Энтеросорбент микроорганизмов
Владельцы патента RU 2423984:
Общество с ограниченной ответственностью "ФОСФОРОС" (ООО "ФОСФОРОС") (RU)
Изобретение относится к области использования природных сорбентов, в частности к энтеросорбенту из шунгитсодержащего природного минерального сырья с содержанием диоксида кремния от 20 до 50 мас.%, при этом среднестатистический медианный размер частиц энтеросорбента составляет 15,0·10-6 м. Изобретение обеспечивает энтеросорбент, обладающий высокими сорбционными свойствами в отношении микроорганизмов, и который может быть использован в ветеринарии в качестве средства для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний сельскохозяйственных животных и птиц. 7 табл.
Изобретение относится к области использования природных сорбентов, в частности к новому энтеросорбенту на основе шунгитсодержащего природного минерального сырья, обладающему высокими сорбционными свойствами в отношении микроорганизмов, и может быть использовано в ветеринарии в качестве средства, сорбирующего микроорганизмы, для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний сельскохозяйственных животных и птиц.
В настоящее время для лечения инфекций применяют антибиотики широкого спектра действия. Однако при использовании нескольких антибиотиков организм остается без защиты от действия бактериальных токсинов и продуктов распада собственных клеток.
Известен энтеросорбент, представляющий собой взвесь глауконита в водном растворе агара, используемый для лечения телят, больных диспепсией (RU 2188652, 10.09.2002). Поставленная цель достигалась тем, что телятам, больным диспепсией, усугубленной присутствием их в экологически неблагоприятной зоне, вводили внутрь по 19-21 мл взвеси глауконита, приготовленного смешиванием 1,8-2,2 г 0,01-0,1 мм фракции глауконита в 0,5% водном растворе агара, 2 раза в день за 20-25 минут до выпойки молозива в течение 5 дней. Недостатком этого сорбента является то, что данных по сорбции конкретных микроорганизмов отсутствуют. Кроме того, использование глауконита с агаром является трудоемким способом применения.
Известен энтеросорбент-шивыртуин, изготовленный из кремнеземсодержащего сырья, содержащий суммарно 60-80% клиноптилолита и монтмориллонита, а также примеси кварца и биотита (RU 2122868, 10.12.1998). Энтеросорбент проявляет сорбционную активность в отношении микроорганизмов, ослабляет диффузию токсинов, стимулирует миграцию лейкоцитов в рану. Из выявленных недостатков существенны для хирургии поглощение витамина D, кроме того, шивыртуин способствует росту грибов рода Candida в просвете пищеварительного тракта, что нивелируется добавлением соответствующих препаратов (нистатин или леворин).
Имеется описание сорбента на основе кремнеземсодержащего минерального сырья, содержащего осадочную опал-кристобалитовую породу, содержащую не более 15 мас.% глинистых минералов группы монтмориллонита и не более 10 мас.% минералов группы слюд (RU 2319488, 20.03.2008). Заявителем патента установлено, что содержание глин группы монтмориллонита в энтеросорбенте не должно превышать 15 мас.%, так как минералы данной группы обладают высокой набухаемостью в жидкостях, и при их содержании выше 15% возникают трудности при энтеросорбции через зонд. Содержание минералов группы слюд должно быть ограничено 10 мас.%, так как при стандартной степени помола сырья (0,1-1 мм) края слюдяных пластинок оказываются достаточно острыми, что может вызвать различные проблемы в организме.
Описан сорбент Полисорб ВП, используемый в ветеринарии, представляющий собой высокочистый (не менее 92% основного вещества) высокодисперсный кремнезем, который производится в Челябинской области [Справочник. Ветеринарные препараты в России. Т.1 / Под ред. Кленова И.Ф. и др. // ООО «Сельхозиздат», Москва - 2004. - С.526-527]. Размер частиц не более 0,090 мм, удельная поверхность не менее 150 м2/г. В просвете желудочно-кишечного тракта Полисорб ВП связывает и выводит из организма эндогенные и экзогенные токсические вещества различной природы, включая микроорганизмы и микробные токсины, антигены, кормовые аллергены, соли тяжелых металлов, радионуклеотиды. Данный сорбент, обладающий способностью сорбировать микроорганизмы, наиболее близок к заявляемому изобретению и выбран в качестве прототипа. Наиболее часто используемый способ применения данного сорбента - выпаивание животных и птиц водной смесью препарата из расчета 0,05-0,5 г/кг массы тела с проведением предварительного водного голодания. Приготовление водных взвесей препарата, срок хранения которых 2 суток, и расчет дозы препарата на массу тела делает способ применения Полисорба несколько трудоемким.
Задачей данного изобретения является новый энтеросорбент на основе природного кремнийсодержащего минерального сырья, расширяющий ассортимент известных энтеросорбентов, эффективно сорбирующих патогенные микроорганизмы из желудочно-кишечного тракта, который может быть использован в комплексе терапевтических мероприятий, наряду с антибактериальной терапией для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний сельскохозяйственных животных и птиц.
Технический результат данного изобретения заключается в адсорбционных свойствах заявленного энтеросорбента в отношении патогенных микроорганизмов.
Технический результат достигается применением заявленного энтеросорбента на основе природного кремнийсодержащего минерального сырья, в качестве которого используют шунгитсодержащее минеральное сырье с содержанием диоксида кремния от 20 до 50 мас.%.
Шунгитсодержащее минеральное сырье представляет собой докембрийские горные породы с силикатной минеральной основой, насыщенные углеродным (шунгитовым) веществом в некристаллическом состоянии.
Заявленный энтеросорбент представляет собой мелкодисперсный порошок со среднестатистическим медианным размером 15,0·10-6 м, физико-химические свойства которого приведены в таблице 1.
| Таблица 1 | |
| Физико-химические свойства энтеросорбента | |
| Наименование показателя | Значение |
| Внешний вид | Порошок от темно-серого до черного цвета |
| Массовая доля углерода в свободном состоянии, % | 4,0-30,0 |
| Массовая доля двуокиси кремния, % | 20,0-50,0 |
| Содержание водорастворимых веществ, % | 0,1-5 |
| Насыпная плотность, кг/м3 | 500-800 |
| Истинная плотность кг/м3 | 2500-2550 |
| Потери при прокаливании, % | 0,1-5 |
| рН водной вытяжки | 6-9 |
| Адсорбция дибутилфталата*, см3/100 гр ГОСТ 7885-86 | 30-35 |
| Адсорбция метиленового синего*, гр/ 100 гр (ГОСТ 4453-74) | 15 |
| Массовая доля остатка на сите после мокрого просева No 0045, %, менее | 0,08 |
Заявляемый энтеросорбент относится к IV классу опасности.
Энтеросорбент получают следующим образом.
Подготовленную руду шунгитосодежащего минерального сырья с содержанием двуокиси кремния 37,2 мас.%, углерода 25,3 мас.% из Зажогинского месторождения измельчают, фракцию размером не более 45,0·10-6 м отделяют, нагревают при температуре от 100 до 200°С, охлаждают до температуры окружающей среды.
Заявляемый энтеросорбент проявляет адсорбционные свойства в отношении микроорганизмов, наиболее часто выступающих в роли этиологического фактора заболеваний желудочно-кишечного тракта сельскохозяйственных животных и птиц, таких как Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringes. Культуры данных бактерий были выделены и идентифицированы в Федеральном государственном учреждении, Федеральный центр токсикологической и радиационной безопасности животных (г.Казань), от больных животных и обладали патогенностью. Дополнительно использовали непатогенный штамм Escherichia coli.
Адсорбционное действие энтеросорбента в отношении патогенных микроорганизмов определяют in vitro, используя методику, описанную для исследования адсорбционного действия медицинского препарата «Энтеросгель» [Руденко А.В. Сорбционное действие Энтеросгеля в отношении различных видов микроорганизмов. / А.В.Руденко, И.В.Багдасарова, А.П.Брудько. // Сучаснi iнфекцii. - 2003. - №2. - с.120-122].
Кроме того, для сравнения эффективности заявляемого энтеросорбента с прототипом исследуют микробиологический состав кишечника крыс с признаками дисбактериоза на фоне применения энтеросорбентов.
Для лучшего понимания приводятся примеры, иллюстрирующие заявленное изобретение.
Пример 1.
Получение энтеросорбентов
А. Шунгитсодержащее минеральное сырье из Зажогинского месторождения с содержанием углерода 25.3 мас.%, оксида кремния 37.2 мас.%, в количестве 250 кг размером менее 5·10-3 м после предварительного удаления влаги и мусора измельчают в мельнице в течение одного часа.
Продукт измельчения количественно из мельницы подается в воздушный классификатор струей осушенного воздуха на разделение, частицы более 45,0·10-6 м в количестве 5 кг возвращаются в мельницу на доизмельчение. Измельчение минерального сырья до более мелкого состояния приводит к агломерации частиц и, как следствие, изменению структуры и свойств энтеросорбента. Более крупные частицы энтерособента, хотя и проявляют сорбционные свойства, но уступают заявляемым по степени эффективности. Образовавшуюся в количестве 245 кг в час мелкодисперсную фракцию размером не более 45,0·10-6 м подают в термическую печь, обеспечивающую равномерный прогрев минерального сырья при температуре 200°С в течение 10 минут, после чего продукт охлаждается в теплообменном устройстве до температуры окружающей среды и подается на затаривание.
Б. Энтеросорбент получается аналогично п.А, отличающийся тем, что в качестве сырья используют минеральное сырье из месторождения Текели-Коксуйской зоны, в котором содержание оксида кремния составляет 50% и содержание углерода 4%.
В. Энтеросорбент получается аналогично п.А, отличающийся тем, что в качестве сырья используют минеральное сырье из Зажогинского месторождения, в котором содержание оксида кремния составляет 20% и содержание углерода 30%.
Пример 2
Адсорбционное действие энтеросорбентов в отношении культуры
Escherichia coli
За 1 сутки до начала опыта на скошенный мясо-пептонный агар (МПА) проводят посев культуры Escherichia coli. Посевы помещают в термостат на 24 часа при температуре 37°С. По истечении 24 часов проводят смывы культур стерильной дистиллированной водой, фильтруют через стерильный фильтр и готовят рабочую суспензию микробов, стандартизируя по стандарту оптической плотности в 2 ед. Параллельно готовят рабочую взвесь с заявляемым энтеросорбентом, полученным согласно примеру 1 п.А. Для этого в стерильную пробирку наливают стерильный изотонический раствор 4,5 мл и добавляют 0,5 мл рабочей суспензии культуры и 25 мг стерильного энтеросорбента (количество используемого для опыта энтеросорбента обусловлено максимально рекомендуемой дозой энтеросорбента - 5 г/кг корма; для сохранения указанного соотношения расчет составлял - 5 г/л стерильного изотонического раствора). Рабочую взвесь с энтеросорбентами помещают в аппарат для встряхивания проб на 1,5 часа. Далее проводят серийные разведения этой смеси 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10000, из которых проводят посевы на МПА в чашки Петри (по три посева на каждое разведение) из пробирки методом «газона» по 0,1 мл получившихся разведений. Чашки помещали в термостат на 24 часа при температуре 37°С.
Параллельно ставят контроли, т.е. выполняют те же действия для:
- пробирки с рабочей суспензией микробов без заявляемого энтеросорбента (основной контроль, по сравнению с которым проводят подсчет адсорбции);
- пробирки с изотоническим раствором и заявляемым энтеросорбентом без микробов (контроль на стерильность, чтобы убедиться в достоверности результатов, что с водой или с заявляемым энтеросорбентом не были внесены другие микробы);
- пробирки с 4,5 мл изотонического раствора, 0,5 мл рабочей суспензии культуры и 25 мг стерильного энтеросорбента-прототипа.
По истечении 24 часов визуально проводят подсчет количества выросших колоний в трех чашках, для подсчета КОЕ брали результаты наибольшего разведения с наименьшим количеством выросших колоний, и выводят средний результат - эту цифру затем умножали на степень разведения, полученную цифру сравнивали с контрольными посевами и разницу цифр считали как адсорбцию и пересчитывали в проценты. Исследования проводили трехкратно со стат.обработкой.
По истечении 24 часов визуально проводят подсчет количества выросших колоний в трех чашках, для подсчета КОЕ брали результаты наибольшего разведения с наименьшим количеством выросших колоний (1:10000), выводят средний результат, который умножают на степень разведения (105), и полученную цифру сравнивают с контрольными посевами.
Разницу считают как адсорбцию и пересчитывают в проценты. Исследования проводят трехкратно с использованием статистической обработки.
Результаты представлены в таблице 2.
| Таблица 2 | ||
| Адсорбционное действие заявленного энтеросорбента в отношении культуры Escherichia coli, КОЕ/мл (×105) | ||
| КОЕ/мл | Показатель адсорбционной активности, % | |
| Контроль | 50 | |
| Полисорб ВП* (прототип) | 17 | 66 |
| Пример 1 п А. | 15 | 70 |
| Пример 1 п.Б. | 15,5 | 69 |
| Пример 1 п.В. | 15,1 | 69,8 |
| * - ветеринарный препарат. |
По данным таблицы 2 видно, что адсорбция в отношении Escherichia coli заявленным энтеросорбентом составила 70%, а Полисорбом ВП - 66%, т.е. заявленный энтеросорбент проявляет лучшие адсорбционные свойства в отношении патогенного штамма Escherichia coli по сравнению с прототипом.
В кишечнике присутствуют в основном непатогенные микроорганизмы Escherichia coli, адсорбция их сорбентами была бы нежелательной, исходя из этого проводят изучение адсорбционной активности предлагаемого энтеросорбента в зависимости от патогенности Е. coli.
Пример 3
Адсорбционное действие энтеросорбентов в зависимости от патогенности Е. coli
Опыт проводят аналогично примеру 2, однако проводят сравнение рабочих взвесей с заявляемым энтеросорбентом патогенного и непатогенного штаммов с рабочими взвесями патогенного и непатогенного штаммов без сорбентов (контроль) и рабочий взвесей с Полисорбом ВП патогенного и непатогенного штаммов.
Результаты представлены в таблице 3.
| Таблица 3 | ||||
| Адсорбционная активность предлагаемого энтеросорбента в зависимости от патогенности Escherichia coli, КОЕ/мл (×105) | ||||
| Escherichia coli патогенный штамм, КОЕ/мл | Показатель адсорбционной активности патогенного штамма, % | Escherichia coli непатогенный штамм, КОЕ/мл | Показатель адсорбционной активности непатогенного штамма, % | |
| Контроль | 57 | 64 | ||
| Полисорб ВП (прототип) | 23 | 59,6 | 38 | 40,6 |
| Пример 1 п А. | 21 | 63,2 | 43 | 32,8 |
| Пример 1 п.Б. | 20 | 61,4 | 42 | 32,0 |
| Пример 1 п.В. | 21 | 60,7 | 42 | 31,8 |
По данным таблицы 3 видно, что адсорбция патогенных микробов заявляемыми энтеросорбентами лежит в диапазоне от 60,7 до 63,2%, непатогенных от 31,8 до 32.8%. У прототипа адсорбция патогенных микроорганизмов составила 59,6%, непатогенных 40,6%. Значительная адсорбция непатогенной микрофлоры может существенно повлиять на полезную микрофлору желудочно-кишечного тракта, что приводит к дисбактериозу. Результаты свидетельствуют, что заявляемые энтеросорбенты проявляют лучшую адсорбционную активность в отношении патогенного штамма Е. coli, тогда как разница в показателях адсорбционной активности патогенных и непатогенных штаммов Escherichia coli у прототипа незначительна (59,6% и 40,6%).
Пример 4
Адсорбционные действия энтеросорбентов в отношении культуры Staphylococcus aureus
Опыт проводят аналогично примеру 2, но объектом исследования является патогенный полевой штамм микроорганизмов Staphylococcus aureus. Результаты исследования представлены в таблице 4.
| Таблица 4 | ||
| Адсорбционное действие энтеросорбентов в отношении культуры Staphylococcus aureus, КОЕ/мл (×105) | ||
| КОЕ/мл | Показатель адсорбционной активности, % | |
| Контроль | 100 | |
| Полисорб ВП (прототип) | 24 | 76 |
| Пример 1 п.А. | 20 | 80 |
| Пример 1 п.Б. | 20,5 | 79,5 |
| Пример 1 п.В. | 20,6 | 79,4 |
Адсорбция заявленных энтеросорбентов в отношении патогенного полевого штамма Staphylococcus aureus составила от 79,4 до 80%, тогда как у прототипа 76%, т.е. заявленный энтеросорбент проявляет лучшие адсорбционные свойства в отношении Staphylococcus aureus по сравнению с прототипом.
Пример 5
Адсорбционные действия энтеросорбентов в отношении культуры Salmonella typhimurium
Опыт проводят в условиях примера 2, но объектом исследования является культура Salmonella typhimurium. Результаты исследования представлены в таблице 5.
| Таблица 5 | ||
| Адсорбционное действие заявленного энтеросорбента в отношении культуры Salmonella typhimurium, КОЕ/мл (×105) | ||
| КОЕ/мл | Показатель адсорбционной активности, % | |
| Контроль | 367 | |
| Полисорб ВП (прототип) | 34 | 90,7 |
| Пример 1 п.А. | 30 | 91,8 |
| Пример 1 п.Б. | 31 | 91,5 |
| Пример 1 п.В. | 33 | 91,0 |
Результаты свидетельствуют, что значение показателя адсорбции заявленных энтеросорбентов в отношении культуры Salmonella typhimurium находится в диапазоне от 91,0 до 91,8%.
Пример 6
Адсорбционные действия энтеросорбентов в отношении культуры
Clostridium perfringes
Опыт проводят в условиях примера 1, но объектом исследования является патогенный полевой штамм микроорганизмов Clostridium perfringes, являющийся анаэробными микроорганизмами, поэтому в течение всего опыта создают анаэробные условия и пробы высевают не на МПА, а на тиогликолевую питательную среду с добавлением 10% глюкозы, с нанесением сверху среды слоя вазелинового масла для исключения попадания кислорода. В этом случае наибольшим разведением с наименьшим количеством выросших колоний было 1:1000.
Результаты исследования представлены в таблице 6.
| Таблица 6 | ||
| Адсорбционное действие заявленного препарата в отношении Clostridium perfringes, КОЕ/мл (×104) | ||
| КОЕ/мл | Показатель адсорбционной активности, % | |
| Контроль | 105 | |
| Полисорб ВП (прототип) | 28 | 73,3 |
| Пример 1 п.А. | 23 | 78,1 |
| Пример 1 п.Б. | 23 | 78,1 |
| Пример 1 п.В. | 25 | 76,2 |
Из данных таблицы видно, что адсорбция заявленных энтеросорбентов в отношении культуры Clostridium perfringes составляет более 76,2%, тогда как у прототипа 73,3%, т.е. заявленный энтеросорбент проявляет лучшие адсорбционные свойства в отношении Clostridium perfringes по сравнению с прототипом.
Из примеров видно, что адсорбционная активность заявляемых энтеросорбентов выше, чем адсорбционная активность прототипа. Практически во всех случаях энтеросорбент с содержанием диоксида кремния 37,2% проявляет немногим большую сорбирующую способность по отношению к исследованным микроорганизмам.
Пример 7
Исследование микробиологического состава кишечника крыс с признаками дисбактериоза на фоне применения заявляемого энтеросорбента и энтеросорбента Полисорб ВП.
С целью выяснения кишечной микрофлоры крыс с признаками дисбактериоза (диарейный синдром) на фоне применения энтеросорбентов были проведены посевы содержимого кишечника.
Фекалии животных отбирают стерильным ватным тампоном из прямой кишки непосредственно в стерильные пробирки в конце 10-дневного опыта при диагностическом вскрытии. Отбор проб проводят выборочно в следующих группах: в первой - получавшей нетоксичный корм, во второй - получавшей токсичный корм, вызвавший дисбактериоз, в третьей - получавшей с токсичным кормом заявляемый энтеросорбент, полученный согласно примеру 1 п.А в количестве 5 г/кг корма, в четвертой группе энтересорбент, полученный согласно примеру 1 п.Б, в пятой группе энтересорбент, полученный согласно примеру 1 п.В, и в шестой группе - получавшей с токсичным кормом Полисорб ВП в количестве 5 г/кг корма. Состав отдельных микроорганизмов содержимого кишечника представлен в таблице 7.
| Таблица 7 | ||||||
| Состав и содержание микроорганизмов в содержимом кишечника крыс, КОЕ/г кишечного содержимого (n=10) | ||||||
| Наименование микроорганизмов | Группа животных | |||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
| Молочнокислые | 2,6×103-4,7×105 | 1,5×101-2,4×103 | 7,9×102-2,6×104 | 8,1×102-2,7×104 | 8,0×102-2,8×104 | 3,5×103-3,2×104 |
| Escherichia coli непатогенный штамм | 3,4×102 -1,4×104 | 4,5×103-1,2×105 | 3,2×102 -4,5×104 | 3,1×102-4,7×104 | 3,2×102-5.1,×104 | 2,7×102-8,3×104 |
| Escherichia coli патогенный штамм | 0 | 0-5,8×102 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Грибы рода Candida | 1,2×101-1,7×103 | 4,6×103 -1,1×105 | 1,8×102-3,6×104 | 1,6×102-3,2×104 | 2,3×102-3,5×104 | 2,4×102-2,9×104 |
Из таблицы 7 видно, что микробиологический состав содержимого кишечника имеет существенные различия. В группе, получавшей токсичный корм без энтеросорбента, отмечается тенденция к снижению содержания молочнокислой микрофлоры, увеличению содержания грибов рода Candida, энтеробактерий, в некоторых случаях патогенных. Применение сорбентов способствовало снижению признаков, характерных для дисбактериоза у животных и уменьшало возникновение диареи. Следует отметить, что эффективность воздействия на микроорганизмы заявляемого энтеросорбента не уступала подобному действию Полисорба ВП.
Таким образом, при изучении адсорбционных свойств заявляемых энтеросорбентов по отношению к различным видам микроорганизмов было установлено, что происходила их значительная адсорбция 63,2-91,8%, что не уступает, а иногда и значительно превосходит адсорбционные свойства прототипа.
Приведенные данные свидетельствуют, что адсорбционная способность заявленного энтеросорбента зависит от свойств микроорганизмов: заявленный энтеросорбент адсорбирует преимущественно патогенную культуру Е. coli, в сравнении с непатогенной, что, вероятно, связано с адгезивными факторами самих микроорганизмов.
Полученные результаты дают основание рекомендовать заявляемый энтеросорбент для профилактики и комплексной терапии токсикозов и заболеваний желудочно-кишечного тракта различной этиологии у сельскохозяйственных животных и птиц.
Энтеросорбент микроорганизмов на основе кремнийсодержащего минерального сырья, отличающийся тем, что в качестве кремнийсодержащего минерального сырья он содержит шунгитсодержащую породу со среднестатистическим медианным размером частиц 15,0·10-6 м, содержащую 20-50 мас.%, диоксида кремния.
