Способ получения генетически модифицированного вируса гриппа и вирусных белков и их применение
Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Способ предусматривает направленное изменение вирулентных свойств вируса гриппа путем генетической модификации сайтов каспазного и гранзимного расщепления в вирусных белках. Способ позволяет целенаправленно снизить или усилить вирулентность вируса. Также описано применение такого генетически измененного вируса гриппа в качестве вакцин и лечебных средств, векторов для переноса и экспрессии биологически активных генетических элементов, полипептидов и их фрагментов в организме-реципиенте для направленного воздействия на метаболизм органов и тканей и в качестве агентов для селективного уничтожения поврежденных и опухолевых клеток в организме. Изобретение может быть использовано в медицине. 5 н. и 6 з.п. ф-лы, 4 ил., 2 табл.
Изобретение относится к области биотехнологии и медицины, в частности предлагается способ направленного изменения вирулентных свойств вируса и вирусных белков.
Известен способ ослабления вирулентных свойств вируса путем его адаптации к размножению при пониженной температуре и получение на его основе вакцинных штаммов путем рекомбинации с новым актуальным штаммом вируса [1, 2]. Полученный рекомбинантный вакцинный штамм применим для интраназального введения, где локальная температура превышает вирусный оптимум и ослабляет его размножение. Такой метод имеет три основных недостатка. Во-первых, ослабляющие холодовые мутации адаптированного вируса носят случайный характер и не исключают возможности быстрой генетический реверсии к исходному патогенному фенотипу вируса. Во-вторых, холодовой фенотип вакцинного вируса не снижает патогенность вируса как таковую, а лишь снижает его способность к репродукции при повышенных температурах. B-третьих, для получения нового донора аттенуации потребуется селекция новых холодовых мутантов со случайным набором мутаций, который невозможно спрогнозировать и контролировать по признакам безвредности, репродуктивности, совместимости с генами актуального вируса - рекомбинантного донора.
Наиболее близким к заявленному техническому решению относится способ ослабления вирулентности вирусов методом направленной модификации гемагглютинина (НА) вируса гриппа, в котором направленному изменению подвергался сайт протеолитического расщепления клеточными трипсиноподобными протеазами [3]. Такая направленная модификация белка НА делала вирус нечувствительным или мало чувствительным к респираторным трипсиноподобным протеазам, что вело к ограничению его размножения в инфицированном организме и ослаблению его вирулентности. Однако при такой аттенуации вируса возникали трудности с его размножением и производством, так как требовалось искусственное применение активирующих протеаз для полноценного размножения и наработки вируса.
В основу изобретения положена техническая задача создать способ получения генетически модифицированного вируса и вирусных белков за счет направленной искусственной модификации вирусных белков в каспазных сайтах, который позволил бы при сохранении способности вирусов к размножению применять их в качестве вакцинных штаммов для профилактики инфекционных заболеваний и повышения иммунитета.
Задача решается тем, что предлагается согласно изобретению способ получения генетически модифицированного вируса гриппа и вирусных белков путем введения мутаций, делеций, вставок в участки вирусного генома, кодирующие каспазные или гранзимные сайты или их мотивы или создания дополнительных каспазных сайтов и их мотивов у вирусных белков путем осуществления сайт-направленного мутагенеза и процесса обратной генетики. В процессе модификации нарушаются природные характеристики сайтов/мотивов таким образом, что полученный модифицированный вирус гриппа представляет собой аттенуированный (т.е. ослабленный) вирус или полученный модифицированный вирус гриппа обладает повышенными вирулентными свойствами и вирусные белки характеризуются усилением токсичности.
Целесообразно при введении мутаций в участок вирусного генома встраивать дополнительно чужеродные гены (химерные вирусы), которые кодируют белки, полипептиды и их фрагменты, усиливающие экспрессионные, лечебные и профилактические свойства получаемых вирусов.
Задача решается также тем, что предлагается, согласно изобретению, применять генетически модифицированный вирус гриппа и вирусные белки для профилактики инфекционных болезней и создания противовирусного иммунитета путем введения в организм человека или животных ингаляционно, подкожно, накожно, внутрикожно, внутримышечно, ректально, через рот.
Желательно использовать их в аэрозольной форме или в виде спрэя для оптимизации лечебного и профилактического эффекта. Предлагается их также применять в качестве продуцентов для получения вирусных и других белков с полезными свойствами, в качестве субстратов для приготовления субъединичных и субвирионных вакцин или их протекторов и усилителей.
Целесообразно применять вирус гриппа в качестве векторов для направленного переноса и экспрессии в организме-реципиенте новых антигенов, химерных белков, и лечебных соединений полипептидной природы, а также для направленного цитолиза клеток и лечения опухолевых и пролиферативных процессов.
Технический результат настоящего изобретения состоит в том, что аттенуация (ослабление) вируса достигается направленной искусственной модификацией вирусных белков в участках (каспазных или гранзимных сайтах) специфического протеолитического расщепления протеолитическими ферментами клетки-хозяина, так называемыми каспазами или гранзимами.
За счет искусственной модификации с помощью сайт-направленного мутагенеза таких сайтов в белке NP или М2 у высоковирулентного, например, вируса гриппа птиц и использования метода обратной генетики получают мутантные варианты зрелого вируса (так называемого рекомбинантного вируса). В результате проведенной модификации синтезированы мутантные вирусные варианты со сниженной вирулентностью (аттенуированные вирусы), которые, однако, сохраняли способность к размножению, либо более вирулентные штаммы с усиленной вирулентностью для цыплят. В то время, в частности, как исходный дикий тип вируса куриной чумы быстро убивал цыплят, аттенуированные каспазные мутанты этого вируса, хорошо размножаясь в организме цыплят, не вызывали их гибели и, что важно подчеркнуть, индуцировали полноценный иммунитет и защищали цыплят от гибели при последующем заражении высоковирулентным диким вирусом.
Полученные мутантные вирусы могут оказаться полезными для медицины и ветеринарии в качестве вакцинных штаммов, в качестве векторов для направленного переноса чужеродных генов и продуктов их экспрессии в организме-реципиенте к органам-мишеням с целью лечебного воздействия на пораженные ткани и органы.
Хорошо известно, что многие вирусные белки у большинства вирусов человека и животных подвержены протеолитическому расщеплению клеточными протеазами-каспазами или близкими к ним гранзимами. Каспазы и гранзимы - это протеазы, которые расщепляют многочисленные клеточные и вирусные белки в специфических участках (каспазных сайтах) по остатку аспарагиновой кислоты (Asp) в процессе программированной клеточной смерти (апоптозе) [4,5]. Некоторые примеры последовательностей аминокислот в участках каспазных сайтов вирусных белков приведены в таблице 1.
| Таблица 1 | |
| Вирусы(**) | Каспазные сайты(*) |
| Герпесвирусы | DCVD |
| Поксвирусы | LVAD |
| Вирусы гриппа | DVDD, METD, MDID, SEAD, DSSD |
| Флавивирусы | TEVD, SGVD |
| Коронавирусы | VVPD |
| Бакуловирусы | DCMD |
| (*) В таблице использован однобуквенный код для обозначения аминокислот | |
| (**) информация приведена в работе [6]. |
Первичная структура каспазных сайтов у многочисленных белков различных животных и микроорганизмов, включая вирусы, как правило, отвечают правилу EXD/Y, QXD/Y, LXD/Y или DXXD/Y, в котором Е - глютаминовая кислота, D -аспарагиновая кислота, X - любые аминокислоты, Y - любые аминокислоты, но более предпочтительно Gly, Ala, Thr, Ser и Asn [5]. Известно, что главный нуклеокапсидный белок NP (м.м. 56 кД) вирусов гриппа А человека имеет в N-концевой области мотив DETD16/G, характерный для расщепления клеточными каспазами. В процессе апоптоза клеток, инфицированных вирусами гриппа людей, белок NP расщепляется каспазами в этом сайте с образованием апоптозной формы aNP (53 кД) и короткого N-концевого 3 кД пептида. У вирусов гриппа птиц белок NP содержит G16 вместо D, что нарушает каспазный мотив DETD16/G и делает его резистентным к протеолизу клеточными каспазами [7]. Другой характерный каспазный (или возможно гранзимный) мотив VDVDD90/G обнаружен в С-концевом участке вирусного белка М2 (14 кД) [8], выполняющего роль вирусного протонового канала. Этот каспазный/гранзимный сайт идентифицирован у всех исследованных вирусов гриппа А как человека, так и птиц и его расщепление приводит к образованию укороченного апоптозного продукта аМ2 с м.м. 12 кД в инфицированных клетках. Подавляющее большинство вирусов человека и животных содержат подобные каспазные сайты или их мотивы в кодируемых ими белках, однако функция и роль этих каспазных участков в репродукции вирусов и патогенезе вирусной инфекции остается неясной [6].
В качестве прототипа в настоящем изобретении использовали природный вирус чумы птиц A/FPV/Rostock/34 (A/FPV/Ro) (H7N1), который обладал высокой патогенностью для кур и цыплят и вызывал их гибель при введении в организм птиц малой дозы вируса (1-5 БОЕ на особь). Как отмечено выше, белки М2 и NP данного птичьего вируса имеют два каспазных мотива. Чтобы провести направленную модификацию этих мотивов использовали прием так называемой обратной генетики, для чего синтезировали полный набор ДНК копий всех вирусных генов (РВ1, РВ2, PA, NP, НА, NA, М, NS) вируса A/FPV/Ro, встроенных в плазмиды рНН-21, и дополнительно готовили 4 плазмиды pcDNA3 со встроенными генами белков РВ1, РВ2, РА и NP, используемых для усиления образования рекомбинантного вируса в трансфицированных клетках. С помощью указанного набора плазмид были получены варианты вируса, в генах которого делали определенные мутации с помощью сайт-направленного мутагенеза.
С помощью данного приема искусственной мутации вирусов были получены 4 рекомбинантных варианта вируса: дикий неизмененный вирус (wtr) с мутацией G16→D в каспазном сайте гена NP (NPgd), с делецией G16 в каспазном сайте NP (NPdel) и мутацией DD90→NN в каспазном сайте гена М2 (М2nn). Мутация G16→D восстанавливала полноценный каспазный сайт в белке NP птичьего вируса, что является характерной особенностью вирусов гриппа человека, и делала белок NP чувствительным к каспазам. Делеция остатка G16 в каспазном сайте белка NP повреждала этот сайт и усиливала его резистентность к расщеплению клеточными каспазами. Мутация DD→NN также нарушала каспазный (гранзимный) мотив в белке М2 и запрещала его расщепление клеточными каспазами. Таким образом, были получены три искусственных варианта рекомбинантного вируса гриппа куриной чумы птиц.
Далее полученные вирусы размножали в культуре клеток собаки (линия МДСК) и полученные образцы мутантных вирусов испытывали по биологической активности. Для проверки биологических свойств полученных каспазных мутантов вируса использовали культуры клеток различного происхождения (так называемая система in vitro) и цыплят (система in vivo), которые являются природным хозяином вируса гриппа A/FPV/Ro/34.
При пассажах в клеточных культурах клеток человека (линия клеток кишечника САСО-2), собаки (линия клеток почки собаки МДСК), курицы (первичная культура фибробластов куриного эмбриона, КФ) все вирусные варианты хорошо размножались и сохраняли произведенные мутации в течение многих пассажей. Таким образом, каспазные мутанты вируса оказались стабильными биологическим видами.
Далее проверялась вирулентная активность полученных мутантов. Для оценки вирулентности вирусных мутантов проводили сравнение их летального действия на цыплят относительно дикого вируса, обладающего, как известно, высоким летальным действием на цыплят. Было установлено, что различные каспазные мутанты вирусов по-разному изменяют свою вирулентность. Мутанты NPgd и М2пп обладали заметно сниженной вирулентностью, тогда как вирулентность мутанта NPdel превышала таковую у дикого типа. Таким образом, с помощью модификации каспазных участков вируса можно дифференцированно влиять на вирулентность путем ее усиления или ослабления в зависимости от задачи и полезного применения таких вирусных вариантов. Варианты с усиленной вирулентностью могут использоваться для направленного лизиса клеток в онкологии, а аттенуированные вирусы могут применяться в качестве противовирусных вакцин или векторов для переноса и направленной доставки генов биологически активных веществ в организме.
В заключительной части изобретения показана возможность использования аттенуированных мутантов NPgd и М2пп для профилактики и защиты от гибели, вызванной высокопатогенным диким вирусом. Для получения такого технического результата цыплят первоначально заражали мутантными вирусами NPgd и М2пп и затем повторно через некоторое время инфицировали смертельной дозой высокопатогенного дикого вируса куриной чумы птиц A/FPV/Ro/34 (H7N1). Если в контрольной группе цыплят, не инфицированных предварительно мутантными вирусами, наблюдалась быстрая смерть, то у предварительно инфицированных каспазными мутантами не отмечалось каких-либо признаков болезни и 100% выживаемость. Эти результаты показывают, что каспазные мутанты вируса вызывают формирование полноценного иммунитета и полную защиту организма от смертельных доз вируса и могут использоваться в качестве вакцин.
Хорошо известно, что в геном различных вирусов можно встраивать чужеродные гены, колирующие биологически активные полипептиды с полезными медицинскими свойствами, такие как интерферон, интерлейкин, цитокины, индукторы или супрессоры клеточного деления, онколитики, гормоны и др. [9]. При заражении такими химерными вирусами в реципиентном организме в местах размножения вируса будут экспрессироваться встроенные гены и синтезироваться и биологически активные полипептиды. В качестве таких переносчиков (векторов доставки) могут использоваться только аттенуированные вирусы, не вызывающие серьезной патологии в организме-реципиенте. Каспазные мутанты вирусов, обладая такими качествами непатогенных вирусов, могут применяться в качестве векторных систем для направленной доставки и синтеза различных биологически активных соединений полипептидной природы в различные органы и ткани организма.
Далее со ссылкой на предлагаемые чертежи подробно описан конкретный вариант осуществления предлагаемого способа, на которых:
фиг.1 изображает анализ переноса, синтеза и протеолитического расщепления каспазами белков NP и М2 у каспазных мутантов вируса гриппа птиц;
фиг.2 изображает размножение каспазных мутантов вируса куриной чумы и экспрессии его белков в клетках различного происхождения;
фиг.3 - динамика веса цыплят, зараженных вариантами WTR, NPgd, NPdel и M2nn вируса чумы птиц;
фиг.4 - динамика размножения вирусов гриппа человека A/WSN/33(WT) и его каспазного мутанта NPG.
Примеры осуществления изобретения
Пример 1. Искусственное получение мутантных вариантов вируса гриппа чумы птиц.
Для получения рекомбинантного вируса дикого типа (wtr) использовали восемь плазмид, содержащих полные копии сегментов РНК вируса куриной чумы A/FPV/Rostock/34 (A/FPV/Ro/34) (H7N1), интегрированных в плазмиду рНН21 по сайтам BspMl (РВ1 и NP), Bsal (РВ2, РА, НА и NA), или BsmBl (М и NS). Дополнительно были синтезированы 4 экспрессионные плазмиды, содержащие гены вирусных белков РВ1 (pcDNA-PBl), РВ2 (pcDNA-PB2), PA (pcDNA-PA) и NP (pcDNA-NP), которые применяли для усиления синтеза рекомбинантного вируса в трансфицированных клетках, как описано в работе [10]. Суспензию клеток 293Т (~106 клеток) в среде Opti-M (Gibco BRL) смешивали с 0,5 мл комплекса липофектамина/2000 и набора 12 плазмид (1 мкг каждой плазмиды) и инкубировали 4 часа при 37°С. Далее к трансформированным клеткам 293Т добавляли 2 мл суспензии клеток МВСК (1,5×105 кл/мл) на среде DMEM, содержащей 0,2% SCS, пенициллин (50 U/m1), стрептомицин (50 мкг/мл), и продолжали совместную инкубацию культур при 37°C. Через 48-72 часа культуральную жидкость, содержащую синтезированный рекомбинантный вирус с титром 25-27 ГАЕ/мл (пассаж 1), делили на порции и хранили при -80°С. Для получения мутантных вирусов, содержащих ген NP с мутациями GLY16→ASP16(NPgd), делецией GLY16(NPdel), или ген М2 с мутацией
AspAsp90→AsnAsn (M2nn), проводили сайт-направленный мутагенез плазмиды pHH21-NP и рНН21-М с использованием специфичных для указанных каспазных мутаций праймеров. Мутагенез проводили с использованием набора «Quick Change" (Stratagene). ДНК-липофектаминовый комплекс для получения мутантного вируса готовили с включением мутантных плазмид рНН21-NPgd, рНН21-NPdel и рНН21-М2nn.
Пример 2. Молекулярная характеристика каспазных мутантов вируса
После получения рекомбинантных вирусов проводили изучение чувствительности вирусных белков NP и М2 к протеолизу каспазами в инфицированных клетках. С этой целью клетки МДСК заражали вирусами и инкубировали в течение 20-24 часов до наступления апоптозной фазы, когда, как было показано ранее [10], активировались клеточные каспазы, которые специфически расщепляли NP(56 kD)→aNP(53 kD) и M2(14 kD)→aM2(12 kD). На фиг.1 представлен анализ протеолитического расщепления каспазами белков NP и М2 у каспазных мутантов вируса гриппа птиц. Культуру клеток МДСК заражали мутантами WTR, NPdel, NPgd, M2nn вируса гриппа куриной чумы (МИ 10) и инкубировали в течение 19-23 ч.п.з., когда в клетках развивалась фаза вирусного апоптоза. Клеточные белки анализировали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с последующей регистрацией белковых форм NP, aNP, М2 и аМ2 методом вестерн-блот и усиленной хемилюминесценции с использованием моноклональных антител к данным белкам и анти-видового пероксидазного конъюгата. У мутанта NPgd белок NP претерпевал расщепление клеточными каспазами. У варианта M2nn белок M2 приобретал резистентность к каспазам и не расщеплялся этими ферментами в инфицированных клетках. Как видно на фиг.1, у вируса дикого типа (wtr) белок NP, лишенный каспазного сайта, сохранял резистентность к клеточным каспазам и не подвергался протеолизу в инфицированных клетках, тогда как имеющий такой сайт белок М2 расщеплялся с образованием апоптозного продукта аМ2. Аналогичный белковый профиль с резистентным NP выявлялся у вируса NPdel с делетированным G16 в белке NP. У мутанта NPgd, в котором полноценный каспазный сайт «человеческого» типа был восстановлен мутацией G16→D, обнаруживался типичный протеолиз NP→aNP вместе с протеолизом М2→аМ2. У мутанта M2NN параллельно с резистентным NP выявлялся устойчивый к каспазному протеолизу М2, что подтверждало повреждающий эффект мутации DD32→NN для каспазного/гранзимного сайта. Так же как и в клетках МДСК, протеолиз NP и М2 был выявлен в клетках САСО-2 и КФ. Этот факт указывал на наличие универсальной чувствительности к каспазам различного происхождения у вирусных белков NP и М2 при сохранении в их составе соответствующих каспазных сайтов. Таким образом, при повреждении каспазных сайтов вирусные белки чувствительность к каспазам утрачивали и, наоборот, при воссоздании каспазных сайтов протеолиз каспазами возобновлялся.
Пример 3. Стабильность и репродуктивные свойства каспазных мутантов вируса.
Для практического использования представляется важным проверка стабильности полученных каспазных мутаций в генерациях вируса при пассировании. Для этого исследовали варианты вируса, которые либо трижды пассировали в культуре МДСК со множественностью инфекции (МИ) 0,01, либо дважды в куриных эмбрионах, и вирусы, выделенные из клоакальных смывов цыплят на 4-5 день после в/м заражения. В образцах исследуемых вирусов выделяли РНК, которую методом обратной тарнскрипции с вирусоспецифическими праймерами переводили в вирусную ДНК с последующим секвенированием интересуемых участков полученных ДНК-транскриптах. Оказалось, что все исследуемые каспазные мутанты обладали стабильностью и сохраняли сайт-направленные мутации при репликации как в культуре клеток, куриных эмбрионах, так и в организме цыплят. Сравнивали уровни репликации полученных рекомбинантных вирусов в клетках млекопитающих (МДСК, САСО-2) и птиц (КФ). Для этого применяли методику инфекционных фокусов, в которой уровень репликации вирусов оценивали по размеру инфекционного фокуса. На фиг.2. показано размножение каспазных мутантов вируса куриной чумы в клетках различного происхождения. Рекомбинантные варианты вируса куриной чумы вносили в культуру клеток кишечника человека (линия САСО-2), почки собаки (линия МДСК), фибробластов куриного эмбриона (КФ) в количестве около 100 (САСО-2 и МДСК) или 10 (КФ) инфекционных вирусных частиц на лунку. После заражения клеточный монослой покрывали слоем агарозы, приготовленной на среде ДМЕМ, и инкубировали в течение 24 (МДСК) или 50 (САСО-2, КФ) часов. Далее клетки фиксировали и вирусные фокусы окрашивали с помощью вирусо-специфических антител и видо-специфичсколго конъюгата пероксидазы с использованием водонерастворимого субстрата тетраметилбензидина. Размер вирусных фокусов отражал уровень размножения исследуемого вируса и экспрессии его белков в клеточной культуре. Обнаружено, что в культурах клеток человека (САСО-2) и птиц (КФ) все 4 варианта птичьего вируса формировали фокусы сходного размера (Фиг.2). Дополнительно исследовали уровни накопления инфекционного вируса в культурах клеток в опытах с многоцикловой инфекцией (множественность заражения 0,001 БОЕ на клетку). Оказалось, что урожай каспазных мутантов вируса куриной чумы в культуре клеток МДСК через 30-35 ч.п.з. у всех четырех вариантов вируса был сходным, как показано в таблице 2.
| Таблица 2. | |
| Вариант вируса | Урожай вируса (БОЕ/мл) |
| 1. WTR | 0,4×108 |
| 2. NPdel | 0,8×108 |
| 3. NPgd | 0,7×108 |
| 4. М2nn | 0,4×108 |
Было также обнаружено, что скорость репродукции у исследованных вариантов вируса при одноцикловой инфекции (МИ 1) была сходной и лишь вирус NPdel отличался ускоренной репродукцией в клеточных культурах и достигал максимального уровня на 1-3 часа раньше, чем другие варианты. Следует отметить, что уровень протеолитического нарезания НАО→НА1/2 у всех исследуемых мутантов практически не различался и приближался к 100% расщеплению во всех исследуемых хозяйских системах, что хорошо согласуется с данными других авторов о мультиаргининовом протеолитическом сайте в белке HA этого штамма. Интересно также, что сходная репродукция всех 4 рекомбинантных вирусов отмечалась при размножении в куриных эмбрионах. Эти наблюдения показывают, что все исследованные рекомбинантные варианта вируса A/FPV/Ro/34 сохраняли способность к репродукции, близкую дикому типу после проведенных аминокислотных замен в участках каспазных сайтов белков NP и М2.
Пример 4. Вирулентность каспазных вариантов вируса
В этом разделе работы сравнивали вирулентность полученных рекомбинантных вирусов в опытах на 8-дневных цыплятах. Цыплят (Lohmann Brown, линия РК-13) по 2 особи в группе заражали внутримышечно вариантами WTR (•), NPgd (▪), NPdel 
и М2nn (♦) вируса A/FPV/Ro/34 со множественностью инфекции 5 БОЕ на цыпленка. Для заражения использовали образцы вируса (пассаж 1), выращенного в культуре клеток МДСК. Инфекционность заражающего вируса определяли методом инфекционных фокусов в культуре МДСК. Момент инфицирования цыплят обозначен на чертеже вертикальной стрелкой. Далее ежедневно наблюдали за животными и контролировали прибавку веса и гибель. Для определения титров экскретируемого вируса через определенные дни после заражения брали клоакальное содержимое с помощью универсального зонда (Зонд 3Г Бу-«ЦМ+») и далее титровали методом инфекционных фокусов в культуре МДСК. Цыплят заражали внутримышечно одинаковой инфекционной дозой исследуемых вирусов (5 БОЕ на цыпленка) и наблюдали за динамикой прибавки веса и гибели цыплят.Результаты типичного эксперимента для вирусов wtr и NPgd показаны на Фиг.3. У цыплят, инфицированных вирусом дикого типа (wtr) и мутантом NPdel, отмечалось быстрое снижение веса птиц и их гибель через 4-5 дней после заражения (д.п.з.). Причем, более быстро, примерно на 1-2 дня раньше, умирали цыплята в группе, зараженной мутантом NPdel, что говорило о его более высокой вирулентности по сравнению с диким вирусом. Напротив, у цыплят инфицированных такой же дозой мутантных вирусов NPgd и М2nn, обнаруживалось лишь замедление прибавки веса, взъерошенность перьевого покрова, снижение активности в период 4-8 д.п.з., что являлось следствием развития гриппозного заболевания. В дальнейшем указанные симптомы быстро проходили, восстанавливался вес, и цыплята полностью выздоравливали. Смертность в этой группе животных не регистрировалась.
Пример 5. Защита от смертельного действия дикого вируса с помощью каспазных мутантов вируса.
Для изучения защитного действия каспазных мутантов использовали высокочувствительных для этой инфекции цыплят. 8-дневные цыплята линии (Lohmann Brown, линия РК-13) заражали вирусом в объеме 0,15 мл внутримышечно в каждую ногу и далее ежедневно наблюдали за животными и контролировали прибавку веса и гибель. Для определения титров экскретируемого вируса через определенные дни после заражения брали клоакальное содержимое с помощью универсального зонда (Зонд ЗГ Бу-«ЦМ+») и далее титровали методом инфекционных фокусов в культуре МДСК. Через 15 дней после первичного заражения цыплят вирусами NPgd и М2nn с дозой 10 БОЕ на цыпленка проводили повторное в/и инфицирование этих цыплят высоко-смертельной дозой (100 БОЕ на цыпленка) дикого вируса A/FPV/Ro/34. После повторного инфицирования смертельной дозой дикого вируса признаки заболевания не выявлялись и все цыплята оставались живыми. При исследовании клоакальных смывов на 3-й и 6-й день после инфицирования вирус обнаружить не удавалось у прединфицированных NPgd и М2nn мутантами, тогда как у контрольных цыплят содержание вируса в клоакальных смывах на 5-й день после заражения
составляло 103-105 БОЕ на мл клоакальной суспензии. В сыворотке крови цыплят на 9-й день после второго заражения определялись высокие титры противовирусных антител, которые в реакции торможения гемагглютинации работали в разведениях 1/6400-1/21600. В контрольной группе плацебо (предварительно неинфицированных цыплят) отмечалась 100% гибель животных через 3-5 д.п.з. Полученные данные показывают, что мутантные вирусы NPgd и M2nn размножались в организме цыплят и индуцировали развитие протективного иммунитета против дикого вируса куриной чумы. Таким образом, точечные мутации G16→D и DD90→NN в каспазном участке белков NP и M2 птичьего вируса гриппа приводила к снижению вирулентных свойств этих штаммов, но сохраняла у них способность индуцировать высокий уровень иммунитета в инфицированном организме.
Пример 6. Искусственное получение мутантного вируса гриппа человека.
Использовали 16-плазмидный метод, описанный в работе Neumann et al [11]. Для получения рекомбинантного вируса дикого типа (WT) использовали восемь плазмид, содержащих полные копии индивидуальных сегментов РНК вируса гриппа человека A/WSN/33 (H1N1), расположенных под промотором полимеразы типа 1 человека (pPolI-WSN-PBl, pPolI-WSN-PB2, pPolI-WSN-PA, pPolI-WSN-HA, pPolI-WSN-NP, pPolI-WSN-NA, pPolI-WSN-M, pPolI-WSN-NS) и восемь экспрессионных плазмид, содержащих гены вирусных белков РВ1 (pcDNA774), РВ2 (pcDNA762), PA (pcDNA787), NP (pCASSG-WSN-NP0), NA (pCAGGS-WNA), Ml (pCAGGS-WSN-M!), M2 (pEP24c), NS2 (pCA-NS2) под промотором β-актина ципленка (pCAGGS) или цитомегаловируса человека (pcDNA). Для трансформации клеток готовили смесь, содержащую по 1 мкг всех перечисленный плазмид, кроме плазмид pPolI-WSN-PA, рЕР24 с и pCA-NS2, которые брали в количестве 0,25 мкг, и полученную смесь ДНК комплексировали с липофектамином 2000 (Gibco BRL), и полученный ДНК-липофектаминовый комплекс использовали для трансформации клеток человека 293Т. Для получения каспазного мутанта вируса (вариант NPG), содержащего ген NP с мутацией ASP16→GLY16, проводили сайт-направленный мутагенез плазмиды pPolI-NP-RT, содержащей полный ген NP вируса A/WSN/33, используя праймеры 5'-CGAACAGATGGAGACC GGTGGAGAACGCCAG-3' и 5'-CTGGCGTTCTCCACC GGTCTCCATCTGTTCG-3' (измененные основания выделены жирным, GLY триплет подчеркнут). При замене ASP на GLY в гене NP возникал уникальный сайт рестрикции AgeI, что позволяло контролировать сохранение мутации в полученном рекомбинантном вирусе при его последующем пассировании. Мутагенез проводили с использованием набора «QuickChange" (Stratagene). ДНК-липофектаминовый комплекс для получения мутантного вируса NPG с мутацией ASP→GLY готовили, как описано выше, но вместо плазмиды pPolI-WSN-NP брали плазмиду pPolI-NP/GLY16-RT. Для трансформации 3 мл суспензии клеток 293Т (~106 клеток) в среде Opti-M (Gibco BRL) с 0,5 мл комплекса ДНК-липофектамин/2000, вносили в культуральные чашки (диаметр 6 см) и инкубировали 4 часа при 37°С. Далее к трансформированным клеткам 293Т добавляли 2 мл суспензии клеток МДСК (1,5×105 кл/мл), приготовленной на среде DMEM, содержащей 0,2% FCS, пенициллин (50 U/ml), стрептомицин (50 мкг/мл), и продолжали инкубацию при 37°С. Через 24 часа среду удаляли и трансформированную смешанную культуру клеток 293Т/МДСК инкубировали далее в течение 48-72 часов в среде DMEM без FCS, содержащей 0,3 мкг/мл трипсина для активации ситезируемого вируса. Культуральную жидкость, содержащую синтезированный рекомбинантный вирус и имеющую гемагглютинирующий титр 25-27 ГАЕ/мл, фракционировали на порции и хранили при -80°С.
Пример 7. Аттенуация репликативных свойств вируса гриппа человека путем модификации каспазного сайта в вирусном белке NP.
Для оценки аттенуации каспазного мутантного вируса гриппа (NPG) человека проводили сравнение скорости его репликации в культуре клеток с диким (исходным; WT) вариантом вируса. Скорость репликации вируса оценивали по уровню накопления вируса в культуральной жидкости инфицированных клеток. 2-ух дневную культуру клеток МДСК инкубировали в течение 1 часа с исследуемым вирусом со множественностью 1 вирион на 104 клеток в клеточной культуре. После 1-часового контакта клетки тщательно промывали средой и инкубировали при 37°С в среде DMEM, содержащей 0,2 мкг/мл ацетилированного трипсина (Sigma). На Фиг.4 представлена динамика размножения вируса гриппа человека. Через указанные интервалы времени (ось абсцисс: цифрами 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 показаны интервалы времени - 12, 24, 48, 60, 72, 84, 96, 108 после заражения соответственно) из среды отбирали образцы, в которых определяли количество вируса по гемагглютинирующей активности куриных эритроцитов и методом инфекционных фокусов в культуре клеток МДСК. На оси ординат Фиг.4 показано количество гемагглютинирующих единиц вируса (ГАЕ) на мл культуральной жидкости. Размножение и накопление вирусного потомства у дикого вируса происходило примерно на 20 часов раньше и в больших количествах, чем у мутанта NPG при инфекции культуры клеток МДСК. Таким образом, эти наблюдения показали, что каспазный мутант вируса гриппа человека имеет сниженную репликацию по сравнению с исходным диким штаммом, т.е. является аттенуированным.
1. Способ получения генетически модифицированного вируса гриппа и вирусных белков путем введения мутаций, делеций, вставок в участки вирусного генома, кодирующие каспазные или гранзимные сайты или их мотивы или создание дополнительных каспазных сайтов и их мотивов у вирусных белков путем осуществления сайт-направленного мутагенеза и процесса обратной генетики.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что полученный модифицированный вирус гриппа представляет собой аттенуированный вирус, и вирусные белки характеризуются ослаблением токсичности.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что полученный модифицированный вирус гриппа обладает повышенными вирулентными свойствами, и вирусные белки характеризуются усилением токсичности.
4. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что при введении мутаций в участок вирусного генома встраивают чужеродные гены (химерные вирусы), которые кодируют белки, полипептиды и их фрагменты, усиливающие экспрессионные, лечебные и профилактические свойства получаемого аттенуированного вируса.
5. Применение генетически модифицированного вируса гриппа и вирусных белков, полученных способом по любому из пп.1-4, для профилактики инфекционных болезней и создания противовирусного иммунитета.
6. Применение вируса гриппа, полученного по любому из пп.1-4, в качестве продуцента для получения вирусных и других белков с полезными свойствами и в качестве субстратов для приготовления субъединичных и субвирионных вакцин или их протекторов и усилителей.
7. Применение вируса гриппа, полученного способом по любому из пп.1, 2, 4, в качестве векторов для направленного переноса и экспрессии в организме-реципиенте новых антигенов, химерных белков и лечебных соединений полипептидной природы.
8. Применение вируса гриппа и вирусных белков, полученных способом по любому из пп.1, 3, 4, для направленного цитолиза клеток и лечения опухолевых и пролиферативных процессов.
9. Применение вируса гриппа и белков по п.5 путем введения в организм человека или животных ингаляционно, подкожно, накожно, внутримышечно, ректально, парантерально, per os.
10. Применение вируса гриппа и белков по п.7 путем введения в организм человека или животных ингаляционно, подкожно, накожно, внутримышечно, ректально, парантерально, per os.
11. Применение вируса гриппа и белков по п.8 путем введения в организм человека или животных ингаляционно, подкожно, накожно, внутримышечно, ректально, парантерально, per os.
