Набор олигонуклеотидных праймеров для идентификации рнк вируса бешенства в образцах

Изобретение относится к области биотехнологии и генетической инженерии. Предложен диагностический набор праймеров для идентификации вируса бешенства, циркулирующего на территории Российской Федерации. Изобретение может быть использовано в медицине для выявления генетического материала вируса бешенства в полевых и клинических образцах. 2 табл.

 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и может быть использовано в медицине для выявления генетического материала вируса бешенства в полевых и клинических образцах.

Заявляемый объект представляет собой продукт химического синтеза олигодезоксирибонуклеотидной природы, предназначенный для индикации РНК лиссавирусов в патологическом материале. При помощи этого набора диагностических праймеров возможно экспресс-определение наличия генетического материала вирусов бешенства, принадлежащих к генотипу 1.

Бешенство - острое инфекционное заболевание центральной нервной системы, поражающее широкий круг хозяев, включая и человека. Это заболевание вызывается вирусом с аналогичным названием: вирус бешенства (Rabies virus), представителем рода Lyssavirus, семейства Rhabdoviridae. Род Lyssavirus объединяет семь генотипов. Генотип 1 представлен классическими штаммами вируса бешенства (rabies virus), которые циркулируют во всем мире. Генотипы 2-7 включают rabies-related (non-rabies) вирусы: Lagos bat virus (генотип 2), Mokola virus (генотип 3), Duvenhage virus (генотип 4), European bat lyssavirus 1 (EBLV1) и 2 (EBLV2) (генотипы 5 и 6 соответственно) и Australian bat lyssavirus (генотип 7). Вирус бешенства (генотип 1) поддерживается в природе межвидовой передачей практически повсеместно (кроме Австралии и некоторых островов) среди представителей Carnivora и Microchiroptera.

Геном представлен единой 1-спиральной линейной молекулой минус-РНК состоит из 11932 нуклеотидов. Вирионная РНК рабдовирусов не обладает инфекционностью. В вирионах рабдовирусов обнаружено 5 полипептидов (гликопротеин G, матриксный белок М, нуклеопротеин N, фосфопротеин NS, обратная транскриптаза L (РНК-зависимую РНК-полимераза)), 3 из которых (L, NS, N) связаны с нуклеокапсидом, а 2 (G, М) входят в состав липопротеидной оболочки. Белок G гликозилирован, образует на поверхности вириона выступы и индуцирует синтез вирус нейтрализующих антител и обеспечивает развитие иммунитета. Белки нуклеокапсида N и NS имеют группоспецифические антигенные детерминанты. Белки нуклеокапсида L и NS являются компонентами траскриптазы. Гены расположены в следующем порядке: 3'-N-NS-M-G-L-5'.

Одним из широко используемых методов детекции РНК вируса бешенства является обратнотранскриптазная полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР) (Nadin-Davis SA, Huang W, Wandeler AI. The design of strain-specific polymerase chain reactions for discrimination of the racoon rabies virus strain from indigenous rabies viruses of Ontario. J Virol Methods. 1996 Mar; 57(l):l-14) [1]. С помощью ПЦР диагноз можно поставить за 8 часов. Кроме того, применение автоматического секвенирования позволяет получить характеристику изолятов в течение 16 часов.

В большинстве случаев ПЦР применяют для штаммовой дифференциации вируса бешенства [1]. В частности, применена ПЦР для дифференциации штаммов вируса бешенства енотов от местных вирусов бешенства, циркулирующих в Онтарио. Использование праймеров к гену нуклеопротеина в мультиплексной ПЦР позволило быстро дифференцировать бешенство енотов от изолятов других видов животных из Онтарио и в соответствии с этим принимать меры борьбы. Кроме этого, возможно применение ОТ-ПЦР для прижизненного обнаружения вирусной РНК. Известна возможность выделения РНК в слюне инфицированных животных и в биоптате слюнной железы.

Наиболее близким набором олигонуклеотидных праймеров для диагностики вируса бешенства является набор, сконструированный американскими исследователями (Gupta PK, Singh RK, Sharma RN, Rao YU, Butchaiah G. Preliminary report on a single-tube, non-interrupted reverse transcription-polymerase chain reaction for the detection of rabies virus in brain tissue. Vet Res Commun. 2001 Apr;25 (3):239-47) [2].

Однако при использовании указанного набора праймеров выявить наличие лиссавирусов в головном мозге летучих мышей, обитающих на территории Российской Федерации, не удалось.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является конструирование диагностического набора праймеров на консервативную область гена нуклеопротеина фиксированного штамма вируса бешенства CVS, циркулирующего на территории Российской Федерации.

Указанный технический результат достигается созданием набора олигонуклеотидных праймеров для идентификации вируса бешенства, циркулирующего на территории Российской Федерации, в полевых и клинических образцах, имеющего следующую структуру:

Название	Позиция	Ген	Последовательность (5'-3')
Rab134F	134-159	N	ATCGTRGAYCAATATGAGTACAAGTA
Rab1292R	1311-1292	N	CNTCCATTCATCATGATTCG
Rab299F	299-318	N	GCAATGCAGTTCTTTGAGGG
Rab857R	877-857	N	TATCTCTTCTTCAAAGTTCTT

К моменту разработки нового заявляемого набора праймеров, опубликованных данных по молекулярно-генетическому изучению вирусов бешенства, циркулирующих на территории Новосибирской области и России в целом, не известно. Не изученным оставался вопрос о циркуляции вирусов бешенства в популяции летучих мышей на территории Новосибирской области, какие генотипы они несут. Таким образом заявляемый объект изобретения обладает критериями новизна, изобретательский уровень и промышленная применимость.

Методика конструирования заявляемых олигонуклеотидных праймеров

Конструирование праймеров осуществлялось путем сравнения нуклеотидных последовательностей различных штаммов лиссавирусов, депонированных в международной базе данных Gene Bank.

Для этого были рассчитаны и синтезированы олигонуклеотидные праймеры на район гена нуклеопротеина (ГНЦ ВБ «Вектор»), координаты праймеров приведены для последовательности АВ085828 (табл. 1):

Таблица 1 Праймеры для амплификации фрагментов генома лиссавирусов
Название	Позиция	Ген	Последовательность (5'-3')
Rab134F	134-159	N	ATCGTRGAYCAATATGAGTACAAGTA
Rab1292R	1311-1292	N	CNTCCATTCATCATGATTCG
Rab299F	299-318	N	GCAATGCAGTTCTTTGAGGG
Rab857R	877-857	N	TATCTCTTCTTCAAAGTTCTT

Апробация праймеров была осуществлена с использованием большого числа изолятов вируса бешенства, выделенных от различных видов диких и домашних животных на территории Новосибирской области, Алтайского и Красноярского края. Было показано, что применение данных праймеров для индикации РНК вируса бешенства в образцах головного мозга обеспечивает синтез фрагментов ДНК рассчитанного размера (558 п.о.) в условиях ОТ-ПЦР. Специфичность продуктов амплификации была подтверждена методом прямого секвенирования.

Характеристика набора праймеров и участка амплифицируемой геномной РНК

Праймеры фланкируют консервативный участок гена нуклеопротеина вируса бешенства, кДНК который не имеет полиндромных повторов нуклеотидов и не образует выраженных вторичных структур, не имеет протяженных G-C участков. Для пар праймеров расчетная температура плавления была близкой и составила Tm=52°С. Специфичность образующегося фрагмента кДНК устанавливали прямым секвенированием полученного фрагмента, используя праймеры Rab134F и Rab1292R, Rab299F и Rab857R, что и было выполнено для большого количества штаммов и изолятов вируса бешенства, выделенных в Новосибирской области от больных бешенством животных.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Выделение РНК вируса бешенства из образцов головного мозга больных бешенством животных.

Для оценки эффективности использования нашего изобретения было исследовано 132 образца головного мозга от различных видов диких и домашних животных. О наличии в исследуемом материале вируса бешенства судили на основании результатов МФА и биологической пробы.

В качестве положительного контроля был использован вирус бешенства штамма CVS, который был передан в коллекцию ГНЦ ВБ «Вектор» из Всероссийского Государственного Научно-исследовательского Института Контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов Министерства Сельского Хозяйства Российской Федерации (г.Москва).

Кроме этого, было проведено исследование материала от летучих мышей, отловленных в Новосибирской области и в Алтайском крае. Суммарно было отловлено 52 летучие мыши видов Myotis daubentonii Kuhl, 1819, Myotis brandtii Eversman, 1845, Murina leucogaster Milne-Edwards, 1872, Plecotus auritus L., 1758.

После первичного анализа мозга летучих мышей на наличие антигена лиссавируса в МФА положительные пробы исследовали методом ОТ-ПЦР.

100mg мозговой ткани гомогенизировали в 200μl 3М ацетата натрия (рН 5.2). К образцам добавляли 10 объемов RNAzol^® (GibcoBRL) и инкубировали при 65°С в течение 15 мин., затем добавляли 300μl хлороформа и отделяли водную фазу, эту процедуру повторяли дважды. Добавляли 500μl охлажденного изопропанола, центрифугировали при 14000 об/мин 20 мин при 4°С (Hermle Z233 МК-2, Германия). Выделенную РНК отмывали 70% этанолом.

Пример 2. Получение кДНК методом обратной транскрипции.

К сухому осадку, содержащему выделенную РНК, добавляли следующую смесь: по 10 нмоль каждого из дезоксинуклеотидтрифосфатов, l,5mM MgCl₂, 10mМ Трис-HCl (рН 8,3 при +25°С), 50mM NaCl, 0,01M дитиотрейтола и 25 пмоль специфической затравки. Синтез кДНК проводили при +37°С 1 час с 50 ед. M-MulV (Boehringer Mannheim).

Пример 3. Проведение полимеразной цепной реакции.

Использовали следующие параметры ПЦР: 94°С 10 с, 56°С 30 с с понижением температуры на 1°С за цикл, 72°С 1 мин - 6 циклов, затем 94°С 10 с, 50°С 15 с, 72°С 30 сек 35 циклов. Завершающий синтез проводили 7 мин 72°C «Eppendorf Mastercycler Gradient», Германия). Праймеры Rab134F и Rab1311R использовали для первого раунда ПЦР, праймеры Rab299F и Rab877R - для второго раунда. В качестве реакционного буфера для ОТ-ПЦР использовали: 30 мМ Tris-HCl (pH 8,5 при ±25°С); 16 мМ (NH₄)₂SO₄; 1,5 мМ MgCl₂; 0,1% Nonidet P40; по 160 μМ dATP, dCTP, dGTP, dTTP; no 0,15 μМ олигонуклеотидов; 0,35 ед. Taq-ДНК полимераза («СибЭнзим», Россия).

Пример 4. Определение нуклеотидной последовательности.

Определение нуклеотидной последовательности выделенного ПЦР фрагмента проводили на «Beckman CEQ2000XL DNA Analysis System» («Beckman Coulter, Inc.») по методу Sanger et al. [9] согласно инструкции к «Beckman sequencing Kit». Нуклеотидные и выведенные аминокислотные последовательности были анализированы с использованием программы MEGA (PSU, США) и DNASTAR (DNAStar Inc., США).

Результат исследований: у полученных ПЦР-продуктов (558 пар нуклеотидов) были определены нуклеотидные последовательности и выведены аминокислотные последовательности.

Специфичность набора праймеров была подтверждена при исследовании заведомо положительных образцов, прямым секвенированием полученного ПЦР-фрагмента. В табл. 2 приведены данные о происхождении образцов материала, для которых были определены нуклеотидные и выведены аминокослотные последовательности.

Следует отметить, что в ОТ-ПЦР с использованием заявляемого набора праймеров в головном мозге летучих мышей были обнаружены фрагменты гена нуклеопротеина лиссавирусов генотипа 1, для которых были определены нуклеотидные и затем выведены аминокислотные последовательности. Следует отметить, что при использовании набора праймеров-аналогов (прототип, [2]) выявить наличие лиссавирусов в головном мозге летучих мышей не удалось.

Таблица 2 Данные об образцах материала, в которых была обнаружена, выделена РНК лиссавирусов и определена нуклеотидная последовательность
№п/п	Обозначения штаммов	Номера последовательностей	Длина секвенированного фрагмента	Вид животного
1.	BAT-YN1	DQ860254	514 bp	водяная ночница (Myotis daubentonii Kuhl 1819)
2.	BAT-BN1	DQ860249	409 bp	водяная ночница (Myotis daubentonii Kuhl 1819)
3.	BAT-BA	DQ860256	514 bp	бурый ушан (Plecotus auritus L., 1758)
4.	BAT-PA	DQ860255	473 bp	водяная ночница (Myotis daubentonii Kuhl 1819)
5.	BADG-4983	DQ517525	514 bp	барсук обыкновенный (Meles meles)
6.	FOX-3728	DQ860250	409 bp	лисица обыкновенная (Vulpes vulpes)
7.	FOX-41135	DQ860247	409 bp	Корсак (Vulpes velox)
8.	CAT-41979	DQ860248	409 bp	Кошка (Felis sp.)
9.	FOX-49355	не депонирован	220 bp	лисица обыкновенная (Vulpes vulpes)
10.	FOX-51093	DQ860251	409 bp	лисица обыкновенная (Vulpes vulpes)
11.	FOX-52099	DQ860252	409 bp	лисица обыкновенная (Vulpes vulpes)
12.	FOX-1153	DQ860253	450 bp	лисица обыкновенная (Vulpes vulpes)
13.	COW-2502	DQ860246	460 bp	KPC (Bovine)
14.	HOR-19549	- не депонирован	220 bp	лошадь
15.	DOG-33650	- не депонирован	220 bp	собака (Canis sp.)
16.	DOG-35093	- не депонирован	220 bp	собака (Canis sp.)
17.	COW-38442	- не депонирован	220 bp	KPC (Bovine)
18.	DOG-49142	- не депонирован	220 bp	собака (Canis sp.)
19.	MAN-44	- не депонирован	514 bp	человек

При исследовании отрицательных контрольных образцов положительных результатов получено не было.

Таким образом, разработка заявленного набора праймеров позволила получить данные о некоторых генетических характеристиках вирусов бешенства, циркулирующих на территории Новосибирской области среди диких и домашних животных, а также выявить наличие лиссавирусов генотипа 1 у летучих мышей на указанной территории.

Набор олигонуклеотидных праймеров для идентификации РНК вируса бешенства в образцах, содержащий две пары олигонуклеотидов, обладающих активностью прямого и обратного праймеров в реакции, обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции, имеет следующую структуру:

Rab134F

5'-(26 п.н.)

ATCGT(A,G)GA(T,C)CAATATGAGTACAAGTA-3'

Rab1292R 5'-C(A,G,C,T)TCCATTCATCATGATTCG-3' (20 п.н.)

Rab299F 5'-GCAATGCAGTTCTTTGAGGG-3' (20 п.н.)

Rab857R 5'-TATCTCTTCTTCAAAGTTCTT-3' (21 п.н.)