Биопрепарат для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов
Владельцы патента RU 2365438:
Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Кубанский государственный университет" (RU)
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к микробиологической очистке почвы и воды от нефти и нефтепродуктов, в том числе от мазута. Биопрепарат содержит в (мас.%): глицерин - 8-10, KNO3 - 0.360-0.367, KH2PO4 - 0.054-0.055, Na2HPO4·12H2O - 0.126-0.128, нефтеокисляющие микроорганизмы - не менее 3-1010 кл/мл препарата, вода - остальное. Изобретение обеспечивает высокоэффективную очистку почвы и воды от нефти и нефтепродуктов. 2 ил., 1 табл.
Изобретение относится к экологической биотехнологии и может быть использовано при микробиологической очистке почвы и воды, загрязненных нефтью и нефтепродуктами. Загрязнение нефтепродуктами природных экосистем и сельхозугодий является приоритетной проблемой современной экологической биотехнологии. Это связано с возрастающим объемом несанкционированных выбросов нефтепродуктов при их добыче, транспортировке, переработке и хранении. Проблема усугубляется увеличением потребностей в энергоносителях и углеводородном сырье.
Для ликвидации загрязнений нефтепродуктами успешно применяют биологические методы. Используемые в настоящее время биопрепараты включают различные нефтеокисляющие микроорганизмы - бактерии и реже грибы. В состав препаратов могут входить различные добавки, улучшающие выживаемость и активность нефтеокисляющих микроорганизмов при их хранении и использовании.
Известен биопрепарат для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов «Нафтокс» (патент RU 2053206, МПК B09C 1/10), представляющий собой аэробные нефтеокисляющие бактерии, нормальные парафины, щавелевокислый аммоний и воду.
Недостатком данного биопрепарата является его низкая эффективность при очистке почвы от биологически устойчивых высококипящих нефтепродуктов, например мазута. Использование данного биопрепарата ограничено очисткой от нефти и дизельного топлива.
Известен биопрепарат - консорциум микроорганизмов «Деворойл» для очистки почвенных и солоновато-водных экосистем от загрязнения нефтепродуктами (патент RU 2023686, МПК C02F 3/34).
Недостатком данного биопрепарата является его малая эффективность при ликвидации нефтяных загрязнений почвы из-за преимущественной деградации используемыми микроорганизмами парафиновой фракции нефти.
Известен биопрепарат для очистки объектов окружающей среды от нефти и нефтепродуктов (патент RU 2138451, МПК В09С 1/10), включающий аэробные нефтеокисляющие бактерии, минеральные добавки и наполнитель, например стерильный торф.
Недостатком данного биопрепарата является нерентабельность его получения в регионах, удаленных от мест расположения залежей торфа, используемого в качестве наполнителя.
Наиболее близким к заявляемому по технической сущности и достигаемому эффекту является биопрепарат для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов (патент RU 2191752, МПК В09С 1/10), включающий аэробные нефтеокисляющие бактерии, воду, полиэтиленгликоль, сахарозу и нефть.
Недостатком прототипа является его низкая эффективность при очистке воды и почвы от биологически устойчивых нефтепродуктов, например мазута.
Задачей настоящего изобретения является разработка биопрепарата, обеспечивающего высокоэффективную очистку почвы и воды от нефти и нефтепродуктов, в том числе биологически устойчивого мазута.
Поставленная задача решается посредством биопрепарата, включающего клетки аэробных нефтеокисляющих микроорганизмов, глицерин, минеральные соли и воду при следующем соотношении компонентов:
В качестве аэробных нефтеокисляющих микроорганизмов биопрепарат содержит штаммы, а именно: Arthrobacter sp. BKM Ас-2272 Д и Rhodococcus sp. BKM Ас-2045 Д, депонированные во Всероссийской коллекции микроорганизмов. Непатогенность штаммов доказана в остром опыте на белых мышах. Данные штаммы являются высокоактивными деструкторами различных нефтепродуктов и индивидуальных углеводородов в широком диапазоне температур и значений рН. Особенностью является способность к окислению нефтепродуктов при высоких температурах - 35-40°С. Штаммы способны к деградации биологически устойчивых высококипящих нефтепродуктов, недоступных для большинства нефтеокисляющих микроорганизмов. Концентрация жизнеспособных аэробных нефтеокисляющих микроорганизмов в биопрепарате не менее 3·1010 кл/мл достаточна его для эффективного применения.
Эффективность препарата обусловлена входящими в его состав штаммами и добавками, взятыми в указанных процентных содержаниях. Высокий предел температурной устойчивости микроорганизмов штаммов позволяет им сохранить деструкционную активность в условиях повышенных температур, когда возрастает биологическая доступность высококипящих нефтепродуктов. Отсутствие фитотоксичности биопрепарата позволяет применять фиторемедиацию на завершающих стадиях очистки. Известно использование глицерина, взятого в концентрации 10%, для увеличения эффективности низкотемпературного хранения штаммов (Методы общей бактериологии: Пер. с англ/Под ред. Герхарда и др. - М.: МИР, 1983 с.527). Экспериментально было выявлено, что концентрация глицерина может быть и меньшей, а именно 8-10%. Но при этом поставленная задача решается. Входящий в состав биопрепарата глицерин является криопротектором, обеспечивающим высокую выживаемость микроорганизмов при низкотемпературном хранении. Минеральные соли служат для предотвращения осмотического шока микроорганизмов, а также для обеспечения микроорганизмов биогенными элементами на начальных стадиях очистки. Расход биопрепарата - не менее 1.4 л на тонну очищаемой нефтезагрязненной почвы или воды.
На фиг.1 представлено снижение концентрации нефтепродуктов в минеральной среде, загрязненной мазутом и нефтью, при очистке с использованием биопрепарата. На фиг.2 - снижение концентрации нефтепродуктов при очистке загрязненной мазутом почвы.
Пример 1. Получение биопрепарата.
Клетки аэробных нефтеокисляющих микроорганизмов штаммов Arthrobacter sp. BKM Ас-2272 Д и Rhodococcus sp. BKM Ас-2045 Д выращивали совместно глубинным культивированием на жидкой минеральной среде с дизельным топливом при контроле и соблюдении оптимальных параметров культивирования. Для приготовления жидкой минеральной среды в 10 литрах воды растворяли 40 г KNO3, 6 г KH2PO4 и 14 г Na2HPO4·12H2O. Дополнительно вносили 200 г дизельного топлива и 8 г MgSO4·7H2O. После глубинного культивирования с использованием аппарата культивирования АК 210 в 10 литров жидкости, содержащей нефтеокисляющие микроорганизмы Arthrobacter sp. BKM Ас-2272 Д и Rhodococcus sp. BKM Ас-2045 Д в концентрации не менее 3·1010 кл/мл, вносили 870 г глицерина для достижения конечной концентрации последнего 8%. Присутствие минеральных солей в жидком биопрепарате в концентрациях: KNO3 - 0.360, KH2PO4 - 0.054 и Na2HPO4·12H2O - 0.126% обеспечено составом исходной жидкой минеральной среды, в которой происходило культивирование. Биопрепарат готов к использованию для очистки почвы и воды, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, либо замораживается и хранится при температуре не выше 10°С в течение 1 месяца.
Пример 2. Получение биопрепарата.
Клетки аэробных нефтеокисляющих микроорганизмов штаммов Arthrobacter sp. BKM Ас-2272 Д и Rhodococcus sp. BKM Ас-2045 Д выращивали, как описано в примере 1, на аналогичной жидкой питательной среде, затем к 10 литрам жидкости, содержащей не менее 3·1010 кл/мл, добавили 1110 г глицерина для достижения конечной концентрации последнего 10%. Присутствие минеральных солей в концентрациях:
KNO3 - 0.367%, KH2PO4 - 0.055% и Na2HPO4·12H2O - 0.128% обеспечено составом исходной минеральной среды, в которой происходило культивирование, с учетом объема внесенного глицерина. Препарат готов к использованию для очистки почвы и воды, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, либо замораживается и хранится при температуре не выше 10°С в течение 1,5 месяца.
Пример 3. В 4 колбы на 0.5 л, содержащие по 200 мл жидкой минеральной среды, представляющей собой воду с растворенными в ней солями KNO3, KH2PO, Na2HPO4·12H2O, MgSO4·7H2O в концентрациях 4.0, 0.6, 1.4 и 0.8 г/л соответственно, внесли нефть и нефтепродукты. В две колбы - по 4 г российской нефти, а в две другие - по 4 г мазута. В одну колбу с внесенным мазутом и в одну колбу с внесенной нефтью добавили по 0,28 мл биопрепарата, приготовленного согласно примеру 1 и содержащего нефтеокисляющие микроорганизмы штаммов Arthrobacter sp. BKM Ас-2272 Д и Rhodococcus sp. BKM Ас-2045 Д в концентрации не менее 3·1010 кл/мл. В остальные две колбы биопрепарат не добавляли. Все 4 колбы культивировали 7 суток на орбитальном шейкере при температуре 25°С. Снижение концентрации нефтепродуктов в минеральной среде приведено на фиг.1. Степень деструкции нефти при обработке биопрепаратом составила 88.6%, мазута - 76,55%. Таким образом, по очистке загрязнения мазутом в водной среде биопрепарат оказался более эффективен по сравнению с прототипом. При очистке нефтяного загрязнения биопрепарат также обладал более высокой по сравнению с прототипом эффективностью.
Пример 4. В 4 стакана на 600 мл помещали по 300 г почвы, загрязненной российской нефтью либо мазутом до концентрации 46 г/кг. В стаканы вносили по 0,42 мл биопрепарата, приготовленного в примере 2, воду до 60% полной влагоемкости почвы и аммофос в количестве 0,2 г.Инкубировали в течение 4 месяцев при температуре 25° и 40°С. Очищаемую почву регулярно перемешивали, влажность и концентрацию биогенных элементов измеряли и поддерживали на начальном уровне. Степени деструкции нефтепродуктов определяли после 2 и 4 месяцев эксперимента (таблица 1). В стаканах, куда биопрепарат не вносили, деструкция нефтепродуктов через 4 месяца инкубирования не превышала в случае мазута - 6.1%, нефти - 8,4%.
Таблица 1. Деструкция нефтепродуктов в почве после обработки биопрепаратом в зависимости от температуры и продолжительности очистки
| нефтепродукт | температура, °С | деструкция нефтепродуктов, % | |
| 2 мес очистки | 4 мес очистки | ||
| нефть | 25 | 69,8 | 94,0 |
| 40 | 78,4 | 90,3 | |
| мазут | 25 | 47,2 | 85,1 |
| 40 | 56,3 | 89,7 |
Таким образом, очистка почвы от нефти и нефтепродуктов (мазута) с использованием биопрепарата по своей эффективности выше, чем у прототипа.
Пример 5. На грунтовой площадке было размещено 0,1 тонны почвы, загрязненной мазутом в концентрации 54 г/кг. В почву вносили биопрепарат, приготовленный в примере 1, в количестве 0,14 л. Перемешивали, поддерживали влажность на уровне 60% от предельной влагоемкости, вносили по 20 г аммофоса и нитроаммофоски. Обработки удобрениями, увлажнение, рыхление проводили 3 раза в месяц. Снижение концентрации нефтепродуктов в загрязненной мазутом почве показано на фиг.2. После 5 месяцев очистки концентрация нефтепродуктов составила 8.7 г/кг. Таким образом, эффективность очистки составила 83,8%. Эффективность аналогичной очистки без внесения биопрепарата составила 12%. Таким образом, применение биопрепарата согласно изобретению позволяет проводить эффективную очистку почвы от мазута - биологически устойчивого нефтепродукта.
Пример 6. Участок почвы, загрязненной нефтью в концентрации 31 г/кг на глубину 0,2 м, площадью 2 м2, был обработан 0,84 л биопрепарата, приготовленного в примере 2. Участок культивировали на глубину 0,2 м, внесли 60 г аммофоса и поддерживали влажность на уровне 60% от предельной влагоемкости почвы. Обработки удобрением, увлажнение, рыхление проводили 2 раза в месяц. После 6 месяцев очистки концентрация нефтепродуктов снизилась до 1,4 г/кг. Эффективность очистки составила 95,5%. Эффективность аналогичной очистки без внесения биопрепарата составила 16,1%.
Пример 7. В сосуд объемом 1 л, заполненный 0,5 л воды, вносили нефть в количестве 3,9 мл. На поверхности воды при этом образовывалась пленка нефти толщиной 0,5 мм. На поверхность воды вносили разбрызгиванием 1,5 мл биопрепарата, приготовленного в примере 1. В аналогичный сосуд, вносили 0,5 л воды, 3,9 мл нефти, биопрепарат при этом не добавляли. В оба сосуда внесли по 0,2 г минерального удобрения (аммофос) в качестве дополнительного источника минерального питания. Сосуды культивировали в статических условиях 1 месяц при температуре 28°С, после чего было отмечено разрушение нефтяной пленки в сосуде, куда был внесен биопрепарат. Разрушение нефти в сосуде в результате обработки биопрепаратом составило 89%. В аналогичном сосуде, куда биопрепарат не вносили, разрушение нефти составило 5%.
Пример 8. В сосуд объемом 1 л, заполненный 0,5 л воды, вносили мазут в количестве 3,9 мл. На поверхности воды при этом образовывалась пленка нефтепродукта толщиной 0,5 мм. На поверхность воды вносили разбрызгиванием 1,5 мл биопрепарата, приготовленного в примере 2. В аналогичный сосуд, содержащий воду, загрязненную нефтепродуктом в том же количестве, биопрепарат не добавляли. В оба сосуда внесли по 0,2 г минерального удобрения (аммофос) в качестве дополнительного источника минерального питания. Сосуды культивировали при температуре 28°С в статических условиях 1 месяц. Разрушение мазута в сосуде в результате обработки биопрепаратом составило 79%. В аналогичном сосуде, куда биопрепарат не вносили, разрушение нефти составило 3%.
Преимуществом предлагаемого биопрепарата по сравнению с прототипом является более эффективная очистка воды и почвы от нефти, а также мазута, являющегося устойчивым загрязнителем внешней среды.
Применение биопрепарата согласно изобретению позволяет осуществлять высокоэффективную очистку почвы и воды, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, в том числе мазутом. Входящие в состав биопрепарат культуры непатогенны и способны к деструкции нефти и нефтепродуктов в широком диапазоне температур.
Биопрепарат для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов, включающий клетки аэробных нефтеокисляющих микроорганизмов, глицерин, минеральные соли и воду, отличающийся тем, что в качестве аэробных нефтеокисляющих микроорганизмов используют штаммы Arthrobacter sp. BKM Ас-2272 Д и Rhodococcus sp. BKM Ас-2045 Д при следующем соотношении компонентов, мас.%:
| глицерин | 8-10 |
| KNO3 | 0,360-0,367 |
| KH2PO4 | 0,054-0,055 |
| Na2HPO4·12H2O | 0,126-0,128 |
| нефтеокисляющие микроорганизмы | не менее 3·1010 |
кл/мл препарата
| вода | остальное |
