Способ получения биопрепарата для очистки морской воды от нефти (варианты)

Изобретение относится к области биотехнологии, микробиологии и касается способа получения высокоэффективного биопрепарата на основе углеводородокисляющего штамма Phyllobacterium myrsinacearum ВКПМ В-9079. Способ получения жидкой формы биопрепарата включает в себя глубинное культивирование концентрата суспензии штамма на жидкой питательной среде. Способ получения сухой формы биопрепарата включает инокуляцию жидкой бактериальной суспензией субстрата-носителя (стерильного адсорбента вермикулитового вспученного) в герметичных пакетах. После чего на адсорбенте осуществляют дополнительное поверхностное культивирование штамма. Изобретение позволяет получить препарат с более высоким титром клеток, более длительный срок хранения препарата. 2 н.п. ф-лы, 2 табл.

 

Изобретение относится к области биотехнологии, микробиологии и касается способа получения высокоэффективного биопрепарата для очистки морской воды от нефти на основе углеводородокисляющего штамма Phyllobacterium myrsinacearum DKS-1. Способ получения жидкой формы биопрепарата включает в себя наращивание биомассы штамма на среде с пептоном, сахарозой, источниками фосфора, калия, магния и последующее культивирование на среде того же состава, заменяя пептон кукурузным экстрактом, после чего полученный концентрат разводят стерильной дистиллированной водой, в которую добавляют (г/л): концентрат бактериальной суспензии - 100,0; меласса - 20,0; K₂HPO₄ - 1,5; KH₂PO₄ - 1,5; MgSO₄ - 1,5. Сухую форму биопрепарата получают путем инокуляции стерильного субстрата-носителя адсорбента вермикулитового вспученного в герметичных пакетах смесью концентрата суспензии штамма, 15% стерильного раствора мелассы и воды, взятых в соотношении 1:1:1 и дополнительного поверхностного культивирования.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к области биотехнологии, микробиологии и предназначено для решения экологических проблем с помощью микробиологических методов, в частности, изобретение может быть использовано для получения биопрепарата, предназначенного для очистки загрязненной нефтью морской воды.

Известен способ получения биопрепарата для очистки водной среды от нефтяного загрязнения, предусматривающий наращивание биомассы бактерий Pseudomonas putida - 36 ЦМПМ В-2443 и ее последующее высушивание [а.с. СССР №1076446, кл. C02F 3/34, 1982].

Однако полученный таким образом бактериальный препарат не дает возможности быстрого удаления нефтяной пленки с поверхности воды, что особенно важно при аварийных разливах нефти. Обязательным условием максимальной эффективности данного препарата является значительное увеличение плотности бактерий в очищаемой среде (не менее 1,5·10 кл/мл), что достигается не ранее чем на 7 сутки. Недостатками способа является то, что максимальная эффективность данного препарата достигается лишь при предварительном "оживлении" биомассы подогревом воды (5 м³) до t=18-28°С, аэрировании 12-16 часов и перемешивании, что является достаточно трудоемкими процессами. Препарат не плавуч, сразу же оседает на дно, и только после постепенного увеличения биомассы бактерий проявляется его деструктивная способность.

Известны также способы получения биопрепаратов для очистки объектов окружающей среды от нефти и нефтепродуктов, включающие культивирование нефтеокисляющих бактерий на питательной среде, внесение минеральных добавок и использование в качестве носителя стерильного торфа (патент РФ №2053205, кл. В09С 1/10, 1996; патент РФ №2116145, кл. В09С 1/10, C02F 3/34, 1998). Недостатком этих способов является использование в качестве носителя торфа, так как он является доступным для микроорганизмов веществом и будет потребляться ими в первую очередь, что увеличит срок очистки от нефти в целом. Кроме того, торф может стать источником эвтрофирования в районах применения биопрепаратов.

Наиболее близким к предлагаемому способу является способ получения биопрепарата «Авалон» (патент РФ №2181701, кл. C02F 3/34, С12Р 39/00, В09С 1/20, C12N 1/20, 2002), который содержит пористый носитель в виде вспененных стеклообразных метафосфатов переменного состава и штаммы микроорганизмов-деструкторов нефти (Serratia marcescens PL-1, Pseudomonas fluorescens biovar II 10-1, Acidovorax delafieldii 3-1), взятый нами за прототип.

Его недостатком является то, что предлагаемые микроорганизмы могут представлять опасность в медицинском и санитарно-гигиеническом отношении. Кроме того, прототип предлагает к использованию коллекционные штаммы, а с точки зрения экологической безопасности и эффективности в состав биопрепаратов должны входить аборигенные микроорганизмы, свойственные конкретному очищаемому от нефти объекту.

Задачей изобретения является создание такого способа получения биопрепарата для очистки морской воды от нефти, который позволил бы обеспечить экологическую, медицинскую и санитарно-гигиеническую безопасность его применения.

Это достигается за счет того, что в качестве биодеструктора используют углеводородокисляющий бактериальный штамм Phyllobacterium myrsinacearum DKS-1, выделенный из вод Северного Каспия, отобранных в районе разведочного бурения нефтяных скважин. Филогенетическое положение штамма проведено на основании секвенирования гена 16S рРНК в Центре "Биоинженерия" РАН и ИНМИ РАН.

Данный штамм защищен патентом (2268934) и депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (коллекционный номер ВКПМ В-9079).

Штамм не токсичен, не обладает вирулентными и токсигенными свойствами, не диссеминирует во внутренних органах лабораторных животных.

Анализ литературных данных и известных технических решений показывает, что не имеется сведений о способах получения биопрепаратов для очистки объектов окружающей среды от нефтяного загрязнения с использованием бактерий рода Phyllobacterium. Следовательно, заявляемое изобретение соответствует условиям патентоспособности "новизна", "изобретательский уровень".

Для промышленной реализации предлагаемого изобретения используются типовое биотехнологическое оборудование и материалы.

Пример 1. Получение жидкой формы биопрепарата.

В качестве деструктора нефти используют бактериальный штамм Phyllobacterium myrsinacearum DKS-1. Хранение штамма осуществляют на агаризованной питательной среде (МПА) с периодическими пересевами (3-4 раза в год). Инкубирование после пересева ведут при температуре 28°С в течение 3-4 дней, затем культуру хранят в холодильнике при температуре 4°С, а также в лиофилизированном состоянии в ампулах.

Штамм Phyllobacterium myrsinacearum DKS-1 характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками: Грамвариабельные прямые подвижные палочки, спор не образуют. Образуют на МПА круглые, выпуклые, блестящие, слизистые, 1-2 мм в диаметре колонии с ровными краями от светло-розового до красного цвета. Оксидазоположительный, каталазоположительный, галотолерантный (рост в интервале солености 0,05-20% NaCl), не гидролизует крахмал, казеин, пектин и целлюлозу, не разжижает желатин, не образует сероводород и индол, восстанавливает нитраты в нитриты, образует кислоту из глюкозы, не окисляет лактозу. Не имеет аргининдегидролазы, лизин - и орнитиндекарбоксилаз, уреазы, фенилаланиндезаминазы, β-галактозидазы, не утилизирует цитрат и малонат натрия, цитрат натрия с глюкозой. Способен к росту на средах Чапека, Миллса, Кинга, магниево-калиево-дрожжевой (МКД), Маккланга, на средах, приготовленных на основе отрубей, мелассы, кукурузного, мясного или дрожжевого экстрактов, картофельного или горохового отваров как с добавлением дизельного топлива и нефти, так и без добавления.

Бактериальный штамм Phyllobacterium myrsinacearum DKS-1, выращиваемый на стандартных средах и средах с добавлением морской соли, способен размножаться и деградировать до 96% углеводородов за 30 суток в диапазоне солености 0,05-20,0%.

Получение жидкой формы биопрепарата включает получение концентрата суспензии штамма с последующим его разведением. Для получения посевного материала указанного штамма используют жидкую питательную среду следующего состава, г/л воды: пептон - 10,0; сахароза - 10,0; KH₂PO₄ - 0,5; K₂HPO₄ - 0,5; MgSO₄×7H₂O - 0,3; рН до стерилизации доводят до 7,4, стерилизуют при 1 атм. (121°С) 30 минут. Приготовленную жидкую среду разливают в качалочные колбы по 100 мл, при этом объем качалочной колбы - 750 мл. Среду засевают смывом с одного косяка и колбу помещают на качалку при 220 об/мин с температурой 28-30°С на 72 часа. Получают титр 0,5-1,0 млрд/мл. Для достижения титра около 1-2×10 КОЕ/мл время культивирования - 96 часов.

Посевной материал можно хранить в холодильнике до 1 месяца при температуре плюс 4-6°С. Посевной материал вносят в ферментер и проводят глубинное культивирование в аэробных условиях при температуре 28-30°С с постоянно работающей мешалкой при коэффициенте заполнения 0,8 на среде следующего состава (г/л воды): кукурузный экстракт - 10,0; сахароза - 10,0; KH₂PO₄ - 0,5; K₂HPO₄ - 0,5; MgSO₄×7H₂O - 0,3; рН=7,5

Для успешного культивирования бактерий в промышленных условиях важное значение имеет количество вносимого посевного материала. Так, в опытных условиях было показано, что через 96 часов культивирования при 28 С штамма Phyllobacterium myrsinacearum DKS-1 титр при внесении 1, 5 или 10% посевного материала достигал максимума 1,38-1,45×10⁹ КОЕ/мл.

Если же вносили 20 или 30% посевного материала, то максимальный титр 0,8-0,9×10⁹ КОЕ/мл достигался через 24 часа культивирования при 28°С (табл.1). Таким образом, при необходимости ускоренного получения биопрепарата можно увеличить количество посевного материала до 20% от объема питательной среды и получить биопрепарат уже через 24 часа, хотя при этом титр бактерий будет несколько ниже, чем при внесении 1-10% посевного материала и культивировании 96 часов.

Таблица 1.
Влияние количества посевного материала на титр Phyllobacterium myrsinacearum DKS-1, ×106, КОЕ/мл
Время культивирования	Количество посевного материала, %
1%	5%	10%	20%	30%
Начальный титр	1×106	60×106	130×106	200×106	300×106
24 часа	160×106	450×106	640×106	800×106	900×106
48 часов	580×106	850×106	950×106	800×106	840×106
72 часа	1200×106	1350×106	1400×106	770×106	800×106
96 часов	1380×106	1400×106	1450×106	700×106	780×106

Полученный в ферментерах концентрат суспензии штамма разводят стерильной дистиллированной водой, в которую добавляют (г/л): концентрат бактериальной суспензии - 100,0; меласса - 20,0; K₂HPO₄ - 1,5; KH₂PO₄ - 1,5; MgSO₄ - 1,5; pH 7,5.

Жидкую форму биопрепарата разливают в стерильные пластиковые бутыли или канистры емкостью от 1 до 10 литров.

Полученную жидкую форму биопрепарата выдерживают в течение 3-5 дней при 20-25°С, после чего ее можно применять для очистки водной поверхности, загрязненной нефтью или нефтепродуктами.

Готовый препарат хранят в сухом темном помещении при температуре +5+20°С. Гарантийный срок годности жидкой формы биопрепарата - 6 месяцев со дня его изготовления.

Пример 2. Получение сухой формы биопрепарата на субстрате-носителе.

В качестве субстрата-носителя используют стерильный адсорбент вермикулитовый вспученный.

Вермикулит вспученный представляет собой сыпучий, пористый, зернистый материал чешуйчатого строения, получаемый в результате обжига природных гидратированных слюд. Обладает высокой огнестойкостью, малой плотностью, низкой теплопроводностью, химико-биологической инертностью при контакте с агрессивными средами, не смачивается расплавленным металлом, имеет высокие сорбционные свойства, экологически чистый, не токсичный, не подвержен гниению, препятствует распространению плесени, без запаха.

Химический состав адсорбента вермикулитового (%): SiO₂ - 34-36; AL₂O₃ - 6-18; MgO - 14-25; CaO - 1,2-2; K₂O - 3-5; Fe₂O₃ - 5,6-17; другие - 0,2-1,2; рН(H₂O)-6,8-8.

Структура вермикулита как носителя обеспечивает оптимальные условия для иммобилизации и жизнедеятельности штамма на пористой структуре. При этом значительно улучшаются условия аэрации, увеличивается площадь питания клеток, а также вермикулит одновременно обеспечивает их минеральное питание. Кроме того, иммобилизация штамма на твердой поверхности предотвращает взаимное ингибирование клеток продуктами их метаболизма.

Субстрат высушивают при температуре 80-100°С, размалывают на молотковой мельнице до тонины 0,1-0,25 мм. Влажность субстрата носителя не должны превышать 15%, а рН должен составлять 7,2-7,4. Субстрат-носитель расфасовывают с наполнением 0,8 от объема в полиэтиленовые пакеты толщиной от 40 до 100 микрон размером 20-30 см по 150 и 400 г, пакеты запаивают и упаковывают в соответствующую тару для отправки на гамма-стерилизацию, где субстрат-носитель подвергают облучению гамма-лучами при дозе 1,0-2,0 Мрад (10-20 кГр). Субстрат-носитель можно стерилизовать и термическим способом - 2 часа при 121°С. В этом случае в качестве упаковки используются мешки из крафт-бумаги размером 20-30 см.

Получают концентрат бактериальной суспензии глубинным культивированием на жидкой среде в ферментере (как в первом примере).

Стерильный субстрат-носитель в пакетах инокулируют инъекцией смесью концентрата суспензии штамма, 15% стерильного раствора мелассы и воды, взятых в соотношении 1:1:1. На каждые 150 г стерильного субстрата-носителя с влажностью 15% используют 50 мл жидкой смеси. Воду и раствор мелассы и других ингредиентов предварительно стерилизуют. Конечная влажность биопрепарата не должна превышать 25%. Инъекция производится стерильной иглой диаметром 0,5-0,7 см. Инокулированные пакеты перемешиваются вручную или во вращающемся барабане - 30 об/мин в течение 3-5 минут. Исходный титр инокулированного субстрата-носителя составляет 20×10⁶ КОЕ/г. Осуществляют дополнительное поверхностное культивирование штамма на субстрате-носителе в течение 3-5 дней при 18-20°С. Благодаря тому, что пакеты герметично закрыты, в них поддерживается практически постоянная влажность.

Готовый препарат хранят в сухом темном помещении при температуре +5+20°С. Гарантийный срок годности этой формы биопрепарата - 1 год со дня его изготовления.

В случае замораживания препарата при транспортировании или хранении препарат перед применением должен быть разморожен и выдержан в течение 5-7 суток при температуре +15+20°С для реактивации - восстановления количества бактерий Phyllobacterium myrsinacearum DKS-1. Неоднократное замораживание и размораживание препарата не допускается.

Свойства и характеристики жидкой и сухой форм биопрепарата представлены в таблице 2.

Таблица 2.
Свойства и характеристики биопрепарата
Жидкая форма
№	Свойства препарата	Характеристики
1	Внешний вид	Жидкость от светло-розового до темно-бурого цвета
2	Влажность, %	99.5
3	Число жизнеспособных клеток Phyllobacterium myrsinacearum DKS-1 в 1 мл препарата в момент изготовления, млн., не менее	50.0
4	К концу гарантийного срока, млн, не менее	40.0
5	Патогенная микрофлора, в том числе сальмонеллы, в 25 мл продукта	отсутствует
Сухая форма
№	Свойства препарата	Характеристики
1	Внешний вид	Сыпучая масса от светло-серого до темно-бурого цвета
2	Влажность, %	45.0
3	Число жизнеспособных клеток Phyllobacterium myrsinacearum DKS-1 в 1 г препарата в момент изготовления, млн, не менее	50.0
4	К концу гарантийного срока, млн, не менее	40.0
5	Патогенная микрофлора, в том числе сальмонеллы, в 25 г продукта	отсутствует

Таким образом, предлагаемый способ благодаря дополнительному поверхностному культивированию штамма на стерильном субстрате-носителе в герметично закрытых пакетах позволяет не только повысить титр и биологическую активность препарата, но и исключает необходимость дополнительной расфасовки готового препарата, что удешевляет технологию получения препарата в целом.

Кроме того, предложенный способ благодаря соблюдению всех требований асептики на каждом этапе производства, исключает возможность заражения биопрепарата посторонней нежелательной микрофлорой.

Преимуществом заявленных форм препарата в сравнении с известным штаммом Phyllobacterium myrsinacearum DKS-1 (RU 2268934 C2, 27.01.2006) является получение более высокого титра клеток, более длительный срок хранения, а также исключение заражения биопрепарата посторонней нежелательной микрофлорой. Кроме того, при иммобилизации штамма на пористой структуре вермикулита (сухая форма биопрепарата) улучшаются условия аэрации, увеличивается площадь питания клеток и дополнительно обеспечивается их минеральное питание, исключается взаимное ингибирование клеток продуктами их метаболизма.

Изобретение обеспечивает достижение технического результата, может быть использовано на практике, обеспечивает возможность воспроизводимости, что удовлетворяет условию патентоспособности "промышленная применимость".

Источники информации

1. Авторское свидетельство СССР №1076446, кл. C02F 3/34, 1982.

2. Патент РФ №2053205, кл. В09С 1/10, 1996.

3. Патент РФ №2116145, кл. В09С 1/10, C02F 3/34, 1998.

4. Патент РФ №2181701, кл. C02F 3/34, С12Р 39/00, В09С 1/20, C12N 1/20, 2002.

1. Способ получения биопрепарата на основе углеводородокисляющего штамма для очистки морской воды от нефти, включающий культивирование штамма Phyllobacterium myrsinacearum ВКПМ В-9079 на среде с пептоном, сахарозой, источником фосфора, калия, магния, последующее культивирование данного штамма на среде с кукурузным экстрактом сахарозой, источником фосфора, калия, магния, разведение полученного концентрата стерильной дистиллированной водой, в которую добавляют (г/л): концентрат бактериальной суспензии - 100,0; мелассу - 20,0; K₂HPO₄ - 1,5; KH₂PO₄ - 1,5; MgSO₄ - 1,5, и выдерживание в течение 3-5 дней при 20-25°С.

2. Способ получения биопрепарата на основе углеводородокисляющего штамма для очистки морской воды от нефти, включающий культивирование штамма Phyllobacterium myrsinacearum ВКПМ В-9079 на среде с пептоном, сахарозой, источником фосфора, калия, магния, последующее культивирование данного штамма на среде с кукурузным экстрактом, сахарозой, источником фосфора, калия, магния, смешивание полученного концентрата с 15%-ным раствором мелассы и водой в соотношении 1:1:1, инокулирование полученной смесью стерильного вермикулита вспученного с последующим поверхностным культивированием в течение 3-5 дней при 18-20°С.