Полинуклеотид, кодирующий белок с функциональной активностью переносчика глюкозы, и белок с функциональной активностью переносчика глюкозы

Изобретение относится к области генной инженерии и биотехнологии и может быть использовано в фармацевтической промышленности. Очищенный и выделенный полинуклеотид кодирует белок с функциональной активностью переносчика глюкозы и аминокислотной последовательностью белка GLUT4, в которой валин в положении 85 заменен метионином. Данный белок биологически активен в экспрессирующих его штаммах дрожжей S. cerevisiae, которые лишены функциональных переносчиков глюкозы и белка Erg4. Применение изобретения позволяет получить белок с функциональной активностью переносчика глюкозы в дрожжевой экспрессионной системе. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 3 табл.

 

Изобретение относится к штаммам дрожжей, в которых человеческий переносчик Glut 4 и Glut 1 может функционально экспрессироваться.

Большинство гетеротрофных клеток транспортирует глюкозу во внутренние отделы клетки через специальные протеины-переносчики. В различных организмах устанавливаются разные механизмы, которые способствуют транспорту глюкозы, такие как, в особенности, протеиновые симпорт-системы, Na⁺-переносчики глюкозы, зависимые от связывания протеинов системы, фосфотрансферазные системы, а также системы для облегченной диффузии. В случае эукариот поглощение глюкозы через облегченную диффузию опосредует семейство переносчиков глюкозы, которые кодируются в случае млекопитающих GLUT-генами (GLUT=переносчик глюкозы) и в случае Saccharomyces cerevisiae - НХТ-генами (НХТ=переносчик гексозы). Эти переносчики причисляют к более крупному семейству переносчиков сахара. Они отличаются наличием 12 трансмембранных спиралей и несколькими консервативными аминокислотными остатками.

Транспорт глюкозы играет большую роль при заболеваниях, которые ассоциированы с дефектным гомеостазом глюкозы, как, например, сахарный диабет или синдром Фанкони-Биккеля. Транспорт глюкозы у млекопитающих поэтому является объектом многочисленных исследований. Вплоть до настоящего момента идентифицированы тринадцать протеинов, подобных переносчикам глюкозы, (от GLUT1 до GLUT12, HMIT-H-мио-инозитол-переносчик). К ключевым ролям этих переносчиков относят поглощение глюкозы в различных тканях, их накопление в печени, их инсулинзависимое поглощение в мышечных клетках и адипоцитах, а также изменение уровня глюкозы за счет Я-клеток поджелудочной железы.

GLUT1 опосредует транспорт глюкозы в эритроциты и через гематоэнцефалический барьер, однако, также экспрессируется во многих других тканях, в то время как GLUT4 ограничен инсулинзависимой тканью, в первую очередь мышечной и жировой тканью. В случае этих инсулинзависимых тканей контроль в отношении нацеливания GLUT4-переносчиков во внутриклеточные компартменты или компартменты клеточных мембран представляет собой важный механизм регуляции поглощения глюкозы. В присутствии инсулина внутриклеточный GLUT4 обратно распределяется на клеточной мембране для облегчения поглощения глюкозы. GLUT1 также экспрессируется в этих инсулинзависимых тканях и его распределение в клетке также находится под влиянием инсулина, однако, в меньшей степени. Сверх того, относительная эффективность, с которой GLUT1 или GLUT4 катализируют транспорт сахара, определяется не только величиной конъюгирования каждого переносчика с поверхностью клетки, но и также их кинетическими свойствами.

Тот факт, что различные изоформы переносчиков глюкозы коэкспрессируются, а также быстрый метаболизм глюкозы, усложняет исследования роли и конкретных свойств каждой изоформы переносчика глюкозы в этих инсулинзависимых тканях. Для решения этой проблемы используют гетерологичные системы экспрессии, как Xenopus-ооциты, клетки культуры тканей, клетки насекомых и дрожжевые клетки. Однако подчеркивается, что в случае этих систем возникает ряд затруднений: слишком слабая активность гетерологично экспрессированных переносчиков, собственные переносчики глюкозы в этих системах, внутриклеточная ретенция значительной части переносчиков или даже продуцирование неактивных переносчиков.

Естественно встречающийся протеин GLUT4 млекопитающих, в особенности таковой человека, может в определенных условиях функционально экспрессироваться в штаммах Saccharomyces cerevisiae. Дрожжевыми клетками являются одноклеточные эукариотические организмы. Поэтому для некоторых протеинов они лучше пригодны для экспрессии, чем бактериальные системы, в особенности для осуществления скрининга для идентификации фармацевтически активных веществ.

Настоящее изобретение относится к очищенному и выделенному полинуклеотиду, включающему последовательность ДНК, которая кодирует протеин GLUT4V85M. В этом протеине в положении 85 аминокислотной цепи человеческого протеина GLUT4 аминокислота валина заменена на метионин. Этот измененный протеин GLUT4V85M открывает дальнейшие альтернативы в отношении экспрессии функционального протеина GLUT4. Протеин GLUT4 в связи с Saccharomyces cerevisiae следует рассматривать как функциональный, если в штамме Saccharomyces cerevisiae, все переносчики глюкозы которого неактивны (=hxt(-)), после экспрессии этого протеина GLUT4 наблюдается поглощение глюкозы. Поглощение глюкозы может быть установлено либо путем измерения транспорта с помощью радиоактивно меченной глюкозы, либо по росту на среде с глюкозой как единственного источника углерода.

Очищенный и выделенный полинуклеотид, включающий последовательность ДНК, которая кодирует протеин GLUT4V85M, согласно предпочтительному варианту осуществления, может включать последовательность следующих групп или состоять из них:

а) нуклеотидная последовательность, согласно идентифицированной последовательности Seg ID № 1;

b) нуклеотидная последовательность, которая в строгих условиях гибридизируется с последовательностью Seg ID № 1 и кодирует протеин GLUT4V85M.

Очищенный и выделенный полинуклеотид предпочтительно кодирует протеин GLUT4V85M, обладающий аминокислотной последовательностью Seg ID № 2. Очищенный и выделенный полинуклеотид, включающий последовательность ДНК, которая кодирует, как описано выше, протеин GLUT4V85M, оперативным образом может быть связан с промотором. В качестве промотора используют в особенности прокариотические или эукариотические промоторы, как, например, Lac-, trp-, ADH- или HXT7-промотор. Часть полинуклеотида кодирующая протеин GLUT4V85M точно связана оперативным образом с промотором, если при использовании этого промотора при помощи вектора в бактериальном или эукариотическом организме образуется мРНК, которая может транслироваться в протеин GLUT4V85M. Таким вектором является, например, вектор p4H7GLUT4V85M (Seg ID № 3). Протеин GLUT4V85M может экспрессироваться в дрожжевых клетках с помощью этого вектора.

Вышеописанный полинуклеотид, включающий последовательность ДНК, которая кодирует протеин GLUT4V85M, согласно предпочтительному варианту осуществления, пригоден для репликации этого полинуклеотида в дрожжевой клетке или для экспрессии части полинуклеотида, кодирующей протеин GLUT4V85M в протеин GLUT4V85M в дрожжевой клетке. В качестве дрожжевой клетки в особенности пригодна клетка Saccharomyces cerevisiae. Для репликации и экспрессии в дрожжевой клетке полинуклеотид, включающий последовательность ДНК, которая кодирует протеин GLUT4V85M, находится в виде дрожжевого вектора. Область полинуклеотида кодирующая протеин GLUT4V85M оперативным образом может быть связана со специфичным для дрожжевых клеток промотором, как, например, с ADH-промотором (промотор алкогольдегидрогеназа) или РХТ7-промотором (промотор переносчик гексозы). В случае дрожжевых векторов речь идет о группе векторов, которая создана для клонирования ДНК в дрожжах.

Изобретение относится, далее, к дрожжевой клетке Saccharomyces cerevisicae, в которой все переносчики глюкозы более не являются функциональными (=hxt(-)) и в которой не содержится функциональный протеин Erg4. В случае такой дрожжевой клетки речь идет предпочтительно о дрожжевой клетке, депонированной в DSMZ (Немецкая коллекция микроорганизмов и клеточных культур ГмбХ, Mascheroder Weg 16, 38124 Брауншвейг) в качестве Saccharomyces cerevisiae DSM 15187.

Изобретение относится также к дрожжевой клетке, в которой все переносчики глюкозы более не являются функциональными и в которой не содержится функциональный протеин Fgy1 и функциональный протеин Erg4. Отсутствие протеина Erg4 или протеина Fgy1 может сводиться в особенности к разрыву соответствующего кодирующего участка генома или к частичному или полному удалению кодирующего участка генома.

В качестве дрожжевой клетки, которая не содержит функциональных переносчиков глюкозы, функционального протеина Fgy1 и никакого функционального протеина Erg4, предпочтительно используют дрожжевую клетку, депонированную в DSMZ в качестве Saccharomyces cerevisiae DSM 15184.

Дрожжевую клетку, как описанная выше, предпочтительно используют для экспрессии (= выражение) протеина GLUT1 или протеина GLUT4 млекопитающего в особенности такого, как крыса, мышь, кролик, свинья, крупный рогатый скот или человекообразные обезьяны. Согласно предпочтительному варианту осуществления, дрожжевую клетку используют для экспрессии человеческого протеина GLUT4 или GLUT1.

Дрожжевая клетка Saccharomyces cerevisiae, все переносчики глюкозы, а также протеин Erg4 которой не являются более функциональными, может содержать полинуклеотид согласно настоящему изобретению, который включает последовательность ДНК, кодирующую протеин GLUT4V85M. Эта дрожжевая клетка также может экспрессировать протеин GLUT4V85M и тем самым содержать этот протеин.

Такой штамм дрожжей, содержащий полинуклеотид, который включает последовательность ДНК, кодирующую протеин GLUT4V85M, представляет собой предпочтительно депонированный в DSMZ штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae DSM 15185.

Дрожжевую клетку, все переносчики глюкозы, а также протеин Erg4 которой более не являются функциональными, которая содержит полинуклеотид, включающий последовательность ДНК, кодирующую протеин GLUT4V85M, можно получать, например, тем, что

а) получают дрожжевую клетку, все переносчики глюкозы, а также протеин Erg4 которой более не являются функциональными;

b) получают выделенный и очищенный полинуклеотид, который включает последовательность ДНК, кодирующую протеин GLUT4V85M, и который может реплицироваться в дрожжевой клетке;

с) дрожжевую клетку из а) трансформируют с помощью полинуклеотида из b);

d) трансформированную дрожжевую клетку селекционируют;

е) в случае необходимости, экспрессируют протеин GLUT4V85M.

Выделенный и очищенный полинуклеотид, который включает последовательность ДНК, кодирующую протеин GLUT4V85M, представляет собой предпочтительно реплицируемый в дрожжевой клетке вектор, в котором клонируется последовательность ДНК. Таким вектором является, например p4H7GLUT4V85M (Seg ID № 3).

Изобретение относится также к дрожжевой клетке, все переносчики глюкозы, а также протеины Egy1 и Erg4 которой более не являются функциональными, и которая содержит полинуклеотид, который включает последовательность ДНК, кодирующую протеин GLUT4V85M. Эта дрожжевая клетка также может экспрессировать протеин GLUT4V85M и тем самым содержать этот протеин. Такой штамм дрожжей представляет собой предпочтительно депонированный в DSMZ штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae DSM 15186.

Дрожжевую клетку, все переносчики глюкозы, а также протеин Fgy1, как и протеин Erg4 которой более не являются функциональными и которая содержит полинуклеотид, включающий последовательность ДНК, кодирующую протеин GLUT4V85M, можно получать, например, тем, что

а) получают дрожжевую клетку, все переносчики глюкозы, а также протеин Fgy1, как и Erg4 которой более не являются функциональными;

b) получают выделенный и очищенный полинуклеотид, который включает последовательность ДНК, кодирующую протеин GLUT4V85M, и который может реплицироваться в дрожжевой клетке;

с) дрожжевую клетку из а) трансформируют с помощью полинуклеотида из b);

d) трансформированную дрожжевую клетку селекционируют;

е) в случае необходимости, экспрессируют протеин GLUT4V85M.

Вышеуказанный выделенный и очищенный полинуклеотид, который включает последовательность ДНК, кодирующую протеин GLUT4V85M, предпочтительно представляет собой реплицируемый в дрожжевой клетке вектор, в котором клонируется последовательность ДНК. Таким вектором является, например p4H7GLUT4V85M (Seg ID № 3).

Изобретение относится также к дрожжевой клетке, все переносчики глюкозы которой более не являются функциональными, которая содержит полинуклеотид, включающий последовательность ДНК, которая кодирует протеин GLUT4V85M.

Эта дрожжевая клетка может также экспрессировать протеин GLUT4V85M и тем самым содержать этот протеин. Такой штамм дрожжей представляет собой предпочтительно депонированный в DSMZ штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae DSM 15188.

Дрожжевую клетку, все переносчики глюкозы которой более не являются функциональными и которая содержит полинуклеотид, включающий последовательность ДНК, которая кодирует протеин GLUT4V85M, можно получать, например, тем, что

а) получают дрожжевую клетку, все переносчики глюкозы которой более не являются функциональными;

b) получают выделенный и очищенный полинуклеотид, который включает последовательность ДНК, кодирующую протеин GLUT4V85M, и который может реплицироваться в дрожжевой клетке;

с) дрожжевую клетку из а) трансформируют с помощью полинуклеотида из b);

d) трансформированную дрожжевую клетку селекционируют;

е) в случае необходимости, экспрессируют протеин GLUT4V85M.

В случае вышеуказанного выделенного и очищенного полинуклеотида, который включает последовательность ДНК, кодирующую протеин GLUT4V85M, речь идет предпочтительно о реплицируемом в дрожжевой клетке векторе, в котором клонируется последовательность ДНК. Таким вектором является, например, p4H7GLUT4V85M (Seg ID № 3).

Изобретение также относится к протеину с аминокислотной последовательностью согласно Seg ID № 2. Этот протеин представляет собой человеческий протеин GLUT4, в котором в положении 85 аминокислотной цепи валин заменен метионином.

Изобретение относится также к способу идентификации соединения, которое стимулирует активность протеина GLUT4, отличающемуся тем, что

а) получают дрожжевую клетку, все переносчики глюкозы, а также протеин Erg4 которой более не являются функциональными и которая содержит полинуклеотид, включающий последовательность ДНК, которая кодирует протеин GLUT4V85M;

b) получают химическое соединение;

с) дрожжи из а) вводят в контакт с химическим соединением из b);

d) определяют поглощение глюкозы дрожжами из с);

е) определенное значение поглощения глюкозы из d) соотносят к определенному значению поглощения глюкозы в дрожжевой клетке согласно а), которую не вводили в контакт с химическим соединением согласно b), причем соединение, которое вызывает увеличение поглощенного количества глюкозы в дрожжах согласно d), стимулирует активность протеина GLUT4V85M. В случае соединений, которые стимулируют активность протеина GLUT4V85M, нужно считать, что они также стимулируют активность GLUT4.

Изобретение относится также к лекарственному средству, которое содержит соединение, идентифицированное вышеописанным способом, а также, далее, добавки и вспомогательные вещества для приготовления лекарственного средства. Далее, изобретение относится к применению соединения, идентифицированного вышеописанным способом, для получения лекарственного средства для лечения диабета типа I и/или II.

Изобретение относится также к лекарственному средству, содержащему соединение, которое идентифицировано вышеописанным способом, а также добавки и вспомогательные вещества для приготовления лекарственного средства. Далее, изобретение относится к применению соединения, которое идентифицировано вышеописанным способом, для получения лекарственного средства для лечения диабета.

Далее, изобретение относится к применению соединения, идентифицированного вышеописанным способом, для получения лекарственного средства для лечения диабета.

Настоящее изобретение относится также к способу идентификации соединения, которое ингибирует протеин, кодирующий ген Erg4, отличающемуся тем, что

а) получают дрожжевую клетку, все переносчики глюкозы которой более не являются функциональными и которая содержит полинуклеотид, включающий последовательность ДНК, которая кодирует протеин GLUT4V85M и может реплицироваться в дрожжевой клетке;

b) получают химическое соединение;

с) дрожжи из а) вводят в контакт с химическим соединением из b);

d) определяют поглощение глюкозы дрожжами из с);

е) определенное значение поглощения глюкозы из d) соотносят к определенному значению поглощения глюкозы в дрожжевой клетке согласно а), которую не вводили в контакт с химическим соединением согласно b), причем соединение, которое вызывает повышение поглощенного количества глюкозы в дрожжах согласно d), ингибирует активность протеина Erg4.

Изобретение относится, далее, к способу идентификации соединения, которое ингибирует соответствующий протеин гена FGY1, отличающемуся тем, что

а) получают дрожжевую клетку, все переносчики глюкозы и протеин Erg4 которой более не являются функциональными и которая содержит протеин GLUT4;

b) получают химическое соединение;

с) дрожжи из а) вводят в контакт с химическим соединением из b);

d) определяют поглощение глюкозы дрожжами из с);

е) определенное значение поглощения глюкозы из d) соотносят к определенному значению поглощения глюкозы в дрожжевой клетке согласно а), которую не вводили в контакт с химическим соединением согласно b), причем соединение, которое вызывает повышение поглощенного количества глюкозы в дрожжах согласно d), ингибирует активность протеина Fgy1.

Изобретение относится также к лекарственному средству, содержащему соединение, идентифицированное вышеописанным способом, а также добавки и вспомогательные вещества для приготовления лекарственного средства.

Изобретение поясняется ниже подробнее в отношении технических деталей.

Гибридизация означает связывание двух однонитиевых нуклеиновых кислот, которые обладают комплементарными последовательностями оснований, с образованием двунитиевых молекул. Гибридизация может происходить между двумя нитями ДНК, одной нитью ДНК и одной нитью РНК, а также между двумя нитями РНК. В принципе, гибридные молекулы можно получать тем, что участвующие в гибридизации нуклеиновые кислоты, которые могут быть сначала двунитиевыми, нагревают настолько, что они распадаются на однонитиевые молекулы без вторичной структуры. Это происходит, например, за счет кипячения на водяной бане в течение 10 минут. Затем оставляют медленно охлаждаться. Во время фазы охлаждения происходит сочетание парами комплементарных цепей с образованием двунитиевых гибридных молекул. Гибридизацию осуществляют в лабораторных условиях обычно при помощи фильтров для гибридизации, на которые путем блоттинга или электрофореза наносят однонитиевые или денатурируемые полинуклеотидные молекулы. Гибридизацию соответствующих комплементарных полинуклеотидных молекул можно визуализировать тем, что эти гибридизируемые полинуклеотидные молекулы снабжают радиоактивной флуоресцирующей меткой. Описываются требования к степени соответствия или точности в отношении пригодности определенных условий. При высоких требованиях к соответствию являются более высокими, чем в случае более низких требований контролирования. При гибридизации нуклеиновых кислот, в зависимости от применения и поставленной задачи, устанавливают определенные, различные в отношении требований, условия. При высоких требованиях, реакционные условия при гибридизации устанавливают так, что в реакцию гибридизации друг с другом могут вступать только очень хорошо подходящие друг другу комплементарные молекулы. Более низкие требования к строгости реакционных условий позволяют осуществляться также частичной гибридизации молекул с более или менее большими участками непарных оснований или оснований, у которых отсутствуют пары.

Условия гибридизации нужно понимать как строгие с точки зрения требований в особенности, если гибридизацию осуществляют в водном, содержащем 2xSSC растворе при температуре 68°С по меньшей мере в течение 2 часов и затем промывают сначала в течение 5 минут в содержащем 2xSSC/0,1% SDS растворе при комнатной температуре, затем в течение 1 часа в содержащем 1xSSC/0,1% SDS растворе при температуре 68°С и в течение 1 следующего часа в содержащем 0,2% SSC/0,1% SDS растворе при температуре 68°С.

2xSSC-, 1xSSC-, соответственно, 0,2xSSC-Раствор приготовляют путем соответствующего разведения 20xSSC-раствора. 20xSSC-Раствор содержит 3 моль/л NaCl и 0,3 моль/л цитрата натрия. Значение рН составляет 7,0. Специалисту известны способы гибридизации полинуклеотидов в строгих условиях. Соответствующие указания находятся в справочниках, как в особенности "Current Protocols in Volecular Biology (Wiley Interscience; ответственные редакторы издания: Frederich M. Ausubel, Roger Brant, Robert E. Kingston, David. J. Moore, J.G. Seidmann, Kevin Struhl; ISBN: 0-471-50338-X).

В случае дрожжевых векторов можно различать разные подгруппы. Ylp-Векторы (дрожжевые интегрирующие плазмиды) соответствуют по существу используемым для клонирований в бактериях векторам, однако содержат селекционируемый дрожжевой ген (например, URA3, LEU2).

Только если после введения этого вектора приходят к интеграции чужеродной ДНК в дрожжевую хромосому, эти последовательности реплицируются вместе с хромосомой и стабильно передаются при возникновении клона во все дочерние клетки.

Исходя из этого способа получают плазмиды, которые могут автономно реплицироваться на основании эукариотических ORls (сайт инициации репликации). Такие дрожжевые векторы называют YRp-векторами (дрожжевые реплицирующиеся плазмиды) или ARS-векторами (автономно реплицирующаяся последовательность). Далее, имеются YEp-векторы (дрожжевые эписональные плазмиды), которые производятся от дрожжевой плазмиды размером 2 мкм и содержат селекционируемый маркерный ген. Класс YAC-векторов (дрожжевая искусственная хромосома) ведет себя как самостоятельные хромосомы.

Дрожжевой вектор, содержащий ген для экпрессии, вводят в дрожжи, чтобы он мог экспрессироваться, путем трансформации. Для этого пригодны, например, такие способы, как электропорация или инкубация компетентных клеток за счет векторной ДНК. Пригодные промоторы экспрессии дрожжей известны специалисту. Таковыми являются, например, SOD1-промотор (супероксиддисмутаза), ADH-промотор (алкогольдегидрогеназа), промотор гена кислой фосфатазы, НХТ2-промотор (переносчик глюкозы 2), НХТ7-промотор (переносчик глюкозы 7), GAL2-промотор (переносчик галактозы) и другие. Конструкция, состоящая из промотора экспрессии дрожжей и гена для экспрессии (например, GLUT4V85M), является целью экспрессии компонента дрожжевого вектора. Этот дрожжевой вектор для осуществления экспрессии может находиться в виде самореплицирующейся частицы независимо от генома дрожжей или может быть стабильно интегрирован в геном дрожжей. В качестве дрожжевого вектора, в принципе, пригодна любая полинуклеотидная последовательность, которая может размножаться в дрожжах. В качестве дрожжевых векторов можно использовать в особенности дрожжевые плазмиды или искусственные дрожжевые хромосомы (дрожжевые искусственные хромосомы). Дрожжевые векторы содержат, как правило, "сайт инициации репликации" (2 микрона, ars) для начала репликации, а также селекционный маркер, который обычно состоит из ауксотрофного маркера или гена устойчивости к антибиотикам. В качестве дрожжевых векторов специалисту известны, например, рВМ272, pCS19, pEMBCYe23, pFL26, pG6, pNN414, pTV3, p426MET25, p4H7 и другие.

Под селекцией клетки в объеме настоящего изобретения нужно понимать ее целенаправленное обогащение на основании селекционного маркера, как, например, устойчивость к антибиотику или к возможности роста на определенной минимальной среде, а также, ее выделение и последующее культивирование на агаровой пластинке или в погруженной культуре.

К обычно используемым методам специалисты относят культивирование, трансформацию и селекцию трансформированной дрожжевой клетки, а также экспрессию протеина в дрожжевой клетке. Указания на этот счет можно найти в стандартных руководствах, как, например, Walker Graeme M. "Yeast Physiology and Biotechnology", Wiley and Sons, ISBN: 0-471-9446-8; или "Protein Synthesis and Targeting in Yeast", редакторы Alistair J.P. Brown, Mick F. Fruite and John E.G. Mc Cartly; Springer Berlin; ISBN: 3-540-56521-3; или "Methods in Yeast Genetics", 1997, A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual; Adams Alison (ред.); Cold Spring Harbor Laboratory; ISBN: 0-87969-508-0.

В случае дрожжей Saccharomyces cerevisiae известны 17 переносчиков гексозы и дополнительно три переносчика мальтозы, которые, поскольку они в достаточной степени интенсивно экспрессируются, способны транспортировать гексозы в дрожжи. Известен штамм, из которого путем делеции удалены все переносчики, которые пригодны для поглощения гексозы. Этот штамм содержит лишь еще оба гена МРН2 и МРН3, которые гомологичны протеинам транспорта мальтозы. Оба гена МРН2 и МРН3 в присутствии глюкозы репрессируются в среде. Установление характеристики этого штамма дрожжей описывается Wieczorke и др., FEBS Lett., 464, 123-128 (1999). Этот штамм не в состоянии размножаться на субстрате с глюкозой в качестве единственного источника углерода. Из этого штамма можно селекционировать мутанты, которые, исходя из соответствующего вектора GLUT1, функционально экспрессируются (штамм hxt fgy1-1).

Если в случае дрожжевого штамма hxt fgy1-1 трансформируют плазмидный вектор, который несет ген GLUT4 под контролем дрожжевого промотора, глюкоза все же транспортируется только очень незначительно. Функциональная экспрессия GLUT4 требует дальнейших адаптаций этого дрожжевого штамма, чтобы обеспечить значительный транспорт глюкозы c помощью GLUT4. Такие дрожжевые штаммы, которые поглощают глюкозу с помощью единственного переносчика глюкозы GLUT4 в клетках, можно выделять на субстратах с глюкозой в качестве единственного источника углерода. Для этого трансформируют дрожжевой штамм hxt fgy1-1, который несет ген GLUT4 под функциональным контролем дрожжевого промотора. Трансформированные таким образом дрожжевые клетки получают на питательной среде, которая содержит глюкозу в качестве единственного источника углерода, и инкубируют на ней. После инкубации в течение нескольких дней, например, при температуре 30°С наблюдают рост отдельных колоний. Одну из этих колоний выделяют. Если из этой колонии удаляют дрожжевую плазмиду, то размножения на питательной среде с глюкозой в качестве единственного источника углерода не происходит. Если этот штамм, который теперь не содержит векторной плазмиды, снова путем трансформации снабжают дрожжевым вектором, который несет ген GLUT4 под функциональным контролем дрожжевого промотора, то этот штамм снова способен размножаться на среде с глюкозой в качестве единственного источника углерода.

Вышеуказанные дрожжевые штаммы являются объектом Международной заявки РСТ/ЕР02/01373 c датой подачи заявки 9 февраля 2002 г., которая учитывает приоритет заявки DE 10106718.6 от 14 февраля 2002 г.

Дрожжевые штаммы, все собственные переносчики гексоз (переносчики глюкозы) которых не являются более функциональными, депонированы в Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур ГмбХ (DSMZ) уже в связи с Международной заявкой РСТ/ЕР02/01373 в более ранний период времени под номером DSM 14035, DSM 14036 или DSM 14037.

Полинуклеотидные и аминокислотные последовательности GLUT4 доступны, например, под следующими регистрационными номерами в банке генов: М20747 (кДНК; человек); EMBL: D28561 (кДНК; крыса); EMBL: M23382 (кДНК; мышь); Swissprot: P14672 (протеин; человек); Swissprot: P19357 (протеин; крыса) и Swissprot: P14142 (протеин; мышь).

Полинуклеотидные последовательности и аминокислотные последовательности GLUT1 раскрыты под следующими кодовыми номерами в указанных банках данных: EMBL: М20653 (кДНК; человек); EMBL: M13979 (кДНК; крыса); EMBL: M23384 (кДНК; мышь); Swissprot: P11166 (протеин; человек); Swissprot: P11167 (протеин; крыса) и Swissprot: P17809 (протеин; мышь).

Лекарственные средства представляют собой готовые препаративные формы введения фармакологически активных веществ для лечения заболеваний или физических отсутствующих функций у человека и животного. Для пероральной терапии известны, например, порошки, гранулы, таблетки, пилюли, пастилки, драже, капсулы, жидкие экстракты, настойки, сиропы. Для наружного применения используют, например, аэрозоли, спреи, гели, мази или порошки. Парентеральное применение возможно с помощью растворов для инъекции или инфузии при использовании ампул, бутылочек или шприц-ампул. Специалисту в области фармацевтической технологии (галенового производства) известны эти и другие лекарственные средства.

Вспомогательные вещества для приготовления лекарственного средства позволяют получать композицию с активным веществом, которая обеспечивает в каждом случае применения оптимально подобранное выделение, распределение и проявление действия биологически активного вещества. Такими вспомогательными веществами, например, являются наполнители, связующие, порофоры или смазки, как лактоза, сахароза, маннит, сорбит, целлюлоза, крахмал, дикальцийфосфат, полигликоли, альгинаты, поливинилпирролидон, карбоксиметилцеллюлоза, тальк или диоксид кремния.

Диабет или сахарный диабет проявляется в выделении глюкозы с мочой при значительном повышении уровня глюкозы в крови (гипергликемия) по причине хронического нарушения обмена веществ, которое основано на недостатке инсулина или пониженном действии инсулина. Отсутствующее или пониженное действие инсулина приводит к недостаточной резорбции и использованию поглощенной кровью глюкозы клетками организма. В жировой ткани под воздействием инсулин-антагонистических гормонов происходит повышенный липолиз с увеличением количества свободных жирных кислот в крови.

При ожирении (ожирение, тучность) речь идет о ненормальном увеличении массы по причине нарушенного энергетического баланса за счет чрезмерного поглощения калорий, которое создает риск в отношении здоровья.

Определение количества гексозы, которое поглощается полученным, как только что описано выше, штаммом дрожжей, можно осуществлять посредством изучения поглощения с помощью радиоактивно меченой глюкозы. Для этого определенную концентрацию дрожжевых клеток, например, количество 60 мг, в расчете на мокрую массу, на мл, суспендируют, например, в 100 мкл буфера и смешивают с определенным количеством ¹⁴С- или ³Н-меченой глюкозы в качестве единственного источника углерода. Клетки инкубируют и в определенные моменты отбирают определенные количества клеток. Определение поглощенного количества глюкозы осуществляют с помощью LSC (жидкостной сцинтилляционный счетчик). Определение количества гексозы, которое поглощается полученным, как только что описано, штаммом дрожжей, однако также можно осуществлять с помощью теста в отношении роста на средах с глюкозой в качестве единственного источника углерода. Для этого определяют скорость роста штамма после добавления соединения, например, путем регулярных измерений оптической плотности культуры при 600 нм и эти значения сравнивают со скоростью роста контрольного штамма (например, дрожжевой штамм дикого типа).

Соединение получают, в частности, путем химического синтеза или путем выделения химических веществ из биологических организмов. Химический синтез можно осуществлять также автоматизированно. Получаемые путем синтеза или выделения соединения можно растворять в пригодном растворителе. Пригодными растворителями являются в особенности водные растворы, которые содержат определенную долю органического растворителя, как, например, диметилсульфоксид.

Введение в контакт штамма дрожжей с соединением для идентификации соединения, согласно настоящему изобретению, осуществляют в особенности в предусмотренных для этой цели лабораторных робототехнических устройствах. Такие устройства могут состоять из специально изготовленных камер с углублениями, титрационных микропланшетов, сосудов Эппендорфа или лабораторной стеклянной посуды. Лабораторные робототехнические устройства, как правило, разработаны в расчете на высокие скорости пропускания. Способ, как указанный выше, осуществляемый с помощью лабораторного робототехнического устройства, поэтому называют также как HTS (высокопроизводительный скрининг).

Последовательность Seg ID № 1 представляет собой полинуклеотидную последовательность, включающую кодирующую область протеина GLUT4V85M. Seg ID № 2 представляет собой аминокислотную последовательность протеина GLUT4V85M. Seg ID № 3 представляет собой полинуклеотидную последовательность вектора p4H7GLUT4V85M.

Примеры

Применение штаммов дрожжей

Все, описанные в настоящей работе штаммы дрожжей, происходят от штамма CEN-PK2-1C (MATa leu2-3, 112 ura3-52 trp1-289 his3-Δ1MAL2-8^cSUC2). Получение штамма дрожжей с делециями в генах переносчиков гексозы (НХТ) описано Wieczorke и др., FEBS Lett., 464, 123-128 (1999): EBY-18ga (MATa Δhxt1-17 Δgal2 Δagt1 Δstl1 leu2-3, 112 ura3-52 trp1-289 his3-Δ1 MAL2-8^cSUC2); EBY.VW4000 (MATa Δhxt1-17 Δgal2 Δagt1 Δmph2 Δmph3 Δstl1 leu2-3, 112 ura3-52 trp1-289 his3-Δ1 MAL2-8^cSUC2). Среды основаны на 1% дрожжевого экстракта и 2% пептона (YP), в то время как минимальные среды состояли из 0,67% азотистого основания дрожжей без аминокислот (YNB) (Difco) и содержали добавки для ауксотрофных потребностей, а также различные источники углерода. Дрожжевые клетки культивировали в аэробных условиях при температуре 30°С в ротационном шейкере или на агаровых пластинках. За ростом клеток следили путем измерения оптической плотности при 600 нм (OD₆₀₀) или путем определения диаметра колоний дрожжей.

Определение поглощения глюкозы

Транспорт глюкозы определяли как поглощение D-[U-¹⁴C]-глюкозы (Amersham) и кинетические параметры определяли из графиков Eadie-Hofstee. Клетки получали путем центрифугирования, промывали фосфатным буфером и снова суспендировали в фосфатном буфере в концентрации 60 мг (мокрая масса) на мл. Поглощение глюкозы определяли при концентрации глюкозы от 0,2 мМ до 100 мМ и удельную активность субстрата изменяли от 0,1 кБк мкмоль^-1 до 55,5 кБк мкмоль^-1. Клетки и растворы глюкозы предварительно инкубировали в течение 5 минут при температуре 30°С. Поглощение глюкозы инициировали путем смешения клеток с радиоактивной глюкозой. После инкубации в течение 5 секунд смешивали с 10 мл охлажденного льдом стоп-буфера (0,1 М KiPO4, рН 6,5, 500 мМ глюкозы) и клетки быстро отфильтровывали на фильтрах из стекловолокон (диаметр = 24 мм, Whatman). Фильтры быстро промывали три раза с помощью охлажденного льдом буфера и введенную радиоактивность измеряли с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика. Ингибирование за счет цитохалазина В (конечная концентрация 20 мкМ, растворен в этаноле) определяли в осуществляемом в течение 15 секунд тесте на поглощение с помощью 50 мМ или 100 мМ радиоактивной глюкозы, после того как клетка в течение 15 минут была инкубирована в присутствии ингибитора или только растворителя.

Создана новая гетерологичная система экспрессии для переносчиков глюкозы клеток млекопитающих. Эта система базируется на штамме S. cerevisiae, из которого удалены все эндогенные переносчики глюкозы путем деструкции кодирующих генов. Этот штамм более неспособен поглощать глюкозу через клеточную мембрану и расти в присутствии глюкозы в качестве единственного источника углерода. Для интеграции гетерологичных переносчиков глюкозы человека или других млекопитающих, GLUT1 и GLUT4, в активной форме в клеточную мембрану дрожжей, нужно вводить дополнительные мутации в штамм дрожжей. GLUT1 активен только в мутантном штамме fgy1-1, GLUT4 активен только в двойных мутантах fgy1-1 fgy4-X.

Ген FGY1 может клонироваться. При этом речь идет о S. cerevisiae ORF YMR212c. По результатам изучения функции получается, что либо Fgy1, либо выработанный Fgy1 продукт ингибирует активность человеческих переносчиков глюкозы или принимает участие в слиянии транспортирующих GLUT везикул с клеточной мембраной.

В противоположность GLUT1 и подобно клеткам млекопитающих, большая часть протеинов GLUT4 в дрожжах локализована во внутриклеточных структурах. В целом, смогли выделить девять рецессивных мутантов (от fgy4-1 до fgy4-9), в которых GLUT4 направляется теперь дальше до клеточной мембраны и при одновременной fgy1-мутации становится там активным.

Для комплементационного анализа использовали описанный Bruns и др. (Genes Dev., 8, 1087-10...5 (1994)) инсерционный банк генов. Штамм hxt fgy1-1 трансформировали сначала с помощью плазмиды GLUT4 и затем с помощью мобилизованного инсерционного банка генов. Затем искали трансформанты, которые могли расти на содержащей глюкозу среде. В случае одного из исследованных мутантов установлено, что ген ERG4 был подвергнут деструкции. ERG4 кодирует фермент (оксидоредуктаза) биосинтеза эргостерола. Этот фермент, стерол-С-24(28)-редуктаза, катализирует последнюю стадию биосинтеза эргостерола и превращает эргоста-5,7,22,24(28)-тетраенол в конечный продукт эргостерол. Протеин Erg4 содержит, по всей вероятности, восемь трансмембранных доменов и локализован в эндоплазматическом ретикулуме. erg4-Мутант является жизнеспособным, так как встраивание предшественников эргостерола в мембраны дрожжей компенсирует потерю эргостерола.

Ингибирующее влияние Erg4 на функциональность GLUT4 подтверждено целенаправленной делецией erg4 в случае штамма hxt fgy1-1. Полученный в результате штамм (hxt fgy1-1 Δerg4) обозначен как SDY022.

Тесты на взаимодействия протеинов при использовании системы "расщепление с участием убикитина" показали, что человеческий GLUT4 взаимодействует непосредственно с Erg4 дрожжей. Поэтому можно исходить из того, что протеин Erg4 дрожжей в эндоплазматическом ретикулуме либо непосредственно предотвращает дальнейшую транслокацию GLUT4, либо он модифицирует GLUT4 каким-либо образом, который важен для транслокации и/или функции.

Точно так же показано, что единственная делеция ERG4 в нулевом штамме hxt, следовательно, несмотря на функциональный FGY1, активирует GLUT1, но не GLUT4. Результаты теста на рост представлены в таблице 1.

Для исключения того, что эргостерол сам оказывает негативное влияние на GLUT4, осуществляли тест в отношении роста на агаровых пластинках в присутствии эргостерола в анаэробных условиях. Все трансформированные с помощью GLUT4 штаммы дрожжей не могли расти в этих условиях (таблица 2). Также трансформанты GLUT1 в штамме hxt fgy1-1, в противоположность аэробному росту, в анаэробных условиях не показали никакого роста в присутствии глюкозы. Только после делеции ERG4 трансформанты GLUT1 могли расти.

Замена Val85 на Met путем мутагенеза in vitro сделала GLUT4 независимым от мутации fgy1-1 и привела к тому, что GLUT4V85M уже в штамме hxt erg4 был функционален. Это наблюдение указывает на то, что Fgy1 прямо или косвенно воздействует на это положение, которое находится внутри второй трансмембранной спирали переносчиков GLUT.

В таблице 3 представлено описание штаммов дрожжей, депонированных, согласно настоящей заявке, в Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ) - Mascheroder Weg 1b, 38124 Брауншвейг.

Таблица 1
Рост трансформантов GLUT1 и GLUT4 на содержащей глюкозу среде
Генотип	1% Глюкозы		1% Глюкозы

Таблица 2
Рост трансформантов GLUT1 и GLUT4 на содержащей глюкозу среде с эргостеролом и без него в анаэробных условиях
Генотип	1% Глюкозы	1% Глюкозы+33 мг/л эргостерола

Таблица 3
Признаки депонированных штаммов дрожжей (Saccharomyces cerevisiae)
Номер депониро-вания в DSMZ	Генотип	Фенотип	Плазмида
		Штамм растет в присутствии 1% мальтозы в качестве источника углерода; ауксотроф по глюкозе, лейцину, триптофану, гистидину и урацилу.
		Штамм растет в присутствии 1% мальтозы в качестве источника углерода; ауксотроф по глюкозе, лейцину, триптофану, гистидину и урацилу.
		Штамм растет в присутствии 1% мальтозы в качестве источника углерода; ауксотроф по глюкозе, лейцину, триптофану, и гистидину.	р4H7GLUT4V85M (селекционный маркер URA3), = идентифициро-ванная последователь-ность № 3.
		Штамм растет в присутствии 1% мальтозы в качестве источника углерода; ауксотроф по глюкозе, лейцину, триптофану, и гистидину.	р4H7GLUT4V85M (селекционный маркер URA3), = идентифициро-ванная последователь-ность № 3.
		Штамм растет в присутствии 1% мальтозы в качестве источника углерода; ауксотроф по глюкозе, лейцину, триптофану, и гистидину.	р4H7GLUT4V85M (селекционный маркер URA3), = идентифициро-ванная последователь-ность № 3.

Основная среда: 0,67 % дрожжевого азотистого основания дрожжей без аминокислот (Difco); рН 6,2.

Дополнение в случае ауксотрофий: лейцин (0,44 мМ), триптофан (0,19 мМ), гистидин (0,25 мМ), урацил (0,44 мМ). Мальтозу можно использовать в количестве 1-2 %.

1. Очищенный и выделенный полинуклеотид, кодирующий белок с функциональной активностью переносчика глюкозы и имеющий последовательность ДНК, которая, по существу, соответствует последовательности, кодирующей белок GLUT4V85M.

2. Полинуклеотид по п.1, отличающийся тем, что этот полинуклеотид включает последовательность одной из следующих групп:

a) нуклеотидная последовательность согласно Seq ID №1;

b) нуклеотидная последовательность, которая в строгих условиях гибридизуется с Seq ID №1 и кодирует белок GLUT4V85M.

3. Полинуклеотид по п.1, причем белок GLUT4V85M имеет аминокислотную последовательность согласно Seq ID №2.

4. Белок с функциональной активностью переносчика глюкозы, отличающийся тем, что он кодируется либо нуклеотидной последовательностью, кодирующей белок GLUT4V85M, либо нуклеотидной последовательностью, представленной в Seq ID №1, либо нуклеотидной последовательностью, которая в строгих условиях гибридизуется с Seq ID №1 и кодирует белок GLUT4V85M, либо нуклеотидной последовательностью, кодирующей белок GLUT4V85M с аминокислотной последовательностью согласно Seq ID №2.

5. Белок по п.4, состоящий из аминокислотной последовательности согласно Seq ID №2.