мл. Общее содержание белка 1,0 г (1,3%).

Пример 4. В условиях примера 2 проводили выделение АР-1 из биомассы Е. coli при варьировании параметров отдельных стадий процесса. Полученные результаты приведены в таблице.

Таблица
Влияние параметров процесса очистки АР-1 на выход и свойства конечного продукта
Степень дезинтеграции, %Объем фильтрата, л1 стад. хром-фии на2 стад. хром-фии3 стадия хром-фии на Sp-целлюлозеСтад. концентрированияХарактеристика полученного продукта
рН сорбции на Sp-целлюлозерН сорбции на ДЕАЕ-целлюлозерН сорбциирН элюциирН сорбции на октил-целлюлозеВыход АР-1, гЧистота, %Активность
97.53.155.37.85.27.05.14.2971 30
97.53.155.17.85.27.05.14.0971 10
97.53.155.27.85.27.05.14.1981 10
983.05.257.85.27.05.14.1981 10
983.05.257.95.27.05.14.0961:100
983.05.258.05.27.05.14.1597.51 10
962.95.258.05.16.85.14.0961:100
962.95.258.05.157.25.14.1981 10
962.95.258.05.27.15.14.1597.51 10
973.05.257.85.27.05.154.1981 10
973.05.257.85.27.05.24.096130

Полученные результаты показали возможность получения препарата АР-1 с выходом более 1.5% и чистотой до 98%, т.е. с более высокой чистотой и большим выходом по сравнению с прототипом.

1. Способ получения антагониста рецептора интерлейкина-1 человека, включающий в себя культивирование рекомбинантного штамма E.coli, содержащего плазмиду, обеспечивающую продукцию антагониста рецептора интерлейкина-1 человека, отделение и гомогенизацию бактериальных клеток, очистку целевого продукта с использованием хроматографических методов, включающих в себя хроматографию последовательно на катионообменной и анионообменной смолах и концентрирование конечного продукта, причем хроматографию на катионообменной смоле проводят при рН более 5,0 с использованием сорбента на основе целлюлозы, агарозы или синтетических полимерных материалов, а хроматографию на анионообменной смоле проводят на сорбенте на основе целлюлозы, агарозы или синтетических полимеров, поверхность которых модифицирована диэтиламиноэтильными функциональными группами, отличающийся тем, что продукт после очистки на анионообменной смоле дополнительно подвергают хроматографической очистке на катионообменной смоле при рН 5,1-5,2 с элюцией буферным раствором при рН 7,0-7,1, а концентрирование целевого продукта осуществляют пропусканием его через гидрофобный сорбент при рН 5,1-5,2.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что перед стадией хроматографической очистки гомогенизат предварительно очищают от остатков бактериальных клеток с использованием фильтрации на полых волокнах и/или центрифугирования и диафильтрации.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что первую катионообменную хроматографическую очистку на катионообменной смоле проводят при рН 5,15-5,3.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что хроматографическую очистку на катионообменной смоле проводят с использованием сорбента Sp-целлюлоза.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что хроматографическую очистку на катионообменной смоле проводят с использованием сорбента Солоза КГ.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что хроматографическую очистку на анионообменной смоле проводят с использованием сорбента DEAE-целлюлоза.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что концентрирование проводят с использованием в качестве гидрофобного сорбента Сфероцелл-октил.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению рекомбинантных аналогов гамма-интерферона человека, и может быть использовано для профилактики и лечения онкологических заболеваний, новообразований и воспалительных процессов у людей в медицине.
Изобретение относится к области медицины и касается гликоформ фактора VII и к композициям, содержащим фактор VII, имеющим измененные конфигурации на основе аспарагинсвязанных олигосахаридных цепей.

Изобретение относится к биологически активным пептидам, обладающим антимикробным действием, которые могут найти применение в биотехнологии и медицине. .

Изобретение относится к биотехнологии. .
Изобретение относится к диагностическим иммунобиологическим препаратам, содержащим биологически активные компоненты клеток Bacillus anthracis. .

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в пищевой промышленности. .

Изобретение относится к биохимии, в частности к биологически активным пептидам, обладающим антимикробным действием, которые могут найти применение в биотехнологии и медицине.

Изобретение относится к генной инженерии, а именно к полипептидам GPCR Drosophila melanogaster (DmGPCR) и полинуклеотидам, которые определяют и кодируют такие полипептиды. .

Изобретение относится к области белковой и генной инженерии и может быть использовано в фармацевтической промышленности. .

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой эукариотическую клетку-хозяина (варианты), которая экспрессирует первый полинуклеотид, кодирующий первый пропептид и FVII или его функциональные варианты, в первой единице экспрессии и экспрессирует второй полинуклеотид, кодирующий второй свободный пропептид, во второй единице экспрессии, причем каждый из указанных первого и второго пропептидов содержит аминокислотную последовательность, независимо выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 и 18.

Изобретение относится к биотехнологии. .

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности генной инженерии, и может быть использовано в медицине. .

Изобретение относится к области медицины и касается композиций и способов для лечения и диагностики рака, в особенности, рака легких. .

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в фармацевтической промышленности

Наверх