Способы лечения послеоперационной боли введением антагониста фактора роста нервов и композиции, содержащие фактор роста нервов

Авторы патента:

ШЕЛТОН Дэвид Л. (US)

ВЕРГАРА Джерман Дж. (US)

A61P41 - Лекарственные средства, используемые в хирургии, например хирургические адъюванты для предотвращения спаек или для замещения стекловидного тела

A61K39/395 - антитела (агглютинины A61K 38/36); иммуноглобулины; иммунные сыворотки, например антилимфоцитные сыворотки

Владельцы патента RU 2338555:

РИНАТ НЬЮРОСАЙЕНС КОРП. (US)

Изобретение относится к медицине и касается применения антагониста фактора роста нервов (NGF) для предотвращения или лечения послеоперационной боли. Для этого вводят эффективные количества антагониста фактора роста нервов (NGF) или фармацевтической композиции, содержащей NGF. Антагонист NGF представляет собой антагонистическое антитело против NGF. Введение этого соединения обеспечивает эффективное лечение послеоперационной боли, которая представляет собой отдельное патологическое состояние, за счет воздействия на механизмы, отличные от участвующих в других видах боли. 3 н. и 6 з.п. ф-лы, 2 табл., 10 ил.

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Для данной заявки испрошен приоритет на основе предварительной заявки на патент США под регистрационным №60/417237, поданной 8 октября 2002 г., содержание которой полностью включено в качестве ссылки.

ЗАЯВЛЕНИЕ ОТНОСИТЕЛЬНО ФЕДЕРАЛЬНО СПОНСИРОВАННОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ИЛИ РАЗРАБОТКИ

Данное изобретение было создано при поддержке Правительства США в соответствии с контрактом №DAAD19-03-C-0006, предоставленной агентством DARPA. Правительство США имеет определенные права на данное изобретение.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к применению антагониста фактора роста нервов (NGF) для предотвращения, облегчения или лечения послеоперационной боли.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Фактор роста нервов (NGF) был первым идентифицированным нейротропином, и его роль в развитии и выживании и периферических, и центральных нейронов была достаточно охарактеризована. Было показано, что NGF является решающим фактором выживания и поддержания в развитии периферических симпатических и эмбриональных сенсорных нейронов и холинергических нейронов основания переднего мозга (Smeyne, et al., Nature 368:246-249 (1994); Crowley, et al., Cell 76:1001-1011 (1994)). NGF стимулирующе регулирует экспрессию нейропептидов в сенсорных нейронах (Lindsay, et al., Nature 337:362-364 (1989)), и его активность опосредована через 2 различных связанных с мембраной рецептора, рецептор тирозинкиназы TrkA и рецептор р75, который структурно связан с другими членами семейства рецепторов фактора некроза опухоли (Chao, et al., Science 232:518-521 (1986)).

В дополнение к воздействиям NGF на нервную систему, появляется все больше данных о его участии в процессах вне нервной системы. Например, было показано, что экзогенно введенный NGF усиливает сосудистую проницаемость (Otten, et al., Eur J Pharmacol. 106:199-201 (1984)), усиливает Т- и В-клеточные иммунные реакции (Otten, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10059-10063 (1989)), вызывают дифференцировку лимфоцитов и пролиферацию тучных клеток и вызывают высвобождение растворимых биологических сигналов из тучных клеток (Matsuda, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6508-6512 (1988); Pearce, et al., J. Physiol. 372:379-393 (1986); Bischoff, et al., Blood 79:2662-2669 (1992); Horigome, et al., J. Biol. Chem. 268:14881-14887 (1993)). Хотя было показано, что экзогенно добавляемый NGF способен оказывать все указанные эффекты, важно отметить, что лишь изредка было показано, что эндогенный NGF важен при любом из указанных процессов in vivo (Torcia, et al., Cell. 85(3):345-56 (1996)). Поэтому неясно, каков может быть эффект ингибирования биологической активности эндогенного NGF, если он имеет место.

NGF продуцируется рядом типов клеток, включая тучные клетки (Leon, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3739-3743 (1994)), В-лимфоциты (Torcia, et al., Cell 85:345-356 (1996)), кератиноциты (Di Marco, et al., J. Biol. Chem. 268:22838-22846)), гладкомышечные клетки (Ueyama, et al., J. Hypertens. 11:1061-1065 (1993)), фибробласты (Lindholm, et al., Eur. J. Neurosci. 2:795-801 (1990)), бронхиальные эпителиальные клетки (Kassel, et al., Clin, Exp.Allergy 31:1432-40 (2001)), почечные мезангиальные клетки (Steiner, et al., Am. J. Physiol. 261:F792-798 (1991)) и миотрубочки скелетных мышц (Schwartz, et al., J. Photochem, Photobiol. B 66:195-200 (2002)). Рецепторы NGF были обнаружены на разнообразных типах клеток вне нервной системы. Например, TrkA был обнаружен на моноцитах, Т- и В-лимфоцитах и тучных клетках человека.

Связь между повышенными уровнями NGF и разнообразными воспалительными состояниями наблюдалась у больных людей, а также на нескольких экспериментальных моделях у животных. Они включают системную красную волчанку (Bracci-Laudiero, et al., Neuroreport. Lett. 4:563-565 (1995)), рассеянный склероз (Bracci-Laudiero, et al., Neurosci. Lett. 147:9-12 (1992)), псориаз (Raychaudhuri, et al., Acta Derm. l'enereol. 78:84-86 (1998)), артрит (Falcimi, et al., Ann. Rheum. Dis. 55:745-748 (1996)), интерстициальный цистит (Okragly, et al., J. Urology 161:438-441 (1991)) и астму (Braun, et al., Eur. J. Immunol. 28:3240-3251 (1998)).

Следовательно, повышение уровня NGF в периферических тканях связано с воспалением, и это наблюдалось при ряде форм артрита. Синовиальная оболочка пациентов, пораженных ревматоидным артритом, проявляет высокие уровни NGF, в то время, как сообщалось о том, что в невоспаленной синовиальной оболочке NGF не выявляется (Aloe, et al., Arch. Rheum. 35:351-355 (1992)). Аналогичные результаты наблюдались у крыс с экспериментально вызванным ревматоидным артритом (Aloe, et al., Clin. Exp. Rheumatol. 10:203-204 (1992)). Сообщалось о повышении уровня NGF у трансгенных мышей с артритом, наряду с увеличением количества тучных клеток (Aloe, et al., Int. J. Tissue Reactions-Exp. Clin. Aspects 15:139-143 (1993)).

Лечение экзогенным NGF ведет к усилению боли и болевой чувствительности. Это иллюстрируется тем обстоятельством, что инъекция NGF ведет к значительному усилению боли и болевой чувствительности и на экспериментальных моделях у животных (Amann, et al., Pain 64, 323-329 (1996); Andreev, et al., Pain 63, 109-115 (1995)) и человека (Dyck, et al., Neurology 48, 501-505 (1997); Petty, et al., Annals Neurol. 36, 244-246 (1994)). Оказывается, что NGF действует через множество механизмов, включая индукцию нейротропина BDNF (Apfel, et al., Mol. Cell. Neurosci. 7(2), 134-142 (1996); Michael, et al., J. Neurosci 17, 8476-8490 (1997)), который в свою очередь изменяет обработку болевых сигналов в спинном мозге (Hains, et al., Neurosci Lett. 320(3), 125-8 (2002); Miletic, et al., Neurosci Lett. 319(3), 137-40 (2002); Thompson, et al., Proc. Natl Acad Sci USA 96(14), 7714-8 (1999)), вызывая изменения периферических и центральных соединений сенсорных нейронов и других передающих боль нейронов в спинном мозге (Lewin, et al., European Journal of Neuroscience 6, 1903-1912 (1994); Thompson, et al., Pain 62, 219-231 (1995)), вызывая изменения роста аксонов (Lindsay, RM, J Neurosci. 8(7), 2394-405 (1998)), вызывая экспрессию рецепторов брадикинина (Peterson et al., Neuroscience 83:161-168 (1998)), вызывая изменения экспрессии генов, ответственных за активацию нервов и проведение в них, в частности, ионных каналов (Boettger, et al., Brain 125(Pt 2), 252-63 (2002); Kerr, et al., Neuroreport 12(14), 3077-8 (2001); Gould, et al., Brain Res 854(1-2), 19-29 (2000)), потенцирование связанного с болью рецептора VR1 (Chuang, et al., Nature 411 (6840), 957-62 (2001)); и вызывая патологические изменения в мышцах (Foster, et al., J. Pathol 197(2), 245-55 (2002)). Многие из указанных изменений происходят непосредственно на передающих болевое ощущение сенсорных нейронах и, очевидно, не зависят от сопутствующего воспаления. Кроме того, существуют, по меньшей мере, 2 других типа клеток, которые, как известно, реагируют на NGF и которые могут участвовать в изменениях ощущения боли или болевой чувствительности. Сообщалось, что первая из них, тучная клетка, реагирует на NGF дегрануляцией (Yan, et al., Clin. Sci. (Lond) 80:565-569 (1991)) или в других исследованиях вызывает или увеличивает продукцию или высвобождения медиатора в сотрудничестве с другими веществами (Pearce and Thompson, J. Physiol. 372:379-393 (1986), Kawamoto, et al., J. Immunol. 164:6412-6419 (2002)). Было ясно показано у крыс, что болевые реакции, опосредованные NGF, по меньшей мере, в некоторой степени опосредованы тучными клетками (Lewin, et al., Eur. J. Neurosci. 6:1903-1912 (1994), Woolf, et al., J. Neurosci. 16:2716-2723 (1996)), хотя потенциальную релевантность этого еще предстоит показать у человека. Также известно, что первичные симпатические нейроны реагируют на NGF и также участвуют в болевой сигнализации (Aley, et al., Neuroscience 71:1083-1090 (1996)). Ясно, что удаление симпатической иннервации модифицирует гиперальгезию, обычно наблюдающуюся в ответ на лечение NGF (Woolf, et al., J. Neurosci. 16:2716-2723 (1996)).

Ежегодно 23000000 пациентов подвергаются хирургическим процедурам. Боль обычно локализуется вблизи участка операции. Послеоперационная боль может иметь 2 клинически важных аспекта, а именно, боль в покое или боль, которая возникает, когда пациент не движется, и механическая боль, которая усиливается движением (кашель/чихание, вставание с постели, физиотерапия и т.д.). Большой проблемой лечения послеоперационной боли при обширных операциях является то, что используемые в настоящее время препараты имеют разнообразные выраженные побочные эффекты, которые задерживают выздоровление, удлиняют госпитализацию и подвергают определенные уязвимые группы пациентов риску тяжелых осложнений. Послеоперационная боль или боль, которая возникает после операции или травматического повреждения, представляет собой серьезную и часто трудноизлечимую медицинскую проблему.

Существуют 2 общие категории медикаментозной терапии для лечения боли, обе из которых имеют недостатки. Первая категория включает нестероидные противовоспалительные препараты (NSAID), которые применяются для лечения незначительной боли, но терапевтическое применение которых ограничивается нежелательными желудочно-кишечными эффектами, такими как эрозия слизистой оболочки желудка, образование пептической язвы или воспаление 12-перстной кишки и толстой кишки. NSAID также могут вызвать токсическое действие на почки при продолжительном применении. И, кроме того, как описано ниже, не очень эффективны для лечения боли, связанной с определенными состояниями, или возникающими при них, включая послеоперационную боль. Вторая категория включает морфин и родственные опиоиды, которые применяются для лечения боли от умеренной до тяжелой, но терапевтическое применение которых ограничено ввиду нежелательных эффектов, таких как седативный эффект, спутанное сознание, запор, подавление дыхания, почечная колика, толерантность к продолжительному применению и риск зависимости. Поэтому необходимы соединения, которые можно применять для лечения боли, с меньшим количеством или отсутствием побочных эффектов.

Боль часто классифицируют как «воспалительную», «нейропатическую» или «висцеральную», но данные традиционные общие обозначения имеют присущие им проблемы. Они привносят механистическую аналогию или идентичность среди всех источников боли в пределах одной из указанных очень общих категорий. Действительно, существует много различных типов воспалительной боли и источников боли, которые не являются ни воспалительными, ни нейропатическими. Кроме того, типы боли, которые имеют воспалительный компонент, и/или традиционно именуются «воспалительными», не означают, что другие физиологические аспекты не участвуют в болевом состоянии. Например, и остеоартрит, и интерстициальный цистит должны были бы быть определены по их названиям как стерильные воспалительные состояния соответственно суставов или мочевого пузыря, но ясно, что боли, связанные с указанными двумя состояниями, механистически совершенно отличны друг от друга. На это указывают различные эффекты данного типа противоболевого лекарственного лечения в отношении указанных типов боли. Большинство пациентов с остеоартритом получают хорошее облегчение боли (по меньшей мере, первоначально) при лечении NSAID. Однако лечение NSAID абсолютно неэффективно при интерстициальном цистите.

Послеоперационная боль (взаимозаменяемо именуемая болью после разреза) часто рассматривается как разновидность воспалительной боли. Хотя в послеоперационной боли может быть «воспалительный» компонент, в нее отчетливо вовлечены дополнительные механизмы. Например, во время операции или другой травмы разрезаются и рвутся и сосуды, и нервы. Это не происходит в ткани, подвергаемой только воспалению. Ясно, что перерезка нерва может вызвать продолжающуюся активность, которая воспринимается как болезненная. Кроме того, перерезка кровеносных сосудов ведет к относительной ишемии ткани, также болезненному стимулу, который не присутствует во время одного воспаления.

Различные механизмы, участвующие в хирургической или вызванной повреждением боли, по сравнению с воспалением, иллюстрируются меняющейся фармакологией и лежащими в основе анатомическими субстратами облегчения боли при двух состояниях. Yamamoto, et al. (Brian Res. 909(1-2):138-144(2001)) показали, что ингибирование спинномозговой кислотной дипептидазы, связанной с N-ацетилом-альфа (NAALADase), вызывает выраженное ослабление механической боли, которая сопровождает воспалительный стимул инъекции каррагинана. Однако в параллельных экспериментах, где NAALADase ингибировали идентичным образом после разреза, не было ослабления механической боли. Данные наблюдения демонстрируют, что биохимия или фармакология, лежащие в основе послеоперационной боли, отличаются от таковых, лежащих в основе воспалительной боли. Анатомические структуры, важные в модуляции болевого ощущения, также были исследованы при послеоперационных и других болевых состояниях (Pogatzki, et al., Anesthesiology, 96(5):1153-1160 (May (2002)). Нисходящие влияния для ствола головного мозга, конкретнее, рострального среднего отдела продолговатого мозга, являются важными медиаторами вторичной гиперальгезии при общих воспалительных, нейропатических и висцеральных болевых состояниях. При повреждении области ствола головного мозга не наблюдалось изменение какой-либо болевой реакции, измеренной после разреза. Данные результаты указывают на то, что первичная и вторичная гиперальгезия после разреза не модулируются нисходящим влиянием из RMM (рострального среднего отдела продолговатого мозга). Отсутствие вклада нисходящих содействующих влияний из RMM во вторичную гиперальгезию после разреза икроножной мышцы поддерживает утверждение о том, что вызванная разрезом боль включала механизмы, отличные от воспалительной и нейропатической боли. В дополнение к очевидным отличиям послеоперационной или вызванной травмой боли от воспалительной, висцеральной или нейропатической боли, эти результаты демонстрируют, что механизмы, участвующие в послеоперационной боли (или боли, вызванной травмой), отчетливо отличаются от других видов боли. Далее, возможность применения конкретного фармакологического (или другого) вмешательства при лечении послеоперационной боли не прогнозируема путем тестирования указанного фармакологического средства или вмешательства на моделях воспалительной, висцеральной или нейропатической боли.

Исчезновение боли в покое и сохранение боли при активности и в ответ на механические стимулы у участка раны также присутствуют у пациентов после операции (Moiniche, et al., Acta Anaesthesiol. Scand. 41:785-9 (1997)). Исследования свидетельствуют о том, что боль в покое и боль, вызываемая в результате разреза, вероятно, передается различными популяциями восходящих волокон и/или различными рецепторами. Кроме применения местных анестетиков для ингибирования этих вызванных реакций, имеется несколько препаратов, которые заметно уменьшают боль при кашле и движении после операции.

Было показано, что предварительное лечение местным анестетиком для блокировки боли во время экспериментального разреза первоначально предотвращает продолжающуюся боль и первичную механическую гиперальгезию. Боль от разреза также исчезает, когда лидокаин инъецируется после травмы. Однако по мере ослабления действия местного анестетика, первичная гиперальгезия возвращается. У пациентов инъекции местных анестетиков, произведенные перед операцией, приблизительно эквивалентны инъекциям, сделанным для уменьшения боли после операции (Moiniche, et al., Anesthesiology 96:725-41 (2002)).

Клинические экспериментальные исследования на людях-добровольцах и преклиническая модель разреза согласуются в том, что введение местного анестетика перед или после разреза приблизительно эквивалентны. Активация центральных нейронов, передающих боль, во время разреза и повышенная чувствительность не являются необходимыми для видов поведения, связанных с болью, через несколько дней. Скорее, в случае разрезов, усиленная реактивность центральных нейронов и боль требуют продолжающейся афферентной входящей импульсации от места разреза. Представляется, что после ослабления действия любого анальгезирующего лечения, проведенного перед разрезом, снова повышается чувствительность хирургической раны и генерируются болевые реакции (Pogatzki, et al., J. Neurophysiol 87:721 (2002)).

Область гиперальгезии (включая не травмированную зону), вызванную разрезами, также картировали. Вторичная гиперальгезия (гиперальгезия вне области повреждения) представляет собой показатель усиленной реактивности центральной нервной системы, т.е. центральной сенсибилизации. Было также отмечено, что область воспалительной гиперемии или красноты (возможно, в результате аксонных рефлексов), вызванная разрезом, отличалась от области гиперальгезии. В отличие от боли в покое и первичной механической гиперальгезии, большая область гиперальгезии никогда не формировалась, когда перед разрезом делали инъекцию местного анестетика. Более того, ее нельзя было устранить инъекцией местного анестетика после разреза. У пациентов после операции в некоторых случаях определенные виды лечения значительно уменьшают область гиперальгезии, но существенно не модифицируют клинические показатели послеоперационной боли (балльные оценки боли и потребление опиоидов). Было показано, что при сокращении области гиперальгезии после колэктомии не происходит существенного уменьшения острой боли, однако это связано с уменьшением количества больных, у которых развилась остаточная боль даже через 6 месяцев после колэктомии (De Kock, et al., Pain 92:373-80 (2001)).

Применение антитела против NGF для лечения хронической висцеральной боли было описано (см. публикацию РСТ №WO 01/78698). Brennan et al. сообщают о введении иммуноадгезина TrkA на крысиной модели послеоперационной боли (см. Society for Neuroscience Abstracts 24(1-2) 880 (1998)).

Все приведенные в настоящем описании ссылки, включая патентные заявки и публикации, полностью включены в качестве ссылки.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение основано на открытии, что антагонисты NGF эффективны при лечении послеоперационной боли. Лечение направлено на один или несколько аспектов послеоперационной боли, как раскрыто в настоящем описании.

В одном аспекте изобретение включает способ предотвращения или лечения послеоперационной боли (взаимозаменяемо именуемой как «боль после разреза» или «посттравматическая боль») введением антагониста фактора роста нервов (NGF). Было показано в соответствии с изобретением, что антагонисты NGF способны ингибировать или блокировать боль, возникающую в результате послеоперационной боли, включая боль вследствие операции или резаной раны, или травмы.

В другом аспекте изобретение включает способы снижения возникновения послеоперационной боли, облегчения послеоперационной боли, уменьшения послеоперационной боли и/или задержки развития или прогрессирования послеоперационной боли у индивидуума, причем указанные способы включают введение эффективного количества антагониста NGF.

В другом аспекте изобретение включает способы увеличения болевого порога у индивидуума, включающие введение эффективного количества антагониста NGF.

В другом аспекте изобретение включает способы усиления заживления травматической раны, вызванной операцией и/или травмой, у индивидуума, включающие введение эффективного количества антагониста NGF.

В некоторых вариантах реализации боль в покое подавляется, облегчается и/или предотвращается, в некоторых вариантах реализации механически вызванная боль (включая боль в результат движения) подавляется, облегчается и/или предотвращается, и в некоторых вариантах реализации термически вызванная боль подавляется, облегчается и/или предотвращается. В некоторых вариантах реализации механически вызванная боль подавляется, облегчается и/или предотвращается введением антитела против NGF. В некоторых вариантах реализации боль в покое подавляется, облегчается и/или предотвращается введением антитела против NGF. В некоторых вариантах реализации термически вызванная боль подавляется, облегчается и/или предотвращается введением антитела против NGF. В некоторых вариантах реализации аллодиния (т.е., повышенная реакция (т.е., увеличенная болевая чувствительность) на обычно не болевой стимул)) подавляется, облегчается и/или предотвращается, и/или гиперальгезия (т.е., повышенная реакция на обычно болевой или неприятный стимул) подавляется, облегчается и/или предотвращается. В еще одних вариантах реализации аллодиния и/или гиперальгезия является термической или механической (тактильной) по природе, или болью в покое. В некоторых вариантах осуществления, боль представляет собой хроническую боль. В других вариантах реализации боль связана с участком разреза, раны или травмы и/или участком, расположенным близко к участку разреза, раны и/или травмы, в нем или около него.

Антагонист NGF, подходящий для применения в способах по изобретению, представляет собой любое средство, которое может прямо или косвенно привести к сниженной биологической активности NGF. В некоторых вариантах реализации антагонист NGF (например, антитело) связывает (физически взаимодействует с) NGF, связывается с рецептором NGF (таким как рецептор trkA и/или р75) и/или уменьшает (тормозит и/или блокирует) нисходящую передачу сигналов рецептором NGF (например, ингибиторы передачи сигналов киназы). Соответственно, в некоторых вариантах реализации антагонист NGF связывает (физически взаимодействует с) NGF. В другом варианте реализации антагонист NGF связывается с рецептором NGF (таким как рецептор trkA и/или р75). В других вариантах реализации антагонист NGF уменьшает (тормозит и/или блокирует) нисходящую передачу сигналов рецептором NGF (например, ингибиторы передачи сигналов киназы). В других вариантах реализации антагонист NGF ингибирует (уменьшает) синтез и/или высвобождение NGF. В другом варианте реализации антагонист NGF представляет собой антагонист NGF, который не является иммуноадгезином TrkA (т.е., является отличным от иммуноадгезина TrkA). В другом варианте реализации антагонист NGF отличен от антитела против NGF. В другом варианте реализации антагонист NGF отличен от иммуноадгезина TrkA и отличен от антитела против NGF. В некоторых вариантах реализации антагонист NGF связывает NGF (такой как hNGF) и значительно не связывается с родственными нейротропинами, такими как NT-3, NT4/5 и/или BDNF. В некоторых вариантах реализации антагонист NGF выбран из любого одного или нескольких: антитела против NGF, антисмысловой молекулы, направленной на NGF (включая антисмысловую молекулу, направленную на нуклеиновую кислоту, кодирующую NGF), антисмысловую молекулу, направленную на рецептор NGF (такой как TrkA и/или р75) (включая антисмысловую молекулу, направленную на нуклеиновую кислоту, кодирующую рецептор NGF), соединение, ингибирующее NGF, структурный аналог NGF, доминантно-негативную мутацию рецептора TrkA и/или р75, который связывает NGF, антитело против TrkA, антитело против р75 и ингибитор киназы. В другом варианте реализации антагонист NGF представляет собой антитело против NGF. В еще одних вариантах реализации антитело против NGF является гуманизированным (таким как описанное в настоящем описании антитело Е3). В некоторых вариантах реализации антитело против NGF представляет собой антитело Е3 (как описано в настоящем описании). В других вариантах реализации антитело против NGF включает один или несколько CDR антитела Е3 (например, 1, 2, 3, 4, 5 или, в некоторых вариантах реализации, все 6 CDR из Е3). В других вариантах реализации антитело является человеческим. В еще одних вариантах реализации антитело против NGF включает аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, показанную в таблице 1 (SEQ ID NO:1), и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, показанную в таблице 2 (SEQ ID NO:2). В еще одних вариантах реализации антитело включает модифицированную константную область, такую как константная область, которая является иммунологически инертной, например, не запускает опосредованный комплементом лизис, или не стимулирует антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC). В других вариантах реализации константная область модифицирована, как описано в Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624; заявке РСТ №РСТ/GB/01441 и/или в заявке на патент Великобритании №9809951.8.

В некоторых вариантах реализации антагонист NGF связывается с NGF. В еще одних вариантах реализации антагонист NGF представляет собой антитело, которое специфически связывается с NGF (таким как человеческий NGF). В еще одних вариантах реализации антитело связывает по существу тот же эпитоп NGF, что и антитело, выбранное из любого одного или нескольких из следующих мышиных моноклональных антител: MAb 911, MAb 912 и MAb 938 (см. Hongo, et al., Hybridoma 19:215-227 (2000)). В некоторых вариантах реализации антагонист NGF связывается с рецептором trkA. Антагонист NGF может представлять собой моноклональное антитело против человеческого NGF (анти-hNGF), которое способно связываться с hNGF и эффективно ингибировать связывание hNGF с человеческим TrkA (hTrkA) и/или эффективно ингибировать активацию рецептора человеческого TrkA.

Аффинитет связывания антитела против NGF с NGF (таким как hNGF) может составлять от приблизительно 0,10 нМ до приблизительно 1,0 нМ, от приблизительно 0,10 до приблизительно 0,80 нМ, от приблизительно 0,15 до приблизительно 0,75 нМ и от приблизительно 0,18 до приблизительно 0,72 нМ. В одном варианте реализации аффинитет связывания составляет приблизительно от 2 пМ до 22 пМ. В некоторых вариантах реализации, аффинитет связывания составляет приблизительно 10 нМ. В других вариантах реализации аффинитет связывания составляет менее, чем приблизительно 10 нМ. В других вариантах реализации аффинитет связывания составляет приблизительно 0,1 нМ или приблизительно 0,07 нМ. В других вариантах реализации аффинитет связывания составляет менее, чем приблизительно 0,1 нМ или менее, чем приблизительно 0,07 нМ. В других вариантах реализации аффинитет связывания принимает любые значения, меньшие, чем приблизительно из следующих: 100 нМ, приблизительно 50 нМ, приблизительно 10 нМ, приблизительно 1 нМ, приблизительно 500 пМ, приблизительно 100 пМ, или от приблизительно 50 пМ до любых из: приблизительно 2 пМ, приблизительно 5 пМ, приблизительно 10 пМ, приблизительно 15 пМ, приблизительно 20 пМ, или приблизительно 40 пМ. В некоторых вариантах реализации аффинитет связывания принимает любое значение из приблизительно 100 нМ, приблизительно 50 нМ, приблизительно 10 нМ, приблизительно 1 нМ, приблизительно 500 пМ, приблизительно 100 пМ, или от приблизительно 50 пМ, или менее, чем приблизительно 50 пМ. В некоторых вариантах реализации аффинитет связывания принимает любые значения, меньшие, чем приблизительно менее, чем любой из приблизительно 100 нМ, приблизительно 50 нМ, приблизительно 10 нМ, приблизительно 1 нМ, приблизительно 500 пМ, приблизительно 100 пМ, или приблизительно 50 пМ. В других вариантах реализации аффинитет связывания составляет приблизительно 2 пМ, приблизительно 5 пМ, приблизительно 10 пМ, приблизительно 15 пМ, приблизительно 20 пМ, приблизительно 40 пМ или более, чем приблизительно 40 пМ. Как хорошо известно в данной области, аффинитет связывания можно выразить в виде K_D, или константы диссоциации, при этом возрастание аффинитета связывания соответствует уменьшению K_D. Аффинитет связывания мышиного моноклонального антитела 911 против NGF (Hongo et al., Hybridoma 19:215-227 (2000)) с человеческим NGF составляет приблизительно 10 нМ, а аффинитет связывания гуманизированного антитела Е3 против NGF (описанный здесь) с человеческим NGF составляет приблизительно 0,07 нМ.

Антагонист NGF можно ввести перед, во время и/или после операции, разреза и/или ранения, которые вызывают или связаны с послеоперационной болью. В некоторых вариантах реализации антагонист NGF вводят перед операцией, разрезом или нанесением на раны. Введение антагониста NGF можно осуществить любым путем, известным в данной области, включая: перорально, внутривенно, подкожно, внутриартериально, внутримышечно, внутрисердечно, интраспинально, интраторакально, внутрибрюшинно, интравентрикулярно, сублингвально, и/или трансдермально. В некоторых вариантах реализации антагонист NGF представляет собой антитело против NGF, а введение осуществляется одним или несколькими из следующих путей: внутривенно, подкожно, посредством ингаляции, внутриартериально, внутримышечно, внутрисердечно, интравентрикулярно и внутрибрюшинно. Введение может быть системным, например, внутривенно, или локализованным.

В некоторых вариантах реализации антагонист NGF вводят в дозе приблизительно от 0,1 до 10 мг/кг массы тела, а в других вариантах реализации антагонист NGF вводят в дозе приблизительно от 0,3 до 2,0 мг/кг массы тела.

В другом аспекте изобретение предоставляет композицию для лечения и/или предотвращения послеоперационной боли, содержащую эффективное количество антагониста фактора роста нервов (NGF) в комбинации с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми эксципиентами. В некоторых вариантах реализации антагонист NGF представляет собой антитело, которое специфически связывается с молекулой NGF. В другом варианте реализации антагонист NGF представляет собой любой антагонист, упомянутый в настоящем описании.

В другом аспекте изобретение предоставляет набор для использования в любом из описанных здесь способах. В некоторых вариантах реализации набор содержит любой из описанных в настоящем описании антагонистов NGF в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем. В другом варианте реализации набор дополнительно содержит инструкции по применению антагониста NGF в любом из описанных в настоящем описании способов.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1 представляет собой график, отражающий оценку кумулятивной боли в покое, по данным за 24 ч до операции («исходный уровень»), через 2 ч после операции («после операции») и через 1 и 2 дня после операции. «Контроль» относится к лечению антителом против NGF, а «911» относится к животным, получавшим лечение антителом 911 против NGF в дозе 35 мг/мг (также именуемым "MAb 911") (Hongo et al., Hybridoma 19:215-227 (2000)). Лечение антителом против NGF значительно уменьшало послеоперационную боль в покое.

Фиг.2 представляет собой график, отражающий оценку термической боли (гиперальгезии) по данным за 24 ч до операции («исходный уровень»), через 4 ч после операции («после операции») и через 1 и 2 дня после операции. «Контроль» относится к лечению антителом против NGF, а «911» относится к животным, получавшим лечение антителом 911 против NGF в дозе 35 мг/мг. Лечение антителом против NGF значительно уменьшало послеоперационную термическую гиперальгезию.

Фиг.3 представляет собой график, отражающий оценку механической боли (гиперальгезии) в ответ на механическую стимуляцию, по данным за 24 ч до операции («исходный уровень»), через 3 ч после операции («после операции») и через 1, 2 и 3 дня после операции. «Контроль» относится к лечению антителом против NGF, а «911» относится к животным, получавшим лечение антителом 911 против NGF. Лечение антителом против NGF в дозе 7 мг/мг уменьшало механически вызванную послеоперационную боль.

Фиг.4 представляет собой график, отражающий оценку боли в покое, по данным через 24 ч после операции, и показывающий, что лечение гуманизированным антителом Е3 против NGF в дозе 0,02 мг/мг, 0,1 мг/кг, 0,6 мг/кг или 1 мг/кг уменьшало боль. «*» указывает на статистически значимое отличие (p<0,5) от отрицательного контроля.

Фиг.5 представляет собой график, отражающий оценку боли в покое, по данным через 24 ч после операции, и показывающий, что лечение гуманизированным антителом Е3 против NGF в дозе 0,5 мг/кг значимо (p<0,005) уменьшало боль в покое при инъекции через 2 ч после операции.

Фиг.6 представляет собой график, отражающий оценку боли в покое, по данным через 24 ч после операции, и показывающий, что лечение антителом 911 против NGF в дозе 5 мг/кг значимо (p<0,02) уменьшало боль в покое при инъекции за 14 дней до операции.

Фиг.7 представляет собой график, отражающий оценку боли в покое, по данным через 24 ч после операции, и показывающий, что лечение антителом 911 против NGF в дозе 5 мг/кг уменьшало боль в покое при инъекции за 21 день до операции.

Фиг.8 представляет собой график, отражающий оценку участков интактных ран, после разреза и лечения солевым раствором, антителом 911 против NGF в дозе 1 мг/кг или положительным контролем-кеторолаком. Участки интактных ран после лечения антителом 911 против NGF не отличались от участков интактных ран после лечения солевым раствором (отрицательный контроль). Таким образом, лечение антителом 911 против NGF не проявляло воздействия на заживление ран. Напротив, у животных, получавших лечение NSAID кеторолаком (положительный контроль), проявилось значительное уменьшение участков интактных ран.

Фиг.9 представляет собой график, демонстрирующий, что лечение низкомолекулярным антагонистом NGF, K252a, значимо (p<0,005) уменьшало боль в покое после операции при оценке через 3 ч ("3H-P-tmt") после лечения К252а. "1H-P-tmt" относится к 1 ч после лечения К252а.

Фиг.10 представляет собой график, отражающий сравнение лечения антителом 911 против NGF и лечения подобранным по изотипу контрольным антителом. У животных, получавших лечение 1 мг/кг антитела против NGF (911), проявилось значимое уменьшение боли в покое (p<0,05). Напротив, у животных, получавших лечение 1 мг/кг подобранного по изотипу контрольного антитела к вызывающему амнезию белку дрозофилы, проявлялись нормальные уровни боли в покое. Данный эксперимент продемонстрировал, что обезболивающий эффект антитела против NGF был специфичным.

ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение основано на выявлении того факта, что введение in vivo терапевтически эффективного количества антагониста NGF, такого как моноклональное антитело против NGF можно использовать для предотвращения и/или лечения послеоперационной боли. Ранее послеоперационную боль лечили высокими дозами опиоидных анальгетиков. Эти средства вызывают нежелательные побочные эффекты, такие как сниженная моторика желудка, седативный эффект, подавление дыхания и почечная колика. Другие обезболивающие средства, такие как NSAID, были относительно неэффективны при лечении этого типа боли. Кроме того, известно, что некоторые NSAID ингибируют заживление ран.

Изобретение включает способы предотвращения или лечения послеоперационной боли у индивидуума (включая млекопитающее, как человека, так и не человека) введением эффективного количества антагониста NGF, такого как антитело против NGF, например, моноклонального антитела против человеческого NGF (анти-hNGF).

В другом аспекте изобретение предоставляет способы облегчения, задержки развития и/или предотвращения прогрессирования послеоперационной боли, включающие введение эффективного количества антагониста NGF индивидууму.

В некоторых вариантах реализации боль в покое подавляется, облегчается и/или предотвращается, а в некоторых вариантах реализации механически вызванная боль (такая как боль в результате движения или другой механической или тактильной стимуляции) подавляется, облегчается и/или предотвращается. В некоторых вариантах реализации термически вызванная боль подавляется, облегчается и/или предотвращается. В некоторых вариантах реализации механически вызванная боль подавляется, облегчается и/или предотвращается введением антитела против NGF. В некоторых вариантах реализации боль в покое подавляется, облегчается и/или предотвращается введением антитела против NGF. В некоторых вариантах реализации термически вызванная боль подавляется, облегчается и/или предотвращается введением антитела против NGF. В некоторых вариантах реализации аллодиния подавляется, облегчается и/или предотвращается, а в некоторых вариантах реализации гиперальгезия подавляется, облегчается и/или предотвращается. В еще одних вариантах реализации аллодиния и/или гиперальгезия является термической или механической (тактильной) по природе, или болью в покое. В некоторых вариантах реализации боль представляет собой хроническую боль. В других вариантах реализации боль связана с участком разреза, раны или травмы и/или участком, расположенным близко к участку разреза, раны и/или травмы, в нем или около него.

Изобретение также включает композиции и наборы для лечения послеоперационной боли, содержащие антагонист NGF, такой как антитело против NGF, например, моноклональное антитело против NGF, для применения в любом из способов, представленных в настоящем описании. В некоторых вариантах реализации антитело против NGF способно эффективно ингибировать связывание NGF с его рецепторами TrkA и/или р75 и/или эффективно ингибировать активацию NGF его рецепторов TrkA и/или р75.

Общие методики

При отсутствии других указаний, в практике настоящего изобретения будут использоваться обычные методики молекулярной биологии (включая рекомбинантные методики), микробиологии, клеточной биологии, биохимии и иммунологии, которые находятся в пределах данной области. Такие методики полностью объясняются в литературе, например Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook, et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction (Mullis, et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995).

Определения

«Антитело» (взаимозаменяемо используемое во множественной форме) представляет собой молекулу иммуноглобулина, способную специфически связываться с мишенью, такой как углеводород, полинуклеотид, липид, полипептид и т.д., посредством, по меньшей мере, одного сайта распознавания антигена, расположенного в вариабельной области молекулы иммуноглобулина. Используемый в настоящем описании термин охватывает не только интактные или моноклональные антитела, но также их фрагменты (такие как Fab, Fab', F(ab')2, Fv), одиночную цепь (ScFv), их мутанты, слитые белки, включающие часть антитела, гуманизированные антитела, химерные антитела, диатела, линейные антитела, одноцепочечные антитела, мультиспецифичные антитела (например, биспецифичные антитела) и любую другую модифицированную конфигурацию молекулы иммуноглобулина, которая включает сайт распознавания антигена требуемой специфичности. Антитело включает антитело любого класса, такого как IgG, IgA или IgM (или их подкласса), кроме того, антитело может не принадлежать к какому-либо определенному классу. В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена их тяжелых цепей, иммуноглобулины могут быть отнесены к различным классам. Существуют 5 основных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и несколько из них можно, кроме того, разделить на подклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. Константные домены тяжелой цепи, которые соответствуют различным классам иммуноглобулинов, называются соответственно альфа, дельта, эпсилон, гамма и мю. Структуры субъединиц и трехмерные конфигурации различных классов иммуноглобулинов хорошо известны.

«Моноклональное антитело» относится к однородной популяции антител, в которой моноклональное антитело состоит из аминокислот (встречающихся или не встречающихся в естественных условиях), которые участвуют в избирательном связывании антигена. Популяция моноклональных антител высоко специфична, будучи направлена против единственного антигенного сайта. Термин «моноклональное антитело» охватывает не только интактные моноклональные антитела и моноклональные антитела полной длины, но также их фрагменты (такие как Fab, Fab', F(ab')2, Fv), одиночную цепь (ScFv), их мутанты, слитые белки, включающие часть антитела, гуманизированные моноклональные антитела, химерные моноклональные антитела и любую другую модифицированную конфигурацию молекулы иммуноглобулина, которая включает сайт распознавания антигена требуемой специфичности и способна связываться с антигеном. Не предполагается каких-либо ограничений в отношении источника антитела или способа, которым оно изготовлено (например, гибридомой, фаговым отбором, рекомбинантной экспрессией, трансгенными животными и т.д.).

«Гуманизированные» антитела относятся к молекуле, имеющей антиген-связывающий сайт, которая по существу получена из иммуноглобулина от представителей видов, отличных от человека, при этом остальная иммуноглобулиновая структура молекулы основана на структуре и/или последовательности человеческого иммуноглобулина. Сайт связывания антигена может включать или полные вариабельные домены, слитые в константные домены, или только определяющие комплементарность области (CDR), пересаженные в соответствующие каркасные области в вариабельных доменах. Сайты, связывающие антиген, могут быть дикого типа или модифицированы замещениями одной или нескольких аминокислот, например, модифицированы для более близкого соответствия человеческому иммуноглобулину. Некоторые формы гуманизированных антител сохраняют все последовательности CDR (например, гуманизированное мышиное антитело, которое содержит все 6 CDR из мышиных антител). Другие формы гуманизированных антител имеют один или несколько CDR (1, 2, 3, 4, 5, 6), которые изменены относительно первоначального антитела. В некоторых случаях, остатки каркасной области (FR) или другие остатки человеческого иммуноглобулина замещены соответствующими не человеческими остатками. Кроме того, гуманизированные антитела могут включать остатки, которые не обнаруживаются в реципиентом антителе или в донорском антителе.

Используемый в настоящем описании термин «фактор роста нервов» и «NGF» относится к фактору роста нервов и его вариантам, которые сохраняют, по меньшей мере, часть активности NGF. Используемый в настоящем описании термин «NGF» включает нативную последовательность NGF любых видов млекопитающих, включая человека, собаку, кошку, лошадь или корову.

Термин «рецептор NGF» относится к полипептиду, который связывается или активируется NGF. Рецепторы NGF включают рецептор TrkA и рецептор р75 любого вида млекопитающих, включая, но не ограничиваясь, человека, собаку, кошку, лошадь или корову.

Термин «антагонист NGF» относится к любой молекуле, которая блокирует, подавляет или уменьшает (включая значительно) биологическую активность NGF, включая нисходящие пути передачи сигналов, опосредованные NGF, такие как связывание с рецепторами, и/или вызванная клеточная реакция на NGF. Термин «антагонист» подразумевает отсутствие какого-либо специфического механизма биологического действия, и считается, что он определенно включает и охватывает все возможные фармакологические, физиологические и биохимические взаимодействия с NGF, прямые или косвенные, или взаимодействие с NGF, его рецептором или посредством другого механизма, и его последствия, которые можно достичь использованием различных и химически разнообразных композиций. Иллюстративные антагонисты NGF включают, но не ограничиваются ими, антитело против NGF, антисмысловую молекулу, направленную на NGF (включая антисмысловую молекулу, направленную на нуклеиновую кислоту, кодирующую NGF), соединение, ингибирующее NGF, структурный аналог NGF, доминантно-отрицательную мутацию рецептора TrkA, который связывает NGF, иммуноадгезин TrkA, антитело против TrkA, антитело против р-75 и ингибитор киназы. В целях настоящего изобретения следует ясно понимать, что термин «антагонист» охватывает все ранее идентифицированные термины, названия и функциональные состояния и характеристики, посредством которых сам NGF, биологическая активность NGF (включая, но не ограничиваясь, его способность опосредовать любой аспект боли), или последствия проявления его биологической активности, по существу сводятся к нулю, уменьшаются или нейтрализуются в любой значительной степени. В некоторых вариантах реализации антагонист NGF (например, антитело) связывает (физически взаимодействует с) NGF, связывается с рецептором NGF (таким как рецептор TrkA, и/или рецептор р-75), снижает (тормозит и/или блокирует) нисходящую передачу сигналов рецептора NGF, и/или ингибирует (снижает) синтез, продукцию и высвобождение NGF. В другом варианте реализации антагонист NGF связывает NGF и предотвращает димеризацию рецептора TrkA и/или автофосфорилирование TrkA. В других вариантах реализации антагонист NGF ингибирует или снижает синтез и/или продукцию (высвобождение) NGF. Примеры типов антагонистов NGF предоставлены в настоящем описании.

Используемый в настоящем описании термин «антитело против NGF» относится к антителу, которое способно связываться с NGF, и ингибировать биологическую активность NGF и/или нисходящий путь (пути), опосредованные передачей сигналов NGF.

«Иммуноадгезин TrkA» относится к растворимой химерной молекуле, включающей фрагмент рецептора TrkA, например, внеклеточный домен рецептора TrkA и последовательность иммуноглобулина, которая сохраняет специфичность связывания рецептора TrkA.

«Биологическая активность» NGF в целом относится к способности связывать рецепторы NGF и/или активировать пути передачи сигналов рецепторов NGF. Без ограничения, биологическая активность включает любую из следующих: способность связывать рецепторы NGF (такие как р75 и/или TrkA); способность содействовать димеризации и/или автофосфорилированию рецептора TrkA; способность активировать пути передачи сигналов рецепторов NGF; способность содействовать дифференцировке, пролиферации, выживанию, росту клеток и другим изменениям клеточной физиологии, включая (в случае нейронов, включая периферические и центральные нейроны) изменение морфологии нейронов, синаптогенез, синаптическую функцию, высвобождение нейромедиаторов и/или нейропептидов и регенерацию после повреждения; и способность опосредовать послеоперационную боль.

Термин «эпитоп» используется для обозначения сайтов связывания (моноклональных или поликлональных) антител на белковых антигенах.

Используемый в настоящем описании термин «лечение» представляет собой подход для получения благоприятного или желательного клинического результата. В целях настоящего изобретения благоприятные или желательные клинические результаты включают, но не ограничиваются, одним или несколькими из следующих: уменьшение или облегчение любого аспекта боли, в частности, уменьшение тяжести, облегчение одного или нескольких симптомов, связанных с послеоперационной болью, включая любой аспект послеоперационной боли (например, укорочение длительности боли, и/или уменьшение болевой чувствительности и/или болевых ощущений).

«Эффективное количество» представляет собой количество, достаточное для достижения благоприятных или желательных клинических результатов, включая облегчение или уменьшение боли. В целях настоящего изобретения эффективное количество антагониста NGF представляет собой количество, достаточное для лечения, облегчения, уменьшения интенсивности или предотвращения послеоперационной боли. В некоторых вариантах реализации «эффективное количество» может уменьшить боль в покое (боль в спокойном состоянии) или механически вызванную боль (включая боль после движения или оба вида боли), и его можно вводить перед, во время и/или после надреза разреза, разрыва или травмы. В некоторых вариантах реализации «эффективное количество» представляет собой количество, достаточное для задержки развития послеоперационной боли.

«Снижение возникновения» боли означает любое уменьшение силы (которое может включать снижение потребности и/или количества (например, подверженность воздействию) других препаратов и/или видов лечения, в целом используемых по поводу данного состояния, включая, например, опиаты), длительности и/или частоты (включая, например, задержку или увеличение времени до возникновения послеоперационной боли у индивидуума). Как понятно специалистам в данной области, индивидуумы могут варьироваться с точки зрения их реакции на лечение, и поэтому, по существу, например, «способ снижения частоты послеоперационной боли у индивидуума» отражает введение описанного в настоящем описании антагониста NGF на основании обоснованного ожидания, что такое введение может, вероятно, вызвать такое снижение частоты у данного конкретного индивидуума.

«Облегчение» послеоперационной боли или одного или нескольких симптомов послеоперационной боли означает уменьшение или ослабление одного или нескольких симптомов послеоперационной боли, по сравнению с ситуацией без введения антагониста NGF. «Облегчение» также включает укорочение или уменьшение продолжительности симптома.

«Ослабление» послеоперационной боли или одного или нескольких симптомов послеоперационной боли означает уменьшение степени одного или нескольких нежелательных клинических проявлений послеоперационной боли у индивидуума или популяции индивидуумов, получающих лечение антагонистом NGF в соответствии с изобретением.

Используемый в настоящем описании термин «задержка» развития послеоперационной боли означает откладывать, препятствовать, замедлять, задерживать, стабилизировать и/или отсрочить прогрессирование послеоперационной боли. Данная задержка может иметь различную продолжительность во времени, в зависимости от анамнеза заболевания и/или индивидуумов, подвергаемых лечению. Как очевидно для специалиста в данной области, достаточная или значительная задержка может, в сущности, охватывать предотвращение в том смысле, что у индивидуума не разовьется послеоперационная боль. Способ, который «задерживает» развитие симптома, представляет собой способ, который снижает вероятность развития симптома в данных временных рамках, и/или снижает степень симптомов в данной временной рамке, по сравнению со случаями, когда способ не используется. Такие сравнения обычно основаны на клинических исследованиях с использованием статистически значимого количества индивидуумов.

«Развитие» или «прогрессирование» послеоперационной боли означает первоначальные проявления и/или последующее прогрессирование расстройства. Развитие послеоперационной боли можно выявить и оценить с использованием стандартных клинических методик, что хорошо известно в данной области. Однако развитие также относится к прогрессированию, которое может быть не выявляемым. В целях настоящего изобретения, развитие или прогрессирование относится к биологическому течению симптомов. «Развитие» включает возникновение, рецидив и начало. Используемый в настоящем описании термин «начало» или «возникновение» послеоперационной боли включает первоначальное появление и/или рецидив.

«Индивидуум» представляет собой позвоночное, предпочтительно, млекопитающее, предпочтительнее, человека. Млекопитающие включают, но не ограничиваются, сельскохозяйственных животных, спортивных животных, домашних животных, приматов, лошадей, коров, собак, кошек, мышей и крыс.

«Послеоперационная боль» (взаимозаменяемо именуемая «болью после разреза» или «посттравматической болью») относится к боли, возникающей и вызванной внешней травмой, такой как разрез, прокол, надрез, разрыв или рана тканей индивидуума (включая боль, которая возникает в результате хирургических процедур, инвазивных или неинвазивных). Используемый в настоящем описании термин «послеоперационная боль» не включает боль, которая возникает без внешней физической травмы. В некоторых вариантах реализации послеоперационная боль представляет собой внутреннюю или наружную боль, и рана, разрез, травма, разрыв или надрез могут возникнуть случайно (как при травматической ране) или умышленно (как при хирургическом разрезе). Используемый в настоящем описании термин «боль» включает восприятие боли и ощущение боли, и боль может быть оценена объективно и субъективно, с использованием балльных оценок боли и других способов, хорошо известных в данной области. Используемый в настоящем описании термин «послеоперационная боль» включает аллодинию (т.е., повышенную реакцию на обычно не болевой стимул) и гиперальгезию (т.е., повышенную реакцию на обычно болевой или неприятный стимул), который может быть, в свою очередь, тепловым или механическим (тактильным) по природе. В некоторых вариантах реализации боль характеризуется тепловой чувствительностью, механической чувствительностью и/или болью в покое. В некоторых вариантах реализации послеоперационная боль включает механически вызванную боль или боль в покое. В других вариантах реализации послеоперационная боль включает боль в покое. Боль может представлять собой первичную или вторичную боль, как хорошо известно в данной области.

«Боль в покое» относится к боли, возникающей в то время как индивидуум находится в покое, в отличие, например, от боли, возникающей, когда индивидуум двигается или подвергается другим механическим стимулам (например, толчкам или тычкам).

«Механически вызванная боль» (взаимозаменяемо именуемая механосенсорной болью) относится к боли, вызванной механическим стимулом, таким как приложение массы к поверхности, тактильный стимул и стимуляция, вызванная или связанная с движением (включая кашель, смещение веса и т.д.).

Восстановление после операции, травмы или раны «усиливается», когда аспект восстановления после операции, травмы или раны улучшается (по сравнению с восстановлением после операции, травмы или раны без введения антагониста NGF). Например, присутствие и/или интенсивность нежелательных побочных эффектов (таких как побочные эффекты, связанные с применением обычных обезболивающих средств (например, опиоидов) может быть уменьшено и/или устранено в присутствии антагониста NGF относительно присутствия и/или интенсивности таких побочных эффектов в отсутствие антагониста NGF. На это усиление указывает введение антагониста NGF, и оно не должно означать, что такое сравнение (введение антагониста NGF в сравнении с отсутствием введения) должно проводиться и быть доказано в отношении любого данного индивидуума.

Способы по изобретению

В отношении всех описанных в настоящем описании способов, ссылка на антагонист NGF также включает композиции, включающие один или несколько указанных средств. Эти композиции могут, кроме того, включать подходящие эксципиенты, такие как фармацевтически приемлемые эксципиенты (носители), включая буферы, которые хорошо известны в данной области. Настоящее изобретение можно использовать отдельно или в комбинации с другими обычными способами лечения.

Способы предотвращения или лечения послеоперационной боли

Настоящее изобретение можно использовать для лечения, задержки развития и/или предотвращения послеоперационной боли у индивидуумов, включая всех млекопитающих, как человека, так и отличных от человека. Кроме того, настоящее изобретение можно использовать у индивидуумов, имеющих резаную рану тканей, разрез, прокол или разрыв, или внутренний, или наружный. Такая резаная рана может возникнуть случайно, как при травматической ране, или умышленно, как при операции.

Соответственно, в одном аспекте изобретение включает способы лечения послеоперационной боли у индивидуума, предусматривающие введение эффективного количества антагониста NGF, такого как антитело против NGF. В некоторых вариантах реализации послеоперационная боль включает одну или несколько из следующих: аллодиния, гиперальгезия, механически вызванная боль, термически вызванная боль, или боль в покое. В некоторых вариантах реализации послеоперационная боль включает механически вызванную боль и/или боли в покое. Например выявлено, что антитела против NGF облегчают оба указанных аспекта. В других вариантах реализации послеоперационная боль включает боль в покое. Боль может представлять собой первичную и/или вторичную боль. В других вариантах реализации аллодиния подавляется, облегчается и/или предотвращается, а в некоторых вариантах реализации гиперальгезия подавляется, облегчается и/или предотвращается. В еще одних вариантах реализации аллодиния и/или гиперальгезия является термической или механической (тактильной) по природе (или обоими) или болью в покое. В некоторых вариантах реализации боль представляет собой хроническую боль. В других вариантах реализации боль локализуется вблизи и/или около одного или нескольких участков разреза, раны или травмы.

В другом аспекте изобретение включает способы предотвращения, облегчения и/или предотвращения развития или прогрессирования послеоперационной боли.

В некоторых вариантах реализации антагонист NGF, такой как антитело против NGF, вводят перед операцией (в некоторых вариантах реализации, перед тем как активность, вероятно, приведет к внешней травме и/или ране). Например, антагонист NGF можно ввести за 30 мин, 1 ч, 5 ч, 10 ч, 15 ч, 24 ч или даже более, например за 1 день, несколько дней или даже за 1 нед, 2 нед, 3 нед или более перед активностью с риском травмы, раны или разреза, или перед операцией (в некоторых вариантах реализации, вероятно, приведут к травме, ране или разрезу). В других вариантах реализации антагонист NGF вводится во время и/или после операции или активности, которая, вероятно, приведет к внешней травме или ране. В одном варианте реализации антагонист NGF вводится через 1 ч, 2 ч, 3 ч, 4 ч, 6 ч, 8 ч, 12 ч, 24 ч, 30 ч, 36 ч или более после операции, раны или травмы.

В другом аспекте изобретение включает способы повышения болевого порога. Используемый здесь термин «повышение болевого порога» относится к снижению, уменьшению и/или минимизации боли, связанной с операцией, разрезом, травмой или раной (включая сниженное, уменьшенное и/или минимизированное субъективное восприятие боли).

В еще одном аспекте изобретение включает способы усиления восстановления после операции (а также усиления восстановления после раны, травматического повреждения и/или разреза).

Понятно, что хотя в настоящем описании ссылка в целом делается на лечение или предотвращение послеоперационной боли, антагонист NGF можно ввести перед явлением или состоянием (состояниями) с возросшим риском внешней травмы (такой как удар), повреждения или раны. Как понятно специалисту в данной области, явление или состояние с возросшим риском внешней травмы, повреждения или раны охватывает работу по опасным профессиям, боевые действия и/или занятия спортом.

Диагностика или оценка боли хорошо установлена в данной области. Оценку можно выполнить на основании объективного показателя, такого как наблюдение поведения, такого как реакция на стимулы, выражение лица и т.д. Оценка может также основываться на субъективных показателях, таких как характеристика боли пациентом с использованием различных шкал боли (см., например, Katz et al., Surg Clin North Am. (1999) 79(2):231-52; Caraceni et al., J. Pain Symptom Manage (2002) 23(3):239-55).

Облегчение боли может характеризоваться динамикой облегчения во времени. Соответственно, в некоторых вариантах реализации облегчение боли наблюдается субъективно или объективно через 1, 2 или несколько часов (а в некоторых вариантах реализации достигает максимума приблизительно через 12-18 ч). В другом варианте реализации облегчение боли наблюдается субъективно или объективно через 24, 36, 48, 60, 72 или более часов после операции (или явления, связанного с раной или травмой).

Антагонисты NGF

В способах по изобретению применяется антагонист NGF, который может представлять собой любую молекулу, которая блокирует, подавляет или уменьшает (включая значительно) биологическую активность NGF, включая нисходящие пути, опосредованные передачей сигналов NGF, такие как связывание рецепторов и/или вызванную клеточную реакцию на NGF. Термин «антагонист» не подразумевает никакого специфического механизма биологического действия, и он предназначен для ясного включения и охватывания всех возможных фармакологических, физиологических и биохимических взаимодействий с NGF и его последствий, которые могут достигаться разнообразными различными и химически многообразными композициями. Иллюстративные антагонисты NGF включают, но не ограничиваются, антитело против NGF, антисмысловую молекулу, направленную на NGF (включая антисмысловую молекулу, направленную на нуклеиновую кислоту, кодирующую NGF), антисмысловую молекулу, направленную на рецептор NGF (такой как рецептор Trka и/или рецептор р75) (включая антисмысловую молекулу, направленную на нуклеиновую кислоту, кодирующую Trka и/или р75), соединение, ингибирующее NGF, структурный аналог NGF, доминантно-негативную мутацию рецептора TrkA, который связывает NGF, иммуноадгезин TrkA, антитело против TrkA, антитело против р75 и ингибитор киназы. Для решения задач настоящего изобретения, следует ясно понимать, что термин «антагонист» охватывает все ранее идентифицированные термины, названия и функциональные состояния и характеристики, посредством которых сам NGF, биологическая активность NGF (включая, но не ограничиваясь, его способность опосредовать любой аспект боли), или последствия реализации биологической активности, по существу сводятся к нулю, уменьшаются или нейтрализуются в любой значительной степени. В некоторых вариантах реализации антагонист NGF (например, антитело) связывает (физически взаимодействует с) NGF, связывается с рецептором NGF (таким как рецептор TrkA и/или р75), и/или уменьшает (тормозит и/или блокирует) нисходящую передачу сигналов рецептором NGF. Соответственно, в других вариантах реализации антагонист NGF связывается (физически взаимодействует) с рецептором NGF. В другом варианте реализации антагонист NGF связывается с рецептором NGF (таким как рецептор TrkA и/или р75). В других вариантах реализации антагонист NGF уменьшает (тормозит и/или блокирует) нисходящую передачу сигналов рецептором (например, ингибиторы передачи сигналов киназы). В других вариантах реализации антагонист NGF ингибирует (снижает) синтез и/или высвобождение NGF. В другом варианте реализации антагонист NGF представляет собой антагонист NGF, который не является иммуноадгезином TrkA (т.е., отличается от иммуноадгезина TrkA). В другом варианте реализации антагонист NGF отличается от антитела против NGF. В другом варианте реализации антагонист NGF отличается от иммуноадгезина TrkA и отличается от антитела против NGF. В некоторых вариантах реализации антагонист NGF связывает NGF (такой как hNGF) и значимо не связывается с родственными нейротропинами, такими как NT-3, NT4/5 и/или BDNF. В некоторых вариантах реализации антагонист NGF не связан с побочной иммунной реакцией. В других вариантах реализации антагонист NGF представляет собой антитело против NGF. В еще одних вариантах реализации антитело против NGF гуманизировано (такое как описанное в настоящем описании антитело Е3). В некоторых вариантах реализации антитело против NGF представляет собой антитело Е3 (как описано здесь). В других вариантах реализации антитело против NGF включает один или несколько CDR антитела Е3 (например, 1, 2, 3, 4, 5 или, в некоторых вариантах реализации, все 6 CDR из Е3). В других вариантах реализации антитело является человеческим. В еще одних вариантах реализации антитело против NGF включает аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, показанную в таблице 1 (SEQ ID NO:1), и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, показанную в таблице 2 (SEQ ID NO:2). В еще одних вариантах реализации антитело включает модифицированную константную область, такую как константная область, которая является иммунологически инертной, например, не запускает опосредованный комплементом лизис, или не стимулирует антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC). В других вариантах реализации константная область модифицирована, как описано в Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624; заявке РСТ №РСТ/GB99/01441 и/или в заявке на патент Великобритании №9809951.8.

Антитела против NGF

В некоторых вариантах реализации изобретения антагонист NGF включает антитело против NGF. Антитело против NGF должно проявлять любую одну или несколько из следующих характеристик: (а) связывание с NGF; (b) ингибирование биологической активности NGF или нисходящих путей, опосредованных функцией передачи сигналов NGF; (с) предотвращение, облегчение или лечение или любого аспекта послеоперационной боли; (d) блокирование или уменьшение активации рецепторов NGF (включая димеризацию и/или автофосфорилирование рецептора TrkA); (е) увеличение выведения NGF; (f) ингибирование (снижение) синтеза, продукции или высвобождения NGF; (g) усиление восстановления после операции, раны или травмы.

Антитела против NGF известны в данной области (см., например, публикации РСТ №№WO 01/78698, WO 01/64247, патенты США №№5844092, 5877016 и 6153189; Hongo et al., Hybridoma, 19:215-227 (2000); Cell. Molec. Biol. 13:559-568 (1993); GenBank Accession Nos. U39608, U39609, L17078 или L17077).

В некоторых вариантах реализации антитело против NGF представляет собой гуманизированное мышиное моноклональное антитело против NGF, названное антителом «Е3», которое включает константную область тяжелой цепи человеческого IgG2a, содержащую следующие мутации: от А330Р331 до S330S331 (нумерация аминокислот со ссылкой на последовательность IgG2a дикого типа; см. Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624); константную область человеческой легкой цепи каппа и вариабельные области тяжелой и легкой цепи, показанные в таблицах 1 и 2.

Таблица 1: Вариабельная область тяжелой цепи

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLIGYDLNWIRQPPG KGLEWIGIIWGDGTTDYNSAVKSRVTISKDTSKNQFSLKLSSVTAADTAV YYCARGGYWYATSYYFDYWGQGTLVTVS (SEQ ID NO:1).

Таблица 2: Вариабельная область легкой цепи

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNNLNWYQQKPG KAPKLLIYYTSRFHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQEHT LPYTFGQGTKLEIKRT (SEQ ID NO:2).

Следующие полинуклеотиды, кодирующие вариабельную область тяжелой цепи или вариабельную область легкой цепи, были депонированы в АТСС (Американскую коллекцию типовых культур) 8 января 2003 г.:

Материал		№ доступа АТСС	Дата депонирования
Вектор Eb.911.3E	Вариабельная область легкой цепи Е3	РТА-4893	8 января 2003 г
Вектор Eb.pur.911.3E	Вариабельная область легкой цепи Е3	РТА-4894	8 января 2003 г
Вектор Db.911.3E	Вариабельная область тяжелой цепи Е3	РТА-4895	8 января 2003 г

Вектор Eb.911.3E представляет собой полинуклеотид, кодирующий вариабельную область легкой цепи, показанную в таблице 2; вектор Eb.pur.911.3E представляет собой полинуклеотид, кодирующий вариабельную область легкой цепи, показанную в таблице 2, и вектор Db.911.3E представляет собой полинуклеотид, кодирующий вариабельную область тяжелой цепи, показанную в таблице 1.

В другом варианте реализации антитело против NGF включает один или несколько CDR антитела Е3 (например, 1, 2, 3, 4, 5 или, в некоторых вариантах реализации, все 6 CDR из Е3). Определение областей CDR вполне в компетенции специалистов в данной области.

Антитела, которые можно использовать в настоящем изобретении, могут охватывать моноклональные антитела, поликлональные антитела, фрагменты антител (например, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc и т.д.), химерные антитела, биспецифичные антитела, гетероконъюгированные антитела, одиночную цепь (ScFv), их мутанты, слитые белки, включающие часть антитела, гуманизированные антитела и любую другую модифицированную конфигурацию молекулы иммуноглобулина, которая включает сайт распознавания антигена требуемой специфичности, включая варианты гликозилированных антител, варианты аминокислотной последовательности антител и ковалентно модифицированные антитела. Антитела могут быть мышиного, крысиного, человеческого или любого другого происхождения (включая химерные или гуманизированные антитела). В целях настоящего изобретения, антитело взаимодействует с NGF таким образом, который ингибирует NGF и/или нисходящие пути, опосредованные функцией передачи сигналов NGF. В одном варианте реализации антитело представляет собой человеческое антитело, которое распознает один или несколько эпитопов на человеческом NGF. В другом варианте реализации антитело представляет собой мышиное или крысиное антитело, которое распознает один или несколько эпитопов на человеческом NGF. В другом варианте реализации антитело распознает один или несколько эпитопов на NGF, выбранном из группы, состоящей из: NGF приматов, собак, кошек, лошадей и коров. В других вариантах реализации антитело включает модифицированную константную область, такую как константная область, которая иммунологически инертна, например, не запускает опосредованный комплементом лизис, или не стимулирует антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC). Активность ADCC можно оценить с использованием способов, раскрытых в патенте США №5500362. В других вариантах реализации константная область модифицирована, как описано в Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624; заявке РСТ №РСТ/GB99/01441 и/или в заявке на патент Великобритании №9809951.8.

Аффинитет связывания антитела против NGF с NGF (таким как hNGF) может составлять от приблизительно 0,10 нМ до приблизительно 0,80 нМ, от приблизительно 0,15 до приблизительно 0,75 нМ и от приблизительно 0,18 до приблизительно 0,72 нМ. В одном варианте реализации аффинитет связывания составляет приблизительно от 2 пМ до 22 пМ. В некоторых вариантах реализации аффинитет связывания составляет приблизительно 10 нМ. В других вариантах реализации аффинитет связывания составляет менее, чем приблизительно 10 нМ. В других вариантах реализации аффинитет связывания составляет приблизительно 0,1 нМ или приблизительно 0,07 нМ. В других вариантах реализации аффинитет связывания составляет менее, чем приблизительно 0,1 нМ или менее, чем приблизительно 0,07 нМ. В других вариантах реализации аффинитет связывания принимает любое значение из приблизительно 100 нМ, приблизительно 50 нМ, приблизительно 10 нМ, приблизительно 1 нМ, приблизительно 500 пМ, приблизительно 100 пМ, или от приблизительно 50 пМ до любого из приблизительно 2 пМ, приблизительно 5 пМ, приблизительно 10 пМ, приблизительно 15 пМ, приблизительно 20 пМ, или приблизительно 40 пМ. В некоторых вариантах реализации аффинитет связывания принимает любое значение из приблизительно 100 нМ, приблизительно 50 нМ, приблизительно 10 нМ, приблизительно 1 нМ, приблизительно 500 пМ, приблизительно 100 пМ, приблизительно 50 пМ, или менее, чем приблизительно 50 пМ. В некоторых вариантах реализации аффинитет связывания принимает любое значение из менее, чем приблизительно 100 нМ, приблизительно 50 нМ, приблизительно 10 нМ, приблизительно 1 нМ, приблизительно 500 пМ, приблизительно 100 пМ, приблизительно 50 пМ. В других вариантах реализации аффинитет связывания составляет приблизительно 2 пМ, приблизительно 5 пМ, приблизительно 10 пМ, приблизительно 15 пМ, приблизительно 20 пМ, приблизительно 40 пМ, или более, чем приблизительно 40 пМ.

Одним из способов определения аффинитета связывания антител к NGF является измерение аффинитета связывания моноклональных фрагментов Fab антитела. Для получения монофункциональных фрагментов Fab антитело (например, IgG) можно расщепить папаином или экспрессировать рекомбинантно. Аффинитет фрагмента Fab антитела против NGF можно определить методом поверхностного плазменного резонанса (устройством для определения поверхностного плазменного резонанса (SPR) BIAcore3000^TM, BIAcore, INC, Piscaway NJ). Осколки СМ5 можно активировать гидрохлоридом N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS) в соответствии с инструкциями поставщика. Человеческий NGF (или любой другой NGF) можно развести в 10 мМ ацетате натрия при рН 4,0 и инжектировать поверх активированного осколка в концентрации 0,005 мг/мл. Используя изменяющееся время потока через каналы отдельных осколков, можно достичь двух диапазонов плотности антигена: 100-200 единиц реакции (RU) для детальных кинетических исследований и 500-600 RU для скрининговых анализов. Осколки можно блокировать этаноламином. Исследования регенерации показали, что смесь элюционного буфера Пирса (продукт №21004, Pierce Biotechnology, Rockford IL) и 4 М NaCl (2:1) эффективно удаляет связанный Fab, в то же самое время поддерживая активность hNGF на осколке в течение более 200 инъекций. Буфер HBS-EP (0,01M HEPES, рН 7,4, 0,15 NaCl, 3 мМ EDTA, 0,005% поверхностно-активного вещества Р29) используют в качестве рабочего буфера для анализов BIAcore. Серийные разведения (по определению, K_D составляет разведение в 0,1-10 раз) образцов очищенного Fab инъецируют в течение 1 мин при скорости 100 мкл/мин, и допустимы периоды времени диссоциации до 2 ч. Величины концентрации белков Fab определяют ELISA и/или электрофорезом SDS-PAGE с использованием Fab известной концентрации (по данным определения аминокислотным анализом) в качестве стандарта. Скорости кинетической ассоциации (k_on) и скорости диссоциации (k_off) получают одновременно подгонкой данных к модели связывания Langmuir (Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994). Methods Enzymology 6.99-100) с использованием программы оценки BIA. Величины константы равновесной диссоциации (K_D) рассчитывают как k_off/k_on. Данный протокол подходит для использования при определении аффинитета связывания антитела к NGF любого вида, включая человеческий NGF, NGF другого позвоночного (в некоторых вариантах млекопитающего) (например, мышиного NGF, крысиного NGF, NGF приматов), а также для использования с другими нейротропинами, такими как родственные нейротропины NT3, NT4/5 и/или BDNF.

В некоторых вариантах реализации антитело связывает человеческий NGF и специфически не связывает NGF от других видов позвоночных (в некоторых вариантах реализации млекопитающего). В некоторых вариантах реализации антитело связывает человеческий NGF, а также один или несколько NGF от других видов позвоночных (в некоторых вариантах реализации млекопитающего). В еще одних вариантах реализации антитело связывает NGF и значимо перекрестно не взаимодействует с другими нейротропинами (такими как родственные нейротропины NT3, NT4/5 и/или BDNF). В некоторых вариантах реализации антитело связывает NGF, а также, по меньшей мере, один другой нейротропин. В некоторых вариантах реализации антитело связывается с NGF вида млекопитающего, такого как лошадь или собака, но значимо не связывается с NGF от других видов млекопитающих.

Эпитоп(ы) могут быть непрерывными и прерывистыми. В одном варианте реализации антитело связывает по существу тот же эпитоп hNGF, что и антитело, выбранное из группы, состоящей из MAb 911, Mab 912 и MAb 938, как описано в публикации Hongo et al., Hybridoma, 19:215-227 (2000). В другом варианте реализации антитело связывает по существу тот же эпитоп hNGF, что и MAb 911. В еще одном варианте реализации антитело связывает по существу тот же эпитоп hNGF, что и MAb 909 (Hongo et al., выше). Например, эпитоп может включать один или несколько из: остатков К32, К34 и Е35 в пределах вариабельной области 1 (аминокислоты 23-35) hNGF; остатки F79 и Т81 в пределах вариабельной области 4 (аминокислоты 81-88) hNGF; остатки Н84 и К88 в пределах вариабельной области 4; остаток R103 между вариабельной областью 5 (аминокислоты 94-98) hNGF и С-концом (аминокислоты 111-118) hNGF; остатка Е11 в пределах превариабельной области 1 (аминокислоты 10-23) hNGF; Y52 между вариабельной областью 2 (аминокислоты 40-49) hNGF и вариабельной областью 3 (аминокислоты 59-66) hNGF; остатков L112 и S113 в пределах С-конца hNGF; остатков R59 и R69 в пределах вариабельной области 3 hNGF; или остатков V18, V20 и G23 в пределах превариабельной области 1 hNGF. Кроме того, эпитоп может включать одну или несколько из вариабельной области 1, вариабельной области 3, вариабельной области 4, вариабельной области 5, N-концевой области и/или С-конца hNGF. В еще одном варианте реализации антитело значительно уменьшает доступность для растворителя остатка R103 hNGF. Понятно, что хотя описанные выше эпитопы относятся к человеческому NGF, средний специалист в данной области может выстроить в ряд структуры человеческого NGF в соответствии с NGF других видов и идентифицировать вероятные копии указанных эпитопов.

В одном аспекте антитела (например, человеческие, гуманизированные, мышиные, химерные), которые могут ингибировать NGF, можно получить с использованием иммуногенов, которые экспрессируют полную длину или частичную последовательность NGF. В другом аспекте можно использовать иммуноген, включающий клетку, которая избыточно экспрессирует NGF. Другой пример иммуногена, который можно использовать, представляет собой белок NGF, который содержит NGF полной длины или часть белка NGF.

Антитела против NGF можно получить любым способом, известным в данной области. Путь и схема иммунизации животного-хозяина в целом соответствуют принятым и обычным методикам стимуляции и продукции антител, как описано ниже в настоящем описании. Общие методики продукции человеческих и мышиных антител известны в данной области и описаны в настоящем описании.

Предусматривается, что можно манипулировать любым млекопитающим индивидуумом, включая людей, полученные у них клетки, продуцирующие интерферон, с тем, чтобы служить в качестве основы для продукции линии клеток гибридомы млекопитающего, включая человека. Обычно животное-хозяина инокулируют внутрибрюшинно, внутримышечно, перорально, подкожно, внутриподошвенно и/или внутридермально количеством иммуногена, включая то, которое описано в настоящем описании.

Гибридомы можно получить из лимфоцитов и иммортализованных клеток миеломы с использованием общей методики гибридизации соматических клеток (Kohler, B. и Milstein, C. (1975) Nature 256:495-497), или в модификации (Buck, D. W., et al., In Vitro, 18:377-381 (1982)). Имеющиеся миеломные линии, включая, но не ограничиваясь, X63-Ag8.653 и линии из Центра распределения клеток института Солка в Сан Диего, Калифорния, США, можно использовать при гибридизации. В целом, методика включает слияние клеток миеломы и лимфоидных клеток с использованием агента, вызывающего слияние, такого как полиэтиленгликоль, или электрическим средством, хорошо известным специалистам в данной области. После слияния клетки выделяют из среды слияния и выращивают в селективной ростовой среде, такой как гипоксантин-аминоптерин-тимидиновая (НАТ) среда, для устранения негибридизированных материнских клеток. Любую из описанных в настоящем описании сред с добавкой сыворотки или без нее, можно использовать для культивирования гибридом, которые секретируют моноклональные антитела. В качестве другой альтернативы методике слияния клеток, В клетки, иммортализованные EBV (вирусом Эпштейна-Барра), можно использовать для продукции моноклональных антител против NGF обсуждаемого изобретения. При желании, гибридомы размножают и субклонируют, и надосадочные жидкости анализируют для выявления активности против иммуногена обычными процедурами иммуноанализа (например, радиоиммуноанализом, ферментным иммуноанализом или флюоресцентным иммуноанализом).

Гибридомы, которые можно использовать в качестве источника антител, охватывают все производные, клетки потомства материнских гибридом, которые продуцируют моноклональные антитела, специфичные для NGF, или их часть.

Гибридомы, которые продуцируют такие антитела, можно выращивать in vitro или in vivo с использованием известных процедур. При желании, моноклональные антитела можно выделить из культуральных сред или биологических жидкостей обычными процедурами очистки иммуноглобулина, такими как осаждение сульфатом аммония, гель-электрофорезом, диализом, хроматографией и ультрафильтрацией. Нежелательную активность, в случае ее присутствия, можно удалить, например, прогонкой препарата по адсорбенту, изготовленному из иммуногена, прикрепленного к твердой фазе, и элюированием или высвобождением желательных антител из иммуногена. Иммунизация животного-хозяина человеческим NGF или фрагментом, содержащим аминокислотную последовательность-мишень, конъюгированную с белком, который является иммуногенным у видов, подлежащих иммунизации, например, гемоцианином в виде замочной скважины-блюдечка, сывороточным альбумином, бычьим тиреоглобулином, или ингибитором трипсина соевых бобов с использованием бифункционального или дериватизированного агента, например, сложного малеимидбензоилсульфосукцинимида (конъюгация через остатки цистеина), N-гидроксисукцинимида (через остатки лизина), глутаральдегида, янтарного ангидрида, SOCl₂, или R₁N=С=NR, где R и R₁ представляют собой различные алкильные группы, может дать популяцию антител (например, моноклональных антител).

При желании, можно секвенировать интересующее антитело против NGF (моноклональное или поликлональное), и затем последовательность полинуклеотида можно клонировать в вектор для экспрессии или распространения. Последовательность, кодирующую интересующее антитело, можно сохранять в векторе в клетке-хозяине, и клетку-хозяина можно затем размножить и заморозить для будущего использования. В альтернативе полинуклеотидную последовательность можно использовать для генетической манипуляции для «гуманизации» антитела, или для улучшения сродства или других характеристик антитела. Например, константную область можно методами генной инженерии модифицировать для большего соответствия человеческим константным областям во избежание иммунного ответа, если антитело используется в клинических испытаниях и способах лечения у людей. Может быть желательно генетически манипулировать с последовательностью антитела для получения большего сродства с NGF и большей эффективности при ингибировании NGF. Специалисту в данной области должно быть очевидно, что одно или несколько изменений полинуклеотидов можно внести в антитело против NGF и все же сохранить его способность связывания с NGF.

Существуют 4 общих этапа для гуманизации моноклонального антитела. Они включают: (1) определение нуклеотида и прогнозируемой аминокислотной последовательности легкого и тяжелого вариабельных доменов исходного антитела; (2) проектирование гуманизированного антитела, т.е., решение, какую каркасную область использовать во время процесса гуманизации; (3) действительные методологии/методики гуманизации и (4) трансфекцию и экспрессию гуманизированного антитела (см., например, патенты США №№4816567, 5807715, 5866692, 6331415, 5530101, 5693761, 5693762, 5585089 и 6180370).

Был описан ряд молекул «гуманизированного» антитела, включающих сайт связывания антигена, полученный из не человеческого иммуноглобулина, включая химерные антитела, имеющие области грызунов или модифицированные области грызунов V и их связанные определяющие комплементарность области (CDR), слитые с константными человеческими доменами (см., например, Winter et al., Nature 349:293-299 (1991), Lobuglio et al., Proc, Nat. Acad. Sci. USA 86:4220-4224 (1989), Shaw et al., J. Immunol. 138:4534-4538 (1987) и Brown et al., Cancer Res. 47:3577-3583 (1987)). В других ссылках описаны CDR грызунов, пересаженные в опорную каркасную область человека (FR) перед слиянием с соответствующим константным доменом человеческого антитела (см., например, Riechmann et al. Nature 332:323-327 (1988), Verhoeyen et al. Science 239:1534-1536 (1988) и Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)). В другой ссылке описаны CDR грызунов, поддерживаемые рекомбинантно покрытыми тонким слоем каркасными областями (см., например, Европейскую патентную публикацию №519596). Данные «гуманизированные» молекулы предназначены для минимизации нежелательной иммунологической реакции в отношении молекул анти-человеческого антитела грызунов, которое ограничивает длительность и эффективность вариантов терапевтического применения указанных частей у людей-реципиентов. Например, константную область антитела можно методами генной инженерии модифицировать таким образом, что она станет иммунологически инертной (например, не запускает лизис комплемента) (см., например, заявку РСТ №PCT/GB99/01441; заявку на патент Великобритании №9809951.8). Другие способы гуманизации антител, которые можно также использовать, раскрыты в Daugherty et al., Nucl. Acids Res. 19:2471-2476 (1991) и в патентах США №№6180377, 6054297, 5997867, 5866692, 6210671 и 6350861 и в заявке РСТ №WO 01/27160.

В еще одной альтернативе полностью человеческие антитела можно получить использованием имеющихся в продаже мышей, у которых методами генной инженерии была вызвана экспрессия специфических белков человеческого иммуноглобулина. Трансгенных животных, которые предназначены для создания более желательного (например, полностью человеческие антитела) или более сильной иммунной реакции, можно также использовать для создания гуманизированных или человеческих антител. Примерами такой технологии являются Xenomouse^ТМ от Abgenix, Inc. (Fremont, CA) и HuMAb-Mouse® и TC Mouse^ТМ от Medarex, Inc. (Princeton, NJ).

В альтернативе, антитела могут быть получены рекомбинантно и экспрессированы с использованием любого способа, известного в данной области. В другой альтернативе антитела можно изготовить рекомбинантно технологией фагового отображения (см., например, патенты США №№5565332, 5580717, 5733743 и 6265150, и Winter et al., Annu. Rev. Immunol. 12:433-455 (1994)). Альтернативно, технологию фагового отображения (McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)) можно использовать для продукции человеческих антител и фрагментов антител in vitro из репертуаров гена вариабельного (V) домена иммуноглобулина от не иммунизированных доноров. В соответствии с данной методикой, гены домена V антитела клонируют внутрирамочно или в главный, или в малый ген белка оболочки нитчатого бактериофага, такого как М13 или fd, и демонстрируют в виде функциональных фрагментов антител на поверхности частицы фага. Ввиду того, что нитчатая частица содержит копию однонитевой ДНК генома фага, отборы, основанные на функциональных свойствах антитела, также приводят к отбору гена, кодирующего антитела, проявляющего указанные свойства. Таким образом, фаг имитирует некоторые из свойств В клетки. Фаговое отображение можно выполнить в различных форматах; обзоры даны, например, в Johnson, Kevin S. и Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3, 564-571 (1993). Несколько источников сегментов V гена можно использовать для фагового отображения. Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) выделили разнообразный ряд анти-оксазолоновых антител из небольшой случайной комбинаторной библиотеки V генов, полученных из селезенок иммунизированных мышей. Можно сконструировать репертуар V генов от иммунизированных людей-доноров, и антитела к ряду разнообразных антигенов (включая ауто-антигены) можно выделить, по существу следуя методикам, описанным Mark et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), или Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993). При естественном иммунном ответе гены антител накапливают мутации с высокой скоростью (соматическая гипермутация). Некоторые из введенных изменений придадут более высокий аффинитет, и В клетки, демонстрирующие поверхностный иммуноглобулин с высоким аффинитетом, предпочтительно реплицируются и дифференцируются во время последующей провокационной пробы антигеном. Данный естественный процесс можно имитировать использованием методики, известной как «цепное перемешивание» (Marks, et al., Bio/Technol. 10:779-783 (1992)). В данном способе аффинитет «первичных» человеческих антител, полученных фаговым отображением, можно улучшить последовательным замещением генов области V тяжелой и легкой цепи репертуарами естественно встречающихся вариантов (репертуаров) генов домена V, полученных у иммунизированных доноров. Данная методика обеспечивает возможность продукции антител и фрагмент антител с аффинитетом в диапазоне pM-nM. Стратегия изготовления очень больших репертуаров антитела фага (также известных как «всеобщие материнские библиотеки») была описана Waterhouse et al., Nucl. Acids Res. 21:2265-2266 (1993). Перемешивание генов можно также использовать для получения человеческих антител из антител грызунов, где человеческое антитело имеет аффинитеты и специфичности, аналогичные исходному антителу грызунов. В соответствии с данным способом, который также именуется «эпитопным импринтингом», ген домена V тяжелой и легкой цепи антител грызунов, полученный методикой фагового отображения, замещают репертуаром генов человеческого домена V, создавая химеры грызуна-человека. Выбор антигена приводит к выделению человеческих вариабельных областей, способных восстановить сайт, связывающий функциональный антиген, т.е., эпитоп управляет (впечатывает) выбором партнера. Когда процесс повторяется для замещения остающегося домена V грызунов, получают человеческое антитело (см. патентную заявку РСТ WO 93/06213, опубликованную 1 апреля 1993 г.). В отличие от традиционной гуманизации антител грызунов трансплантацией CDR, данная методика обеспечивает полностью человеческие антитела, которые не имеют каркаса или остатков CDR, происходящих от грызунов.

Очевидно, что хотя приведенное выше обсуждение относится к гуманизированным антителам, обсужденные общие принципы применимы к изготовлению в соответствии с требованиями антител для использования, например, у собак, кошек, приматов, лошадей и коров. Кроме того, очевидно, что один или более аспектов описанной в настоящем описании гуманизации антитела можно комбинировать, например, пересадкой CDR, мутацией каркаса и мутацией CDR.

Антитела можно изготовить рекомбинантно сначала выделением антител и клеток, продуцирующих антитела, из животного-хозяина, получением последовательности гена и использования последовательности гена для рекомбинантной экспрессии антитела в клетках-хозяевах (например, клетках СНО). Другой способ, который можно использовать для экспрессии последовательности антител у растений (например, табака) или трансгенного молока. Были раскрыты способы рекомбинантной экспрессии антител в растениях или молоке (см., например, Peeters, et al., Vaccine 19:2756 (2001); Lonberg, N. и D. Huszar Int. Rev. Immunol 13:65 (1995) и Pollock, et al., J. Immunol. Methods 231:147 (1999)). Способы изготовления производных антител, например, гуманизированных, одноцепочечных и т.д. известны в данной области.

Иммуноанализы и проточно-цитометрические методики разделения клеток, такие как флюоресцентный метод разделения клеток лимфоцитов (FACS), можно также использовать для выделения антител, которые специфичны для NGF.

Антитела могут быть связаны со многими различными носителями. Носители могут быть активными и/или инертными. Примеры хорошо известных носителей включают полипропилен, полистирол, полиэтилен, декстран, нейлон, амилазы, стекло, естественные и модифицированные целлюлозы, полиакриламиды, агарозы и магнетит. Природа носителя может быть или растворимой или нерастворимой в целях изобретения. Специалистам в данной области будут известны другие подходящие носители для связывания антител, или они смогут установить их, используя обычное экспериментирование.

ДНК, кодирующую моноклональные антитела, можно легко выделить и секвенировать с использованием обычных процедур (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, которые способны специфически связываться с генами, кодирующими тяжелую и легкую цепи моноклональных антител). Клетки гибридомы служат в качестве предпочтительного источника такой ДНК. После выделения ДНК можно поместить в экспрессирующие векторы (такие как экспрессирующие векторы, раскрытые в публикации РСТ WO 87/04462), которые затем трансфицируют в клетку-хозяина, такую как клетки E.coli, обезьяньи клетки COS, клетки яичников китайского хомячка (СНО) или клетки миеломы, которые иначе не продуцируют белок иммуноглобулина, для получения синтеза моноклональных антител в рекомбинантных клетках-хозяевах (см., например, публикацию РСТ WO 87/04462). ДНК можно также модифицировать, например, замещением кодирующей последовательности константных доменов тяжелой и легкой цепи человека вместо гомологичных мышиных последовательностей (Morrison et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 81:6851 (1984)), или ковалентным присоединением к иммуноглобулину, кодирующему последовательность всей или части кодирующей последовательности для не иммуноглобулинового полипептида. Таким образом, получают «химерные» или «гибридные» антитела, которые имеют специфичность связывания раскрытого в настоящем описании моноклонального антитела против NGF.

Антитела против NGF можно охарактеризовать с использованием способов, хорошо известных в данной области. Например, один способ представляет собой идентификацию эпитопа, с которым оно связывается, или «картирование эпитопа». Существует много способов, известных в данной области, для картирования и характеристики локализации эпитопов на белках, включая растворение кристаллической структуры комплекса антитела-антигена, конкурентных анализов, анализов экспрессии фрагментов гена и анализов на основе синтетических пептидов, как описано, например, в главе 11 Harlow и Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, (1999). В дополнительном примере картирование эпитопа можно использовать для определения последовательности, с которой связывается антитело против NGF. Картирование эпитопа имеется в продаже из многих источников, например, Pepscan Systems (Edelhertweg 15, 8219 PH Lelystad, The Netherlands). Эпитоп может представлять собой линейный эпитоп, т.е., содержащийся в одном фрагменте секвенирования аминокислот, или конформационный эпитоп, образованный трехмерным взаимодействием аминокислот, которые необязательно могут содержаться в одном фрагменте секвенирования. Пептиды меняющейся длины (например, длиной, по меньшей мере, 4-6 аминокислот) можно выделить или синтезировать (например, рекомбинантно) и использовать для анализов связывания с антителом против NGF. В другом примере эпитоп, с которым связывается антитело против NGF, можно определить при систематическом скрининге использованием перекрывающих пептидов, полученных из последовательности NGF, и определением связыванием антитела против NGF. В соответствии с анализами экспрессии фрагментов гена, открытую рамку считывания, кодирующую NGF, фрагментируют или случайно, или специфическими генетическими конструкциями, и определяют реактивность экспрессированных фрагментов NGF с подлежащим тестированию антителом. Фрагменты генов можно, например, получить PCR (полимеразной реакцией синтеза цепи), а затем транскрибировать и транслировать в белок in vitro в присутствии радиоактивных аминокислот.Затем связывание антитела с фрагментами NGF, мечеными радиоактивной меткой, определяют иммунопреципитацией и гель-электрофорезом. Определенные эпитопы можно также идентифицировать использованием больших библиотек случайных пептидных последовательностей, демонстрируемых на поверхности частиц фага (библиотеки фага). Альтернативно, определенную библиотеку фрагментов перекрывающих пептидов можно испытать на связывание с тестируемым антителом в простых анализах связывания. В дополнительном примере, мутагенез связывающего антиген домена, эксперименты обмена доменов и мутагенез сканированием аланина можно выполнить для идентификации требуемых остатков, достаточных и/или необходимых для связывания эпитопа. Например, эксперименты обмена доменов можно выполнить с использованием мутантного NGF, в котором различные фрагменты полипептида NGF были замещены (обменены) последовательностями из близко родственного, но антигенно отличного белка (такого как другой член семейства нейротропиновых белков). Оценкой связывания антитела с мутантным NGF можно оценить важность конкретного фрагмента NGF для связывания антитела.

Еще одним способом, который можно использовать для характеристики антитела против NGF, является использование конкурентных анализов с другими антителами, которые, как известно, связываются с тем же антигеном, т.е., разными фрагментами на NGF, для определения того, связывается ли антитело против NGF с тем же эпитопом, что и другие антитела. Конкурентные анализы хорошо известны специалистам в данной области. Примеры антител, которые можно использовать в конкурентных анализах для настоящего изобретения, включают MAb 911, 912, 938, как описано в публикации Hongo, et al., Hybridoma 19:215-227 (2000).

Другие антагонисты NGF

Можно использовать антагонисты NGF, отличные от антител против NGF. В некоторых вариантах реализации изобретения антагонист NGF включает, по меньшей мере, одну антисмысловую молекулу, способную блокировать или уменьшать экспрессию функционального NGF. Нуклеотидные последовательности NGF известны и легко определяемы из публично доступных баз данных (см., например, Borsani et al., Nuc. Acids Res. 1990, 18, 4020; Accession Number NM 002506; Ullrich et al., Nature 303:821-825 (1983)). Обычной процедурой является получение молекул антисмысловых олигонуклеотидов, которые будут специфически связывать мРНК NGF без перекрестного взаимодействия с другими полинуклеотидами. Иллюстративные сайты нацеливания включают, но не ограничиваются, инициирующий кодон, регуляторные области 5', кодирующую последовательность и не транслированную область 3'. В некоторых вариантах реализации олигонуклеотиды имеют длину приблизительно от 10 до 100 нуклеотидов, длину приблизительно от 15 до 50 нуклеотидов, длину приблизительно от 18 до 25 нуклеотидов, или более. Олигонуклеотиды могут включать модификации каркаса, такие как, например, фосфортиоатные связи, и модификации 2'-О сахара, хорошо известные в данной области. Иллюстративные антисмысловые молекулы включают антисмысловые молекулы NGF, описанные в публикации США №20010046959; см. также http://www.rna-tec.com/repair.htm.

В других вариантах реализации антагонист NGF включает, по меньшей мере, одну антисмысловую молекулу, способную блокировать или уменьшать экспрессию функционального рецептора NGF (такого как TrkA и/или р75). Woolf et al., J. Neuroscie (2001) 21(3):1047-55; Taglialetela et al., J Neurochem (1996) 66(5):1826-35. Нуклеотидные последовательности TrkA и р75 известны и легко определяемы из публично доступных баз данных.

Альтернативно, экспрессию и/или высвобождение NGF и/или экспрессию рецептора NGF можно уменьшить с использованием способов, хорошо известных из уровня техники: разрушения гена, морфолино олигонуклеотидов, РНК или рибозимов (см. http://www.macalester.edu/˜montgomery/RNAi.html;

http://pub32.ezboard.com/fmorpholinosfrm19.showMessage?topicID=6.topic; http://www.highveld.com/ribozyme.html.).

В других вариантах реализации, антагонист NGF включает, по меньшей мере, одно соединение, ингибирующее NGF. Используемый в настоящем описании термин «соединение, ингибирующее NGF», относится к соединению, отличному от антитела против NGF, которое прямо или косвенно уменьшает, ингибирует, нейтрализует или устраняет биологическую активность NGF. Соединение, ингибирующее NGF, должно проявлять любую одну или несколько из следующих характеристик: (а) связывание с NGF; (b) ингибирование биологической активности NGF или нисходящих путей, опосредованных функцией передачи сигналов NGF; (с) предотвращение, облегчение или лечение любого аспекта послеоперационной боли; (d) блокирование или уменьшение активации рецепторов NGF (включая димеризацию и/или автофосфорилирование рецептора TrkA); (е) увеличение выведения NGF; (f) ингибирование (снижение) синтеза, продукции или высвобождения NGF; (g) усиление восстановления после операции. Иллюстративные соединения, ингибирующие NGF, включают низкомолекулярные ингибиторы NGF, описанные в публикации США №20010046959; соединения, которые ингибируют связывание NGF с р75, как описано в публикации РСТ №WO 00/69829; соединения, которые ингибируют NGF, связывающиеся с TrkA и/или р75, как описано в публикации №WO 98/17278. Дополнительные примеры соединений, ингибирующих NGF, включают соединения, описанные в публикациях РСТ №№WO 02/17914, WO 02/20479, Патентах США №№5342942, 6127401 и 6359130. Еще одними иллюстративными соединениями, ингибирующими NGF, являются соединения, которые представляют собой конкурентные ингибиторы NGF (см. патент США №6291247). Кроме того, специалист в данной области может получить другие низкомолекулярные соединения, ингибирующие NGF.

В некоторых вариантах реализации соединения, ингибирующие NGF, связывают NGF. Иллюстративные сайты нацеливания (связывания) включают, но не ограничиваются, часть NGF, которая связывается с рецептором TrkA и/или р75, и те части NGF, которые прилегают к области, связывающей рецептор, и которые частично ответственны, за правильную трехмерную форму связывающей рецептор части. В другом варианте реализации соединения, ингибирующие NGF, связывают рецептор NGF (такой как TrkA и/или р75) и ингибируют биологическую активность NGF. Иллюстративные сайты нацеливания включают те части TrkA и/или р75, которые связываются с NGF.

В варианте реализации, включающем маленькие молекулы, маленькая молекула может иметь молекулярную массу приблизительно от 100 до 20000 дальтон, от 500 до 15000 дальтон или от 1000 до 10000 дальтон. Библиотеки маленьких молекул имеются в продаже. Маленькие молекулы можно вводить с использованием любого средства, известного в данной области, включая ингаляционное, внутрибрюшинное, внутривенное, внутримышечное, подкожное, подоболочечное, внутрижелудочковое, пероральное, энтеральное, парентеральное, интраназальное или дермальное введение. В целом, когда антагонист NGF представляет собой маленькую молекулу, ее следует вводить в дозировке от 0,1 до 300 мг/кг массы пациента, разделенной на 3 или более доз. Для взрослого пациента с нормальной массой тела можно вводить дозу в диапазоне от 1 мг до 5 г на 1 дозу.

В других вариантах реализации антагонист NGF включает, по меньшей мере, один структурный аналог NGF. «Структурные аналоги NGF» в настоящем изобретении относятся к соединениям, которые имеют такую же трехмерную структуру, как часть структуры NGF, и которые связываются с рецептором NGF в физиологических условиях in vitro и in vivo, причем связывание, по меньшей мере, частично ингибирует биологическую активность NGF. В одном варианте реализации структурный аналог NGF связывается с рецептором TrkA и/или р75. Иллюстративные, структурные аналоги NGF включают, но не ограничиваются, бициклические пептиды, описанные в публикации РСТ №WO 97/15593; бициклические пептиды, описанные в патенте США №6291247; циклические соединения, описанные в патенте США №6017878, и полученные из NGF пептиды, описанные в публикации РСТ №WO 89/09225. Подходящие структурные аналоги NGF могут также быть спроектированы и синтезированы посредством молекулярного моделирования связывания рецептора NGF, например, способом, описанным в публикации РСТ №WO 98/06048. Структурные аналоги NGF могут представлять собой мономеры или димеры/олигомеры в любой желательной комбинации одних и тех же или различных структур для получения улучшенных аффинитетов и биологических эффектов.

В других вариантах реализации изобретение предоставляет антагонист NGF, включающий, по меньшей мере, один доминантно-негативный мутант рецептора TrkA и/или р75. Специалист в данной области может получить доминантно-негативные мутанты, например, рецептора TrkA, так что рецептор свяжет NGF и, следовательно, будет действовать в качестве «стока» для захвата NGF. Однако доминантно-негативные мутанты не будут иметь нормальную биологическую активность рецептора (такого как рецептор TrkA) после связывания с NGF. Иллюстративные доминантно-негативные мутанты включают, но не ограничиваются, мутанты, описанные в следующих ссылках: Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95, 10884; Eide et al., J. Neurosci. 1996, 16, 3123; Liu, et al., J. Neurosci 1997, 17, 8749; Klein et al., Cell 1990, 61, 647; Valenzuela et al., Neuron 1993, 10, 963; Tsoulfas et al., Neuron 1993, 10, 975 и Lamballe et al., EMBO J. 1993, 12, 3083, каждая из которых полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки. Доминантно-негативные мутанты можно вводить в форме белка или в форме экспрессирующего вектора, так что доминантно-негативный мутант (например, мутант рецептор TrkA) экспрессирован in vivo. Белок или экспрессирующий вектор можно ввести с использованием любого средства, известного в данной области, например путем внутрибрюшинного, внутривенного, внутримышечного, подкожного, подоболочечного, внутрижелудочкового, перорального, энтерального, парентерального, интраназального, дермального или ингаляционного введения. Например, введение экспрессирующих векторов включает местное или системное введение, включая инъекцию, пероральное введение, введение веществ в виде частиц с помощью пневматического пистолета или введение через катетер и местное введение. Специалист в данной области знаком с введением экспрессирующих векторов для получения экспрессии экзогенного белка in vivo (см., например, патенты США №№6436908, 6413942, 6376471).

Можно также использовать нацеленную доставку терапевтических композиций, содержащих антисмысловой полинуклеотид, экспрессирующий вектор или субгеномные полинуклеотиды. Методики опосредованной рецептором доставки ДНК описаны, например, в Findeis et al., Trends Biotechnol. (1993) 11:202; Chiou et al., Gene Therapeutics: Methods And Applications Of Direct Gene Transfer (J. A. Wolff, ed.) (1994); Wu et al., J. Biol. Chem. (1988) 263:621; Wu et al., J. Biol. Chem. (1994) 269:542; Zenke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87:3655; Wu et al., J. Biol. Chem (1991) 266:338. Терапевтические композиции, содержащие полинуклеотид, вводят в диапазоне от приблизительно 100 нг до приблизительно 200 мг ДНК для местного введения в протоколе генной терапии. В некоторых вариантах реализации концентрация находится в диапазоне от приблизительно 500 нг до приблизительно 50 мг, от приблизительно 1 мкг до приблизительно 2 мг, от приблизительно 5 мкг до приблизительно 500 мкг, и от приблизительно 20 мкг до приблизительно 100 мкг или более ДНК можно также использовать во время протокола генной терапии. Терапевтические полинуклеотиды и полипептиды настоящего изобретения можно доставить с использованием носителей доставки гена. Носитель доставки гена может быть вирусного или не вирусного происхождения (см. в целом Jolly, Cancer Gene Therapy (1994) 1:51; Kimura, Human Gene Therapy (1994) 5:845; Connelly, Human Gene Therapy (1995) 1:185; и Kaplitt, Nature Genetics (1994) 6:148). Экспрессию таких кодирующих последовательностей можно вызвать с использованием эндогенных промоторов и/или усилителей млекопитающих или гетерологичных промоторов и/или усилителей. Экспрессия кодирующей последовательности может быть или конститутивной, или регулируемой.

Векторы на основе вирусов для доставки желательного полинуклеотида и экспрессии в желательной клетке хорошо известны в данной области. Иллюстративные носители на основе вирусов включают, но не ограничиваются, рекомбинантные ретровирусы (см., например, публикации РСТ №№WO 90/07936, WO 94/03622, WO 93/25698, WO 93/25234, WO 93/11230, WO 93/10218, WO 91/02805; патенты США №№5219740, 4777127; патент Великобритании №2200651 и патент ЕР №0345242), векторы на основе альфавируса (например, векторы вируса Синдбис, вирус леса Семлики (АТСС VR-67; АТСС VR-1247), вирус реки Росс (АТСС VR-373; АТСС VR-1246) и вирус венесуэльского лошадиного энцефалита (АТСС VR-923; АТСС VR-1250; АТСС VR-1249; АТСС VR-532)) и векторы, связанные с аденовирусом (AAV) (см., например, публикации РСТ №№WO 94/12649, WO 93/03769, WO 93/19191, WO 94/28938, WO 95/11984 и WO 95/00655). Можно также использовать введение ДНК, связанной с убитым аденовирусом, как описано в публикации Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147.

Можно также использовать не вирусные носители и способы доставки, включающие, но не ограничивающиеся, поликатионную конденсированную ДНК, связанную или не связанную с одним убитым аденовирусом (см., например, Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147); ДНК, связанную с лигандом (см., например, Wu, J. Biol. Chem. (1989) 264:16985); клетки-носители доставки эукариотических клеток (см., например, патент США №5814482; публикации РСТ №№WO 95/07994, WO 96/17072, WO 95/30763 и WO 97/42338); и нейтрализацию заряда ядра или слияние с клеточными мембранами. Можно также использовать депротеинизированную ДНК. Иллюстративные способы внедрения депротеинизированной ДНК описаны в публикации РСТ №WO 90/11092 и патенте США №5580859. Липосомы, которые действуют в качестве носителей доставки гена, описаны в патенте США №5422120; публикации РСТ №WO 95/13796, WO 94/23697, WO 91/14445 и патенте ЕР №0524968. Дополнительные подходы описаны в Philip, Mol. Cell Biol. (1994) 14:2411 и в Woffendin, Proc. Natl. Acad. Sci. (1994) 91:1581.

Также очевидно, что экспрессирующий вектор можно использовать для направления экспрессии любого из основанных на белке антагонистов NGF, описанных в настоящем описании (например, антитела против NGF, иммуноадгезина TrkA и т.д.). Например, другие фрагменты рецептора TrkA, которые способны блокировать (от частичного до полного блокирования) NGF и/или биологическую активность NGF, известны в данной области.

В другом варианте реализации антагонист NGF включает, по меньшей мере, один иммуноадгезин TrkA. Используемый в настоящем описании термин «иммуноадгезины TrkA» относится к растворимым химерным молекулам, включающим внеклеточный домен рецептора TrkA и последовательность иммуноглобулина, который сохраняет специфичность связывания рецептора TrkA (по существу сохраняет специфичность связывания рецептора TrkA) и способен связывать NGF.

Иммуноадгезины TrkA известны в данной области, и было обнаружено, что они блокируют (уменьшают или подавляют) связывание NGF с рецептором TrkA (см., например, патент США №6153189). Brennan et al. сообщают о введении иммуноадгезина TrkA на крысиной модели послеоперационной боли (см. Society for Neuroscience Abstracts 24 (1-2) 880 (1998). В одном варианте реализации иммуноадгезин TrkA включает слияние аминокислотной последовательности рецептора TrkA (или ее части) из внеклеточного домена TrkA, способной связывать NGF (в некоторых вариантах реализации аминокислотной последовательности, которая по существу сохраняет специфичность связывания рецептора TrkA) и последовательности иммуноглобулина. В некоторых вариантах реализации рецептор TrkA представляет собой последовательность человеческого рецептора TrkA, и слияние происходит с последовательностью константного домена иммуноглобулина. В других вариантах реализации последовательность константного домена иммуноглобулина представляет собой последовательность константного домена тяжелой цепи иммуноглобулина. В других вариантах реализации ассоциация двух слияний рецептора TrkA-тяжелой цепи иммуноглобулина (например, посредством ковалентного связывания дисульфидной связью (связями)) приводит к структуре, подобной гомодимерному иммуноглобулину. Легкая цепь иммуноглобулина может быть, кроме того, связана с одной или обеими химерами иммуноглобулина рецептора TrkA в связанном дисульфидом димере для получения гомотримерной или гомотетрамерной структуры. Примеры подходящих иммуноадгезинов TrkA включают те, которые описаны в патенте США №6152189.

В другом варианте реализации антагонист NGF включает, по меньшей мере, одно антитело против TrkA, способное блокировать, подавлять, изменять и/или уменьшать физическое взаимодействие NGF с рецептором TrkA и/или нисходящую передачу сигналов, посредством чего биологическая активность NGF снижается и/или блокируется. Антитела против TrkA известны в данной области. Иллюстративные антитела против TrkA включают антитела, описанные в публикациях РСТ №№WO 97/21732, WO 00/73344, WO 02/15924 и в публикации США №20010046959.

В другом варианте реализации антагонист NGF включает, по меньшей мере, одно антитело против р75, способное блокировать, подавлять и/или уменьшать физическое взаимодействие NGF с рецептором р75 и/или нисходящую передачу сигналов, посредством чего снижается и/или блокируется биологическая активность NGF.

В другом варианте реализации антагонист NGF включает, по меньшей мере, один ингибитор киназы, способный ингибировать нисходящую передачу сигналов киназы, связанную с активностью рецептора TrkA и/или р75. Иллюстративным ингибитором киназы является К252а или К252b, который известен в данной области и описан в публикациях Knusel et al., J. Neurochem. 59:715-722 (1992); Knusel et al., J. Neurochemistry 57:955-962 (1991); Koizumi et al., J. Neuroscience 8:715-721 (1988); Hirata et al., Chemical Abstracts 111:728, XP00204135, см. реферат и 12^th Collective Chemical Substance Index, p.34237, c.3 (5-7), 55-60, 66-69), p.34238, c.1 (41-44), c.2 (25-27, 32-33), p.3423, c.3 (48-50, 52-53) и патент США №6306849.

Ожидается, что при поиске клиницистами будет идентифицирован ряд других категорий антагонистов NGF.

Идентификация антагонистов NGF

Антитела против NGF и другие антагонисты NGF можно идентифицировать или характеризовать с использованием способов, известных в данной области, посредством чего выявляется и/или измеряется уменьшение, облегчение или нейтрализации биологической активности NGF. Например, для идентификации антагонистов NGF можно использовать анализ активации рецепторов киназы (KIRA), описанный в патентах США №№5766863 и 5891650. Данный анализ типа ELISA (иммуноферментного анализа) подходит для качественного или количественного измерения активации киназы измерением аутофосфорилирования домена киназы рецептора протеин-тирозин-киназы (далее именуемого "rPTK"), например, рецептор TrkA, а также для идентификации и характеристики потенциальных антагонистов отобранного rPTK, например, TrkA. Первая стадия анализа включает фосфорилирование домена киназы рецептора киназы, например, рецептора TrkA, где рецептор присутствует в клеточной мембране эукариотической клетки. Рецептор может представлять собой эндогенный рецептор или нуклеиновую кислоту, кодирующую рецептор, или конструкция рецептора может быть трансформирована в клетку. Обычно, первую твердую фазу (например, лунка первой планшеты анализа) покрывают по существу однородной популяцией таких клеток (обычно линии клеток млекопитающих) так, что клетки прилипают к твердой фазе. Часто клетки являются клейкими и поэтому естественно прилипают к первой твердой фазе. Если используется «конструкция рецептора», то он обычно включает слияние рецептора киназы и полипептид flag. Полипептид flag распознается агентом захвата, часто антителом захвата, в части ELISA анализа. Анализируемое вещество, такое как перспективное антитело против NGF или другой антагонист NGF, затем добавляют вместе с NGF в лунки, имеющие клейкие клетки, так что рецептор тирозин-киназы (например, рецептор TrkA) открыт для воздействия (или контакта с) NGF и анализируемым веществом. Данный анализ обеспечивает возможность идентификации антител (или другого антагониста NGF), которые ингибируют активацию TrkA его лигандом NGF. После контакта с NGF и анализируемым веществом клейкие клетки солюбилизируются с использованием лизирующего буфера (который содержит солюбилизирующий детергент) и осторожного перемешивания, посредством этого высвобождая клеточный лизат, который может быть непосредственно подвергнут части ELISA анализа, без необходимости концентрации или осветления клеточного лизата.

Полученный таким образом клеточный лизат затем готов для того, чтобы подвергнуться стадии ELISA анализа. В качестве первого этапа стадии ELISA, вторая твердая фаза (обычно лунка титровочной микропланшеты ELISA) покрыта агентом захвата (часто антителом захвата), которое специфически связывается с рецептором тирозинкиназы, или, в случае конструкции рецептора, с полипептидом flag. Покрытие второй твердой фазы проводят так, что агент захвата прилипает ко второй твердой фазе. Агент захвата представляет собой в целом моноклональное антитело, но, как описано в представленных здесь примерах, можно также использовать поликлональные антитела. Полученный клеточный лизат затем подвергают воздействию или контакту с прилипающим агентом захвата так, что рецептор или конструкция рецептора прилипает (или захватывается) ко второй твердой фазе. Затем проводят этап промывания с тем, чтобы удалить не связанный клеточный лизат, оставляя захваченный рецептор или конструкцию рецептора. Прилипающий или захваченный рецептор или конструкцию рецептора затем подвергают воздействию или контакту с антителом против фосфотирозина, которое идентифицирует фосфорилированные остатки тирозина в рецепторе тирозинкиназы. В одном варианте реализации антитело против фосфотирозина конъюгировано (прямо или косвенно) с ферментом, который катализирует изменение цвета не радиоактивного цветового реагента. Соответственно, фосфорилирование рецептора можно измерить последующим изменением цвета реагента. Фермент может быть связан с антителом против фосфотирозина непосредственно, или конъюгирующая молекула (например, биотин) может быть конъюгирована с антителом против фосфотирозина, и фермент может быть в последующем связан с антителом против фосфотирозина через конъюгирующую молекулу. Наконец, связывание антитела против фосфотирозина с захваченным рецептором или конструкцией рецептора измеряют, например, изменением цвета у цветового реагента.

Антагонист NGF можно также идентифицировать инкубацией перспективного вещества с NGF и мониторингом любой одной или нескольких следующих характеристик: (а) связывание с NGF; (b) ингибирование биологической активности NGF или нисходящих путей, опосредованных функцией передачи сигналов NGF; (c) ингибирование, блокирование или уменьшение активации рецептора NGF (включая димеризацию и/или аутофосфорилирование TrkA); (d) увеличение выведения NGF; (e) лечение или предотвращение любого аспекта послеоперационной боли; (f) ингибирование (уменьшение) синтеза, продукции или высвобождения NGF; (g) усиление восстановления после операции. В некоторых вариантах реализации антагонист NGF можно идентифицировать инкубацией перспективного вещества с NGF и мониторингом связывания и сопутствующего уменьшения или нейтрализации биологической активности NGF. Анализ связывания можно выполнить очищенным полипептидом (полипептидами) NGF или клетками, естественно экспрессирующими или трансфицированными для экспрессии полипептида (полипептидов) NGF. В одном варианте реализации анализ связывания представляет собой анализ конкурентного связывания, где оценивают способность перспективного антитела конкурировать с известным антагонистом NGF за связывание NGF. Анализ можно выполнять в различных форматах, включая формат ELISA. В других вариантах реализации антагонист NGF идентифицируют инкубацией перспективного вещества с NGF и мониторингом сопутствующего ингибирования димеризации и/или аутофосфорилирования рецептора TrkA.

После первоначальной идентификации активность перспективного антагониста NGF можно дополнительно подтвердить и уточнить биологическими анализами, известными в качестве тестов видов нацеленной биологической активности. Альтернативно, биологические анализы можно использовать для прямого скрининга перспективных веществ. Например, NGF способствует ряду морфологически распознаваемых изменений в реагирующих клетках. Они включают, но не ограничиваются, содействие дифференциации клеток РС12 и усиление роста нейритов из этих клеток (Urfer et al., Biochem. 36:4775-4781 (1997); Tsoulfas et al., Neuron 10:975-990 (1993)), содействие разрастанию нейритов из эксплантатов реагирующих сенсорных и симпатических ганглиев (Levi-Montalcini, R. и Angeletti, P. Nerve growth factor. Physiol. Rev.48, 534-569, 1968) и содействие выживанию нейронов, зависимых от NGF, таких как нейроны эмбрионального ганглия дорсального корешка, ганглия тройничного нерва или нейронов симпатического ганглия (например, Chun & Patterson, Dev. Biol. 75:705-711, (1977); Buchman & Davies, Development 118:989-1001, (1993)). Так, анализ ингибирования биологической активности NGF включает культивирование клеток, реагирующих на NGF, с NGF плюс анализируемое вещество, такое как перспективное антитело против NGF или перспективный антагонист NGF. По прошествии соответствующего периода времени будет анализироваться реакция клеток (дифференцировка клеток, разрастание нейритов или выживание клеток).

Способность перспективного антагониста NGF блокировать или нейтрализовывать биологическую активность NGF можно оценить мониторингом способности перспективного вещества ингибировать опосредованное NGF выживание в биологическом анализе выживания ганглиев дорсального корешка эмбрионов крыс, как описано в публикации Hongo et al., Hybridoma 19:215-227 (2000).

Композиции для использования в способах изобретения

Композиции, используемые в способах по изобретению, содержат эффективное количество антагониста NGF (такого как антитело против NGF) и в некоторых вариантах реализации композиции, кроме того, включают фармацевтически приемлемый эксципиент. В некоторых вариантах реализации композиция предназначена для использования в любом из способов, описанных в настоящем описании. Примеры таких композиций, а также как их составлять, также описаны в представленном выше разделе и ниже. В одном варианте реализации композиция включает антагонист NGF. В другом варианте реализации композиция включает один или несколько антагонистов NGF. В другом варианте реализации композиция включает один или несколько антагонистов NGF, выбранных из любого одного или нескольких их следующих: антагониста (например, антитела), которое связывает (физически взаимодействует) с NGF, антагониста, который связывается с рецептором NGF (таким как рецептор TrkA и/или р75), и антагониста, который уменьшает (тормозит и/или блокирует) нисходящую передачу сигналов NGF. В еще одних вариантах реализации композиция включает любой антагонист NGF, который не представляет собой иммуноадгезин TrkA (т.е., не является иммуноадгезином TrkA). В других вариантах реализации композиция включает любой антагонист NGF, который не является антителом против NGF. В еще одних вариантах реализации композиция включает любой антагонист NGF, который не является иммуноадгезином TrkA и не является антителом против NGF. В других вариантах реализации антагонист NGF ингибирует (уменьшает) синтез, продукцию или высвобождение NGF. В некоторых вариантах реализации антагонист NGF связывает NGF и не вступает в существенное перекрестное взаимодействие с высвобождаемыми нейротропинами (такими как NT3, NT4/5 и/или BDNF). В некоторых вариантах реализации антагонист NGF не связан с неблагоприятным иммунным ответом. В некоторых вариантах реализации антагонист NGF выбран из группы, состоящей из антитела против NGF, антисмысловой молекулы, направленной на NGF (включая антисмысловую молекулу, направленную на нуклеиновую кислоту, кодирующую NGF), антисмысловую молекулу, направленную на рецептор NGF (такой как TrkA и/или р75), ингибиторное соединение NGF, структурный аналог NGF, доминантно-негативную мутацию рецептора TrkA, который связывает NGF, иммуноадгезин TrkA, антитело против TrkA, антитело против р75 и ингибитор киназы. В другом варианте реализации антагонист NGF представляет собой антитело против NGF. В других вариантах реализации антитело против NGF распознает человеческий NGF. В некоторых вариантах реализации антитело против NGF является человеческим. В еще одних вариантах реализации антитело против NGF является гуманизированным (таким как описанное в настоящем описании антитело Е3). В еще одних вариантах реализации антитело против NGF включает константную область, которая не запускает ненужный или нежелательный иммунный ответ, такой как опосредованный антителом лизис или ADCC. В других вариантах реализации антитело против NGF включает один или несколько CDR антитела Е3 (например, 1, 2, 3, 4, 5 или, в некоторых вариантах реализации, все 6 CDR из Е3).

Понятно, что композиции могут включать более чем один антагонист NGF. Например, композиция может включать несколько членов класса антагонистов NGF (например, смесь антител против NGF, которые распознают различные эпитопы NGF), а также члены различных классов антагонистов NGF (например, антитело против NGF и соединение, ингибирующее NGF). Другие иллюстративные композиции включают несколько антител против NGF, которое распознает один и тот же эпитоп (эпитопы), различные виды антител против NGF, которые связываются с различными эпитопами NGF, или различные соединения, ингибирующие NGF.

Композиция, используемая в настоящем изобретении, может, кроме того, содержать фармацевтически приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы (Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20^th Ed. (2000) Lippincott Williams и Wilkins, Ed. K.E.Hoover.) в форме лиофилизированных композиций или водных растворов. Приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозировках и концентрациях и могут содержать буферы, такие как фосфат, цитрат, и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консервирующие вещества (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония, хлорид бензетония; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил или пропилпарабен; катехол; резорцинол; циклогексанол; 3-пентанол и м-крезол); полипептиды низкой молекулярной массы (менее, чем приблизительно 10 остатков); белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды, и другие углеводороды, включая глюкозу, маннозу или декстраны; хелатообразующие агенты, такие как EDTA; сахара, такие как сахароза, манит, трегалоза или сорбит; образующие соль противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, комплексы Zn-белка); и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN^TM, PLURONICS^TM или полиэтиленгликоль (PEG). Фармацевтически приемлемые эксципиенты далее описаны в настоящем описании. Антагонист NGF и его композиции можно также применять в сочетании с другими средствами, которые служат для усиления и/или дополнения эффективности средств.

Наборы

Изобретение также включает наборы для использования в настоящих способах. Наборы изобретения включают один или несколько контейнеров, содержащих антагонист NGF (в частности, антитело, такое как описанное в настоящем описании гуманизированное антитело Е3), а в некоторых вариантах реализации, кроме того, содержат инструкции по применению в соответствии с любыми из описанных в настоящем описании способами. В некоторых вариантах реализации антагонист NGF может представлять собой любой антагонист NGF, описанный в настоящем описании. В еще одних вариантах реализации набор включает антагонист NGF, который не является иммуноадгезином TrkA (т.е. отличается от иммуноадгезина TrkA). В других вариантах реализации набор включает антагонист NGF, который не является антителом против NGF. В еще одних вариантах реализации набор включает любой антагонист NGF, который не является иммуноадгезином TrkA и не является антителом против NGF. В некоторых вариантах реализации набор включает антитело против NGF (такое как описанное в настоящем описании антитело Е3). В других вариантах реализации набор включает антитело против NGF, содержащее один или несколько CDR антитела Е3 (например, 1, 2, 3, 4, 5 или, в некоторых вариантах реализации, все 6 CDR из Е3). В еще одних вариантах реализации инструкции содержат описание введения антагониста NGF для лечения, облегчения и/или предотвращения послеоперационной боли в соответствии с любым из описанных в настоящем описании способов. Набор может, кроме того, включать описание выбора индивидуума, подходящего для лечения, на основании идентификации того, имеется ли у индивидуума послеоперационная боль, или имеется ли у индивидуума риск послеоперационной боли. В еще одних вариантах реализации инструкция содержит описание введения антагониста NGF для лечения, предотвращения и/или облегчения послеоперационной боли. В еще одних вариантах реализации инструкции включают описание введения антагониста NGF индивидууму с риском послеоперационной боли.

Инструкции, относящиеся к применению антагониста NGF, в целом включают информацию, касающуюся дозировки, схемы введения и пути введения для предполагаемого лечения. Контейнеры могут представлять собой стандартные дозы, упаковки основного количества продукта (например, упаковки множества доз) или субстандартные дозы. Инструкции, поставляемые в наборах изобретения, обычно представляют собой письменные инструкции на этикетке или вкладыше упаковки (например, лист бумаги, включенный в набор), но также приемлемы инструкции, считываемые устройством (например, инструкции, переносимые на магнитном или оптическом диске хранения).

На этикетке или вкладыше упаковки указано, что композиция применяется для лечения, облегчения и/или предотвращения послеоперационной боли. Инструкции могут быть предоставлены для осуществления любого из описанных в настоящем изобретении способов.

Наборы настоящего изобретения находятся в подходящей упаковке. Подходящая упаковка включает, но не ограничивается ими, флакончики, бутылки, банки, гибкие упаковки (например, запаянные мешочки Милара или пластиковые мешочки) и им подобные. Предусмотрены также упаковки для использования в комбинации со специальным устройством, таким как ингалятор, устройство для интраназального введения (например, распылитель), или устройство для вливания, такое как мини насос. Набор может иметь отверстие стерильного доступа (например, контейнер может представлять собой мешочек или флакончик с раствором для внутривенного введения, имеющий пробку, прокалываемую иглой для подкожной инъекции). Контейнер может также иметь отверстие стерильного доступа (например, контейнер может представлять собой мешочек или флакончик с раствором для внутривенного введения, имеющий пробку, прокалываемую иглой для подкожной инъекции). По меньшей мере, одно активное вещество в композиции представляет собой антагонист NGF, такой как антитело против NGF. Контейнер может, кроме того, включать второе фармацевтически активное вещество.

Наборы могут необязательно предоставлять дополнительные компоненты, такие как буферы и интерпретирующая информация. Обычно, набор включает контейнер и этикетку или вкладыш (вкладыши) упаковки на контейнере или связанные с контейнером.

Введение антагониста NGF и оценка лечения

Антагонист NGF можно вводить индивидууму любым подходящим путем. Например, антагонист NGF можно ввести вместе перорально, внутривенно, сублингвально, подкожно, внутриартериально, в синовиальную полость, внутрипузырно (например, через мочевой пузырь), внутримышечно, внутрисердечно, интраторакально, внутрибрюшинно, внутрь желудочков, сублингвально, ингаляцией, суппозиторией или трансдермально. Их можно ввести перорально, например, в форме таблеток, троше, капсул, эликсиров, суспензий, сиропов, вафель, леденцов, жевательных резинок или им подобных, полученных процедурами, признанными в данной области. Специалисту в данной области должно быть очевидно, что описанные в настоящем описании примеры не предназначены быть ограничивающими, но могут быть иллюстративными для имеющихся методик.

Соответственно, в некоторых вариантах реализации антагонист NGF, такой как антитело против NGF, вводят индивидууму в соответствии с известными способами, такими как внутривенное введение, например, в виде болюса или непрерывным вливанием в течение периода времени, внутримышечным, внутрибрюшинным, введением в спинномозговую жидкость, подкожным, внутрисуставным, в синовиальную полость, подоболочечным, пероральным, ингаляционным или местным путями. Имеющиеся в продаже распылители для жидких композиций, включая струйные распылители и ультразвуковые распылители, можно использовать для введения. Жидкие распылители можно непосредственно распылять, а лиофилизированный порошок можно распылить после растворения. Альтернативно, антагонист NGF можно распылять в виде аэрозоля с использованием фторуглеродной композиции и ингалятором отмеренных доз, или ингаляционно вводить в виде лиофилизированного и молотого порошка.

В одном варианте реализации антагонист NGF вводят посредством сайт-специфических или нацеленных местных методик доставки. Примеры методик сайт-специфической или нацеленной местной доставки включают различные имплантируемые депонированные источники антагониста NGF, или катетеры для местной доставки, такие как катетеры для вливаний, вводимый катетер или игольчатый катетер, синтетические трансплантаты, обертки адвентиции, шунты и стенты или другие имплантируемые устройства, сайт-специфические носители, прямую инъекцию, или прямую аппликацию (см., например, публикацию РСТ №WO 00/53211 и патент США №5981568).

Различные композиции антагониста NGF (такого как антитело против NGF) можно применять для введения. В некоторых вариантах реализации антагонист NGF можно вводить отдельно. В некоторых вариантах реализации антагонист NGF включает антитело против NGF и может быть в различных композициях, включая композиции, включающие фармацевтически приемлемый эксципиент. Фармацевтически приемлемые эксципиенты известны в данной области, и они представляют собой относительно инертные вещества, которые облегчают введение фармакологически эффективного вещества. Например, эксципиент может придать форму или консистенцию или действовать в качестве разбавителя. Подходящие эксципиенты включают, но не ограничиваются, стабилизирующие вещества, смачивающие и эмульгирующие вещества, соли для изменения осмолярности, инкапсулирующие вещества, буферы и усилители проникновения через кожу. Эксципиенты, а также композиции для парентеральной и не парентеральной доставки препарата изложены в Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20^th Ed. Mack Publishing (2000).

В некоторых вариантах реализации указанные средства включают в композиции для введения инъекцией (например, внутрибрюшинно, внутривенно, подкожно, внутримышечно и т.д.). Соответственно, указанные вещества можно комбинировать с фармацевтически приемлемыми носителями, такими как солевой раствор, раствор Рингера, раствор декстрозы и им подобные. Конкретная схема дозировки, т.е., доза, время введения и повторения будут зависеть от конкретного индивидуума и медицинского анамнеза индивидуума.

Антитело против NGF можно вводить с использованием любого подходящего способа, включая введение инъекцией (например, внутрибрюшинно, внутривенно, подкожно, внутримышечно и т.д.). Антитело против NGF можно также вводить путем ингаляции, как описано в настоящем описании. В целом, для введения антител против NGF первоначальная дозировка перспективного средства может составлять приблизительно 2 мг/кг. В целях настоящего изобретения типичная суточная дозировка может находиться в любом диапазоне приблизительно от 3 мкг/кг до 30 мкг/кг, до 300 мкг/кг, до 3 мг/кг, до 30 мг/кг, до 100 мг/кг или более, в зависимости от упомянутых выше факторов. Для повторных введений в течение нескольких дней или дольше, в зависимости от состояния, лечение продолжают до тех пор, пока не происходит желательное подавление симптомов, или до тех пор, пока не будут достигнуты терапевтические уровни, достаточные для уменьшения послеоперационной боли. Иллюстративная схема введения включает введение исходной дозы приблизительно 2 мг/кг с последующим введением поддерживающей дозы приблизительно 1 мг/кг антитела против NGF 1 раз/нед, или последующим введением поддерживающей дозы приблизительно 1 мг/кг 1 раз/2 нед. Однако можно использовать другие схемы введения, в зависимости от типа фармакокинетического разложения, которого желает достичь врач. Например, предусмотрено введение от одного до четырех раз/нед. Ход данного лечения легко контролируется обычными методиками и анализами. Схема дозировки (включая антагонист (антагонисты) NGF) может варьироваться с течением времени.

В целом, когда это не антитело, антагонист NGF (в некоторых вариантах реализации) можно вводить в дозировке от 0,1 до 300 мг/кг массы тела пациента, разделенной на дозы от одной до трех, или как раскрыто в настоящем описании. У некоторых взрослых пациентов с нормальной массой тела можно вводить дозы в диапазоне приблизительно от 0,3 до 5,00 мг/кг. Конкретная схема дозировки, т.е., доза, время введения и повторение, будут зависеть от конкретного индивидуума и медицинского анамнеза указанного индивидуума, а также свойств отдельных средств (таких как период полувыведения средства и других соображений, хорошо известных в данной области).

C целью настоящего изобретения соответствующая дозировка антагониста NGF будет зависеть от используемого антагониста (антагонистов) NGF (или их композиций), типа и тяжести подлежащей лечению боли, от того, вводят ли средство в целях предотвращения или лечения, предшествующего лечения, клинического анамнеза пациента и реакции на средство, и по усмотрению лечащего врача. Обычно клиницист введет антагонист NGF, такой как антитело против NGF до тех пор, пока не будет достигнута дозировка, которая даст желательный результат.

Эмпирические соображения, такие как период полувыведения, в целом будут участвовать в определении дозировки. Например, антитела, которые совместимы с иммунной системой человека, такие как гуманизированные антитела, или полностью человеческие антитела, можно использовать для продления периода полувыведения антитела и для предотвращения атаки на антитело иммунной системы хозяина. Частоту введения можно определить и подобрать в течение курса терапии, и она в целом, но необязательно, основана на лечении и/или подавлении и/или облегчении и/или задержке боли. Альтернативно, могут быть целесообразны композиции длительного, непрерывного высвобождения антитела против NGF. Различные композиции и устройства для достижения пролонгированного высвобождения известны в данной области.

В одном варианте реализации дозировки для антагониста NGF можно определить эмпирически у индивидуумов, которым антагонист NGF (такой как антитело) вводили один или несколько раз. Индивидуумам вводят возрастающие дозировки антагониста NGF, например, антитела против NGF. Для оценки эффективности антагониста NGF можно следить за индикатором боли.

Введение антагониста NGF в соответствии со способом настоящего изобретения может быть непрерывным или прерывистым, в зависимости, например, от физиологического состояния реципиента, от того, является ли цель введения терапевтической или профилактической, и от других факторов, известных опытным практикующим врачам. Введение антагониста NGF (например, если антагонист NGF представляет собой антитело против NGF) может быть по существу непрерывным в течение предварительно выбранного периода времени или может быть в виде ряда доз, вводимых через промежутки времени, например, до, во время или после развития боли; перед, во время, перед и после, во время и после, перед и во время или перед, во время и после развития боли. Введение может быть осуществлено перед, во время и/или после ранения, разреза, травмы, операции и любого другого явления, которое, вероятно, вызовет возникновение послеоперационной боли.

В некоторых вариантах реализации может присутствовать более одного антагониста NGF, такого как антитело. Антагонисты могут быть одними и теми же, или отличными друг от друга. Могут присутствовать, по меньшей мере, один, по меньшей мере, 2, по меньшей мере, 3, по меньшей мере, 4, по меньшей мере, 5 различных антагонистов NGF. В целом, указанные антагонисты NGF имеют комплементарные виды активности, которые не оказывают неблагоприятного влияния друг на друга. Антагонисты NGF можно применять в сочетании с другими средствами, которые служат для усиления и/или дополнения эффективности средств.

Терапевтические композиции антагониста NGF (такого как антитело), используемые в соответствии с настоящим изобретением, получают для хранения смешиванием антитела, имеющего требуемую степень чистоты, с необязательными фармацевтически приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизаторами (Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20^th Ed. Mack Publishing (2000)), в форме лиофилизированных композиций или водных растворов. Приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозировках и концентрациях и могут включать буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; соли, такие как хлорид натрия; антиоксиданты, включающие аскорбиновую кислоту и метионин; консервирующие вещества (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония, хлорид бензетония; фенол, бутил или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцинол; циклогексанол; 3-пентанол и м-крезол); полипептиды низкой молекулярной массы (менее, чем приблизительно 10 остатков); белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды, и другие углеводороды, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатообразующие вещества, такие как EDTA; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; образующие соль противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, комплексы Zn-белка); и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN^TM, PLURONICS^TM или полиэтиленгликоль (PEG).

Липосомы, содержащие антагонист NGF (такой как антитело), получают способами, известными в данной области, такими, как описано в Epstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030 (1980) и патенты США №№4485045 и 4544545. Липосомы, которые усиливали время циркуляции, раскрыты в патенте США №5013556. В частности, полезные липосомы можно генерировать способом выпаривания в обращенной фазе с липидной композицией, включающей фосфатидилхолин, холестерин и дериватизированный PEG фосфатидилэтаноламин (PEG-PE). Липосомы подвергают экструзии через фильтры определенного размера пор для получения липосом с требуемым диаметром.

Активные ингредиенты могут также быть захвачены в микрокапсулы, полученные, например, методиками коацервации или межповерхностной полимеризации, например, соответственно гидроксиметилцеллюлозные или желатиновые микрокапсулы и поли(метилметакрилатные) микрокапсулы, в коллоидные системы доставки препарата (например, липосомы, микросферы альбумина, микроэмульсии, нано-частицы и нанокапсулы) или в макроэмульсии. Такие методики раскрыты в Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20^th Ed. Mack Publishing (2000).

Можно получить препараты пролонгированного высвобождения. Подходящие примеры препаратов пролонгированного высвобождения включают полупроницаемые матрицы твердого гидрофобного полимера, содержащие антитело, причем матрицы представлены в виде спрофилированных изделий, например, пленок или микрокапсул. Примеры матриц пролонгированного высвобождения включают полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтилметакрилат) или поли(виниловый спирт), полилактиды (патент США №3773919), сополимеры L-глутамовой кислоты и 7-этил-L-глутамата, неразлагаемый этиленвинилацетат, разлагаемые сополимеры молочной кислоты-гликолевой кислоты, такие как LUPRON DEPOT^TM (инъецируемые микросферы, составленные из сополимера молочной кислоты-гликолевой кислоты и ацетата лейпролида), изобутиратацетата сахарозы и поли-D-(-)-3-гидроксимасляной кислоты.

Композиции, подлежащие использованию для введения in vivo, должны быть стерильными. Это легко осуществляется, например, фильтрацией через стерильные фильтрационные мембраны. Например, терапевтические композиции антитела против NGF в целом помещают в контейнер, имеющий стерильное отверстие доступа, например, мешочек с раствором для внутривенного введения или флакончик, имеющий пробку, которую можно проколоть иглой для подкожных инъекций.

Композиции в соответствии с настоящим изобретением могут быть в стандартных лекарственных формах, таких как таблетки, пилюли, капсулы, порошки, гранулы, растворы или суспензии, или суппозитории, для перорального, парентерального или ректального введения, или введения ингаляцией или инсуффляцией.

Для получения твердых композиций, таких как таблетки, основной активный ингредиент смешивают с фармацевтическим носителем, например, обычными ингредиентами таблетирования, такими как кукурузный крахмал, лактоза, сахароза, сорбит, тальк, стеариновая кислота, стеарат магния, дикальцийфосфат или смолы и другими фармацевтическими разбавителями, например, водой, для формирования твердой композиции предварительного состава, содержащей однородную смесь соединения настоящего изобретения или его нетоксичной фармацевтически приемлемой соли. При именовании указанных фармацевтических композиций однородными, подразумевается, что активный ингредиент равномерно диспергирован по композиции, так что композицию можно легко подразделить на эквивалентно эффективные стандартные лекарственные формы, такие как таблетки, пилюли и капсулы. Затем данную твердую композицию предварительного состава подразделяют на стандартные лекарственные формы описанного выше типа, содержащие от приблизительно 0,1 до приблизительно 500 мг активного ингредиента настоящего изобретения. Таблетки или пилюли новой композиции можно покрыть или изготовить путем смешивания другим образом для получения лекарственной формы, обеспечивающей преимущество продолжительного действия. Например, таблетка или пилюля может включать внутреннюю и наружную части лекарственной формы, причем последняя представлена в виде оболочки вокруг первой. Указанные две составляющие можно разделить энтеросолюбильным слоем, который служит для сопротивления разложению в желудке и обеспечивает возможность внутренней части проходить интактной в 12-перстную кишку или задержать высвобождение. Разнообразные материалы можно использовать для таких энтеросолюбильных слоев или покрытий, причем такие материалы включают ряд полимерных кислот и смесей полимерных кислот с такими материалами, как шеллак, цетиловый спирт и ацетат целлюлозы.

Подходящие поверхностно-активные вещества включают, в частности, неионные вещества, такие как полиоксиэтиленсорбитаны (например, Tween^TM 20, 40, 60, 80 или 85) и другие сорбитаны (например, Span^TM 20, 40, 60, 80 или 85). Композиции с поверхностно-активным веществом могут содержать от 0,05% до 5% поверхностно-активного вещества, или от 0,1 до 2,5%. Следует понимать, что при необходимости можно добавлять другие ингредиенты, например, манит или фармацевтически приемлемые носители.

Подходящие эмульсии можно получить с использованием имеющихся в продаже жировых эмульсий, таких как Intralipid^TM, Liposyn^TM, Infonutrol^TM, Lipofundin^TM и Lipiphysan^TM. Активный ингредиент может быть или растворен в предварительно смешанной эмульсионной композиции, или альтернативно он может быть растворен в масле (например, масле соевых бобов, масле сафлора, масле хлопковых семян, кунжутном масле, кукурузном масле или миндальном масле), и эмульсия образуется после смешивания с фосфолипидом (например, яичными фосфолипидами, фосфолипидами соевых бобов или лецитином соевых бобов) и водой. Следует понимать, что можно добавить другие ингредиенты, например, глицерин или глюкозу, для регулировки тоничности эмульсии. Подходящие эмульсии будут обычно содержать до 20% масла, например, от 5 до 20%. Жировая эмульсия может включать капельки жира от 0,1 до 1,0 мкм, в частности, от 0,1 до 0,5 мкм и иметь рН в диапазоне от 5,5 до 8,0.

Эмульсионные композиции могут представлять собой композиции, полученные смешиванием антагониста фактора роста нервов с Intralipid^TM или его компонентами (масло соевых бобов, яичные фосфолипиды, глицерин и вода).

Композиции для ингаляции или инсуффляции включают растворы и суспензии в фармацевтически приемлемых, водных или органических растворителях или их смесях и порошки. Жидкие или твердые композиции могут содержать подходящие фармацевтически приемлемые эксципиенты, как изложено выше. В некоторых вариантах реализации композиции вводят пероральным или интраназальным дыхательным путем для местного или системного эффекта. Композиции в предпочтительно стерильных фармацевтически приемлемых растворителях можно распылять с использованием газов. Распыленные растворы можно вдыхать непосредственно из распыляющего устройства, или распыляющее устройство может быть прикреплено к лицевой маске, тенту или дыхательному аппарату под прерывистым положительным давлением. Композиции в виде раствора, суспензии или порошка можно вводить предпочтительно перорально или интраназально из устройств, которые доставляют композицию соответствующим образом.

Эффективность лечения можно оценить способами, хорошо известными в данной области.

ПРИМЕРЫ

Следующие примеры предоставлены для иллюстрации, но не ограничения изобретения.

Пример 1

Лечение моноклональным антителом против NGF эффективно при лечении послеоперационной боли

Заявители использовали модель боли, которая имитирует послеоперационную боль, для оценки эффективности лечения антителом 911 против NGF (мышиным моноклональным антителом; см. Hongo et al., Hybridoma 19:215-227 (2000). Каждый эксперимент включал 16 животных (n=8 на группу). Антитело против NGF инъецировали внутрибрюшинно (в/б) в различных концентрациях на эксперимент (35 или 7 мг/кг) за 15 ч до разреза. Контрольная группа не получала антитело, но ей инъецировали в/б солевой раствор.

Животные. Самцов крыс линии Sprague Dawley с массой тела от 220 до 240 г закупали у компании Harlan (San Diego) и акклиматизировали в условиях вивария в течение 1 недели перед операцией.

Операция. Операция была основана на процедуре, описанной Brennan, et al., Pain 64:493-501 (1996). Животных наркотизировали смесью 2% изофлюрана и воздуха, введение которой продолжали во время операции через носовую воронку. Подошвенную поверхность правой задней лапы готовили тампоном с повидоном-йодом, и делали центральный продольный разрез длиной 1 см через кожу и фасцию, начиная в 0,5 см от края пятки и продолжая в направлении пальцев стопы. Измерения проводили линейкой при стопе, удерживаемой в фиксированном положении. Подошвенную мышцу поднимали с использованием искривленного пинцета и делали продольный разрез. Мышцу разрезали на ее полную глубину между отхождением и прикреплением. Кровотечение останавливали во время операции давлением, оказываемым марлевым тампоном. Рану закрывали двумя матрацными швами (черное моноволокно этикон размера 5-0). Указанные шовные нити завязывали узлами 5-6 раз, причем первый узел завязывали неплотно. Рану обрабатывали тампоном с раствором бацитрацина. Животным давали возможность восстановиться и отдыхать в чистых клетках, по меньшей мере, в течение 2 ч перед тем, как начинали поведенческое тестирование.

Оценка боли в покое. Кумулятивную балльную оценку боли использовали для оценки боли, связанной с опорой на лапу. Животных помещали на пластиковую сетку (решетка: 8 мм²) в прозрачных пластиковых клетках, которые были подняты на платформу (высота 18 дюймов), обеспечивающую возможность осмотра нижней стороны их лап. После 20 мин периода акклиматизации, функцию опоры на лапу оценивали по шкале от 0 до 2. Балльную оценку 0 давали, если лапа бледнела или вдавливалась в сетку, указывая на полную функцию опоры. Балльную оценку 1 давали, если крыса щадила лапу, едва касаясь кожей сетки, при отсутствии побеления или вдавления кожи. Балльную оценку 2 давали, если лапа удерживалась, полностью не касаясь сетки. Отдергивание лапы считали балльной оценкой 2, если крыса еще находилась в покое. Каждое животное наблюдали в течение 1 мин через каждые 5 мин в течение 30 мин. Сумму 6 балльных оценок (0-12), полученную в течение получасового периода, использовали для оценки боли в стопе с разрезом. Частоту балльных оценок 2 также рассчитывали и использовали для оценки частоты сильной боли или полного управления лапой животным. Каждое животное тестировали за 24 ч до операции (исходный уровень) и через 2 ч, 24 ч, 48 ч и 72 ч после операции. Результаты этого эксперимента показаны на фиг.1, которая изображает кумулятивную балльную оценку боли в покое, наблюдавшуюся у животных, которые получали лечение антителом 911 против NGF в дозе 35 мг/кг. Данные результаты демонстрируют, что лечение антителом против NGF значительно уменьшало послеоперационную боль в покое. Опорная функция была надежным показателем того, насколько животное могло использовать конечность, и поэтому она была эффективным показателем облегчения боли.

Оценка механически вызванной боли с использованием тактильной аллодинии. Тактильную аллодинию измеряли волосками Semmes-Weinstein Von Frey (Stoelting, Wood Dale, IL). Животных помещали в 12-мм клетки с днищем в виде пластиковой сетки, поднятые на платформу (высота: 18 дюймов), обеспечивающие доступ к нижней поверхности их лап. Животные привыкали к этому окружению (в течение 1-2 дней за 1 нед) перед началом эксперимента. После 15-мин периода акклиматизации тактильную аллодинию испытывали прикосновением к коже, медиальнее и проксимальнее точки начала разреза на пятке задней лапы животного волосками Von Frey в восходящем порядке силы до тех пор, пока не вызывалась реакция отдергивания лапы. Использовали волоски von Frey номеров от 4,08 до 5,46; каждый номер коррелировал с силой в граммах, как описано ниже. Каждый волосок Von Frey прикладывали к поверхности под прямым углом, сгибая волосок на 2 с или до тех пор, пока не возникала реакция. Как только реакцию отдергивания устанавливали, лапу повторно испытывали в еще двух испытаниях, начиная следующим нисходящим волоском Von Frey до тех пор, пока реакция не возникала.

Самое маленькое количество силы, требуемое для того, чтобы вызвать реакцию по трем испытаниям, регистрировали как порог отдергивания в граммах. Самая большая сила 29 г поднимала лапу, а также вызывая реакцию, представляя таким образом точку отсечки. Если реакция не вызывалась, регистрировали среднее восходящее волокно «5,88». Таким образом тестировали и левую и правую лапу. Каждое животное тестировали за 24 ч до операции (исходный уровень) и через 2 ч, 24 ч, 48 ч и 72 ч после операции. Тактильную аллодинию тестировали после определения балльной оценки боли в покое. Результаты этого эксперимента показаны на фиг.3, которая предоставляет кумулятивную балльную оценку в ответ на механическую стимуляцию у животных, получавших лечение антителом 911 против NGF в дозе 7 мг/кг. Данные результаты продемонстрировали, что лечение антителом против NGF уменьшало послеоперационную механически вызванную боль.

Оценка термической гиперальгезии. Термическую гиперальгезию оценивали подошвенным тестом у крыс (Ugo Basile, Italy) в соответствии с модифицированным способом Hargreaves, et al. (1988). Крыс приучали к устройству, которое состояло из 4 отдельных плексиглассовых ящиков на поднятом стеклянном столе. Подвижный источник теплового излучения располагался под столом и был сфокусирован на заднюю лапу. Пока животное находилось в покое, но не спало, нажимали кнопку на контрольном ящике, источник теплового излучения включался, и автоматически регистрировалось время, прошедшее до тех пор, пока животное не отдергивало лапу от теплового источника. Данная латентность отдергивания лапы (PWL) выявляется залитым в источник теплового излучения световым детектором, который улавливает движение лапы крысы по изменению коэффициента отражения излучающего источника. Регистрировали величины латентности отдергивания лапы в секундах. Для предотвращения повреждения ткани имелась точка автоматической отсечки, составляющая 22,5 с. PWL определяли 3-4 раза для обеих задних лап каждого животного, средняя величина которой представляла исходные уровни для правой и левой задних лап. Результаты представлены в виде соотношение балльной оценки, измеренной на правой лапе (участок операции) и левой лапе. Устройство однократно калибровали (в начале исследования) и устанавливали на интенсивность 40 для получения нормальной PWL, равной приблизительно 6 с. Каждое животное испытывали за 24 ч до операции (исходный уровень) и через 3 ч, 24 ч, 48 ч и 72 ч после операции. Измерения термической гиперальгезии производили после измерений тактильной аллодинии. Результаты этого эксперимента показаны на фиг.2, которая изображает кумулятивную балльную оценку, наблюдаемую у животных, получавших лечение антителом 911 против NGF в дозе 35 мг/кг в ответ на термическое раздражение. Данные результаты продемонстрировали, что лечение антителом против NGF снижало послеоперационную термическую гиперальгезию.

Пример 2

Лечение послеоперационной боли с использованием гуманизированного антитела против NGF и сравнение с лечением послеоперационной боли опиоидом

Эффект гуманизированного антитела против NGF, обозначенного Е3, на послеоперационную боль испытывали на экспериментальной модели послеоперационной боли, как описано в примере 1. Антитело Е3 включает константную область тяжелой цепи человеческого IgG2a, содержащую следующие мутации: от А330Р331 до S330S331 (нумерация аминокислот со ссылкой на последовательность IgG2a дикого типа (см. Eur J. Immunol. (1999) 29:2613-2624); константную область человеческой легкой цепи каппа и вариабельные области тяжелой и легкой цепи, показанные в таблицах 1 и 2.

Антитело против NGF инъецировали внутрибрюшинно (в/б) в различных концентрациях антитела (0,004, 0,01, 0,02, 0,1, 0,6 и 1 мг/кг массы тела животного) за 15 ч до разреза. Отрицательная контрольная группа не получала антитело, но ей в/б инъецировали солевой раствор. Фентанил в дозе 0,01 мг/кг инъецировали в/б в качестве положительного контроля за 30 мин перед испытанием через 24 ч после операции. Каждый эксперимент включал 8 животных (n=8 на группу) для каждого состояния, и контрольная группа содержала 56 животных. Операцию выполняли и кумулятивную балльную оценку боли измеряли, как описано в примере 1, за исключением того, что самцов крыс линии Sprague Dawley закупали у компании Harlan (Wisconsin). Боль в покое оценивали через 24 ч после операции, как описано в примере 1.

Как показано на фиг.4, гуманизированное антитело против NGF Е3 значительно уменьшало боль в покое (p<0,05) после операции при введении в дозировке от 0,02 мг/кг до 1 мг/кг. А "*" обозначает статистически значимое отличие от контроля (p<0,05). Лечение дозировкой 0,02 мг/кг облегчало связанное с болью поведение, по меньшей мере, так же эффективно, как лечение фентанилом в дозе 0,01 мг/кг. Эта доза фентанила в 10 раз больше обычной дозы данного мощного опиоида для человека.

Пример 3

Предоперационное и послеоперационное лечение послеоперационной боли антителом против NGF

Эффективность антитела против NGF в уменьшении послеоперационной боли при введении после разреза испытывали на экспериментальной модели послеоперационной боли, описанной в примере 1, с использованием крыс линии Sprague Dawley, закупленных у компании Harlan (Wisconsin). Гуманизированное антитело против NGF Е3 (0,5 мг/кг) инъецировали внутривенно (в/в) через 2 ч после нанесения разреза. Контрольная группа не получала антитело, но ей инъецировали в/в солевой раствор. Операцию выполняли и кумулятивную балльную оценку боли оценивали через 24 ч после операции, как описано в примере 1. Как показано на фиг.5, лечение антителом против NGF значимо (p<0,05) уменьшало боль в покое через 24 ч после разреза, когда антитело вводили через 2 ч после нанесения разреза. Данные результаты продемонстрировали, что антитело против NGF эффективно облегчало послеоперационную боль при введении после операции.

Эффективность антитела против NGF в уменьшении послеоперационной боли при введении за 14 дней или 21 день до разреза испытывали на экспериментальной модели, описанной в примере 1, с использованием самцов крыс линии Sprague Dawley, закупленных у компании Harlan (Wisconsin). Мышиное моноклональное антитело 911 против NGF инъецировали в/б в различных концентрациях (1 мг/кг или 5 мг/кг) за 14 дней или 21 день до нанесения разреза. Контрольной группе инъецировали в/б солевой раствор. Операцию выполняли и боль в покое, выраженную в виде кумулятивной балльной оценки, оценивали через 24 ч после операции, как описано в примере 1. Как показано на фиг.6 и 7, антитело 911 против NGF значимо уменьшало боль в покое в дозировке 5 мг/кг при введении за 14 дней до операции и уменьшало боль в покое при инъекции за 21 день до операции.

Пример 4

Лечение антителом против NGF не проявляет эффекта на заживление ран

В научной литературе имеются предположения, что лечение избыточным количеством NGF может способствовать заживлению ран у животных, страдающих сахарным диабетом (Matsuda et al., (1998) J. Exp.Med 187(3):297-30) и язв роговицы и кожи (Lambiase et al., (2003) Arch Ital Biol. 141(2-3):141-8). Для определения того, нарушит ли применение антитела против NGF заживление ран, эффект лечения антителом против NGF на заживление ран испытывали у крыс.

Самцов крыс линии Sprague Dawley с массой тела 250-350 г закупали у компании Harlan (Wisconsin), доставляли в виварий и давали акклиматизироваться, по меньшей мере, в течение 1 нед. Животных анестезировали изофлюраном, и дорзальную поверхность (спину) брили и очищали йодоповидоном с последующей обработкой тампоном со спиртом. Производили разрез длиной 2,5 см через кожу по средней линии между лопатками. Кровотечение останавливали давлением марлевым тампоном. Рану закрывали четырьмя одиночными швами этиконовыми нитями размера 4-0, и животным давали возможность восстановиться. Затем животных делили на 3 группы: одна группа получала однократные дозы мышиного моноклонального антитела 911 против NGF во время операции (1 мг/кг в/б); одна группа получала кеторолак (5 мг/кг/день в течение 5 дней, начиная в день операции, внутримышечно (IM0) в качестве положительного контроля; и получавшая солевой раствор контрольная группа (отрицательный контроль). Известно, что кеторалак ингибирует заживление ран (Haws et al., (1996) Ann. Plast Surg. 37(2):147-51; Gerstenfeld et al., (2003) J. Orthop Res. 21(4):670-5).

Область разреза исследовали и фотографировали ежедневно, начиная в день после операции. Швы удаляли на 2-й день после операции. Разрезы оценивали в баллах как «интактные», если весь разрез оставался закрытым, и «незажившие», если весь или некоторая часть разреза повторно расходились. Результаты выражали в виде доли интактных ран (т.е., количество интактных ран, деленное на общее количество животных, у которых проводили балльную оценку).

Как показано на фиг.8, заживление ран животных, получавших лечение антителом 911 против NGF, значимо не отличалось от заживления ран у животных, получавших лечение солевым раствором. Таким образом, лечение против NGF не проявило видимого эффекта на заживление ран. Напротив, заживление ран было значительно ингибировано у животных, получавших лечение кеторолаком, при сравнении с животными, получавшими лечение солевым раствором или антителом 911 против NGF (p<0,0005).

Гистологическую картину заживших ран также исследовали у трех крыс, получавших лечение антителом против NGF, и трех крыс, получавших лечение солевым раствором. Через 21 день после разреза животных умерщвляли, и образцы кожи, включающие область разреза, фиксировали в формалине, заливали в парафин и делали срезы через участок разреза. Эти срезы обрабатывали антителом против NGF или солевым раствором, окрашивали гематоксилином и эозином, и их исследовал ветеринарный патологоанатом, не располагавший данными о лечении, полученном животными. Ни в одной группе крыс не наблюдали отклонений от нормы в заживлении ран.

Пример 5

Лечение послеоперационной боли низкомолекулярным антагонистом NGF K252a

Эффективность антагониста NGF K252a при лечении послеоперационной боли испытывали на модели разреза, описанной в примере 1. Раствор К252а в концентрации 25 мг/мл готовили в DMSO. К 250 мкл раствора добавляли 3500 мкл раствора 45% циклодекстрина и тщательно смешивали. Затем добавляли 3750 мкл солевого раствора для получения конечной концентрации 0,8333 мг/мл К252а. У животных (полученных, как описано в примере 2) делали разрез, и боль в покое оценивали, как описано в примере 1. «Исходную» кумулятивную боль в покое определяли через 24 ч после разреза. Затем К252а инъецировали в/б в дозе 4 мг/кг испытуемым животным, а контрольным животным инъецировали раствор носителя (раствор, содержащий все компоненты раствора К252а, за исключением К252а). Кумулятивные балльные оценки боли в покое определялись через 1 ч после лечения К252а или носителя (отмечено «1Н-Р-tmt» на фиг.) и через 3 ч после лечения К252а или носителя (отмечено «3Н-Р-tmt» на фиг.) экспериментатором, не располагавшим данными о лечении. Как показано на фиг.9, лечение К252а значительно уменьшало боль в покое (p<0,005) через 3 ч после введения, тогда как лечение носителем не оказывало такого эффекта. Данные результаты продемонстрировали, что лечение К252а уменьшало боль в покое в той же степени, что и лечение антителом против NGF в аналогичных экспериментах.

Пример 6

Сравнение послеоперационной боли у животных, получавших лечение антителом против NGF или подобранным по изотипу контрольным антителом

Для того чтобы продемонстрировать, что обезболивающий эффект антитела против NGF требует ингибирования NGF, эффективность мышиного антитела 911 против NGF при лечении послеоперационной боли сравнивали с эффективностью такой же дозы подобранного по изотипу мышиного антитела, которое является иммунореактивным с вызывающим амнезию белком дрозофилы. Эксперимент проводили, как в примере 1, за исключением того, что крыс линии Sprague Dawley закупали у компании Harlan (Wisconsin). Крыс лечили в/б введением за 15 ч перед операцией 1 мг/кг или антитела 911 против NGF (отмечено «911» на фиг.) или подобранного по изотипу мышиного антитела против вызывающего амнезию белка (отмечено «amn ab» на фиг.). Через 24 ч после операции боль в покое (кумулятивную балльную оценку) оценивал наблюдатель, не располагавший данными о лечении животных. Как показано на фиг.10, лечение антителом 911 против NGF значимо (p<0,005) уменьшало боль в покое, по сравнению с животными, получавшими лечение антителом против вызывающего амнезию белка. Данные результаты продемонстрировали, что обезболивающий эффект лечения антителами против NGF является специфичным.

Хотя представленное выше изобретение было описано с определенными подробностями путем иллюстрации и описания примеров для обеспечения ясности и понимания, однако описания и примеры не следует рассматривать как ограничивающие объем изобретения.

1. Способ лечения послеоперационной боли у индивидуума, включающий введение индивидууму эффективного количества антагониста фактора роста нервов (NGF), который представляет собой антагонистическое антитело против NGF.

2. Способ по п.1, где подавляется или облегчается боль в покое.

3. Способ по п.1, где подавляется или облегчается механически вызванная боль.

4. Способ по п.1, где антагонистическое антитело против NGF представляет собой человеческое антитело.

5. Способ по п.1, где антагонистическое антитело против NGF представляет собой гуманизированное антитело.

6. Способ по п.1, где антагонистическое антитело против NGF связывает человеческий NGF.

7. Способ по п.6, где антагонистическое антитело против NGF связывает человеческий NGF с аффинитетом связывания приблизительно 0,1 нМ или менее чем приблизительно 0,1 нМ.

8. Фармацевтическая композиция для лечения послеоперационной боли, содержащая фармацевтически эффективное количество антагонистического антитела против NGF и фармацевтически приемлемый носитель.

9. Набор для лечения послеоперационной боли, включающий антагонист NGF и инструкции по применению антагониста NGF для лечения послеоперационной боли, где антагонист NGF представляет собой антагонистическое антитело против NGF.

Изобретение относится к медицине, а именно к анестезиологии, и может быть использовано при плановых операциях с предполагающейся массивной кровопотерей. .

Дедифференцированные программируемые стволовые клетки моноцитарного происхождения и их получение и применение // 2333243

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения взрослых дедифференцированных, программируемых стволовых клеток из моноцитов человека.

Способ профилактики нозокомиального перитонита // 2333005

Изобретение относится к медицине и предназначено для профилактики присоединения нозокомиального перитонита у больных с уже развившимся перитонитом, после наложения лапаростомы.

Способ профилактики послеоперационных спаек // 2330648

Изобретение относится к медицине, в частности к хирургии, и касается профилактики спаечного процесса в брюшной полости. .

Способ профилактики и лечения осложнений случайных ран и открытых переломов конечностей // 2330643

Изобретение относится к медицине, а именно к хирургии, медицине катастроф, и может быть использовано при профилактике и лечении осложнений ран и/или открытых переломов конечностей.

Способ устранения посттравматических дефектов глазницы // 2330636

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, к хирургии. .

Способ подбора индивидуальной дозы озона при лечении больных острым панкреатитом // 2328295

Изобретение относится к медицине, а именно к реаниматологии и хирургии, и может быть использовано при лечении больных с острым панкреатитом. .

Способ лечения флегмон челюстно-лицевой области // 2328292

Изобретение относится к медицине, а именно к хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии, и может быть использовано при комплексном лечении флегмон челюстно-лицевой области.

Способ предупреждения развития жировой эмболии в периоперационном периоде // 2326676

Изобретение относится к медицине, к анестезиологии и реаниматологии. .

Способ идентификации соединений, взаимодействующих с трансмембранными белками // 2326166

Изобретение относится к области биотехнологии. .

Препарат и способ профилактики и лечения диареи у телят // 2337709

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к комплексному биологическому препарату, который может быть использован для профилактики и лечения телят при диарее вирусно-бактериальной этиологии.

Противоопухолевое средство на основе иммунолипосомальной биологической конструкции, способ его получения и векторной доставки в центральную нервную систему при опухолевом процессе // 2336901

Изобретение относится к области биофармакологии и медицины. .

Человеческие моноклональные антитела к рецептору эпидермального фактора роста (egfr), способ их получения и их использование, гибридома, трансфектома, трансгенное животное, экспрессионный вектор // 2335507

Препараты в форме растворов, содержащие антитела // 2335299

Изобретение относится к области медицины, а именно к производству лекарственных средств. .

Иммунотерапия злокачественных заболеваний в-клеток и аутоиммунных заболеваний с применением конъюгированных и неконъюгированных антител, комбинаций антител и слитых белков // 2335297

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунотерапии. .

Способ получения гипериммунной сыворотки против гемофилеза и пастереллеза свиней // 2333771

Изобретение относится к области биотехнологии. .

Высококонцентрированные композиции антител и белков // 2332986

Изобретение относится к фармакологии и аллергологии и представляет собой стабильную жидкую композицию, содержащую анти-IgE-антитело или моноклональное анти-IgE-антитело, аргинин-HCI, гистидин, полисорбат и может быть использовано для подкожного введения пациенту при необходимости.

Способ очистки иммуноглобулина (варианты) // 2332247

Изобретение относится к области химико-фармацевтической промышленности и используется, в частности, для получения лекарственных средств, очищенных с помощью методов хроматографии.

Лекарственное средство для лечения гриппа у птиц // 2332236

Изобретение относится к ветеринарии и может быть использовано для лечения и профилактики гриппа у домашних птиц, преимущественно кур. .

Антитела к ростовому фактору соединительной ткани // 2330861

Изобретение относится к антителам, которые связываются с CTGF. .

Препарат гетерологичного антирабического иммуноглобулина для внутривенного и внутримышечного введения и способ его получения // 2339401

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к производству медицинских биологических препаратов