Питательная среда для выращивания углеводородокисляющих бактерий с повышенной деструктивной способностью

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии. В состав среды входит (г/л): солевая основа: натрий хлористый 5,0, аммоний фосфорнокислый однозамещенный 1,0, калий фосфорнокислый двузамещенный 1,0, магний сернокислый 0,2, а также агар-агар 15,0, нефть 5,0 и глюкоза 1,0, дистиллированная вода - остальное. Плотная питательная среда расширяет арсенал методических подходов для выращивания микроорганизмов с повышенной способностью утилизировать углеводороды нефти, перспективных для создания на их основе биопрепаратов, предназначенных для очистки окружающей среды от нефтезагрязнения. Микроорганизмы, выращенные на плотной питательной среде, являются типичными по культурально-морфологическим и биохимическим характеристикам.

 

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии и может быть использовано для выращивания углеводородокисляющих бактерий с повышенной деструктивной активностью с целью приготовления посевного материала для глубинного культивирования в ферментере при параметрах, оптимальных для микроорганизмов-деструкторов, получения биомассы и создания биопрепарата на основе нефтеокисляющих микроорганизмов.

Антропогенное загрязнение окружающей среды стало серьезной проблемой и достигло глобальных масштабов. Нефть и нефтепродукты относятся к самым массовым загрязнителям природных объектов [Лисичкин В.А., Шелепин Л.А., Боев Б.В. Закат цивилизации или движение к ноосфере (Экология с разных сторон). - М.: ИЦ-ГРАНТ, 1997. - 352 с.]. В этой связи вопросы всестороннего изучения биологических свойств микроорганизмов, особенностей процессов микробной утилизации нефти и нефтепродуктов и влияния на них различных факторов, создание условий для проявления максимальной активности штаммов-деструкторов входят в число первоочередных, стоящих перед экологической биотехнологией [Турковская О.В. Биологические и технологические аспекты микробной очистки сточных вод и природных объектов от поверхностно-активных веществ и нефтепродуктов. Автореферат дис. докт. биол. наук. - Саратов, 2000. - 43 с.].

Современная стратегия очистки окружающей среды с использованием биотехнологических подходов основывается, с одной стороны, на стимуляции естественной (аборигенной) микрофлоры, а с другой, - на интродукции специализированных углеводородокисляющих микроорганизмов [Плешакова Е.В., Дубровская Е.В., Турковская О.В. Приемы стимуляции аборигенной нефтеокисляющей микрофлоры//Биотехнология. - 2005. - № 1. - С.42-50; Дебабов В.Г. Интродукция генетически измененных микроорганизмов в окружающую среду// Биотехнология. - 1992. - № 6. - С.8-11].

Несмотря на то, что исследования по селекции мироорганизмов-нефтедеструкторов, пригодных для биотехнологии очистки окружающей среды, ведутся уже в течение довольно продолжительного времени, ощущается нехватка таких микроорганизмов и созданных на их основе биопрепаратов. Зачастую лишь единичные микроорганизмы-деструкторы из числа испытанных могут претендовать на дальнейшее углубленное изучение и последующее практическое применение. Важно при этом подчеркнуть следующее положение стратегии очистки окружающей среды от ксенобиотиков: начальным и ключевым звеном практически безотходной биотехнологии восстановления экологического статуса природных объектов является деятельность специализированных микроорганизмов, образующих трофические цепи и постадийно участвующих в процессе биодеструкции загрязнений [NIPER/DOE Conference. Application of microorganisms to petroleum technology//Enhan. Energy Recov. News. - 1987. - Vol.11, N 2.- P.1; Гвоздяк П.И., Подорван Н.И., Гвоздяк Н.П. Использование бактерий для отделения нефти от твердых частиц// Микробиол. журн. - 1990. - Т. 52, № 5. - С.38-42]. Такие специализированные микроорганизмы, как свидетельствует практика микробиологических исследований, выделяются из природных объектов, длительное время загрязненных нефтью и нефтепродуктами, довольно редко. Как правило, изучаемые пробы (почва, вода и т.д.) после отделения от твердых частиц и примесей и дополнительной процедуры очистки и обогащения для выделения микроорганизмов высевают на плотные питательные среды на основе белковых гидролизатов или перевара Хоттингера [Турковская О.В., Игнатов В.В. Роль микробиологии в разработке приемов рекультивации нефтезагрязненных почв//Фундаментальные и прикладные исследования саратовских ученых для процветания России и Саратовской губернии: Материалы научн. конф., посвященной 275-летию РАН. - 23-25 марта 1999 г. - Саратов: Изд-во СГУ, 1999. - С.276-278; Турковская О.В., Игнатов В.В. Загрязнение окружающей среды нефтью и нефтепродуктами: проблемы и пути решения//Тезисы научн. конф. «Нефтегазовая отрасль на пороге XXI века». - 17-18 августа 1999 г. - Саратов, 1999. - С.25-27]. Часто в качестве селективных используют питательные среды на основе различных сочетаний солей, в которые после стерилизации вносят нефтепродукты [Гурба А.В., Воробьева Т.И., Винаров А.Ю. Минеральная основа среды для выращивания микроорганизмов-биодеструкторов нефтезагрязнений. Медицинская промышленность и биотехнология. Наука. Производство. Маркетинг. - М.: Фарминдустрия, 1992. - Вып.5-6. - С.17-20; Турковская О.В., Шуб Г.М., Иосипенко А.Д. Способ выявления микроорганизмов-деструкторов неионогенных поверхностно-активных веществ/ А.с. СССР. № 1507794. Способ выявления микроорганизмов-деструкторов неионогенных поверхностно активных веществ, опубл. 15.09.1989; Process for cultivating microorganisms on hydrocarbons/ Deschamps A., Franckowiack S., Gatellier C. et al. Пат. GB № 1284799, опубл. 09.08.1972; Lee S., Cutright T.J. Nutrient medium for the bioremeditation of polycyclic aromatic hydrocarbon-contaminated soil/ Пат. US № 5508194, опубл. 16.04.1996].

Аналогичный подход предложен для селекции ассоциаций микроорганизмов-деструкторов токсических веществ в высококонцентрированных сточных водах [Гвоздяк П.И., Загорная И.Б., Никоненко В.У., Чеховская Т.П. А.с. СССР № 1409657, Способ селекции ассоциаций микроорганизмов-деструкторов].

Известен способ селекции углеводородокисляющих бактерий в жидкой минеральной среде с добавлением нефти с последующим отбором культур для пересева через 5, 10 и 15 дней [Сатубалдин К.К., Салангинас Л.А., патент RU № 2241745. Способ выделения деструкторов нефти и нефтепродуктов, опубл. 10.12.2004].

Выделенные из природных объектов с помощью микробиологических методов и питательных сред микроорганизмы-деструкторы при испытании часто оказываются неспособными активно утилизировать углеводороды нефти и в дальнейшем не используются, а пополняют коллекции технофильных микроорганизмов. В то же время есть свидетельства того, что процесс утилизации субстратов, в частности, углеводородов, в окружающей среде может находится под регуляторным контролем поступающих в среду легкометаболизируемых углеводов [Регуляторное действие глюкозы на активность углеводородокисляющих микроорганизмов в почве/ Гузев B.C., Халимов Э.М., Волде М.И., Куличевская И.С.//Микробиология. - 1997. - Т.66, № 2. - С.154-159]. Так глюкоза, внесенная в питательную среду в концентрации до 1,0 мг/мл, может на порядок увеличить численность углеводородокисляющих бактерий, тогда как более высокие дозы углевода значительно ингибируют этот процесс. Обнаружено также, что в почве катаболитная репрессия синтеза ферментов деградации имеет пролонгированный характер: после утилизации мономера (глюкозы) разложение растительных полимеров на значительное время задерживается, вопреки классическим представлениям о диауксическом росте [Эффект задержки в регуляции микробного разложения полимеров в почве по типу катаболитной репрессии/ Гузев B.C., Бызов Б.А., Звягинцев Д.Г., Звягинцев Н.Д.//Изв. АН СССР. Сер. биол. - 1986. - № 6. - С.834-841]. Добавленная в избыточных количествах в питательную среду с дефицитом источников минерального питания глюкоза снижает метаболическую активность микроорганизмов до минимального уровня, и у них развивается так называемое состояние «отмирания, вызванного субстратом» или «субстратной смерти» [Calcott P.M., Postage J.R. On substrate accelerated death in Klebsiella aerogenes// J. Gen. Microbiol. - 1971. - Vol.70, N 1. - P.115-122].

Относительно механизма отрицательного действия глюкозы на углеводородокисляющие микроорганизмы известно то, что данное свойство углевода связно не с некими токсичными продуктами его метаболизма, а с регуляцией экспрессии генов, кодирующих определенные ферменты [Перт С.Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток/Пер. с англ. - М.: Мир, 1978. - 332 с.]. Предполагается, что тот или иной уровень экспрессии генов определяет отрицательную обратную связь концентрации глюкозы (≥600 мг/л) с процессом утилизации ксенобиотика. При указанной концентрации глюкозы в среде культивирования было обнаружено как угнетение синтеза белков транспортной системы микроорганизма, так и нарушение регуляции активности этой системы путем активации-инактивации ее белков [Коронелли Т.В. Липиды микобактерий и родственных микроорганизмов. - М.: Изд-во МГУ, 1984. - 160 с.; Барышникова Л.М., Чемерис Н.А., Головлев Е.Л. Глюкозный эффект в регуляции транспорта глюкозы клетками Rhodococcus minimus// Микробиология. - 1994. - Т.63, вып.3. - С.405-410]. С учетом данных литературы о влиянии глюкозы на активность углеводородокисляющих микроорганизмов становится очевидной необходимость включения этого углевода в небольших количествах в питательную среду. О важности этого углевода свидетельствует опубликованные результаты по конструированию биопрепарата для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов, в состав которого входит глюкоза (от 0,9 до 1,0 мас.%) [Сваровская Л.И., Писарева С.И., Алтунина Л.К. Патент RU № 2361686, Биопрепарат для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов, опубл. 20.07.2009].

Недостатком существующих питательных сред является их изначальное предназначение для выделения микроорганизмов вообще из образцов почвы и воды, контактирующих с нефтью и нефтепродуктами, либо для стимуляции аборигенной микрофлоры при ремедиации почвы, а также для активации нефтеокисляющих микроорганизмов при нефтедобыче. Такие питательные среды в принципе не могут быть использованы для выявления в популяции выделенных микроорганизмов клонов с повышенной деструктивной активностью, перспективных для использования в биотехнологических целях. В этой связи важно подобрать такой компонентный состав питательной среды, который бы обеспечил рост активных нефтеокисляющих микроорганизмов-деструкторов, биомасса которых может быть использована для глубинного выращивания в ферментерах на ее основе, а также для лиофильного высушивания и получения маточных культур коллекционных линий микроорганизмов-деструкторов нефти и нефтепродуктов.

Наиболее близкой к заявляемой является питательная среда, предназначенная для выращивания микроорганизмов-продуцентов биосурфактантов, нашедших практическое использование в процессе повышения нефтеотдачи [Brown M.L., Moses V. Surfactants and their use/Патент GB № 2172898, опубл. 01.10.1986]. Питательная среда имеет следующий состав (оригинальная пропись среды № 2, г/л):

калий азотнокислый (КNO3)	2,0
калий фосфорнокислый двузамещенный (К2НРO4)	0,5
кальций хлористый (CaCl2·6H2O)	0,1
магний хлористый (MgCl2·6Н2О)	2,0
аммоний хлористый (NH4Cl)	1,0
железо сернокислое (FeSO4·7H2O)	0,003
аскорбиновая кислота (С6Н8О6)	0,1
тиогликолевая кислота (HSCH2COOH)	0,1
дрожжевой экстракт	1,0
глюкоза	20,0
агар-агар	15,0
дистиллированная вода	остальное
рН	7,4 ед. рН

Общим с заявляемой прописью питательной среды является минеральная основа агаризованной среды и глюкоза (20,0 г/л). Стимуляция роста микроорганизмов-продуцентов биосурфактантов обеспечивается также включением в пропись питательной среды дрожжевого экстракта. Глюкоза в указанной концентрации не позволяет использовать питательную среду для скрининга высокоактивных углеводородокисляющих микроорганизмов.

Выбор питательной среды оригинальной прописи №2 связан с тем, что микроорганизмы-продуценты биосурфрактантов клонизируют нефтяные горизонты, обладают способностью утилизировать углеводороды нефти, используя последние для биосинтеза биосурфрактанта, облегчающего нефтеотдачу. В популяции таких микроорганизмов с использованием микробиологических методов и соответствующей питательной среды можно обнаружить микроорганизмы с повышенной деструктивной активностью.

Задачей изобретения является конструирование плотной питательной среды, обеспечивающей рост и размножение популяций природных и коллекционных штаммов углеводородокисляющих бактерий, обладающих повышенной деструктивной способностью.

Технический результат, который может быть достигнут при использовании предлагаемой питательной среды - возможность выращивания бактерий любого вида и рода, содержащих наследуемые генетические детерминанты биодеструкции углеводородов нефти перспективных для создания на их основе биопрепаратов для очистки и рекультивации нефтезагрязненной почвы.

Указанная задача решена разработкой прописи плотной питательной среды на основе необходимого и достаточного количества минеральных веществ с включением в ее состав глюкозы и нефти и специальным образом обработанной с использованием ультразвука.

Разработанная плотная питательная среда успешно апробирована в процессе изучения свойств коллекционных штаммов и природных изолятов, относящихся к родам Pseudomonas, Rhodococcus, Alcaligenes, Brevibacterium, Micrococcus, позволивший выявить от 20 до 50% клонов в популяции исследованных культур, вообще не способных расти на среде и утилизировать углеводороды нефти. Отобранные с использованием предлагаемой плотной питательной среды клоны способны ассимилировать углеводороды нефти в качестве единственного источника углерода. Биомасса таких клонированных микроорганизмов при росте на плотной питательной среде с нефтью в 13-14 раз выше по сравнению с биомассой исходной популяции углеводородокисляющих бактерий. Плотная питательная среда для выращивания углеводородокисляющих бактерий с повышенной деструктивной способностью содержит солевую основу: натрий хлористый, аммоний фосфорнокислый однозамещенный, калий фосфорнокислый двузамещенный и магний сернокислый, а также агар-агар, нефть и глюкозу, при следующем количественном соотношении компонентов, г/л:

натрий хлористый (NaCl)	5,0
аммоний фосфорнокислый однозамещенный (NH4H2PO4)	1,0
калий фосфорнокислый двузамещенный (К2НРO4)	1,0
магний сернокислый (MgSO4·7Н2О)	0,2
агар-агар	15,0
нефть	5,0
глюкоза	1,0
дистиллированная вода	остальное
рН	7,2-7,4 ед. рН

Приготовление плотной питательной среды для выращивания углеводородокисляющих бактерий с повышенной деструктивной способностью осуществляют следующим образом. Навеску солей растворяют в дистиллированной воде и устанавливают рН 7,5. Солевую основу и агар-агар стерилизуют автоклавированием (температура 121±1°С, давление пара 1,2-1,5 атм) в течение 15 мин. Сразу после автоклавирования к агаризованной солевой основе добавляют 1,0 г глюкозы, предварительно растворенной в 5,0 мл дистиллированной воды и стерилизованной фильтрованием через микропористый фильтр (размер пор 0,2 мкм), 5,0 г сырой нефти и в горячем виде подвергают обработке ультразвуковом на ультразвуковом низкочастотном диспергаторе при рабочей частоте 35±1 кГц в течение 2-2,5 мин. Полученную суспензию, содержащую эмульгированную нефть, разливают в стандартные чашки Петри. После охлаждения питательная среда с нефтью и глюкозой готова к использованию.

Обработка разогретой в процессе автоклавирования питательной среды после внесения глюкозы и нефти ультразвуком позволяет получить гомогенную, нерасслаивающуюся эмульсию агаризованной среды с нефтью, которая после охлаждения обеспечивает рост нефтеокисляющих микроорганизмов и позволяет характеризовать колонии по морфологическим признакам.

Положительной характеристикой заявляемой питательной среды является наличие в ее составе глюкозы. Учитывая регуляторное влияние глюкозы на активность углеводородокисляющих бактерий, содержащая ее плотная питательная среда с нефтью позволяет существенно расширить возможности получения биомассы микроорганизмов-деструкторов нефтезагрязнений, обладающих повышенной активностью. Глюкоза не оказывает отрицательного влияния на качество плотной питательной среды по физико-химическим и биологическим свойствам.

Разработанная питательная среда с успехом использована для выращивания углеводородокисляющих бактерий различных таксономических групп для последующего их лиофильного высушивания и в качестве посевного материала для глубинного культивирования в ферментерах и создания биопрепаратов на их основе.

Пример 1

Готовят навеску солевой основы при следующем количественном соотношении компонентов, г/л:

натрий хлористый (NaCl)	5,0
аммоний фосфорнокислый однозамещенный (NН4Н2РO4)	1,0
калий фосфорнокислый двузамещенный (К2НРO4)	1,0
магний сернокислый (MgSO4·7H2O)	0,2

Навеску солей растворяют в 975,0 мл дистиллированной воды в колбе и устанавливают рН 7,5. Добавляют в колбу 15,0 г агар-агара, выдерживают 30 мин при комнатной температуре для его набухания. Солевую основу и агар-агар стерилизуют автоклавированием при температуре 121±1°С и давлении пара 1,2-1,5 атм в течение 15 мин. Готовят стерильный раствор глюкозы, растворяя 1,0 г углевода в 5,0 мл дистиллированной воды, стерилизуют фильтрованием через микропористый фильтр (размер пор 0, 2 мкм). Сразу после автоклавирования к агаризованной солевой основе добавляют 5,0 мл стерильного раствора глюкозы и 5,0 г сырой нефти, подвергают обработке ультразвуком при рабочей частоте 35±1 кГц в течение 2-2,5 мин до формирования гомогенной суспензии. Полученную суспензию разливают в чашки Петри и оставляют на 1 ч для остывания питательной среды. На затвердевшую поверхность питательной среды с нефтью в чашках Петри наносят методом отпечатков предварительно выращенные на агаре Хоттингера колонии бактерий Alcaligenes xylosoxidans ssp.xylosoxidans. Чашки Петри с посевами бактерий на питательную среду с нефтью инкубируют при температуре 37±1°С. Через 24 ч инкубации исследуют популяционный состав бактерий A. xylosoxidans ssp.xylosoxidans по способности расти на питательной среде с нефтью и, соответственно, утилизировать углеводороды нефти с последующим отбором искомых колоний бактерий с повышенной деструктивной способностью.

Пример 2

Готовят навеску солевой основы при следующем количественном соотношении компонентов, г/л:

натрий хлористый (NaCl)	5,0
аммоний фосфорнокислый однозамещенный (NН4Н2РO4)	1,0
калий фосфорнокислый двузамещенный (К2НРO4)	1,0
магний сернокислый (MgSO4·7H2O)	0,2

Навеску солей растворяют в 975,0 мл дистиллированной воды в колбе и устанавливают рН 7,5. Добавляют в колбу 15,0 г агар-агара, выдерживают 30 мин при комнатной температуре для его набухания. Солевую основу и агар-агар стерилизуют автоклавированием при температуре 121±1°С и давлении пара 1,2-1,5 атм в течение 15 мин. Готовят стерильный раствор глюкозы, растворяя 1,0 г углевода в 5,0 мл дистиллированной воды, стерилизуют фильтрованием через микропористый фильтр (размер пор 0, 2 мкм). Сразу после автоклавирования к агаризованной солевой основе добавляют 5,0 мл стерильного раствора глюкозы и 5,0 г сырой нефти, подвергают обработке ультразвуком при рабочей частоте 35±1 кГц в течение 2-2,5 мин до формирования гомогенной суспензии. Полученную суспензию разливают в чашки Петри и оставляют на 1 ч для остывания питательной среды. На затвердевшую поверхность питательной среды с нефтью в чашках Петри наносят методом отпечатков предварительно выращенные на агаре Хоттингера колонии бактерий Rhodococcus erythropolis. Чашки Петри с посевами бактерий на питательную среду с нефтью инкубируют при температуре 28±1°С. Через 48 ч инкубации исследуют популяционный состав бактерий R. erythropolis по способности расти на питательной среде с нефтью и, соответственно, утилизировать углеводороды нефти с последующим отбором искомых колоний бактерий с повышенной деструктивной способностью.

Питательная среда для выращивания углеводородокисляющих бактерий с повышенной деструктивной способностью, содержащая солевую основу: натрий хлористый, аммоний фосфорно-кислый однозамещенный, калий фосфорно-кислый двузамещенный и магний серно-кислый, а также агар-агар, нефть и глюкозу, при следующем количественном соотношении компонентов, г/л:

натрий хлористый (NaCl)	5,0
аммоний фосфорно-кислый однозамещенный (NH4H2PO4)	1,0
калий фосфорно-кислый двузамещенный (К2НРO4)	1,0
магний серно-кислый (MgSO4·7H2O)	0,2
агар-агар	15,0
нефть	5,0
глюкоза	1,0
дистиллированная вода	остальное

рН 7,2-7,4 ед. рН
полученная внесением солевой основы и агар-агара в дистиллированную воду, стерилизацией автоклавированием при температуре 121±1°С и давлении пара 1,2-1,5 атм в течение 15 мин, добавлением в растопленную агаризованную основу раствора глюкозы и нефти и последующей обработкой ультразвуком при рабочей частоте 35±1 кГц в течение 2-2,5 мин до формирования гомогенной суспензии.