Способ определения наличия бактерий escherichia coli по детектированию их фрагментов с помощью атомно-силовой микроскопии

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу определения наличия бактерий Escherichia coli. Способ включает специфическую иммобилизацию фрагментов указанных бактерий из раствора на аффинную поверхность, состоящую из слоя белка G с нанесенным на него слоем антител, специфичных к выявляемым бактериальным клеткам. Осуществляют двухэтапную промывку образца от неспецифически связавшегося материала, включающую в себя промывку в буфере со значением рН 8,5-9,5 и последующую промывку деионизованной водой. Используют атомно-силовую микроскопию как инструмент визуализации связавшихся бактериальных фрагментов с возможностью прямого подсчета объема связавшегося аналита на единицу поверхности. Предложенное изобретение позволяет определять наличие сверхмалых концентраций клеток в анализируемом растворе. 1 ил.

 

Заявленный способ определения наличия бактерий Escherichia coli no детектированию их фрагментов относится к области сенсорных технологий, направленных на обнаружение и визуализацию бактериальных клеток, а также их фрагментов. Под фрагментом бактериальной клетки понимается любая ее часть, содержащая антигенную детерминанту.

Существует ряд технических решений, близких по смыслу к предлагаемому способу: диагностическая тест-система для выявления заболевания (патент RU 2361215 С1), нанобиочип, используемый для регистрации белков и белковых комплексов, способ его получения и способ регистрации белков и белковых комплексов с использованием зондовой микроскопии (патент RU 2007117787A), способ регистрации специфических макромолекул в биологической пробе и устройство для его осуществления (патент RU 2006129865A), способ регистрации макромолекул при проведении протеомных исследованний и биочип, используемый при их регистрации (патент RU 2004119864).

Однако методы, разработанные во всех перечисленных патентах, имеют один существенный недостаток: они не описывают регистрацию или визуализацию бактериальных клеток и их фрагментов, в том числе Escherichia coli, а относятся лишь к макромолекулам (в основном к белкам и белковым комплексам) и к вирусам.

Существуют способы регистрации специфически связавшихся с аффинной поверхностью бактерий, основанные на применении методов кварцевого микробаланса, эллипсометрии, поверхностного плазменного резонанса (Lazcka О., Del Campo F.J., Munoz F.X., Biosens. Bioelectron, 2007, 22, 1205-1217; Ivnitski D., Abdel-Hamid I., Atanasov P., Wilkins E., Biosens. Bioelectron, 1999, 14, 599-624). Недостатками данных методов являются (1) высокий уровень сигнала в контрольных экспериментах, т.е. при неспецифическом связывании, (2) отсутствие возможности визуализации связавшегося аналита, которая для бактериальных клеток (и их фрагментов) означает подтверждение физического события их связывания с аффинной поверхностью, (3) невозможность детектировать единичную бактериальную клетку или часть бактериальной клетки, (4) риск обсемененности помещения и возможности заражения персонала при детектировании патогенных бактерий.

Задачей, решаемой предлагаемым изобретением, является определение наличия бактериальных клеток Escherichia coli и их фрагментов в растворах с малыми концентрациями с помощью атомно-силовой микроскопии. Предложенный метод позволяет определять наличие сверхмалых концентраций клеток в анализируемом растворе, в том числе детектировать связавшиеся с аффинной поверхностью фрагменты единственной бактерии. Метод одинаково чувствителен как к бактериальным клеткам целиком, так и к их фрагментам, поскольку антитела связываются с антигенной детерминантой. Время детектирования от момента экспонирования аналита к аффинной поверхности до получения результата составляет от 20 минут. Данный метод подходит для контроля качества питьевой воды и любых других жидкостей на содержание в них бактерий Escherichia coli. Поскольку данным методом можно детектировать фрагменты бактерий Escherichia coli, то это позволяет использовать для анализа раствор разрушенных бактериальных клеток, что позволяет снизить риск заражения обслуживающего персонала.

Технический результат в предлагаемом изобретении достигают следующей последовательностью действий: подготовка аффинной поверхности на основе специфических антител, экспонирование аналита к этой поверхности, двухэтапная промывка подложки, получение топографии поверхности образца с помощью атомно-силовой микроскопии. При этом экспонирование аналита к аффинной поверхности проводят в окружении буферного раствора со значением рН, и при температурах, являющихся оптимальными для специфического связывания антитела с антигеном. Существенным признаком является также двухэтапность промывки: сначала в буфере, позволяющем наиболее эффективно отмыть не специфически связавшийся материал, а затем водой, позволяющей отмыть подложку от солей.

Рассмотрим осуществление предлагаемого изобретения на примере детектирования фрагментов бактерии Escherichia coli из суспензии с концентрацией по целым клеткам 10⁷ КОЕ/мл. В качестве контрольного эксперимента берется аналитический раствор (аналит), содержащий фрагменты бактерии Bacillus subtilis той же концентрации.

Для подготовки аффинной поверхности используется распространенный метод нанесения на поверхность слюды слоя из белка G, на который в свою очередь наносятся специфические антитела к Escherichia coli. Для увеличения адгезивных свойств слюды перед нанесением на нее белка G ее обрабатывают в тлеющем разряде в течение 60 секунд при силе тока 0,4 мА (напряжение 1,5 кВ, расстояние между электродами 5 мм, площадь электродов 0,5 см²). После нанесения слоя антител на поверхность слоя белка G подложку промывают в деионизованной воде и просушивают. Экспозицию аналита к биофункциональной поверхности проводят ее помещением сверху на небольшую каплю (20 мкл) анализируемой суспензии в буфере рН 8,5-9,5 при 37°С в течение 10 минут, после чего промывают погружением подложки в буферный раствор и ее раскачиванием на шейкере, при этом подложку жестко закрепляют в раскачиваемой системе. После этого подложку промывают деионизованной водой от солей, высушивают в струе сжатого азота и исследуют с помощью атомно-силовой микроскопии. Анализируя АСМ-изображения, производят подсчет количества связавшихся бактериальных клеток или суммарного объема связавшихся клеточных фрагментов на единицу поверхности.

На фиг.1 представлен трехмерный вид АСМ-изображений фрагментов клеток Escherichia coli, связавшихся с аффинной к ним поверхностью из суспензии концентрацией 10⁷ КОЕ/мл (слева), а также такой же поверхности, к которой экспонировалась суспензия фрагментов клеток Bacillus subtilis той же концентрацией (справа). Размер области сканирования приведенных изображений составляет 10×10 мкм². Анализ АСМ-изображений демонстрирует, что суммарный объем связавшихся фрагментов Escherichia coli высотой более 50 нм составляет на наблюдаемом поле 2,47×10¹⁴ нм³, тогда как эта величина для Bacillus subtilis равна нулю, т.е. в случае неспецифической пары «анитело-антиген» связывание объектов высотой более 50 нм не наблюдается вовсе.

Таким образом, предлагаемое изобретение позволяет проводить диагностику жидкостей, в том числе пищевых, на содержание микроорганизмов, причем в случае возможно предварительно осуществлять намеренное разрушение клеток для снижения риска обсемененности помещения и заражения обслуживающего персонала. При этом чувствительность детектирования не понизится.

Способ определения наличия бактерий Escherichia coli по детектированию их фрагментов в растворе, включающий в себя специфическую иммобилизацию фрагментов указанных бактерий из раствора на аффинную поверхность, состоящую из слоя белка G с нанесенным на него слоем антител, специфичных к выявляемым бактериальным клеткам, предусматривающий двухэтапную промывку образца от неспецифически связавшегося материала, включающую в себя промывку в буфере со значением рН 8,5-9,5 и последующую промывку деионизованной водой, использование атомно-силовой микроскопии как инструмента визуализации связавшихся бактериальных фрагментов и возможностью прямого подсчета объема связавшегося аналита на единицу поверхности.