Способ прогнозирования возможности изменения клинической формы пузырчатки

Изобретение относится к области медицины, в частности к лабораторным методам исследования, и может быть использовано в дерматологии. Способ направлен на повышение точности прогноза за счет более достоверного определения профиля антигенов-мишеней аутоиммунной пузырчатки. Это достигается исследованием клинически интактного участка кожи больного методом прямой иммунофлюоресценции. Определяют место локализации фиксированного иммуноглобулина класса G. При локализации иммуноглобулинов класса G в межклеточной субстанции всех слоев эпидермиса прогнозируют возможность изменения формы пузырчатки, при наличии иммуноглобулинов класса G не во всех слоях - вероятность изменения клинической формы пузырчатки низкая. Предлагаемый способ позволяет осуществить прогноз возможности перехода от одной клинической формы к другой и обратно. Это дает возможность определить более эффективную тактику ведения и лечения пациента. 3 ил.

 

Изобретение относится к области лабораторных исследований и может быть использовано в дерматологии.

Известен способ прогнозирования изменения клинической формы пузырчатки, включающий исследование профиля антигенов-мишеней в сыворотке крови больных методом иммунопреципитации (Western blot technique) (Kawana S., Hashimoto Т., Nishikawa Т., Nishiyama S. Change in clinical features, histologic findings, and antigen profiles with development of pemphigus foliaceus from pemphigus vulgaris // Arch.dermatol., 1994; 130: p.1534-1538).

Недостатком этого способа является его низкая чувствительность и специфичность, что не позволяет с достаточной достоверностью прогнозировать возможности изменения клинических форм пузырчатки.

Наиболее близким является способ прогнозирования возможности изменения клинической формы пузырчатки путем исследования сыворотки крови больного, которую наслаивают в разные субстраты и определяют профили антигенов-мишеней методом непрямой иммунофлюоресценции (Hashimoto Т., Amagai M., Garrod DR., Nishikawa T. Immunofluorescence and immunoblot studies on the reactivity of pemphigus vulgaris and pemphigus foliaceus sera with desmoglein 3 and desmoglein l // Epithelial Cell Biol., 1995; 4: p.63-69).

Недостатком этого способа является то, что точность прогноза недостаточна, поскольку не всегда можно определить профиль антигенов-мишеней из-за отсутствия циркулирующих аутоантител в сыворотке крови больных. Это связано как с чувствительностью используемых субстратов, так и со способностью антител сорбироваться в тканях больного и прочно связываться с антигенами-мишенями. Поэтому только в 60-70% случаев можно выявить аутоантитела, специфически направленные к определенным антигенам-мишеням.

Задачей предлагаемого изобретения является устранение этих недостатков и повышение точности прогноза за счет более достоверного определения профиля антигенов-мишеней аутоиммунной пузырчатки.

Это достигается исследованием клинически интактного участка кожи больного методом прямой иммунофлюоресценции. Определяют место локализации фиксированного иммуноглобулина класса G. При локализации иммуноглобулинов класса G в межклеточной субстанции всех слоев эпидермиса прогнозируют возможность изменения формы пузырчатки, при наличии иммуноглобулинов класса G не во всех слоях - вероятность изменения клинической формы пузырчатки низкая.

Изучение на молекулярно-биологическом уровне морфологического строения и биохимического состава кожи позволило выявить и идентифицировать разные антигены-мишени (десмоглеины) для аутоантител пузырчатки.

При проведении иммуногистохимической реакции предложенным способом достигается точность определения профиля антигенов-мишеней, способствующая прогнозу об изменении клинической картины аутоиммунной пузырчатки.

При исследовании криостатных срезов клинически интактных участков кожи больных аутоиммунной пузырчаткой выявлен факт фиксации IgG в местах локализации антигенов-мишеней, характерных для каждой формы пузырчатки.

При выявлении фиксированного IgG в межклеточной субстанции базального и шиповатого слоях эпидермиса, где преимущественно располагается десмоглеин 3 (аутоантиген вульгарной пузырчатки), диагностируют вульгарную пузырчатку, в межклеточной субстанции зернистого слоя, где экспрессируется десмоглеин 1 (аутоантиген листовидной или себорейной пузырчатки), - листовидную или себорейную пузырчатку. В ряде случаев можно наблюдать фиксацию IgG в межклеточной субстанции всех слоев эпидермиса с преимущественным поражением или базального/шиповатого, или шиповатого/зернистого слоев в зависимости от форм проявления пузырчатки.

На фиг.1 показана фиксация IgG в межклеточной субстанции базального 1 и шиповатого 2 слоев эпидермиса при вульгарной пузырчатке с вовлечением в патологический процесс только слизистой оболочки полости рта; на фиг.2 показана фиксация IgG в межклеточной субстанции шиповатого и зернистого 3 слоев эпидермиса при себорейной пузырчатке с вовлечением в патологический процесс кожи; на фиг.3 показана фиксация IgG в межклеточной субстанции всех слоев эпидермиса при вульгарной пузырчатке с вовлечением в патологический процесс кожи и слизистой оболочки полости рта.

Способ осуществляется следующим образом.

Ткань биоптата кожи (клинически интактный участок кожи) больного замораживают при низкой температуре (-20°С). Серийные криостатные срезы помещают на предметное стекло, подсушивают в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем срезы промывают физиологическим раствором с фосфатным буфером (PBS), pH 7,0-7,4, в течение 3-5 мин с целью удаления не связанных с тканями растворимых белков и обрабатывают люминесцирующей сывороткой (метка изотиоцианатом флюоресцеина) против иммуноглобулинов класса G в течение 30 мин при комнатной температуре. Вновь промывают PBS в течение 3-5 мин и заключают под покровное стекло в 60% нейтральный глицерин. Для контроля одновременно проводят изучение криостатных срезов, окрашенных гематоксилином и эозином в световом микроскопе.

Одним из диагностических маркеров аутоиммунной пузырчатки является обнаружение иммуноглобулина класса G в межклеточных пространствах эпидермиса.

При вульгарной и вегетирующей пузырчатке фиксация иммуноглобулина класса G наблюдается в межклеточных пространствах шиповатого слоя, а при себорейной и листовидной пузырчатке - в зернистом слое эпидермиса.

К настоящему времени предлагаемым методом обследовано 164 больных разными формами пузырчатки, из них 121 больной вульгарной пузырчаткой, 7 больных вегетирующей, 22 - себорейной, 10 - паранеопластической, 4 - листовидной.

В течение 15 лет мы наблюдали 9 случаев перехода одной клинической формы пузырчатки в другую на фоне снижения или отмены поддерживающей дозы глюкокортикостероидов. В 4 случаях - переход вульгарной пузырчатки в себорейную (3 случая) и листовидную (1 случай); в 5 других случаях - переход себорейной пузырчатки в вульгарную и обратно. При этом переход из одной формы в другую занимал различный промежуток времени, от 1 года до 11 лет (в среднем 7,1±3,3 года).

При первоначальном развитии аутоиммунной пузырчатки независимо от клинических форм ее проявления у всех больных было обнаружено отложение иммуноглобулина класса G во всех слоях эпидермиса, но наиболее выраженная реакция отмечалась в местах локализации антигена-мишени. В случаях вульгарной пузырчатки - на уровне базального/шиповатого слоев, где локализуется антиген-мишень вульгарной пузырчатки (десмоглеин 3), а в случаях себорейной пузырчатки - на уровне шиповатого/зернистого слоев, где локализуется антиген-мишень листовидной или себорейной пузырчатки (десмоглеин 1). При последующем обострении патологического процесса у каждого из этих больных было выявлено сохранение фиксации иммуноглобулина класса G в межклеточной субстанции всех слоев эпидермиса, но с изменением степени выраженности иммунофлюоресцентной реакции от недифференцированных слоев к дифференцированным слоям эпидермиса с данным классом иммуноглобулина и наоборот, т.е. произошло изменение профиля антигенов-мишеней.

Так, вовлечение системы межклеточного соединения всех слоев эпидермиса у одного и того же больного сопровождается проявлением в течение всего периода болезни клинически разных форм пузырчатки. Это свидетельствует о возможном переходе одной клинической формы болезни в другую и обратно.

Пример 1

Обследован больной К., 68 лет (и/б 20064, 2002). Болен в течение двух месяцев. Впервые после ушиба головы появились высыпания на коже волосистой части. При цитологическом исследовании мазков-отпечатков со дна эрозий и содержимого пузырей обнаружены эозинофилы 3-4 в поле зрения и эпителиальные клетки с начинающимся акантолизом. Больной госпитализирован с предварительным диагнозом: вульгарная пузырчатка.

При осмотре: патологический процесс распространенный, симметричный, локализуется на коже туловища, волосистой части головы, лица, верхних и нижних конечностей, слизистой оболочке полости рта и носа.

Для уточнения диагноза проводились гистологическое и иммуногистохимическое исследования. При гистологическом исследовании очага поражения на коже выявлен вскрывшийся пузырь, характерный для вульгарной пузырчатки. При иммуногистохимическом исследовании криостатных срезов клинически интактных участков кожи методом прямой иммунофлюоресценции обнаружена фиксация IgG в межклеточной субстанции базального и шиповатого слоев эпидермиса.

На основании комплексного обследования больному выставлен диагноз: вульгарная пузырчатка. Проведена глюкокортикостероидная терапия. Больной был выписан в удовлетворительном состоянии. Назначен ежедневный прием 60 мг преднизолона per os. В течение последующих 3-х лет доза преднизолона была снижена до поддерживающей дозы - 1,5 таблетки в день (7,5 мг). У пациента в настоящее время длительная клиническая ремиссия.

Пример 2

Обследован больной М., 41 года (и/б 16610, 2001). Болен около двух лет. Впервые без видимой причины в зимний период времени на коже в области правой голени появился пузырь.

При осмотре: процесс распространенный, симметричный, локализуется на коже лица, волосистой части головы, туловища, верхних и нижних конечностей. Патологический процесс представлен чешуйко-корками серозно-желтого цвета, расположенными на гиперемированном фоне. Корки, наслаиваясь друг на друга, приобрели вид «слоеного теста». Они легко отторгаются, образуя поверхностные эрозии. Симптом Никольского положительный.

Для уточнения диагноза использовали гистологический и иммуногистохимический методы исследования.

При гистологическом исследовании биоптата пораженного участка кожи выявлена картина, характерная для листовидной пузырчатки: внутриэпидермальные субкорнеальные пузыри с нерезко выраженным акантолизом. В дерме отмечена неспецифическая воспалительная реакция. При иммуногистохимическом исследовании биоптата клинически интактного участка кожи методом прямой иммунофлюоресценции выявлена фиксация IgG в шиповатом и зернистом слоях эпидермиса.

На основании клинико-морфологической картины и данных гистологического и иммуногистохимического методов исследования больному выставлен диагноз: листовидная пузырчатка. Назначена глюкокортикостероидная терапия. На фоне проводимой терапии отмечен клинически положительный эффект: отсутствие свежих высыпаний, исчезновение чешуйко-корок, эпителизация эрозий. Больной выписан в удовлетворительном состоянии. Назначен ежедневный прием 40 мг преднизолона per os. Даны рекомендации о дальнейшем снижении дозы преднизолона под контролем дерматолога по месту жительства. В настоящее время у больного отмечается длительная клиническая ремиссия на 20 мг преднизолона.

Пример 3

Обследована больная Г., 65 лет (и/б 1235, 2002). Больна около 3-х месяцев. Впервые после нервного стресса появились высыпания на коже туловища, сопровождающиеся незначительным зудом. При цитологическом исследовании мазков-отпечатков со дна эрозий обнаружены акантолитические клетки. Больная госпитализирована с предварительным диагнозом: вульгарная пузырчатка.

Для уточнения диагноза проводились гистологические и иммуноморфологические исследования. Выявлена картина вульгарной пузырчатки.

Методом прямой иммунофлюоресценции выявлено наличие IgG в межклеточной субстанции во всех слоях эпидермиса. Вовлечение в патологический процесс всех слоев эпидермиса свидетельствует о возможном переходе одной клинической формы к другой.

Больная повторно госпитализирована в кожную клинику МОНИКИ через 4 года с обострением патологического процесса. Клиническая картина была представлена тотальной эритродермией и шелушением. Поставлен диагноз - листовидная пузырчатка.

При иммуноморфологическом исследовании клинически интактного участка кожи выявлена фиксация IgG во всех слоях эпидермиса. Это свидетельствует о возможности повторного перехода к иной форме пузырчатки.

Сохранившийся устойчивый негативизм к глюкокортикостероидной терапии не позволил полноценно провести иммуносупрессивную терапию. В качестве альтернативы была используема ранее проводимая схема: преднизолон в невысоких дозах в сочетании с дипроспаном. На фоне этой терапии было достигнуто некоторое подавление патологического процесса: отсутствие свежих высыпаний, разрешение явлений эритродермии и шелушения. Больная выписана под наблюдение дерматолога по месту жительства.

Пример 4

Обследована больная С., 39 лет (и/б 13647, 1993). Больна в течение года. Впервые появилась эрозия на слизистой оболочке полости рта (твердое небо), болезненность при глотании. При осмотре: патологический процесс локализован на слизистой оболочке полости рта (твердое небо), красной кайме губ и слизистой полости носа.

Для уточнения диагноза проводилось цитологическое, гистологическое, иммунологическое и иммуногистохимическое исследования. Так, в мазках-отпечатках со дна эрозий обнаружены акантолитические клетки. Гистологическая картина соответствовала картине, характерной для вульгарной пузырчатки. В сыворотке крови больной обнаружены циркулирующие аутоантитела класса IgG к межклеточной субстанции многослойного плоского эпителия в разведении 1:40.

На основании клинико-морфологической картины и лабораторных данных исследования больной подтвержден диагноз: вульгарная пузырчатка. Назначена глюкокортикостероидная терапия.

В биоптате интактного участка кожи методом прямой иммунофлюоресценции выявлен фиксированный IgG в межклеточной субстанции всех слоев эпидермиса. Такая иммуноморфологическая картина согласно предлагаемому способу говорит о возможном переходе одной клинической формы пузырчатки к другой.

Больная выписана в удовлетворительном состоянии в клинической ремиссии (полная эпителизация эрозий на слизистой оболочке полости рта, красной кайме нижней губы и слизистой полости носа). Назначен ежедневный прием 40 мг преднизолона per os. В течение первых 5 лет доза преднизолона постепенно снижена до полной отмены. В последующие 6 лет отмечалась полная клиническая ремиссия без поддерживающей дозы преднизолона.

В апреле 2004 года больная была госпитализирована в кожную клинику МОНИКИ с обострением патологического процесса, возникшего после нервного перенапряжения. При этом высыпания локализовались на коже (грудь, живот, спина) без вовлечения слизистых оболочек. Патологический процесс был представлен эритематозными очагами, правильной формы, с четкими границами, поверхность которых покрыта серозными корочками. Клиническая картина соответствовала себорейной пузырчатке.

При повторном иммуногистохимическом исследовании интактного участка кожи больной обнаружены фиксированный IgG в межклеточной субстанции всех слоев эпидермиса с наиболее выраженной иммунофлюоресцентной реакцией в зернистом слое. Это свидетельствует о произошедшем переходе вульгарной пузырчатки к себорейной пузырчатке. Наличие фиксированного иммуноглобулина класса G во всех слоях эпидермиса дает возможность прогнозировать и дальнейший возможный переход в иную форму.

На основании клинико-морфологической картины и иммуногистохимического исследования больной выставлен диагноз: себорейная пузырчатка. Проведена глюкокортикостероидная терапия: 100 мг преднизолона per os в сутки. Больная выписана с клиническим положительным эффектом. Назначен ежедневный прием 30 мг преднизолона. Даны рекомендации по дальнейшему снижению дозы преднизолона под контролем дерматолога по месту жительства.

Таким образом, предлагаемая методика позволяет осуществить прогноз возможности перехода от одной клинической формы к другой и обратно. Это позволяет определить более эффективную тактику ведения и лечения пациента.

Способ прогнозирования возможности изменения клинической формы пузырчатки, включающий исследование биологической ткани, отличающийся тем, что в качестве биологической ткани исследуют клинически интактный участок кожи больного методом прямой иммунофлюоресценции, определяют место локализации фиксированного иммуноглобулина класса G и при его локализации во всех слоях эпидермиса прогнозируют возможность изменения формы пузырчатки, при наличии иммуноглобулина класса G не во всех слоях вероятность изменения формы пузырчатки низкая.