Способ определения амилолитической активности ферментов микрофлоры в кишечнике птицы

Изобретение относится к физиолого-биохимическим исследованиям пищеварения у животных. Отбирают из слепых отростков толстого кишечника 1 г содержимого, добавляют 9 мл дистиллированной воды, тщательно перемешивают, центрифугируют в течение 3 мин при 4000 об/мин, 1 мл центрифугата смешивают с питательной смесью, содержащей NaCl - 0,9 г, NaHCO₃ - 0,3 г, добавляют крахмал и дистиллированную воду. Реактивы и в опытные и в контрольные пробирки добавляют одинаковые, только опытные пробирки инкубируют при температуре 41°С в течение 35 мин. Контрольные пробирки инкубированию не подвергают, в них сразу добавляют соляную кислоту для прекращения реакции. Растворы колориметрируют, определяют оптическую плотность растворов и рассчитывают количество расщепленного крахмала в процентах, по значению которого оценивают амилолитическую активность. Это обеспечивает упрощение и сокращение процесса определения.

 

Изобретение относится к физиологическим исследованиям пищеварения у животных, в частности к методам определения активности ферментов микрофлоры толстого кишечника у птицы.

Известна сравнительная оценка сахарифицирующего и декстрирующего методов при определении активности амилазы крови у здоровых и больных острым панкреатитом (см. Мерина-Глускина В.М. Лабораторное дело. №3. М.: Медицина, 1965, с.142. Уголев A.M. Приспособление пищеварительных желез к качеству пищи. Дисс. Док. М., 1958. Уголев A.M., Чулкова Т.М. Бюл. Экспер. Биол., 1961. №9, с.45).

По известной методике для приготовления буферного раствора (рН 7,15-7,2) к 11,876 г Na₂HPO₄ добавляют дистиллированную воду, доводя объем до 1 литра. Кроме того, к 9,078 г KH₂PO₄ добавляют дистиллированной воды также до 1 литра. Перед исследованием готовят рабочий буферный раствор из 3 частей раствора KH₂PO₄ и 7 частей Na₂HPO₄.

В 5 мл 5% раствора NaCl, находящегося в центрифужной пробирке, добавляют 1 мл крови, взятой из пальца. Центрифугирование проводят в течение 7-10 минут при 2000 оборотов в мин. К 2 мл 0.15% раствору крахмала добавляют 2 мл буферного раствора и 1 мл центрифугата. Смесь подвергают инкубации в водяной бане при 38°С в течение 60 минут. Затем для прекращения реакции наливают 2 мл НС1, 8 мл дистиллированной воды и по 0,5 мл разведенного йодного реактива. Для контроля берут те же реактивы, но вместо центрифугата (плазма) добавляют 1 мл дистиллированной воды.

Б - оптическая плотность исследуемого раствора;

В - количество субстрата, мг;

(см. Тараканов Б.В., Долгов И.А., Николичева Т.А. Определение амилазной активности крахмалгидролизующих микроорганизмов фотометрическим методом. Методические указания. Изучение микрофлоры преджелудков у жвачных. Боровск, 1977, с.40-41).

Недостатком известных технических решений является сложность проведения исследований, ограниченность применения и использование большого количества компонентов.

Задачей заявляемого предложения является расширение технологических возможностей и упрощение процесса исследования.

Поставленная задача достигается тем, что в способе определения амилолитической активности ферментов микрофлоры кишечника птицы, включающем отбор проб из слепых отростков толстого кишечника птицы в количестве не более 1 г, добавление не более 9 мл дистиллированной воды и перемешивание, полученную смесь центрифугируют в течение 3 мин при 4000 об/мин, затем по 1 мл центрифугата и по 2 мл буфера, содержащего 0,8-0,9 г NaCl и 0,3-0,4 г NaHCO₃, а также не более 2-х мл 0,15% раствора крахмала и не более 8 мл дистиллированной воды добавляют в контрольную и опытную пробирки, в контрольную пробирку сразу доливают соляную кислоту в количестве не более 2 мл для прекращения реакции, а опытную пробирку подвергают инкубированию при температуре 41-42°С в течение 35 мин, после инкубирования в опытную пробирку добавляют такое же количество соляной кислоты, как и в контрольную пробирку, растворы колориметрируют, определяют оптическую плотность исследуемого и контрольного растворов и рассчитывают количество расщепленного крахмала в процентах, по значению которого оценивают амилолитическую активность.

Новизна заявляемого предложения обусловлена тем, что по сравнению с известными техническими решениями в способе определения амилолитической активности значительно упрощается и сокращается процесс определения ферментов микрофлоры толстого кишечника за счет исключения фильтрации, отделения жидкости и сокращения количества используемых компонентов.

Способ определения амилолитической активности ферментов микрофлоры в кишечнике птицы осуществляется следующим образом.

Предварительно пробу отбирают из слепых отростков толстого кишечника в количестве не более 1 г, так как содержимое слепых отростков незначительно и содержит наибольшее количество микрофлоры, вырабатывающей амилолитические ферменты, затем добавляют не более 9 мл дистиллированной воды, перемешивают, центрифугируют в течение 3 мин при 4000 оборотах в мин, затем по 1 мл центрифугата и по 2 мл буфера добавляют в опытные и контрольные пробирки. Также в пробирки добавляют по 2 мл 0,15% раствор крахмала и по 8 мл дистиллированной воды.

Для приготовления буферного раствора с рН 7-8 к 100 мл дистиллированной воды добавляют 0,9 г NaCl и 0,3 г NaHCO₃. Количество химических препаратов определялось экспериментально при получении требуемого рН.

Приготовленная смесь в опытных пробирках подвергалась инкубированию на водяной бане при температуре 41°С, в течение 35 минут. Температура 41°С соответствует температуре тела птицы. Контрольные пробирки не инкубируют, в них сразу добавляют соляную кислоту в количестве не более 2 мл, достаточном для прекращения реакции гидролизации крахмала. Затем растворы колориметрируют, определяют оптическую плотность исследуемого и контрольного растворов и рассчитывают количество расщепленного крахмала в процентах, по значению которого оценивают амилолитическую активность.

Пример конкретного осуществления способа определения амилолитической активности ферментов микрофлоры в кишечнике птицы.

Растворы калориметрируют в фотоэлектрокалориметре при красном светофильтре против дистиллированной воды, в кюветах с 5 мм между рабочими гранями. И полученные результаты сравнивают с показателями контроля, принимаемого за 100. Расчет производится в процентах расщепления крахмала.

Например:

0,75 - 100%

0,25-х;

х=25:0,75=33,3% - крахмала осталось негидролизированным в пробе.

100-33,3=66,7%.

Наиболее близким техническим решением является способ определения амилолитической активности рубцового содержимого, в котором готовят

фосфатный буфер, состоящий из 2-х растворов:

раствор 1 - натрий фосфорнокислый двухзамещенный 11,876 г/л;

раствор 2 - калий фосфорнокислый однозамещенный 9.078 г/л.

Перед опытом готовят рабочий буферный раствор из 7 частей раствора 1 и 3-х частей раствора 2, затем готовят субстрат 0,4%-ный раствор растворимого крахмала на фосфатном буфере (рН - 7,1)

К 20 мл 0,4%-ного раствора крахмала на фосфатном буфере (39°С) добавляют 1 мл рубцовой жидкости и инкубируют при 39°С в течение 30 мин. Затем для прекращения реакции добавляют 0,5 мл 1 нормального раствора соляной кислоты и хорошо взбалтывают. Для определения количества расщепленного крахмала 0,2 мл инкубационной смеси переносят в пробирки, доливают 5 мл дистиллированной воды и 0,5 мл раствора йода, смешивают и калориметрируют при длине волны 620 ммк. Полученные результаты сравнивают с показателями контроля, который ставят с рубцовой жидкостью (1 мл), прокипяченной для инактивации фермента и 20 мл 0,4%-ного раствора крахмала. Расчет расщепленного крахмала производят по формуле:

(А-Б)×В:А = количество расщепленного крахмала (мг), где

А - оптическая плотность контрольного раствора.

Для проведения лабораторных исследований использованы следующие реактивы:

1) Для приготовления 0,15% раствора крахмала к 0,15 г растворимого крахмала добавляют дистиллированную воду в количестве 50 мл, доводят до кипения и доливают до 100 мл дистиллированную воду. Раствор готовят за день до исследований с целью отстаивания.

2) Для приготовления буферного раствора (рН 7-8) к 100 мл дистиллированной воды добавляют 0,9 г NaCl и 0,3 г NaHCO₃.

3) Для приготовления йодного реактива, необходимого для определения оптической плотности, 0,3 г кристаллического йода и 3 г йодистого калия растворяют в дистиллированной воде и доливают до 100 мл. Из этого раствора готовят рабочий раствор, доливая к 2 мл его 6 мл дистиллированной воды.

4) Соляная кислота 5% (5 мл HCl до 100 мл дистиллированной водой).

Ход анализа.

В пробирки помещают по 1 г содержимого слепых отростков толстого кишечника, добавляют до 9 мл дистиллированную воду, перемешивают. Центрифугируют 3 мин при 4000 оборотов в минуту. Для опыта в пробирки вводят 2 мл 0,15% раствор крахмала, добавляют 2 мл буферного раствора и 1 мл центрифугата. Смесь подвергают инкубированию в водяной бане при 41°С в течение 35 мин. Затем для прекращения реакции наливают 2 мл HCl 5%. Для контроля берут те же реактивы, но не инкубируют, а сразу наливают 2 мл HCl 5%. В опыт и контроль наливают 8 мл дистиллированной воды. Непосредственно перед калориметрированием в опыт и контроль наливают рабочий раствор йода по 0,5 мл, перемешивают.

Растворы калориметрируют в фотоэлектрокалориметре при красном светофильтре против дистиллированной воды, в кюветах с 5 мм между рабочими гранями, и полученные результаты, в качестве которых используют оптическую плотность исследуемого раствора, сравнивают с показателями оптической плотности контрольного раствора, которые принимают за 100.

Расчет производится в процентах расщепления крахмала.

Пример расчета:

1-й показатель фотоэлектрокалориметра - оптическая плотность исследуемого раствора - 0,35;

2-й показатель фотоэлектрокалориметра - оптическая плотность контрольного раствора - 0,85.

Согласно пропорции

0,85 - 100%

0,35-х;

х=35:0,85=41,2% - крахмала осталось негидролизированным в пробе, следовательно, гидролизовалось амилазой 100-41,2=58,8%. Полученный процент гидролизованного крахмала указывает на активность ферментов микрофлоры в химусе слепых отростков толстого кишечника.

Способ определения амилолитической активности ферментов микрофлоры кишечника птицы, включающий отбор проб из слепых отростков толстого кишечника птицы в количестве не более 1 г, добавление не более 9 мл дистиллированной воды и перемешивание, полученную смесь центрифугируют в течение 3 мин при 4000 об/мин, затем по 1 мл центрифугата и по 2 мл буфера, содержащего 0,8-0,9 г NaCl и 0,3-0,4 г NaHCO₃, а также не более 2-х мл 0,15% раствора крахмала и не более 8 мл дистиллированной воды добавляют в контрольную и опытную пробирки, в контрольную пробирку сразу доливают соляную кислоту в количестве не более 2 мл для прекращения реакции, а опытную пробирку подвергают инкубированию при температуре 41-42°С в течение 35 мин, после инкубирования в опытную пробирку добавляют такое же количество соляной кислоты, как и в контрольную пробирку, растворы колориметрируют, определяют оптическую плотность исследуемого и контрольного растворов и рассчитывают количество расщепленного крахмала в процентах, по значению которого оценивают амилолитическую активность.