Производные гиалуроновой кислоты с пониженной биодеградируемостью

Изобретение относится к новым производным гиалуроновой кислоты, которые могут быть использованы в медицине и фармакологии. Описываются производные гиалуроновой кислоты общей формулы

, где R=ОН или R¹ и соотношение R¹:OH изменяется от 8:92 до 100:0

, , , ,

, , ,

, ,

, , ,

обладающие пониженной биодеградируемостью по сравнению с природной гиалуроновой кислотой. 3 ил., 1 табл.

 

Изобретение относится к новым химическим веществам, а именно к производным гиалуроновой кислоты, которые могут быть использованы в медицине, фармакологии.

Гиалуроновая кислота (ГК) относится к классу гликозаминогликанов - гетерополисахаридов линейного строения, является основным веществом внеклеточного матрикса, выполняет важные функции в живых организмах и состоит из повторяющихся звеньев D-глюкуроновой кислоты и N-ацетил-D-глюкозамина:

Высокомолекулярная ГК (М˜10⁶ Да) входит в состав вискоэластичных гелей "Provisk" (Швеция) и "Healon" (Канада), применяющихся в офтальмохирургии при операциях экстракции катаракты, является действующим веществом в пленках "Seprafilm" для предупреждения спаечной болезни брюшины. Гидрогель на основе комплексной соли ГК с хлоридом железа (III) (0.5% FeCl₃) предложен в качестве барьерного материала (фирма "Этикон") и предназначается для профилактики спаечной болезни в абдоминальной хирургии. Низкомолекулярной ГК пропитывают салфетки "Гиаплюс" (г. Тула), используемые для лечения ожоговой болезни. Лекарственное средство "Куриозин" (Гедеон Рихтер, Венгрия), представляющее собой цинковую соль ГК, используется для лечения трофических язв и угрей, препарат "Цистистат" восстанавливает функции слизистой оболочки мочевого пузыря при интерстициальном цистите, препараты "Sinvisc", "Viscorneal-Ortho" и др. предназначаются для внутрисуставного введения и применяются для лечения артритов различной этиологии. ГК является также компонентом косметических кремов и тоников для стимуляции роста волос.

В последние годы проявляется большой интерес к получению и исследованию биологических свойств химически модифицированной ГК. Химическая модификация может придать ГК дополнительные медикаментозные свойства, можно также ожидать значительного изменения физико-химических и биологических свойств модифицированной ГК (биодоступность, биодеградируемость), существенного расширения областей применения производных ГК как самостоятельных лекарственных препаратов, так и в качестве адъювантов (в качестве систем доставки лекарственных средств).

Пониженная биодеградируемость может быть полезной функцией производных ГК, поскольку целью химической модификации полимеров чаще всего является пролонгирование терапевтического действия ковалентно связанных с полимерной матрицей лекарств. Известны некоторые производные ГК, биодеградируемость которых под действием субстратспецифичного фермента гиалуронидазы является значительно более низкой, чем природной ГК. Низкая биодеградируемость достигалась кросс-сшивкой молекул ГК дигидразидами или тригидразидами различного строения в присутствии 1-этил-3-[3-(диметиламино)пропил]карбодиимида (КДИ) [Vercruysse K.P., Marecak D.M., Marecak J.F., Prestwich G.D. // Bioconj. Chem. 1997. V. 8(5). P. 686-694; Prestwich G.D., Marecak D.M., Marecak J.F., Vercruysse K.P., Ziebell M.R. // J.Controll. Rel. 1998. V.53. P.99]. Реакцией с триметилсилилдиазометаном получена ГК, в которой карбоксильные группы полностью метилированы. Такая этерифицированная ГК не деполимеризуется под действием гиалуронидазы или гиалуронангидролазы, но является субстратом для хондротин-ACI лиазы из Flavobacterium heparinium и хондротин-ACII лиазы из Arthrobacter aurescens [К. Hirano, S. Sakai, T. Ishikawa, F.Y. Avci, R.J. Linhardt, T.Toida // Carbohydr. Res. 2005. V.430 (14), 2297-2304].

Наиболее близкими к предлагаемому изобретению являются структурные аналоги ГК, полученные взаимодействием ГК с фармакозначимыми аминами в присутствии КДИ в качестве конденсирующего реагента [Понеделькина И.Ю., Одиноков В.Н., Вахрушева Е.С. и др. // Биоорг. химия. 2005. Т.31. №1. С.90-95; Лукина Е.С. Автореф. дисс. на соиск. степ. канд. наук. 2007. 110 С. (www.anrb.ru/ink, диссер. совет)]. Практически все полученные этим способом конъюгаты ГК наряду с амидными группами содержат звенья с изоуреидокарбонильными группами, образовавшимися в результате присоединения КДИ к карбоксигруппам ГК, и растворимость конъюгатов в воде сильно зависит от содержания этих звеньев. Ферментативная биодеградируемость конъюгатов ГК под действием гиалуронидазы зависит как от природы, так и от содержания модифицированных звеньев. Биодеградируемость конъюгатов ГК с содержанием остатков фармакозначимых аминов до 30% сохраняется на уровне природной ГК, с дальнейшим увеличением конверсии карбоксигрупп биодеградируемость снижается. Значительное снижение биодеградируемости наблюдается только для конъюгатов, содержащих значительное количество уреидных звеньев и обладающих, вследствие этого, ограниченной растворимостью в воде (например, конъюгаты ГК с таурином, ГК со стрептоцидом).

Задачей предлагаемого изобретения является получение обладающих пониженной биодеградируемостью производных гиалуроновой кислоты (ГК). Это достигается следующим образом. ГК селективно окисляют по первичным гидроксигруппам в системе 2,2,6,6-тетраметилпиперидиний-1-оксил радикал (TEMPO)-NaBr-NaClO-H₂O (pH 10.2, 0°С), получая в составе окисленной ГК (ГК_ох) звенья N-ацетил-D-глюкозаминуроновой кислоты [Jiang В., Drouet E., Milas M., Rinaudo М. // Carbohydr. Res. 2000. V.327. P.455-461]. Затем в присутствии 1-этил-3-[3-(диметиламино)пропил]карбодиимида (КДИ) конъюгацией собственных и введенных в результате окисления карбоксигрупп ГК с фармакозначимыми первичными аминами получают целевые конъюгаты с варьируемым (в зависимости от соотношения реагентов) содержанием соответствующего фармакофора (схема). Следует отметить, что при использовании ГК_ох удается увеличить фармакологическую нагрузку на молекулу полисахарида - вплоть до ˜100% конверсии карбоксигрупп в амидные (в расчете на моносахаридное звено), причем во всех конъюгатах практически отсутствуют продукты присоединения КДИ по карбоксигруппам ГК_ох, то есть звенья с уреидокарбонильными группами. Растворимость в воде хорошая.

Схема

,

где R=OH и R¹ в конъюгатах, и содержащие R¹ сооставляет 8-100% мольн. в расчете на моносахаридное зерно, n=100-150

, , , ,

, , ,

, , ,

, , ,

Реакцию ГК_ох с аминами проводят в присутствии КДИ при различных соотношениях реагентов в водной среде (рН 4.7-4.8) при комнатной температуре в течение 20-30 мин. В качестве соединений, содержащих аминогруппу, используют n- (1) и о-аминофенолы (2), n-аминобензойную (3), антраниловую (4), 4- (5) и 5-аминосалициловые (6) кислоты, этиловый эфир n-аминобензойной кислоты (анестезин) (7), β-диэтиламиноэтиловый эфир n-аминобензойной кислоты (новокаин) (8), гидразид изоникотиновой кислоты (изониазид) (9), 2-аминоэтансульфоновую кислоту (таурин) (10), 1-фенил-2,3-диметил-4-аминопиразолон-5 (4-аминоантипирин) (11), а также сульфаниламидные препараты, содержащие свободную аминогруппу, такие как n-аминобензолсульфамид (стрептоцид) (12), n-аминобензолсульфацетамид-натрий (сульфацил-натрий) (13) и др. Для модификации ГК_ох можно применять α-аминокислоты (глицин, лизин и др.) или их эфиры, различные диамины (гидразин, этилендиамин, гексаметилендиамин) и дигидразиды, например дигидразид адипиновой кислоты. В зависимости от соотношения реагентов (от ГК_ох:амин:КДИ=1:0.12:0.25 до ГК_ох:амин:КДИ=1:1.5:1.5, в расчете на моносахаридное звено ГК_ох) получают конъюгаты с различным содержанием остатков амина R¹ - от 8 до ˜100% мольн. в расчете на моносахаридное звено ГК_ох.

Содержание остатков амина R¹ (т.е. конверсию карбоксильных групп ГК_ох в амидные) определяют по данным ¹Н-ЯМР-спектроскопии, используя интегральные интенсивности характеристических сигналов протонов остатков конъюгированных с ГК_ох соответствующих аминов по отношению к интенсивности сигнала метильных протонов ацетамидной группы в области 2 м.д. как внутреннему стандарту.

Спектры ¹Н-ЯМР и ¹³С-ЯМР регистрируют для растворов в D₂O на спектрометре Bruker АМХ-300 (рабочая частота для ¹Н-ЯМР-300.13 МГц), в качестве внутреннего стандарта используют натриевую соль 3-(триметилсилил)-1-пропансульфоновой кислоты. УФ-спектры получают на спектрофотометре Specord M-40. Контроль рН растворов проводят с помощью рН-метра «рН-340».

ГК_ох и ее конъюгаты, как определено после инкубации с ферментом гиалуронидазой, проявляют более низкую биодеградируемость по сравнению с немодифицированной ГК.

Биодеградируемость ГК_ох и ее производных (в сравнении с природной ГК) оценивают по разработанной авторами методике, которая заключается в следующем: 0.01 ммоль соответствующего образца помещают в центрифужную пробирку V=10 мл, растворяют в 1 мл буфера (30 мМ лимонная кислота/150 мМ Na₂HPO₄/150 мМ NaCl; pH 6.3), затем добавляют 3 ед. гиалуронидазы (препарат Лидаза) в 0.1 мл того же буфера, инкубируют при 37°С в течение 20 ч. По окончании ферментативной реакции в каждую пробирку добавляют 4 мл охлажденной до 0°С смеси метанол/диэтиловый эфир (3:1) и выдерживают при 0°С в течение 1 ч для полноты осаждения полимера, не подвергшегося ферментативному расщеплению. Выпавшие осадки отделяют центрифугированием, супернатанты, содержащие не осаждающиеся смесью MeOH/Et₂O (3:1) низкомолекулярные продукты ферментативной деградации, помещают в стеклянные стаканы и упаривают досуха. Каждый высушенный образец растворяют в аликвоте воды V=5 мл, отбирают пробу и спектрофотометрически анализируют содержание уроновых кислот карбазоловым методом по Дише, λ=530 нм [Методы химии углеводов: Пер. с англ. М.: Мир, 1967. Под редакцией Н.А. Кочеткова]. За показатель биодеградируемости принимают величину оптической плотности раствора хромофора (при λ=530 нм) испытуемого образца, рассчитанную в % от оптической плотности раствора хромофора природной ГК, которую принимают за 100%. Результаты оформляют в виде диаграмм (рис.1а-в), на которых биодеградируемость природной ГК принимают 100%-ной.

Предлагаемое изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Конъюгат ГК_ох с n-аминофенолом, R¹=8%.

а) ГК селективно окисляют по первичным гидроксигруппам в системе 2,2,6,6-тетраметилпиперидиний-1 -оксил радикал (TEMPO)-NaBr-NaClO-H₂O (рН 10.2) [Jiang В., Drouet E., Milas M., Rinaudo M. // Carbohydr. Res. 2000. V.327. P.455-461]. Условия реакции окисления ГК: рН 10.2, 0°С, TEMPO = 0.027 ммоль, NaBr = 0.5 ммоль, ГК = 2.5 ммоль в 200 мл воды, и 4 мл 13%-го водного раствора гипохлорита натрия (NaClO). Окисленный продукт из водного раствора выделяют осаждением в метанол. Осадок отделяют центрифугированием, промывают метанолом, диэтиловым эфиром и высушивают при пониженном давлении и температуре не выше 60°С. Получают водорастворимый порошок белого цвета. Количественное определение уроновых кислот в ГК_ох по стандартной методике реакции Дише показывает, что хромофор, поглощающий при 530 нм, образует только D-глюкуроновая кислота. Содержание D-глюкуроновой кислоты составляет 45.2% масс. (теоретически рассчитано - 44.4% масс.),

¹³С NMR ГК_ох (D₂О): δ 177.5, 177.2, 176.4 (С=O), 105.3, 102.8, 83.7, 82.8, 78.7, 78.2, 75.9, 74.7, 69.9, 56.6, 24.9 (СН₃CONH). Как видно из спектра ¹³С ЯМР, вместо двух синглетов атомов углерода СООН-группы D-глюкуроновой кислоты и СН₃CONH-группы, в области 176-178 м.д. наблюдается третий синглет, отвечающий атому углерода вновь образовавшейся СООН-группы. При этом сигнал атома углерода CH₂OH-групп в области 62-63 м.д. отсутствует, что свидетельствует о полной трансформации первичных гидроксигрупп ГК в карбоксильные (схема). Как видно из рис.1.а, при используемых условиях ферментативной обработки ГК_ох не является субстратом для гиалуронидазы.

б) К смеси 60 мг (˜0.3 ммоль СООН-групп) ГК_ох и 3.7 мг (0.036 ммоль) n-аминофенола (1) в 15 мл Н₂О добавляют 0.1 н. NaOH до рН 4.7-4.8, затем при интенсивном перемешивании и температуре 20-22°С вносят 10.8 мг (0.056 ммоль) карбодиимида (соотношение реагентов ГК_ох:n-аминофенол:КДИ=1:0.12:0.25 в расчете на одну карбоксигруппу ГК_ох), поддерживая рН 4.7-4.8 титрованием 0.1 н. HCl. Через 0.5 ч к охлажденной до 0°С реакционной смеси последовательно добавляют 0.1 н. NaOH (до рН 7-8), 2-3 мл насыщенного раствора NaCl и 45 мл охлажденного метанола. Выпавший осадок отделяют центрифугированием, растворяют в 10 мл 6% NaCl, добавляют 30 мл метанола. Вновь выпавший осадок центрифугируют, промывают метанолом (10×3 мл), затем эфиром (10×3 мл) и сушат при температуре ≤60°С и пониженном давлении. Получают ˜60 мг конъюгата в виде белого порошка, растворимого в воде. Содержание остатков R¹ (или конверсия карбоксигрупп ГК_ох в амидные) в конъюгате ГК_ох с n-аминофенолом составляет 8% в расчете на моносахаридное звено ГК_ох. Аналогично ГК_ох этот конъюгат не является субстратом для гиалуронидазы.

Пример 2. Конъюгаты ГК_ох с n-аминофенолом, R¹=25-100%.

Конъюгаты ГК_ох с содержанием остатков n-аминофенола 25% (табл.), 27%, 30%, 37%, 46% и 100% получают аналогично примеру 1, при этом используют другие соотношения реагентов. При соотношении ГК_ох:n-аминофенол:КДИ=1:0.5:0.38 получают конъюгат с содержанием R¹=25%, 1:0.5:0.45 - R¹=27%, 1:0.5:0.5 - R¹=30%, 1:0.6:0.75 - R¹=37%, 1:1:0.75 -R^l=46% и при 1:1.5:1.5 - R^l˜100%.

С увеличением содержания остатков n-аминофенола биодеградируемость конъюгатов возрастает по сравнению с ГК_ох, но уровня природной ГК не достигает (рис.1а). Биодеградируемость конъюгата с содержанием R¹˜100% не приводится, поскольку в цитратном буфере (рН 6.5) он не растворяется.

Пример 3. Конъюгаты ГК_ох с аминами 2-13 синтезируют аналогично примерам 1 и 2. В таблице приведены характеристики конъюгатов, полученных при соотношении ГК_ох:2-13:КДИ=1:0.5:0.38. Значения биодеградируемости соответствующих конъюгатов 2а-13а зависят от природы амина и значительно меньше биодеградируемости природной ПС (рис.1б).

Таблица
Конъюгат	Содержание R1 (% в расчете на моносахаридное звено) в конъюгатах, полученных при соотношении ГКох:1-13:КДИ=1:0.5:0.38	Характеристичекие сигналы остатков аминов в 1Н ЯМР-спектрах конъюгатов, δ, м.д.
1а	25	7.41, 7.39, 7.00, 6.98
2а	35	7.59, 7.57, 7.28, 7.26, 7.09, 7.06
3а	36	8.04, 7.70
4а	19	8.31, 8.02, 8.00, 7.64, 7.58, 7.33
5а	30	7.89, 7.86, 7.25, 7.16, 7.11, 7.08
6а	23	7.98, 7.59, 7.56, 7.05, 7.02
7а	31	8.12, 7.71
8а	30	8.11, 7.74
9а	35	8.80, 7.90
10а	23*	-
11а	35	7.68, 7.52, 7.49
12а	30	8.01, 7.98, 7.84, 7.81
13а	20	8.01, 7.99, 7.83, 7.81
* Определено элементным анализом на S.

Для конъюгатов ГК_ОХ с 4-аминоантипирином с содержанием R¹=10-90% также приведена зависимость биодеградируемости от содержания остатков амина (рис. 1в).

Производные гиалуроновой кислоты общей формулы:

где R=OH и R¹ в конъюгатах, n=100-150

, , , ,

, , ,

, , ,

, , ,

где содержание R¹ составляет 8-100% в расчете на моносахаридное звено, полученные взаимодействием окисленной гиалуроновой кислоты с соответствующим фармакозначимым первичным амином, обладающие пониженной биодеградируемостью.