Среда для выращивания культуры аутологичных лимфоцитов
Владельцы патента RU 2393218:
Федеральное государственное учреждение "Центральный научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии имени Н.Н. Приорова Росмедтехнологий" (RU)
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к средам для выращивания культуры аутологичных лимфоцитов, и может быть использовано как для лечения, так и для профилактики гнойно-воспалительных осложнений у пациентов. Среда для выращивания культуры аутологичных лимфоцитов на основе культуральной среды RPMI - 1640 (Roswell Park Memorial Institute) содержит 10% раствор фитогемоагглютинина и сыворотку собственной крови, полученной из любой центральной или периферической вены пациента, для которого выращивают культуру аутологичных лимфоцитов, при следующем соотношении компонентов, объемные %: сыворотка собственной крови пациента - 0,75-1,2; 10%-ный раствор фитогемоагглютинина в культуральной среде RPMI - 1640-0,008-0,013; культуральная среда RPMI - 1640 - остальное до 100%. Изобретение позволяет с высокой степенью надежности исключить аллергические реакции организма пациента, повысить содержание лимфобластов в культуре аутологичных лимфоцитов, исключить появление чужеродного белка и обеспечить необходимую стерильность за счет исключения прорастания бактерий. 1 табл.
Изобретение относится к области медицины, а именно к биотехнологии, к среде для выращивания культуры аутологичных лимфоцитов, и может быть использовано как для лечения, так и для профилактики гнойно-воспалительных осложнений у пациентов в условиях хирургических, травматологических и других стационаров. Изобретение позволяет быстро и доступно получить безопасный для пациента материал для заместительной клеточной технологии.
Известна среда для выращивания культуры аутологичных лимфоцитов, содержащая культуральную среду RPMI - 1640 (Roswell Park Memorial Institute) (см. патент РФ №2333243, МПК С12N 5/08, 2005 г.).
Однако известная среда для выращивания культуры аутологичных лимфоцитов при своем использовании обладает следующими недостатками:
- не обеспечивает выращивание аутологичных лимфоцитов с необходимым содержанием лимфобластов (содержание лимфомассы до 0,9×109/л),
- не обеспечивает надежного исключения аллергических реакций организма пациента, в том числе у травматолого-ортопедических пациентов после перенесенной высокой хирургической агрессии,
- не обеспечивает исключение появления чужеродного белка.
Задачей изобретения является создание среды для выращивания культуры аутологичных лимфоцитов.
Техническим результатом является обеспечение надежного исключения аллергических реакций организма пациента, в том числе у травматолого-ортопедических пациентов после перенесенной высокой хирургической агрессии, повышение содержания культуры аутологичных лимфоцитов, исключение появления чужеродного белка, обеспечение необходимой и достаточной стерильности за счет исключения прорастания бактерий, а также обеспечение выращивания аутологичных лимфоцитов с большим содержанием лимфобластов.
Технический результат достигается в предложенной среде для выращивания культуры аутологичных лимфоцитов сочетанием компонентов использованных для ее изготовления, а также количественным соотношением входящих в нее компонентов.
Технический результат достигается тем, что предложена среда для выращивания культуры аутологичных лимфоцитов, содержащая культуральную среду RPMI - 1640 (Roswell Park Memorial Institute), а также 10% раствор фитогемоагглютинина в культурной среде RPMI - 1640 и сыворотку собственной крови, полученной из любой центральной или периферической вены пациента, для которого выращивают культуру аутологичных лимфоцитов, при следующем соотношении компонентов, объемные %:
| сыворотка собственной крови пациента | 0,75-1,2 |
| 10%-ный раствор фитогемоагглютинина в | |
| культурной среде RPMI - 1640 | 0,008-0,013 |
| культуральная среда RPMI - 1640 | остальное до 100%. |
Культурная среда RPMI - 1640 используется следующего состава:
| Компоненты | Мол. | Конц. | Молярность |
| Неорганические соли | |||
| Нитрат кальция (Ca(NO3)2 | 236 | 100,00 | 0,424 |
| Хлорид калия (KCI) | 75 | 400,00 | 5,30 |
| Сульфат магния (MgSO4) | 120 | 48,84 | 0,407 |
| Хлорид натрия (NaCl) | 58 | 6000,00 | 103,44 |
| Бикарбонат натрия (NaHCO3) | 84 | 2000,00 | 23,800 |
| Фосфат натрия (Na2HPO4) | 142 | 800,00 | 5,63 |
| Другие компоненты | |||
| Глюкоза | 180 | 2000,00 | 11,10 |
| Глутатион, восстановленный | 307 | 1,50 | 0,0032 |
| Феноловый красный | 398 | 5,00 | 0,0125 |
| Аминокислоты | |||
| L-аргинин | 174 | 200,00 | 1,10 |
| L-аспарагин | 132 | 50,00 | 0,379 |
| L-аспарагиновая кислота | 133 | 20,00 | 0,150 |
| Дигидрохлорид L-цистеина | 313 | 65,00 | 0,206 |
| L-глутаминовая кислота | 147 | 20,00 | 0,136 |
| L-глутамин | 146 | 300,00 | 2,05 |
| Глицин | 75 | 10,00 | 0,133 |
| L-гистидин | 155 | 15,00 | 0,0967 |
| L-гидроксипролин | 131 | 20,00 | 0,153 |
| L-изолейцин | 131 | 50,00 | 0,382 |
| L-лейцин | 131 | 50,00 | 0,382 |
| Гидрохлорид L-лизина | 146 | 40,00 | 0,219 |
| L-метионин | 149 | 15,00 | 0,101 |
| L-фенилаланин | 165 | 15,00 | 0,0909 |
| L-пролин | 115 | 20,00 | 0,174 |
| L-серин | 105 | 30,00 | 0,286 |
| L-треонин | 119 | 20,00 | 0,168 |
| L-триптофан | 204 | 5,00 | 0,0245 |
| Динатриевая соль L-тирозина, | 261 | 29,00 | 0,110 |
| L-валин | 117 | 20,00 | 0,171 |
| Витамины | |||
| Биотин | 244 | 0,20 | 0,008 |
| D-пантотенат кальция | 477 | 0,25 | 0,0005 |
| Холинхлорид | 140 | 3,00 | 0,0214 |
| Фолиевая кислота | 441 | 1,00 | 0,0022 |
| Изоинозит | 180 | 35,00 | 0,194 |
| Ниацинамид | 122 | 1,00 | 0,0081 |
| п-Аминобензойная кислота | 137 | 1,00 | 0,0072 |
| Пиридоксин HCl | 206 | 1,00 | 0,0048 |
| Рибофлавин | 376 | 0,20 | 0,0005 |
| Тиамин HCl | 337 | 1,00 | 0,0029 |
| Витамин В 12 | 1355 | 0,005 | 0,00000369 |
Среди существенных признаков, характеризующих предложенную среду для выращивания культуры аутологичных лимфоцитов, отличительными являются:
- дополнительное содержание в культурной среде 10%-ного раствора фитогемоагглютинина в культурной среде RPMI - 1640,
- дополнительное содержание в культурной среде сыворотки собственной крови, полученной из любой центральной или периферической вены пациента, для которого выращивают культуру аутологичных лимфоцитов,
- выбор содержания компонентов, объемные %:
| сыворотка собственной крови пациента | 0,75-1,2 |
| 10%-ный раствор фитогемоагглютинина в | |
| культурной среде RPMI - 1640 | 0,008-0,013 |
| культуральная среда RPMI - 1640 | остальное до 100%. |
Экспериментальные исследования предложенной среды для выращивания культуры аутологичных лимфоцитов показали ее высокую эффективность. Предложенная среда для выращивания культуры аутологичных лимфоцитов при своем использовании в процессе иммунокоррегирующей терапии с использованием лимфоцитарной взвеси обеспечивает надежное исключение аллергических реакций организма пациента, в том числе у травматолого-ортопедических пациентов после перенесенной высокой хирургической агрессии, обеспечивает повышение содержания культуры аутологичных лимфоцитов до 2×109/л, исключает появления чужеродного белка, обеспечивает необходимую и достаточную стерильность. Одновременно было установлено, что использование предложенной среды для выращивания культуры аутологичных лимфоцитов обеспечивает выращивание аутологичных лимфоцитов с большим содержанием лимфобластов.
Качественное и количественное содержание предложенной «Среды для выращивания культуры аутологичных лимфоцитов» заявленного состава является оптимальным результатом проведения в Федеральном государственном учреждении «Центральный научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии имени Н.Н.Приорова Росмедтехнологий» (ЦИТО) комплекса научно-исследовательских работ.
Предложенная среда для выращивания культуры аутологичных лимфоцитов используется следующим образом. Осуществляют забор цельной крови пациента из любой его центральной или периферической вены в предварительно промытый гепарином шприц в количестве 10 мл и отстаивают ее в течение 100-140 минут. Затем отбирают лейкоцитарную фракцию в количестве 0,5-1,5 мл и вводят в нее 5 мл культуральной среды RPMI - 1640, а также 5 мл собственной сыворотки пациента. Разливают полученную клеточную взвесь в стерильные емкости по 2 мл и вводят в каждую емкость по 5 мл культуральной среды RPMI - 1640 и по 0,01 мл 10%-ного раствора фитогемоагглютинина в культуральной среде RPMI - 1640. Емкости с культурой лимфоцитов размещают в термостате и выдерживают при температуре 37°С в течение 72 часов, затем полученную в каждой емкости клеточную культуру аутологичных лимфоцитов центрифугируют в физиологическом растворе (5 мл) 3-5 раз при скорости вращения 1000 об/мин по 10 минут, при этом после каждого центрифугирования сливают надосадочную жидкость и в каждую емкость добавляют по 5 мл физиологического раствора для повторения центрифугирования клеточной культуры аутологичных лимфоцитов. Клеточная масса аутологичных лимфоцитов готова для своего использования. Из 5 флаконов, в которых культивировались аутологичные лимфоциты, собирают клеточную взвесь, доводят до объема 10 см3 физраствором и вводят внутривенно пациенту в любую его центральную или периферическую вену.
Реализация предложенной среды для выращивания культуры аутологичных лимфоцитов иллюстрируется следующими клиническими примерами.
Пример 1. Пациент П., 55 лет, поступил в 8 травматолого-ортопедическое отделение ФГУ ЦИТО с диагнозом «Сочетанная травма.
Закрытая черепно-мозговая травма. Сотрясение головного мозга. Закрытый оскольчатый перелом правой бедренной кости со смещением отломков». Анализ иммунного статуса показал: общее количество лимфоцитов 1,0×109/л, абсолютное количество Т-лимфоцитов 0,68×109/л.
Пациенту выполнили оперативное вмешательство - остеосинтез правой бедренной кости пластиной.
Накануне оперативного вмешательства выполнили забор цельной крови пациента из его центральной вены в предварительно промытый гепарином шприц в количестве 10 мл. Забранную цельную кровь пациента отстаивали в течение 100 минут. Для выращивания культуры аутологичных лимфоцитов в отобранной лейкоцитарной фракции использовали предложенную среду на основе культуральной среды RPMI - 1640, содержащей 0,75 объемных % сыворотки собственной крови пациента и 0,013 объемных % 10%-ного раствора фитогемоагглютинина в культурной среде RPMI - 1640.
Выращенную клеточную массу аутологичных лимфоцитов, содержащую 1,95×109/л культуры аутологичных лимфоцитов с большим содержанием лимфобластов ввели внутривенно пациенту в кубитальную вену предплечья. Послеоперационный период - гладкий. Показатели клеточного иммунитета нарастали уже на следующий день после введения культуры аутологичных лимфоцитов. К3-5 дню после введения общее количество лимфоцитов в крови пациента составило 1,3×109/л, абсолютное количество Т-лимфоцитов составило 0,8×109/л, количество Т-супрессоров составило 0,013×109/л. К 10 дню после введения общее количество лимфоцитов в крови пациента составило 1,4×109/л, абсолютное количество Т-лимфоцитов составило 1,0×109/л, количество Т-супрессоров составило 0,018×109. Определено увеличение содержания иммуноглобулинов классов G, М и А.
У пациента после перенесенной высокой хирургической агрессии в процессе иммунокоррегирующей терапии с использованием лимфоцитарной взвеси обеспечено надежное исключение аллергических реакций организма, обеспечено повышение содержания культуры аутологичных лимфоцитов, исключены появления чужеродного белка, обеспечена необходимая и достаточная стерильность. Использование предложенной среды для выращивания культуры аутологичных лимфоцитов обеспечивает выращивание аутологичных лимфоцитов с большим содержанием лимфобластов. Качество жизни пациента хорошее.
Пример 2. Пациентка К., 65 лет, поступила в 8 травматолого-ортопедическое отделение ФГУ ЦИТО с диагнозом «Правосторонний гонартроз 3-4 степени, выраженная вальгусная деформация нижней конечности, анкилоз правого тазобедренного сустава». Анализ иммунного статуса показал: общее количество лимфоцитов 0,95×109/л, абсолютное количество Т-лимфоцитов 0,64×109/л.
Пациентке выполнили оперативное вмешательство - надмыщелковая остеотомия бедра и надкостный остеосинтез из расширенного латерального доступа.
Накануне оперативного вмешательства выполнили забор цельной крови пациентки из ее центральной вены в предварительно промытый гепарином шприц в количестве 10 мл. Забранную цельную кровь пациентки отстаивали в течение 100 минут. Для выращивания культуры аутологичных лимфоцитов в отобранной лейкоцитарной фракции использовали предложенную среду на основе культуральной среды RPMI - 1640, содержащей 1,2 объемных % сыворотки собственной крови пациента и 0,010 объемных % 10%-ного раствора фитогемоагглютинина в культурной среде RPMI - 1640.
Выращенную клеточную массу аутологичных лимфоцитов, содержащую 1,92×109/л, культуры аутологичных лимфоцитов с большим содержанием лимфобластов, ввели внутривенно пациентке в кубитальную вену предплечья. Послеоперационный период - гладкий. Показатели клеточного иммунитета нарастали уже на следующий день после введения культуры аутологичных лимфоцитов. К 3-5 дню после введения общее количество лимфоцитов в крови пациентки составило 1,25×109/л, абсолютное количество Т-лимфоцитов составило 0,75×109/л, количество Т-супрессоров составило 0,012×109/л. К 10 дню после введения общее количество лимфоцитов в крови пациентки составило 1,4×109/л, абсолютное количество Т-лимфоцитов составило 1,0×109/л, количество Т-супрессоров составило 0,017×109. Определено увеличение содержания иммуноглобулинов классов G, М и А.
У пациентки после перенесенной высокой хирургической агрессии в процессе иммунокоррегирующей терапии с использованием лимфоцитарной взвеси обеспечено надежное исключение аллергических реакций организма, обеспечено повышение содержания культуры аутологичных лимфоцитов, исключены появления чужеродного белка, обеспечена необходимая и достаточная стерильность. Использование предложенной среды для выращивания культуры аутологичных лимфоцитов обеспечивает выращивание аутологичных лимфоцитов с большим содержанием лимфобластов. Качество жизни пациентки хорошее.
Пример 3. Пациентка Д., 69 лет, поступила в 8 травматолого-ортопедическое отделение ФГУ ЦИТО с диагнозом «Левосторонний гонартроз 3-4 степени, выраженная вальгусная деформация нижней конечности, анкилоз левого тазобедренного сустава». Анализ иммунного статуса показал: общее количество лимфоцитов 0,9×109/л, абсолютное количество Т-лимфоцитов 0,60×109/л.
Пациентке выполнили оперативное вмешательство - надмыщелковая остеотомия бедра и надкостный остеосинтез из расширенного латерального доступа.
Накануне оперативного вмешательства выполнили забор цельной крови пациентки из ее центральной вены в предварительно промытый гепарином шприц в количестве 10 мл. Забранную цельную кровь пациентки отстаивали в течение 100 минут. Для выращивания культуры аутологичных лимфоцитов в отобранной лейкоцитарной фракции использовали предложенную среду на основе культуральной среды RPMI - 1640, содержащей 0,95 объемных % сыворотки собственной крови пациента и 0,008 объемных % 10%-ного раствора фитогемоагглютинина в культурной среде RPMI - 1640.
Выращенную клеточную массу аутологичных лимфоцитов, содержащую 1,92×109/л культуры аутологичных лимфоцитов с большим содержанием лимфобластов, ввели внутривенно пациентке в кубитальную вену предплечья. Послеоперационный период - гладкий. Показатели клеточного иммунитета нарастали уже на следующий день после введения культуры аутологичных лимфоцитов. К 3-5 дню после введения общее количество лимфоцитов в крови пациентки составило 1,25×109/л, абсолютное количество Т-лимфоцитов составило 0,78×109/л, количество Т-супрессоров составило 0,011×109/л. К 10 дню после введения общее количество лимфоцитов в крови пациентки составило 1,3×109/л, абсолютное количество Т-лимфоцитов составило 0,9×10%, количество Т-супрессоров составило 0,017×109. Определено увеличение содержания иммуноглобулинов классов G, М и А.
У пациентки после перенесенной высокой хирургической агрессии в процессе иммунокоррегирующей терапии с использованием лимфоцитарной взвеси обеспечено надежное исключение аллергических реакций организма, обеспечено повышение содержания культуры аутологичных лимфоцитов, исключены появления чужеродного белка, обеспечена необходимая и достаточная стерильность. Использование предложенной среды для выращивания культуры аутологичных лимфоцитов обеспечивает выращивание аутологичных лимфоцитов с большим содержанием лимфобластов. Качество жизни пациентки хорошее.
Среда для выращивания культуры аутологичных лимфоцитов, содержащая культуральную среду RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute), отличающаяся тем, что дополнительно содержит 10%-ный раствор фитогемоагглютинина и сыворотку собственной крови, полученную из любой центральной или периферической вены пациента, для которого выращивают культуру аутологичных лимфоцитов, при следующем соотношении компонентов, об.%:
| сыворотка собственной крови пациента | 0,75-1,2 |
| 10%-ный раствор фитогемоагглютинина в | |
| культуральной среде RPMI-1640 | 0,008-0,013 |
| культуральная среда RPMI-1640 | остальное до 100%. |
