Лиофилизированный препарат, содержащий антитела против рецептора egf

Изобретение относится к медицине, а именно к получению фармацевтических композиций. Предложена стабильная лиофилизированная композиция, содержащая антитело Cetuximab или Matuzumab (EMD 72000) против рецептора эндотелиального фактора роста (рецептора EGF), сахар или аминосахар, аминокислоту и поверхностно-активное вещество. Композиция в соответствии с изобретением является физиологически хорошо переносимой, может быть легко приготовлена, точно дозирована, является стабильной в отношении продуктов распада и агрегатов при хранении в течение периода, по крайней мере, от трех месяцев до одного-двух лет, а также во время повторяемых процессов замораживания и оттаивания. После восстановления может применяться парентерально для лечения опухолей. 3 н. и 8 з.п. ф-лы, 3 табл., 5 ил.

 

Настоящее изобретение касается стабильного лиофилизированного фармацевтического препарата, содержащего антитело, которое направлено против рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), а также способа его получения.

Разнообразные исследования в условиях in vitro и in vivo показали, что блокирование EGFR антителами оказывает направленное против опухолей влияние на различных уровнях, например, путем ингибирования пролиферации клеток, снижения ангиогенеза, индуцированного опухолью, индукции апоптоза раковых клеток и повышения токсических эффектов радиотерапии и традиционной химиотерапии.

МАВ с225 (Cetuximab®) представляет собой клинически одобренное антитело, которое связывается с рецептором EGF. Cetuximab® является химерным антителом, вариабельные участки которого имеют мышиное происхождение, а константные участки имеют происхождение от человека, это антитело было впервые описано Naramura и др. Cancer Immunol. Immunotherapy 1993, 37:343-349 и в WO 96/40210 A1.

МАВ 425 представляет собой антитело мышиного происхождения, которое сверхэкспрессируется в опухолевых клетках и направлено против EGFR, в частности в клетках карциномы А431. Оно было гуманизировано, а также были описаны его химерные формы, например, в ЕР 0531472 A1; Kettleborough и др. Protein Engineering 1991, 4: 773-783; Bier и др.. Cancer Chemother. Pharmacol. 2001, 47:519-524; Bier и др., - Cancer Immunol. Immunother. 1998, 46:167-173. EMD 72000 представляет собой описанное антитело (h425), которое находится на клинической фазе I/II, его константный участок состоит из к-цепи и γ-1-цепи человека.

Человеческие анти-EGFR антитела могут быть получены с помощью технологии использования ксеногенных мышей, как описано в WO 91/10741 A1, WO 94/02602 A1 и WO 96/33735 A1. Специфическое антитело, которое было получено с помощью этой технологии и в настоящее время подвергается клиническим испытаниям, представляет собой ABX-EGF (Abgenix, Crit. Rev. Oncol. Hematol., 2001, 38:17-23; Cancer Research 1999, 59:1236-1243).

Другие антитела, направленные против EGFR, также были описаны, например, в ЕР 0586002 В1 и в J.Natl.Cancer Inst., 1993, 85:27-33 (МАВ 528).

Подобно другим антителам EGFR антитела также используются парентерально как раствор для терапевтического применения. Особой проблемой растворов, содержащих такие антитела, является их склонность к агрегации и образованию белковых мультимеров. В случае распадающихся мультимеров это может быть приписано случайному образованию внутримолекулярных дисульфидных мостиков при взаимодействии между соседними группами. Гидрофобные взаимодействия и последующее образование мультимеров, которые не распадаются, также являются возможными. Кроме того, могут также происходить реакции дезамидирования, которые впоследствии приводят к реакциям разложения белков. Описанные реакции денатурации возникают, в частности, во время хранения при повышенной температуре или во время напряжения при сдвиге, которое возникает, например, при транспортировке. В общем случае жидкие препараты таким образом имеют более низкую пригодность в качестве лекарственной формы для широкого применения.

Обычный процесс, направленный на стабилизацию антител, представляет собой сушку сублимацией растворов, содержащих антитела и вспомогательные вещества. Удаление воды снижает образование продуктов распада и агрегатов (Hsu и др., Dev. Biol. Stand. 1991, 74:255-267 и Pikal и др., Dev. Biol. Stand. 1991, 74:21-27).

WO 93/00807 А1 описывает лиофилизированные препараты белков, которые с целью стабилизации включают полиэтиленгликоли и сахар. Однако полиэтиленгликоли являются сомнительными с токсикологической точки зрения и таким образом их по возможности следует избегать в составе лекарственных средств, в частности, если они предназначены для парентерального введения.

WO 98/22136 А2 раскрывает лиофилизированный препарат, содержащий антитело, аминосахар, аминокислоту и поверхностно-активное вещество. Несмотря на то, что препарат заявлен для антител вообще, только препараты, раскрытые в качестве рабочих примеров, являются такими, которые включают моноклональные антитела, направленные против вируса гепатита В (АК HBV), при этом в каждом случае препарат содержит антитело против L-селектина (анти-L-селектин) и антитело против рецептора неврального фактора роста L (анти-LNGFR). Тогда как препараты, содержащие АК HBV и анти-L-селектин были приготовлены из растворов, которые имеют максимальную концентрацию антитела 8 мг/мл и 7 мг/мл соответственно, препарат, содержащий антитело, направленное против фактора роста анти-LNGFR, готовили при использовании раствора, включающего только 0,25 мг/мл антитела, но в остальном имеющего идентичный качественный и количественный состав вспомогательных агентов. Несмотря на то, что препарат, содержащий анти-LNGFR, таким образом имеет более чем в двадцать раз меньшее содержание антитела и соответственно более низкое содержание продуктов распада, которое можно было бы ожидать, не было представлено никаких данных в отношении их стабильности, в отличие от препаратов, содержащих другие антитела.

Задачей настоящего изобретения является получение стабилизированного препарата антител, направленных против EGFR. Препарат не должен содержать каких-либо токсикологически неприемлемых вспомогательных агентов, должен быть стабильным в течение относительно длительного периода времени в условиях повышенного напряжения, таких, как высокая температура и атмосферная влажность, должен восстанавливаться с помощью водного растворителя для получения готового к употреблению раствора с высоким содержанием активного ингредиента.

Неожиданно было обнаружено, что препарат, который соответствует этим требованиям, получают путем сушки сублимацией водного раствора, который, кроме этих антител к EGFR, также включает сахар или аминосахар, аминокислоту и поверхностно-активное вещество. Настоящее изобретение таким образом касается стабильных лиофилизированных препаратов моно- или поликлональных антител, при этом указанные препараты содержат сахар или аминосахар, аминокислоту и поверхностно-активное вещество и характеризуются тем, что антитело является антителом, направленным против рецептора эпидермального фактора роста (EGFR).

Антитело, которое может присутствовать, представляет собой любое антитело, которое направлено против эпидермального фактора роста, в частности мышиные, гуманизированные или химерные антитела, упомянутые в начале, и антитела к EGFR, которые были приготовлены и могут быть приготовлены путем указанной технологии на основе ксеногенных мышей. Антитело к EGFR, которое присутствует в препарате в соответствии с изобретением, предпочтительно представляет собой Cetuximab® или EMD 72000, а также мышиные, гуманизированные или химерные аналоги антител, которые им соответствуют. Особое предпочтение отдается препаратам, которые включают Cetuximab® или EMD 72000 в качестве антитела.

Препарат в соответствии с изобретением является физиологически хорошо переносимым, может быть легко приготовлен, точно дозирован, а также является стабильным в отношении продуктов распада и агрегатов при хранении и во время повторяемых процессов замораживания и оттаивания. Он является стабильным при хранении в течение периода, который составляет, по крайней мере, от трех месяцев до одного-двух лет при хранении в условиях холодильника (2-8°С) и при комнатной температуре (23-27°С, 60%-ная относительная атмосферная влажность (RAH)). Неожиданно было обнаружено, что препарат в соответствии с изобретением является стабильным при хранении в течение указанного периода при повышенных температурах и более высокой относительной атмосферной влажности, например, при температуре 40°С и 75%-ной относительной атмосферной влажности.

Лиофилизированный препарат может быть восстановлен простым способом для получения готового к употреблению раствора, который не содержит видимых частиц, а именно путем прибавления водного растворителя, например воды, для целей инъекции или для получения изотонического водного раствора. Восстановленный раствор является стабильным в течение периода времени приблизительно 5 дней, но, в частности, особенно предпочтительно использовать его в пределах четырех часов.

Восстановление препарата в соответствии с изобретением с помощью водных растворителей преимущественно позволяет получать препарат содержащих антитело растворов, которые имеют значение рН в пределах от 5 до 8, предпочтительно таких, которые имеют значение рН от 6,0 до 7,4, особенно предпочтительно значение рН приблизительно 7,2, и осмолярность от 250 до 350 мосмол/кг. Восстановленный препарат может таким образом вводится непосредственно внутривенно, внутриартериально, а также подкожно, без существенной боли. Кроме того, препарат может также добавляться к растворам для инфузии, таким как, например, раствор глюкозы, изотонический физиологический раствор или раствор Рингера, который также может включать дополнительные ингредиенты, так, что позволяет вводить относительно большие количества активного ингредиента.

В соответствии с преимущественным воплощением изобретения лиофилизированный фармацевтический препарат существенно состоит из антитела, сахара или аминосахара, аминокислоты, буфера и поверхностно-активного вещества.

Препарат в соответствии с изобретением позволяет получать препарат растворов антитела, который соответствует по своей концентрации клиническим потребностям. Предпочтение отдается растворам антитела, которые имеют концентрацию антитела от приблизительно 0,5 до 25 мг/мл, особенно преимущественно от 5 до 20 мг/мл, очень предпочтительно от 10 до 15 мг/мл. Препарат в соответствии с изобретением таким образом позволяет получать препараты, готовые к употреблению, которые имеют существенно более высокую концентрацию, чем описано для препаратов в соответствии с WO 98/22136 А2.

Используемый в препарате сахар в соответствии с изобретением может представлять собой моно-, ди- или трисахарид. Примерами моносахаридов, которые могут быть упомянуты, являются глюкоза, манноза, галактоза, фруктоза и сорбоза, примерами дисахаридов, которые могут быть упомянуты, являются сахароза, лактоза, мальтоза и трегалоза, а примером трисахарида, который может быть упомянут, является раффиноза. Предпочтение отдается сахарозе, лактозе, мальтозе и трегалозе, особенно предпочтительной является сахароза.

Также возможно присутствие аминосахаров, то есть моносахаридов, которые содержат первичную, вторичную или третичную аминогруппу или ацилированную аминогруппу (-NH-CO-R) вместо гидроксильной группы. Для целей настоящего изобретения особое предпочтение отдается глюкозамину, N-метилглюкозамину, галактозамину и нейраминовой кислоте.

Сахар/аминосахар присутствует в препарате в соответствии с изобретением в таком количестве, чтобы он присутствовал в заключительном растворе после восстановления с помощью предложенного объема растворителя в концентрации от приблизительно 1 до 200 мг/мл. Сахар предпочтительно присутствует в восстановленном растворе в концентрации от 30 до 65 мг/мл.

Приемлемые аминокислоты, которые используются в соответствии с изобретением, представляют собой основные аминокислоты, такие как, например, аргинин, гистидин, орнитин, лизин, среди прочих, при этом аминокислоты желательно использовать в виде их неорганических солей (преимущественно в форме солей хлористоводородной кислоты, то есть в форме гидрохлоридов). В случае, когда используются свободные аминокислоты, желаемое значение рН устанавливают путем добавления приемлемых физиологически переносимых буферных веществ, таких как, например, органические или неорганические кислоты, такие как лимонная кислота или фосфорная кислота, серная кислота, уксусная кислота, муравьиная кислота или их соли. Предпочтение отдается цитратам и фосфатам, с которыми получают особенно стабильные лиофилизаты.

Предпочтительными аминокислотами являются аргинин, лизин и орнитин. Кроме того, также является возможным использовать кислые аминокислоты, такие как, например, глутаминовая кислота и аспарагиновая кислота, или нейтральные аминокислоты, такие как, например, изолейцин, лейцин и аланин, или ароматические аминокислоты, такие как, например, фенилаланин, тирозин или триптофан. Содержание аминокислот в препарате в соответствии с изобретением составляет от 1 до 100 мг/мл, предпочтительно от 1 до 50 мг/мл, особенно предпочтительно 3-30 мг/мл (основываясь в каждом случае на восстановленном растворе).

Используемыми поверхностно-активными веществами являются все сурфактанты, которые обычно используются в фармацевтических препаратах, предпочтительно полисорбаты и полимеры полиоксиэтилена-полиоксипропилена. Особое предпочтение отдается монолаурату полиоксиэтилен(20)сорбита и моноолеату полиоксиэтилен(20)сорбита. В соответствии с изобретением препарат включает от 0,001 до 1 масс.%, предпочтительно от 0,005 до 0,1 масс.% и особенно предпочтительно приблизительно 0,01 масс.% (основываясь в каждом случае на восстановленном растворе).

Если препарат в соответствии с изобретением включает буферные растворы, то они должны, в принципе, быть физиологически переносимыми веществами, которые приемлемы для установления желательного значения рН. Количество буферных веществ выбирают таким образом, чтобы после восстановления лиофилизированного препарата, например, с помощью воды для инъекций полученный водный раствор имел буферную концентрацию от 5 ммол/л до 20 ммол/л, предпочтительно приблизительно 10 ммол/л. Предпочтительными буферными растворами являются цитратный буферный раствор или фосфатный буферный раствор. Приемлемые фосфатные буферные растворы представляют собой растворы солей фосфорной кислоты моно- и/или динатрия и калия, таких, как гидрофосфат динатрия или дигидрофосфат калия, а также смеси солей натрия и калия, такие как, например, смеси гидрофосфата динатрия и дигидрофосфата калия.

Если восстановленный раствор не является уже изотоническим вследствие осмотических свойств антитела, то вспомогательные вещества, которые используются для стабилизации, изотонический агент, предпочтительно физиологически переносимая соль, такая как, например, хлорид натрия или хлорид калия, или физиологически переносимый полиол, такой как, например, глюкоза или глицерин, могут также присутствовать в концентрации, необходимой для установления изотоничности.

Кроме того, лиофилизаты в соответствии с изобретением могут включать также физиологически переносимые вспомогательные вещества, такие как, например, антиоксиданты, такие, как аскорбиновая кислота или глютатион, консерванты, такие, как фенол, крезол, метил- или пропилпарабен, хлорбутанол, тиомерсал или хлорид бензалкония, полиэтиленгликоли (PEG), такие, как PEG 3000, 3350, 4000 или 6000, или циклодекстрины, такие, как гидроксипропил-β-циклодекстрин, сульфобутилэтил-β-циклодекстрин или γ-циклодекстрин.

Препарат в соответствии с изобретением может быть приготовлен путем получения водного препарата, включающего Cetuximab® или EDM 72000 в качестве активного ингредиента, а также сахар, аминосахар, аминокислоту и поверхностно-активное вещество в качестве добавок, и, если это является желательным, фармацевтические вспомогательные вещества, с последующей лиофилизацией раствора.

Водный препарат может быть приготовлен путем прибавления указанных вспомогательных агентов к раствору, содержащему Cetuximab® или EDM 72000. С этой целью определенные количества маточных растворов, содержащих указанные вспомогательные агенты в определенных концентрациях, преимущественно прибавляют к раствору, имеющему определенную концентрацию Cetuximab® или EDM 72000, как полученно из его препарата, и смесь, если это является желательным, разводят до предварительно рассчитанной концентрации водой. Альтернативно вспомогательные вещества могут также прибавляться как твердые вещества к начальным растворам, содержащим Cetuximab®. Если Cetuximab® или EDM 72000 находится в твердой форме, например в форме лиофилизата, то препарат в соответствии с изобретением может быть приготовлен сначала растворением соответствующих антител в воде или в водном растворе, содержащем один или более дополнительных вспомогательных агентов, с последующим прибавлением необходимых в каждом случае количеств маточных растворов, содержащих дополнительные вспомогательные вещества, дополнительных вспомогательных веществ в твердой форме и/или воды. Cetuximab® или EDM 72000 также могут преимущественно быть растворены непосредственно в растворе, содержащем все дополнительные вспомогательные вещества.

Один или более вспомогательных агентов, которые присутствуют в препарате в соответствии с изобретением, могут преимущественно быть уже прибавленными во время или в конце процесса приготовления препарата частного антитела к EGFR. Это предпочтительно выполняют путем растворения Cetuximab® или EDM 72000 непосредственно в водном растворе, содержащем один, более чем один или все дополнительные вспомогательные вещества на заключительном этапе очистки, который осуществляют после его приготовления. Для этого, чтобы получить препарат, соответствующий(ие) дополнительный(ые) ингредиент(ы), который(ые) необходим(ы), прибавляют в меньшем количестве в каждом случае и/или не прибавляют вообще. Особенно предпочтительно для соответствующего ингредиента растворять его непосредственно в водном растворе, который содержит все дополнительные вспомогательные вещества на конечном этапе очистки, которую выполняют после его приготовления, непосредственно получая раствор, который подвергают лиофилизации.

Раствор, содержащий соответствующее антитело и вспомогательные вещества, доводят до значения рН от 5 до 8, стерильно фильтруют и подвергают сушке сублимацией.

Примеры объясняют изобретение, не ограничивая его.

Если используют 10 ммол/л буфера на основе фосфата натрия или фосфата калия со значением рН 7,2, то он включает 2,07 г/л 7-гидрата гидрофосфата динатрия и 0,31 г/л моногидрата дигидрофосфата натрия или 1,220 г/л гидрофосфата дикалия и 0,4050 г/л дигидрофосфата калия.

Пример 1

Лиофилизат получали из водного раствора, содержащего:

10 мг/мл EMD 72000

10 ммол/л буфера на основе фосфата калия с рН 7,2

17 ммол/л аргинина

3 вес.% сахарозы

0,01 вес.% монолаурата полиоксиэтилен(20)сорбита

0,4 вес.% PEG 6000

Приготовление осуществляли путем перемешивания определенных объемов водных растворов, содержащих соответствующие вспомогательные вещества в определенных концентрациях. Использовали следующие растворы:

Раствор А (раствор активного ингредиента), содержащий:

20 мг/мл EMD 72000

10 ммол/л буфера на основе фосфата калия с рН 7,2

Раствор В (буферно-солевой раствор):

10 ммол/л буфера на основе фосфата калия с рН 7,2

6 вес.% сахарозы

0,02 вес.% монолаурата полиоксиэтилен(20)сорбита

34 ммол/л аргинина

0,8 вес.% полиэтиленгликоля 6000

Для приготовления препарата в соответствии с изобретением соединяли друг с другом равные объемы раствора А и раствора В.

Приготовленный раствор стерильно фильтровали перед упаковкой. Каждый флакон наполняли 2 мл раствора. После этого флакон частично герметизировали при помощи пробок и подвергали лиофилизации. После высушивания сублимацией флаконы герметически закрывали.

Пример 2

Лиофилизат получали из водного раствора, содержащего:

10 мг/мл EMD 72000

10 ммол/л буфера на основе фосфата калия с рН 7,2

14 ммол/л аргинина

3 вес.% сахарозы

0,01 вес.% монолаурата полиоксиэтилен(20)сорбита

Приготовление осуществляли путем перемешивания определенных объемов водных растворов, содержащих соответствующие вспомогательные вещества в определенных концентрациях. Использовали следующие растворы:

Раствор А (раствор активного ингредиента), содержащий:

20 мг/мл EMD 72000

10 ммол/л буфера на основе фосфата калия с рН 7,2

Раствор В (буферно-солевой раствор):

10 ммол/л буфера на основе фосфата калия с рН 7,2

6 вес.% сахарозы

0,02 вес.% монолаурата полиоксиэтилен(20)сорбита

34 ммол/л аргинина.

Для приготовления препарата в соответствии с изобретением соединяли друг с другом равные объемы раствора А и раствора В.

Приготовленный раствор стерильно фильтровали перед упаковкой. Каждый флакон наполняли 20 мл раствора. После этого флаконы частично герметизировали с пробок и подвергали лиофилизации. После высушивания сублимацией флаконы герметично закрывали пробками.

Пример 3

Лиофилизат получали из водного раствора, содержащего:

15 мг/мл Cetuximab®

5 ммол/л цитрата

100 ммол/л аргинина

4 вес.% маннитола

0,01 вес.% моноолеата полиоксиэтилен(20)сорбита

Приготовление осуществляли путем перемешивания определенных объемов водных растворов, содержащих соответствующие вспомогательные вещества в определенных концентрациях. Использовали следующие растворы:

Раствор А (раствор активного ингредиента), содержащий:

19 мг/мл Cetuximab®

5 ммол/л цитрата

127 ммол/л аргинина

0,01 вес.% моноолеата полиоксиэтилен(20)сорбита.

Раствор В (буферно-солевой раствор):

5 ммол/л цитрата

19,05 вес.% маннитола

0,01 вес.% моноолеата полиоксиэтилен(20)сорбита.

Для приготовления препарата в соответствии с изобретением 7,9 мл раствора А и 2,1 мл раствора В соединяли друг с другом.

Приготовленный раствор фильтровали при использовании стерильного фильтра перед упаковкой. Каждый флакон наполняли 2 мл раствора при помощи пипетки. После этого флакон частично герметизировали при помощи пробок и подвергали лиофилизации. После высушивания сублимацией флаконы герметично закрывали пробками.

Пример 4

Лиофилизат получали из водного раствора, содержащего:

15 мг/мл Cetuximab®

5 ммол/л цитрата

100 ммол/л аргинина

1,5 вес.% сахарозы

0,01 вес.% монолаурата полиоксиэтилен(20)сорбита.

Приготовление осуществляли путем перемешивания определенных объемов водных растворов, содержащих соответствующие вспомогательные вещества в определенных концентрациях. Использовали следующие растворы:

Раствор А (раствор активного ингредиента), содержащий:

19 мг/мл Cetuximab®

5 ммол/л цитрата

127 ммол/л аргинина

0,01 вес.% моноолеата полиоксиэтилен(20)сорбита.

Раствор В (буферно-солевой раствор):

5 ммол/л цитрата

7,1% сахарозы

0,01 вес.% моноолеата полиоксиэтилен(20)сорбита.

Для приготовления препарата в соответствии с изобретением 7,9 мл раствора А и 2,1 мл раствора В соединяли друг с другом. Приготовленный раствор фильтровали при использовании стерильного фильтра перед упаковкой. Каждый флакон наполняли 2 мл раствора при помощи пипетки. После этого флакон частично герметизировали при помощи пробок и подвергали лиофилизации. После высушивания сублимацией флаконы герметично закрывали пробками.

Пример 5

Лиофилизат получали из водного раствора, содержащего:

15 мг/мл Cetuximab®

10 ммол/л буфера на основе фосфата калия с рН 7,2

14 ммол/л гидрохлорида L-аргинина

88 ммол/л сахарозы

0,01 вес.% монолаурата полиоксиэтилен(20)сорбита,

значение рН доводили до 7,5 при использовании фосфорной кислоты.

Приготовление осуществляли путем перемешивания определенных объемов водных растворов, содержащих соответствующие вспомогательные вещества в определенных концентрациях. Использовали следующие растворы:

Раствор А (раствор активного ингредиента), содержащий:

25 мг/мл Cetuximab®

10 ммол/л буфера на основе фосфата калия с рН 7,2

воду для инъекций

Раствор В (буферно-солевой раствор):

10 ммол/л буфера на основе фосфата калия с рН 7,2

35,6 ммол/л гидрохлорида L-аргинина

219 ммол/л сахарозы

0,025 вес.% монолаурата полиоксиэтилен(20)сорбита,

значение рН доводили до 7,5 при использовании фосфорной кислоты.

Для приготовления препарата в соответствии с изобретением 6 мл раствора А и 4 мл раствора В соединяли друг с другом.

Приготовленный раствор фильтровали при использовании стерильного фильтра перед упаковкой. Каждый флакон наполняли 2 мл раствора при помощи пипетки. После этого флакон частично герметизировали при помощи пробок и подвергали лиофилизации. После высушивания сублимацией флаконы герметично закрывали пробками.

Пример 6 (сравнительный препарат 1)

Водный раствор, содержащий:

5 мг/мл Cetuximab®

10 ммол/л буфера на основе фосфата натрия с рН 7,2

145 ммол/л хлорида натрия.

Приготовление осуществляли путем перемешивания определенных объемов водных растворов, содержащих соответствующие вспомогательные вещества в определенной концентрации. Использовали следующие растворы:

Раствор А (раствор активного ингредиента), содержащий:

10 мг/мл Cetuximab®

10 ммол/л буфера на основе фосфата натрия с рН 7,2

145 ммол/л хлорида натрия.

(Раствор получали путем элюирования активного ингредиента из колонки при использовании раствора В на конечном этапе хроматографической очистки активного ингредиента, который осуществляли после приготовления).

Раствор В (буферно-солевой раствор):

Соответствует раствору А, но не содержит активного ингредиента.

Для приготовления сравнительного препарата 10 мл каждого из растворов А и В соединяли друг с другом.

Пример 7 (сравнительный препарат 2)

Водный раствор, содержащий:

5 мг/мл Cetuximab®

10 ммол/л буфера на основе фосфата натрия с рН 7,2

45 ммол/л хлорида натрия

0,01 вес.% моноолеата полиоксиэтилен(20)сорбита.

Приготовление осуществляли путем перемешивания определенных объемов водных растворов, содержащих соответствующие вспомогательные вещества в определенной концентрации. Использовали следующие растворы:

Раствор А (раствор активного ингредиента), содержащий:

9,7 мг/мл Cetuximab®

10 ммол/л буфера на основе фосфата натрия с рН 7,2

145 ммол/л хлорида натрия.

(Раствор получали путем элюирования активного ингредиента из колонки при использовании раствора В на конечном этапе хроматографической очистки активного ингредиента, который осуществляли после приготовления).

Раствор В (буферно-солевой раствор): соответствует раствору А, но не содержит активного ингредиента.

Раствор С (раствор сложного эфира жирной кислоты полиоксиэтиленсорбита): соответствует раствору В, но дополнительно содержит 1 вес.% моноолеата полиоксиэтилен(20)сорбита.

Для приготовления сравнительного препарата 10 мл раствора А и 9,8 мл раствора В, а также 0,2 мл раствора С соединяли друг с другом.

Приготовленный раствор фильтровали при использовании стерильного фильтра перед упаковкой. Каждый флакон наполняли 2 мл раствора при использовании пипетки. После этого флаконы герметично закрывали пробками.

Исследования стабильности препаратов

Стабильность препаратов в соответствии с изобретением, полученных в примерах 1 и 2, исследовали в условиях напряжения. Для этого приготовленные лиофилизаты хранили при температуре 40°С и относительной атмосферной влажности (RAH) 75%. Препараты хранили до определенного момента времени и анализировали при использовании приемлемых аналитических способов. Возможная нестабильность препаратов антител проявлялась, главным образом, в образовании агрегатов и образовании продуктов распада. Продукты распада предпочтительно определяли с помощью электрофореза в геле (SDS-PAGE) и изоэлектрического фокусирования (IEF), в то время как визуальное наблюдение и измерение мутности использовали для определения видимых агрегатов, а вытеснительную хроматографию на основе размеров (HPLC-SEC) осуществляли для определения растворимых агрегатов. Подобно этому тест ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), используемый для оценки препаратов, служил для проверки целостности и способности связываться с рецептором.

Результаты, представленные в таблицах 1 и 2, ясно подтверждают качественный и количественный состав приготовленных препаратов даже при повышенных температурах хранения и повышенной относительной атмосферной влажности (40°С/75% RAH).

Таблица 1: Стабильность препарата в соответствии с примером 1
Время хранение (месяцы)	рН	ELISA (отн. титр)	SDS-PAGE [% мономера IG]	SE-HPLC
Невосстанавливаемые	Восстанавливаемые
Температура 2-8°С
0	7,11	1,00	100	100	100
6	7,14	1,01	99,3	100	99,6
12	7,15	1,04	99,9	99,1	99,7
24	7,16	1,03	100	100	100
Температура 25°С, 60%-ная относительная влажность
6	7,17	1,03	99,1	99,0	99,5
Время хранение (месяцы)	рН	ELISA (отн. титр)	SDS-PAGE [% мономера IG]	SE-HPLC
Невосстанавливаемые	Восстанавливаемые
12	7,15	1,01	98,7	99,1	99,6
24	7,16	1,03	100	100	99,5
Температура 40°С, 75%-ная относительная влажность
6	7,17	1,10	98,8	98,2	99,3
12	7,15	не изм.	не изм.	не изм.	не изм.
24	7,16	0,98	100	100	99,3

Таблица 2: Стабильность препарата в соответствии с примером 2
Время хранение (недели)	рН	ELISA (отн. титр)	SDS-PAGE [% мономера IG]	SE-HPLC
Невосстанавливаемые	Восстанавливаемые
Температура 2-8°С
0	7,20	0,97	100	100	99,33
13	7,23	1,00	не изм.	не изм.	99,24
26	7,21	1,02	99,47	99,57	99,27
Температура 25°С, 60%-ная относительная влажность
13	7,24	1,05	не изм.	не изм.	99,22
26	7,24	0,97	99,47	99,64	99,21
Температура 40°С, 75%-ная относительная влажность
13	7,23	1,04	не изм.	не изм.	99,08
26	7,25	0,97	99,61	99,62	98,85

Стабильность препаратов в соответствии с изобретением по примерам от 3 до 7 также проверяли в стрессовых тестах. С этой целью флаконы, содержащие раствор в соответствии с примерами 3-5, и для сравнения, флаконы, содержащие раствор в соответствии с примерами 6-7, хранили при температуре 25°С и 60%-ной относительной атмосферной влажности (RAH) и при температуре 40°С и 75%-ной относительной атмосферной влажности (RAH). Перед началом хранения и после определенного времени хранения в каждом случае оценивали визуально три пробирки под прямым освещением с холодным источником света и определяли поглощение растворов при длине волны 350 и 550 нм, что является мерой мутности. Кроме того, в каждом случае брали три пробирки и анализировали на содержание Cetuximab® и наличие продуктов распада с помощью HPLC-гель фильтрации.

Хроматографические исследования на основе HPLC осуществляли при использовании градиентов (В) ацетонитрил/вода 95/5 (об/об) и буферного раствора с рН 2,5/ацетонитрил 95/5 (об/об) (А) в качестве элюентов. Колонка: LiChroCHART® 125-2 HPLC картридж; Super-spher® 60 RP - select В, скорость истечения: 0,3 мл/мин, определение при длине волны 210 нм.

Результаты изучения стабильности представлены в таблице 3.

Таблица 3
Иссл. раствор	Хранение при 40°/75% RAH (нед.)	Cetuximab® [%]	Агрегаты [%]	Продукты распада [%]	Мутность при λ=350 нм	Мутность при λ=550 нм	Визуальная оценка
Пр.3	0	99,30	0,20	0,51	0,0211	0,0055	Прозр.
Пр.3	4	99,04	0,62	0,34	0,0214	0,0029	Прозр.
Пр.3	8	98,54	1,12	0,34	0,0224	0,0020	Прозр
Пр.3	13	98,43	1,18	0,40	0,0246	0,0019	Прозр.
Пр.4	о	99,33	0,19	0,48	0,0198	0,0045	Прозр.
Пр.4	4	99,11	0,40	0,50	0,0174	0,0025	Прозр.
Пр.4	8	99,19	0,44	0,38	0,0181	0,0021	Прозр.
Пр.4	13	99,20	0,45	0,36	0,0172	0,0014	Прозр.
Пр.5	0	99,69	0,19	0,04	0,0195	0,0050	Прозр.
Пр.5	4	92,00	0,24	0,25	0,0165	0,0028	Прозр.
Пр.5	8	89,94	0,22	0,22	0,0156	0,0023	Прозр.
Пр.5	13	86,66	0,28	0,20	0,0187	0,0045	Прозр.
Пр.6	0	99,69	0,62	0,15	0,0130	0,0021	Прозр.
Пр.6	4	92,00	0,84	7,38	0,0232	0,0047	Мутн.
Пр.6	8	89,94	1,39	8,68	0,0338	0,0044	Мутн.
Пр.6	13	86,66	3,26	10,11	0,0403	0,0061	Мутн.
Пр.7	0	99,72	0,17	0,11	0,0128	0,0016	Прозр.
Пр.7	4	98,60	0,56	0,84	0,0200	0,0022	Прозр.
Пр.7	8	96,49	2,21	1,32	0,0280	0,0033	Прозр.
Пр.7	13	86,46	4,84	8,73	0,0382	0,0036	Мутн.

Фиг.1-5 также показывают сравнение результатов различных исследований стабильности препарата в соответствии с изобретением по примеру 4 по сравнению с композициями 1 и 2, полученными после определенного времени хранения при температуре 40°С и 75%-ной относительной влажности. Перед осуществлением каждого анализа высушенный сублимацией препарат в соответствии с примером 4 восстанавливали с помощью воды для инъекций для получения водного раствора, содержащего в три раза большее содержание воды по сравнению с исходным раствором, который использовался для приготовления лиофилизированного препарата путем сушки сублимацией.

Фиг.1 показывает уменьшение содержания активного ингредиента в сравнительных композициях 1 и 2 по сравнению с препаратом в соответствии с изобретением по примеру 4, измеренное как содержание мономера при использовании HPLC-SEC.

Фиг.2 показывает увеличение количества продуктов распада в сравнительных композициях 1 и 2 по сравнению с препаратом в соответствии с изобретением по примеру 4, измеренное как содержание мономера при использовании HPLC-SEC.

Фиг.3 показывает увеличение количества агрегатов в сравнительных композициях 1 и 2 по сравнению с препаратом в соответствии с изобретением по примеру 4, измеренное как содержание мономера при использовании HPLC-SEC.

Фиг.4 показывает увеличение оптической плотности при λ=350 нм в сравнительных композициях 1 и 2 по сравнению с препаратом в соответствии с изобретением по примеру 4.

Фиг.5 показывает увеличение оптической плотности при λ=550 нм в сравнительных композициях 1 и 2 по сравнению с препаратом в соответствии с изобретением по примеру 4.

Результаты ясно показывают, что композиции в соответствии с изобретением имеют существенно более высокую стабильность по сравнению с жидкими сравнительными растворами.

1. Лиофилизированная фармацевтическая композиция для лечения опухоли, содержащая антитела, сахар или аминосахар, аминокислоту и поверхностно-активное вещество, отличающаяся тем, что антитело представляет собой Cetuximab или Matuzumab (EMD 72000), сахар представляет собой моно-, ди- или трисахарид, аминосахар представляет собой глюкозамин, N-метилглюкозамин, галактозамин или нейраминовую кислоту, аминокислота представляет собой основную, кислую или нейтральную аминокислоту, поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат или полимер полиоксиэтилена-полиоксипропилена для получения раствора антител с концентрацией антител от 0,5 до 25 мг/мл.

2. Лиофилизированная фармацевтическая композиция по п.1, которая, по существу, состоит из антитела, сахара или аминосахара, аминокислоты, буферного раствора и поверхностно-активного вещества.

3. Лиофилизированная фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что сахар представляет собой сахарозу, мальтозу или трегалозу.

4. Лиофилизированная фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что аминокислота представляет собой аргинин, лизин или орнитин.

5. Лиофилизированная фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что поверхностно-активное вещество представляет собой сложный эфир жирной кислоты полиоксиэтиленсорбита, моноолеат полиоксиэтилен(20)сорбита или монолаурат полиоксиэтилен(20)сорбита.

6. Лиофилизированная фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что также содержит изотонический агент в концентрации, необходимой для установления изотоничности.

7. Лиофилизированная фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что в качестве изотонического агента присутствует хлорид натрия.

8. Водный фармацевтический препарат моно- или поликлонального антитела, получаемый при восстановлении лиофилизата по одному из пп.1-7 с помощью водного растворителя.

9. Водный фармацевтический препарат по п.8, отличающийся тем, что раствор имеет значение рН 5-8, предпочтительно 6-7,4.

10. Водный фармацевтический препарат по п.9, отличающийся тем, что раствор имеет значение рН приблизительно 7,2.

11. Способ получения лиофилизированной фармацевтической композиции по одному из пп.1-7, отличающийся тем, что готовят водный препарат, содержащий Cetuximab или Matuzumab (EMD 72000) в качестве активного ингредиента, а также сахар или аминосахар, аминокислоту и поверхностно-активное вещество в качестве дополнительных агентов, и, если это является желательным, дополнительные фармацевтические вспомогательные вещества, и после этого раствор подвергают лиофилизации.