Способ выделения гепатоцитов животных с пойкилотермной системой терморегуляции (амфибии, черепахи)

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к выделению гепатоцитов животных с пойкилотермной системой терморегуляции, и может быть использовано при диагностике вирусных инфекций и производстве вакцин. Выделяют гепатоциты с использованием при вторичном перфузировании трех-четырехкратной обработки печени раствором Хэнкса, содержащим ионы кальция и коллагеназу I типа в концентрации от 0,02 до 0,05% по 10 минут при температуре перфузата 0-4°С. Очистку гепатоцитов в фиколловом градиенте проводят трех-четырехкратно с добавлением 0,5-1,15 М углеводов, например сахарозы, 15 мин на центрифуге при 1000 об/мин при температуре 20°С. Получение клеточной суспензии гепатоцитов путем дифференциального центрифугирования проводят в течение 2 минут при 700 об/минуту. Исходную клеточную суспензию гепатоцитов предварительно инкубируют при комнатной температуре в течение 20 минут. Изобретение позволяет повысить выход жизнеспособных гепатоцитов животных с пойкилотермной системой терморегуляции на 20% по сравнению с традиционной методикой выделения клеток. 4 табл.

 

Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано для изучения механизмов функционирования клеток, управления клеточными процессами, такими как пролиферация и дифференцировка, для изучения основ межклеточных взаимодействий и модификации метаболизма в условиях физиологической нормы и эксперименте, при диагностике вирусных инфекций с целью изучения спектра чувствительности культур гепатоцитов различных животных к вирусам, в биотехнологических процессах при производстве вакцин, замещении, восстановлении, корректировке функций поврежденных тканей печени путем имплантации или трансплантации выращенных in vitro гепатоцитов.

Известен способ выделения гепатоцитов животных с пойкилотермной системой терморегуляции (амфибий, черепах), который подробно описан в книге Адамса Р., М.: Мир, 1983, и этот же способ хорошо представлен в коллективной монографии «Животная клетка в культуре». М.: Спутник+, 2000.

Известный способ включает в себя: вскрытие брюшной полости и канюлирование v. portae, через которую осуществляют перфузирование печени бескальциевым раствором Хэнкса для отмывки крови и удаления ионов кальция, вторичное перфузирование печени раствором Хэнкса, содержащим раствор коллагеназы и ионы кальция в течение 5 минут при температуре 37°С, механическую обработку печени путем измельчения печени ножницами на кусочки весом 1-2 гр, которые переносят в колбу, содержащую среду Игла, помещаемую на магнитную мешалку на 5 минут. После обработки на магнитной мешалке проводят очистку полученной тканевой взвеси в фиколловом градиенте 15 мин на центрифуге при 1000 об/мин при температуре 20°С с целью удаления клеточного детрита, элементов крови, гемопоэтических клеток, крупных фрагментов, после чего полученный осадок ресуспензируют в инкубационной среде. Далее с целью удаления дебриса поврежденных клеток клеточную суспензию пропускают через фильтр в колбу и оставляют для предварительной инкубации на 20 минут при температуре 37°С на шейкере. Для получения популяции паренхимных клеток проводят фильтрацию и дифференциальное центрифугирование в течение 5 мин при 200 об/минуту. После чего в камере Горяева 1% раствором трипанового синего определяют количество жизнеспособных гепатоцитов при концентрации клеток в 3×10⁶ кл/мл. Далее культивирование гепатоцитов проводят в чашках Петри, на дно которых помещают покровные стекла, предварительно обработанные, например, желатином.

Однако известный способ не может обеспечить получение жизнеспособных гепатоцитов более 75% у изучаемых видов животных с различной системой терморегуляции, так как длительный период выделения гепатоцитов (6-8 часов) влечет за собой потерю жизнеспособных клеток, и, кроме того, в известном способе не предусмотрены условия, позволяющие поддерживать жизнеспособность гепатоцитов.

Следует особо подчеркнуть, что высокий процент жизнеспособных гепатоцитов является необходимым условием для успешного проведения медико-биологических исследований, а следовательно, получения значимых (достоверных) исследуемых показателей.

Задачей предлагаемого изобретения является повышение процента выхода жизнеспособных гепатоцитов животных вида Rana terrestris (амфибии), Trachemys scripta elegans (черепахи) с пойкилотермной системой терморегуляции.

Поставленная задача - увеличение процента выхода жизнеспособных гепатоцитов животных вида Rana terrestris (амфибии), Trachemys scripta elegans (черепахи), решается благодаря тому, что заявляемый способ выделения, как и прототип, включает в себя вскрытие брюшной полости, канюлирование v. portae, через которую осуществляют перфузирование печени бескальциевым раствором Хэнкса для отмывки крови и удаления ионов кальция, вторичное перфузирование печени проводят раствором Хэнкса, содержащим раствор коллагеназы I типа и ионы кальция, измельчение печени на кусочки весом 1-2 гр, которые переносят в колбу, содержащую среду Игла, которую затем помещают на магнитную мешалку на 5 минут, после чего проводят очистку полученной тканевой взвеси в фиколловом градиенте на центрифуге с целью удаления клеточного детрита, элементов крови, гемопоэтических клеток, крупных фрагментов, затем полученный осадок ресуспензируют в инкубационной среде, далее клеточную суспензию фильтруют в колбу и оставляют для предварительной инкубации на шейкере с целью удаления дебриса поврежденных клеток. Для получения популяции паренхимных клеток проводят фильтрацию и дифференциальное центрифугирование. После чего в камере Горяева 1% раствором трипанового синего определяют количество жизнеспособных гепатоцитов при концентрации клеток в 3×10⁶ кл/мл. Далее культивирование гепатоцитов проводят в чашках Петри, на дно которых помещают покровные стекла, предварительно обработанные, например, желатином.

В отличие от прототипа в заявляемом способе вторичное перфузирование печени животных вида Rana terrestris (амфибии), Trachemys scripta elegans (черепахи) проводят трех-четырехкратно раствором Хэнкса, содержащим коллагеназу I типа и ионы кальция в восходящей концентрации (от 0,02 до 0,05%) по 10 минут при температуре перфузата 0-4°С, а очистку гепатоцитов проводят в фиколловом градиенте трех-четырехкратно с добавлением 0,5-1,15 М углеводов, например сахарозы, 15 мин на центрифуге при 1000 об/мин при температуре 20°С, при этом получение клеточной суспензии гепатоцитов проводили путем сочетания фильтрации и дифференциального центрифугирования в течение 2 мин при 700 об/минуту, затем исходную клеточную суспензию гепатоцитов пропускают через фильтр в колбу и оставляют на шейкере для предварительной инкубации на 20 минут при 20-22°С, учитывая систему терморегуляции животных.

Заявляемый способ «Способ выделения гепатоцитов животных с пойкилотермной системой терморегуляции (амфибии, черепахи)» реализуется следующим образом.

Под эфирным наркозом у животного (амфибии и черепахи) проводят вскрытие брюшной полости канюлирование v. portae, через которую осуществляют перфузирование печени бескальциевым раствором Хэнкса для отмывки крови и удаления ионов кальция, затем трех-четырехкратно проводят вторичное перфузирование печени раствором Хэнкса, содержащим коллагеназу I типа и ионы кальция в восходящей концентрации (от 0,02 до 0,05%) по 10 минут при температуре перфузата 0-4°С. Затем после удаления Глиссоновой капсулы и крупных кровеносных сосудов печень измельчали в пенициллиновом флаконе ножницами на кусочки весом 1-2 г, которые переносят в колбу, содержащую среду Игла, которую затем помещают на магнитную мешалку, например, типа MS3000, Biosan, Латвия, на 5 минут. После чего проводят трех-четырехкратную очистку полученной тканевой взвеси в фиколловом градиенте по 15 мин на центрифуге, например, ОПН-3, Киргизия, при 1000 об/мин при температуре 20°С с добавлением 0,5-1,15 М углеводов, например сахарозы, с целью удаления клеточного детрита, элементов крови, гемопоэтических клеток, крупных фрагментов. Затем полученный осадок ресуспензируют в инкубационной среде, далее полученную клеточную суспензию фильтруют через нейлоновые фильтры в колбу и оставляют для предварительной инкубации на 20 минут при температуре 20-22°С на шейкере, например, типа BS-010108-AK, UP-12, Biosan, Латвия, с целью удаления дебриса поврежденных клеток. Для получения популяции паренхимных клеток проводят фильтрацию через нейлоновые фильтры и дифференциальное центрифугирование, например, типа VAC-601 в течение 2 мин при 700 об/минуту. После чего в камере Горяева 1% раствором трипанового синего определяют количество жизнеспособных гепатоцитов при концентрации клеток в 3×10⁶ кл/мл. Далее клеточную суспензию разливают в чашки Петри, на дно которых помещают покровные стекла, предварительно обработанные 0,2% раствором желатина (Sigma, США). Инкубировали гепатоциты в среде F12, которая содержала 0,2 мг/мл альбумина (Sigma, США) и 0,5 мкг/мл инсулина (Sigma, США), а также содержащей 40 мкг/мл гентамицина, 10% фетальной сыворотки (РАА, Австрия), 25 ед./мл фактора LIF (Sigma, США). Далее чашки Петри помещают в термостат, например, типа BS-010410-BAA, СН-100, Biosan, Латвия, для культивирования при температуре 20°С.

Пример 1. Влияние дробной перфузии и температурных режимов на процент выхода жизнеспособных гепатоцитов амфибий и черепах.

Животному вскрывали брюшную полость, затем проводили канюлирование v. portae, через которую осуществляют перфузирование печени бескальциевым раствором Хэнкса для отмывки крови и удаления ионов кальция. Вторичное перфузирование печени проводят согласно сформированным группам дробно раствором Хэнкса, содержащим ионы кальция и коллагеназу I типа в восходящей концентрации (от 0,02 до 0,05%). Для опыта сформировали три группы амфибий и черепах:

1 группа - перфузия проводилась однократно 5 минут раствором Хэнкса, содержащим ионы кальция и коллагеназу I типа от 0,02 до 0,05% при комнатной температуре;

2 группа - 10 минут раствором Хэнкса, содержащим ионы кальция и коллагеназу I типа от 0,02 до 0,05% трехкратно при температуре 10-15°С;

3 - группа 10 минут трех-четырехкратно раствором Хэнкса, содержащим ионы кальция и коллагеназу I типа от 0, 02 до 0,05% при температуре 0-4°С.

Из таблицы 1 видно, самый высокий процент выхода жизнеспособных гепатоцитов (98%) в третьей группе, в которой перфузию печени проводили трех-четырехкратно раствором Хэнкса, содержащим ионы кальция и коллагеназу I типа в восходящей концентрации (от 0,02 до 0,05%) по 10 минут при температуре перфузата 0-4°С. Так как мягкое, постепенное, менее глубокое ферментативное воздействие на мембраны гепатоцитов положительно сказывается на их жизнеспособности.

Таблица 1
Влияние дробной перфузии и температурных режимов на процент выхода гепатоцитов амфибий и черепах (% жизнеспособных клеток)
№ группы	Амфибии	Черепахи
1 группа	80	78
2 группа	89	86
3 группа	98	98

Затем печень измельчали ножницами, как этап механической обработки, тканевую взвесь помещали на магнитную мешалку, после чего проводили трех-четырехкратную очистку тканевой взвеси в фиколловом градиенте 15 мин на центрифуге 1000 об/мин при температуре 20°С с добавлением 0,5-1,15 М углеводов, например сахарозы, после этого получали клеточную суспензию гепатоцитов путем сочетания фильтрации и дифференциального центрифугирования 2 мин при 700 об/минуту, последующую предварительную инкубацию гепатоцитов проводят на шейкере при 20-22°С 20 минут. Полученную клеточную суспензию гепатоцитов в количестве 3 мл (3×10⁶ гепатоцитов) разливают в чашки Петри, на дне которых находятся покровные стекла покрытые желатином. После чего в камере Горяева 1% раствором трипанового синего определяют количество жизнеспособных гепатоцитов при концентрации клеток в 3×10⁶ кл/мл. Далее чашки Петри помещают в термостат для культивирования при температуре 20°С.

Пример 2. Получение клеточной суспензии амфибий и черепах и очистка в фиколловом градиенте с добавлением углеводов.

Животному вскрывали брюшную полость, затем проводили канюлирование v. portae, через которую осуществляют перфузирование печени бескальциевым раствором Хэнкса для отмывки крови и удаления ионов кальция. Вторичное перфузирование печени проводят трех-четырехкратно раствором Хэнкса, содержащим ионы кальция и коллагеназу I типа в восходящей концентрации (от 0,02 до 0,05%) по 10 минут при температуре перфузата 0-4°С. Далее проводили механическую обработку печени путем измельчения, полученную тканевую взвесь помещали на магнитную мешалку.

Проводили очистку тканевой взвеси в фиколловом градиенте. Для опыта сформировали три группы амфибий, черепах:

1 группа - очистка в фиколловом градиенте однократная;

2 группа - очистка в фиколловом градиенте трех-четырехкратная;

3-группа - очистка в фиколловом градиенте трех-четырехкратная с добавлением 0,5-1,15 М углеводов.

Таблица 2
Влияние дробной очистки в фиколловом градиенте с добавлением углеводов на процент выхода гепатоцитов (% жизнеспособных клеток)
№ группы	Амфибии	Черепахи
1 группа	76	78
2 группа	80	84
3 группа	96	96

Из таблицы 2 видно, что добавление углеводов и трех-четырехкратная очистка в фиколловом градиенте повышают выход жизнеспособных гепатоцитов в 3 группе на 18-20% по сравнению с первой группой и на 12-16% по сравнению со второй. Предлагаемая углеводная метаболическая коррекция способствует сохранности и стабилизации мембран и энергетического обмена митохондрий, обеспечивая сохранность жизнеспособных гепатоцитов.

В дальнейшем получали клеточную суспензию гепатоцитов путем сочетания фильтрации и дифференциального центрифугирования 2 мин при 700 об/минуту, предварительную инкубацию гепатоцитов проводили на шейкере при 20-22°С 20 минут, после чего разливали в чашки Петри в количестве 3 мл (3×10⁶ гепатоцитов), на дне которых находятся покровные стекла, покрытые желатином. После чего в камере Горяева 1% раствором трипанового синего определяют количество жизнеспособных гепатоцитов при концентрации клеток в 3×10⁶ кл/мл. Далее чашки Петри помещают в термостат для культивирования при температуре 20°С.

Пример 3. Получение паренхимной клеточной суспензии амфибий и черепах.

Животному вскрывали брюшную полость, затем проводили канюлирование v. portae, через которую осуществляют перфузирование печени бескальциевым раствором Хэнкса для отмывки крови и удаления ионов кальция. Вторичное перфузирование печени проводят трех-четырехкратно раствором Хэнкса, содержащим ионы кальция и коллагеназу I типа в восходящей концентрации (от 0,02 до 0,05%) по 10 минут при температуре перфузата 0-4°С. Далее проводили механическую обработку печени путем измельчения, полученную тканевую взвесь помещали на магнитную мешалку. Трех-четырехкратная очистка тканевой взвеси в фиколловом градиенте проводится по 15 мин на центрифуге 1000 об/мин при температуре 20°С с добавлением 0,5-1,15 М углеводов, например сахарозы.

Для дальнейшего получения паренхимной клеточной суспензии экспериментально подбирали режимы дифференциального центрифугирования:

I - 5 минут при 200 об/мин;

II - 5 минут при 700 об/мин;

III - 2 минуты при 700 об/мин.

Таблица 3
Влияние различных режимов дифференциального центрифугирования на процент выхода гепатоцитов (% жизнеспособных клеток)
№ группы	Амфибии	Черепахи
1 группа	74	75
2 группа	79	80
3 группа	96	96

Из таблицы 3 видно, что самый высокий выход жизнеспособных гепатоцитов наблюдался при 3 режиме (2 минуты при 700 об/мин) - 96%, который является оптимальным, т.к. этим режимом достигается минимальное механическое воздействие на гепатоциты и дифференцированное разделение паренхимных и непаренхимных клеток печени.

Полученную таким образом суспензию гепатоцитов предварительно инкубируют на шейкере при 20-22°С 20 минут, затем в камере Горяева 1% раствором трипанового синего определяют количество жизнеспособных гепатоцитов при концентрации клеток в 3×10⁶ кл/мл, разливают по 3 мл (3×10⁶ гепатоцитов) в чашки Петри, на дне которых находятся покровные стекла, покрытые желатином. Далее чашки Петри помещают в термостат для культивирования при температуре 20°С.

Пример 4. Подбор оптимальных температурных режимов для предварительного инкубирования гепатоцитов амфибий и черепах.

Животному вскрывали брюшную полость, затем проводили канюлирование v. portae, через которую сначала осуществляют перфузирование печени бескальциевым раствором Хэнкса для отмывки крови и удаления ионов кальция, затем проводят трех-четырехкратно вторичное перфузирование печени раствором Хэнкса, содержащим ионы кальция и коллагеназу I типа в восходящей концентрации (от 0,02 до 0,05%) по 10 минут при температуре перфузата 0-4°С. Затем печень измельчали ножницами, как этап механической обработки, полученную тканевую взвесь помещали на магнитную мешалку с дальнейшей трех-четырехкратной очисткой в фиколловом градиенте по 15 мин на центрифуге 1000 об/мин при температуре 20°С с добавлением 0,5-1,15 М углеводов, например сахарозы. В дальнейшем получали клеточную суспензию гепатоцитов путем сочетания фильтрации и дифференциального центрифугирования 2 мин при 700 об/минуту. Для отработки режима предварительной инкубации на шейкере подбирали оптимальный температурный режим:

- 37-38°С;

- 20-22°С;

- 5-10°С.

Оптимальным температурным режимом для поддержания жизнеспособности гепатоцитов является комнатная температура - 20-22°С, при которой активность ферментов обеспечивает стабильное жизнеспособное состояние гепатоцитов. При температуре же в 37-38°С моделируется эффект гипертермии, а температура 5-10°С не обеспечивает стабильного жизнеспособного состояние гепатоцитов.

После предварительной инкубации полученную клеточную суспензию в количестве 3 мл (3×10⁶ гепатоцитов) разливают в чашки Петри, на дне которых находятся покровные стекла, покрытые желатином. Затем в камере Горяева 1% раствором трипанового синего определяют количество жизнеспособных гепатоцитов при концентрации клеток в 3×10⁶ кл/мл, для инкубации разливают по 3 мл (3×10⁶ гепатоцитов) в чашки Петри, на дне которых находятся покровные стекла, покрытые желатином. Далее чашки Петри помещают в термостат для культивирования при температуре 20°С.

Из таблицы 4 видно, что изменение условий выделения гепатоцитов амфибий и черепах в предлагаемом способе увеличивает на 20% выход жизнеспособных гепатоцитов на этапе посева для культивирования в чашках Петри по сравнению с прототипом.

Таблица 4
Сравнительные показатели процента выделенных гепатоцитов для культивирования (% жизнеспособных клеток)
Вид животных	Общее количество гепатоцитов 1 мл/106 (прототип)	Общее количество гепатоцитов 1 мл/106 (предлагаемый способ)
Rana terrestris	76	96
Trachemys scripta elegans	76	96

Способ выделения гепатоцитов животных вида Rana terrestris (амфибии) и Trachemys scripta elegans (черепахи), включающий в себя вскрытие брюшной полости, канюлирование, двухэтапное перфузирование, механическую обработку печени, очистку гепатоцитов, фильтрацию и дифференциальное центрифугирование, предварительную инкубацию и высевание гепатоцитов в чашки Петри с определением количества жизнеспособных гепатоцитов в камере Горяева, отличающийся тем, что вторичное перфузирование печени проводят трех-четырехкратно раствором Хэнкса, содержащим коллагеназу I типа в концентрации 0,02-0,05% по 10 мин при температуре перфузата 0-4°С, а очистку гепатоцитов осуществляют трех-четырехкратно в фиколловом градиенте с добавлением 0,5-1,15 М углеводов, например сахарозы, фильтрацию и дифференциальное центрифугирование проводят при 700 об/мин с экспозицией в 2 мин, предварительную инкубацию гепатоцитов проводят при 20-22°С в течение 20 мин.