Способ стимуляции миелопоэза
Владельцы патента RU 2442589:
Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт фармакологии Сибирского отделения РАМН НИИ фармакологии СО РАМН (RU)
Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии, и может быть использовано для стимуляции миелопоэза. Для этого вводят пегилированную гиалуронидазу в дозе 50 ЕД/кг 1 раз в сутки в течение 2 дней и дополнительно однократно внутривенно препарат, содержащий D-глюкуроновую кислоту, в дозе 2 мг/кг. Способ позволяет ускорить регенеративные процессы гемопоэтической ткани при дополнительном введении низких доз D-глюкуроновой кислоты за счет ее регуляторного влияния на метаболизм гиалуроновой кислоты гликокаликса кроветворных прекурсоров. 3 табл.
Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии и гематологии.
Высокая частота встречаемости заболеваний системы крови, резистентных к современной медикаментозной терапии [1, 2], является основанием для разработки новых способов стимуляции гемопоэза.
Известно большое количество способов стимуляции гемопоэза.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату прототипом является способ стимуляции миелопоэза с помощью препарата иммобилизированной гиалуронидазы [3].
Недостатком данного способа является его недостаточная эффективность.
Задачей, решаемой данным изобретением, является повышение эффективности способа.
Поставленная задача достигается техническим решением, заключающемся в одновременном введении перорально пегилированной гиалуронидазы в дозе 50 ЕД/кг 1 раз в сутки в течение 2 дней и однократно внутривенно D-глюкуроновой кислоты в дозе 2 мг/кг.
Новым в предлагаемом изобретении является дополнительное однократное введение внутривенно D-глюкуроновой кислоты в дозе 2 мг/кг.
На сегодняшний день показана возможность стимуляции эритроидного и грануломоноцитарного ростков кроветворения с помощью пегилированной гиалуронидазы (пэгГД) [3]. При этом механизмом действия препарата является стимуляция процессов пролиферации и дифференцировки кроветворных клеток под влиянием образующихся под действием фермента низко- и среднемолекулярных форм гиалуроновой кислоты (ГК) межклеточного матрикса гемопоэтической ткани [4].
Известны гемостимулирующие эффекты D-глюкуроновой кислоты, но лишь при ее курсовом введении в высоких дозах (50 мг/кг) [5]. При этом широкое клиническое использование данного препарата в качестве гемостимулятора в указанных дозах, учитывая его кислотность, частоту и тяжесть возникновения местнораздражающих реакций, представляется маловероятным.
Вместе с тем, известно, что введение препаратов гиалуронидазы способно сопровождаться разобщением процессов пролиферации и дифференцировки кроветворных предшественников [4, 6], и как следствие - ограничением выраженности гемостимулирующих эффектов, потенциал которых может быть значительно выше. Кроме того, показано снижение способности прогениторных элементов, подвергшихся воздействию гиалуронидазы, к энграфтингу при их трансплантации [7], а также возможность предупреждения формирования данного феномена путем инкубации трансплантата в растворе, содержащем D-глюкуроновую кислоту, представляющую собой структурную единицу мономера ГК [8].
Тем не менее, возможность усиления гемостимулирующего эффекта пэгГД с помощью дополнительного введения D-глюкуроновой кислоты, причем в дозах, значительно ниже терапевтически эффективных доз, остается не известна.
Факт совместного применения пэгГД и D-глюкуроновой кислоты с достижением нового технического результата: создание эффективного способа стимуляции миелопоэза за счет потенцирования специфических гематотропных эффектов каждого из используемых веществ, для специалиста является не очевидным. Эксперимент показал непредсказуемый результат.
Заявляемые существенные признаки проявили в совокупности новые свойства, не вытекающие явным образом из уровня техники в данной области. Предлагаемое изобретение может быть использовано в экспериментальной медицине с выходом в практическое здравоохранение. Идентичной совокупности признаков при исследовании уровня техники по патентной и научно-медицинской литературе не обнаружено.
Исходя из вышеизложенного, следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».
Способ осуществляют следующим образом:
Лабораторному животному (мыши) одновременно вводят перорально препарат пегилированной гиалуронидазы в дозе 50 ЕД/кг 1 раз в сутки, в течение 2-х дней, и однократно внутривенно D-глюкуроновую кислоту в дозе 2 мг/кг.
Заявляемая доза и режим введения пэгГД и D-глюкуроновой кислоты подобраны опытным путем и являются оптимальными для получения заявленного технического результата.
Предлагаемый способ был изучен в экспериментах на мышах линии CBA/CaLac в количестве 244 штук, массой 18-20 г. Мыши 1 категории (конвенциональные линейные мыши) получены из питомника отдела экспериментального биомедицинского моделирования НИИ фармакологии СО РАМН (сертификат имеется).
Эффективность стимуляции миелопоэза определялась на модели цитостатической миелосупрессии в соответствии с методическими указаниями по изучению гемостимулирующей активности фармакологических веществ [9] с помощью стандартных и культуральных гематологических методов на 3, 5 и 8-е сутки после введения цитостатика [10].
Пример 1.
Моделирование цитостатической миелосупрессии осуществляли путем однократного внутрибрюшинного введения циклофосфана в максимально переносимой дозе (250 мг/кг) в 0,3 мл физиологического раствора. Опытным животным на фоне моделирования миелосупрессии вводили перорально препарат пэгГД (ООО «Саентифик фьючер менеждмент», г.Новосибирск) 1 раз в сутки в течение 2-х дней в дозе 50 ЕД/кг (способ-прототип) и препарат пэгГД в аналогичном режиме совместно с однократным внутривенным введением D-глюкуроновой кислоты в дозе 2 мг/кг («Sigma», США).
Контролями служили группы животных, которым вводили либо однократно внутривенно D-глюкуроновую кислоту в дозе 2 мг/кг, либо 1 раз в сутки в течение 2-х дней физиологический раствор.
Введение препарата пэгГД на фоне моделирования цитостатической миелосупрессии сопровождалось стимуляцией процессов регенерации эритроидного и гранулоцитарного ростков кроветворения. Отмечалось увеличение содержания кроветворных прекурсоров (КОЕ-Э, КОЕ-ГМ) и морфологически распознаваемых клеточных элементов эритроидного и грануломоноцитарного ростков кроветворения в гемопоэтической ткани (табл.1, 2), а также количества зрелых клеток эритроидного и гранулоцитарного ряда в периферической крови (табл.3).
В отличие от этого введение D-глюкуроновой кислоты в дозе 2 мг/кг не оказывало статистически значимого влияния на показатели системы крови (табл.1-3).
В то же время применение D-глюкуроновой кислоты на фоне введения пэгГД сопровождалось значительной стимуляцией процессов кроветворения. Причем темп и выраженность регенерации кроветворной ткани в данном случае существенно превосходили таковые при использовании только пэгГД. Так, количество КОЕ-Э и КОЕ-ГМ в костном мозге на 5-е сутки было в 2,3 и 1,8 раз соответственно выше аналогичных параметров у животных, получавших терапию по способу-прототипу.
Указанные изменения состояния пула родоначальных элементов сопровождались закономерно более ранним восстановлением морфологически распознаваемых показателей костного мозга (в первую очередь, незрелых и зрелых нейтрофильных гранулоцитов, эритроидных клеток) (табл.2) и периферической крови (ретикулоцитов, палочко- и сегментоядерных нейтрофилов и тромбоцитов) (табл.3).
Таким образом, дополнительное введение низких доз D-глюкуроновой кислоты на фоне проведения терапии с помощью пегилированной гиалуронидазы приводило к значительному ускорению регенеративных процессов гемопоэтической ткани. При этом механизмом потенцирования гемостимулирующих эффектов пэгГД, по-видимому, являлось регуляторное влияние D-глюкуроновой кислоты на метаболизм гиалуроновой кислоты гликокаликса кроветворных прекурсоров.
Литература
1. Glaspy J.A. Hematopoietic management in oncology practice. Part 1. // Myeloid growth factors Oncology (Huntingt). - 2003. - Vol.17. - №11. - P.1593-1603.
2. Волкова М.А. Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор граноцит и его клиническое применение // Тер. архив. - 1998. - №4. - С.80-84.
3. Дыгай A.M., Артамонов А.В., Бекарев А.А. и др. Гемостимулирующие эффекты иммобилизированной гиалуронидазы и механизмы их развития при цитостатической миелосупрессии // Бюл. эксперим. биол. и медицины. - 2010. - №5. - С.528-531.
4. Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. и др. Регуляция функций прогениторных клеток с помощью гиалуронидазы // Вестник РАМН. - 2009. - №11. - С.7-10.
5. Гурьянцева Л.А., Удут Е.В., Симанина Е.В. и др. Механизмы регуляции системы крови под влиянием гемостимуляторов на фоне цитостатической миелосупрессии // Сибирский онкологический журнал. - 2005. - №3. - С.39-43.
6. Зюзьков Г.Н., Жданов В.В., Дыгай A.M., Гольдберг Е.Д. Роль гиалуронидазы в регуляции гемопоэза // Бюл. эксперим. биол. и медицины. - 2007. - №12. - С.690-695.
7. Hui Zhu, Noboru Mitsuhashi, Andrew Klein e.a. The Role of the Hyaluronan Receptor CD44 in Mesenchymal Stem Cell Migration in the Extracellular Matrix // Stem Cells. 2006 - Vol.24. - N.4. - P.928-935.
8. Патент (RU) на изобретение №2392947 «Способ получения клеточного материала для трансплантации при миелосупрессии», 2010. Авторы: Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. и др.
9. Дыгай A.M., Жданов В.В., Гольдберг В.Е. и др. Методические указания по изучению гемостимулирующей активности фармакологических веществ // Ведомости научного центра экспертизы и государственного контроля лекарственных средств. - 2002. - №1(9). - С.29-32.
10. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. - Томск: Изд-во ТГУ, 1992. - С.130-145.
| Таблица 1 | |||
| Динамика содержания КОЕ-Э и КОЕ-ГМ в костном мозге мышей линии CBA\CaLac (на 105 неприлипающих миелокариоцитов) после введения дистиллированной воды (1), 2 мг/кг D-глюкуроновой кислоты (2) и 50 ЕД/кг пегилированиой гиалуронидазы (пэгГД) (3) и совместно D-глюкуроновую кислоту с пэгГД (4) на фоне моделирования цитостатической миелосупрессии, (Х±m) | |||
| Сроки исследования, сутки | КОЕ-Э | КОЕ-ГМ | |
| Фон | 6,75±0,73 | 4,50±0,38 | |
| 3-е | 1 | 8,40±0,30* | 8,35±0,44* |
| 2 | 8,58±0,23* | 8,70±0,96* | |
| 3 | 14,1±1,7*# | 12,38±0,82*# | |
| 4 | 18,3±0,23*#$ | 17,00±0,53*#$ | |
| 5-е | 1 | 7,56±0,48 | 6,63±0,78* |
| 2 | 7,59±0,51 | 7,75±0,76* | |
| 3 | 10.73±0,65*# | 15,89±0,45*# | |
| 4 | 24,8±1,3*#$ | 28,5±0,5*#$ | |
| 10-е | 1 | 5,8±0,8 | 4,25±0,53 |
| 2 | 5,75±0,7 | 4,4±0,29 | |
| 3 | 7,7±0,3# | 6,1±0,80* | |
| 4 | 8,10±0,42*# | 8,2±0,7*# | |
| * - различия достоверны по отношению к фону при р<0,05; | |||
| # - различия достоверны по отношению к группе, получавшей дистиллированную воду на фоне введения циклофосфана при р<0,05; | |||
| $ - различия достоверны с группой животных, получавших только пэгГД при р<0,05. |
| Таблица 2 | ||||||
| Динамика показателей костномозгового кроветворения у мышей линии CBA\CaLac (×106 бедро) после введения дистиллированной воды (1), 2 мг/кг D-глюкуроновой кислоты (2) и 50 ЕД/кг пегилированной гиалуронидазы (пэгГД) и совместно D-глюкуроновую кислоту с пэгГД (4) на фоне моделирования цитостатической миелосупрессии, (Х±m) | ||||||
| Сроки исследования, сутки | Незрелые нейтрофильные гранулоциты | Зрелые нейтрофильные гранулоциты | Эозинофильные гранулоциты | Моноциты | Эритроидные клетки | |
| фон | 1,0±0,05 | 3,22±0,19 | 0,57±0,05 | 0,34±0,08 | 1,85±0,32 | |
| 3-е | 1 | 0,03±0,01* | 0,10±0,04* | 0 | 0,25±0,05 | 0,17±0,04* |
| 2 | 0,03±0,02* | 0,15±0,02* | 0 | 0,20±0,14 | 0,14±0,05* | |
| 3 | 0,14±0,02*# | 0,14±0,04* | 0 | 0,42±0,07 | 0,36±0,03*# | |
| 4 | 0,15±0,02*# | 0,17±0,03* | 0 | 0,51±0,03* | 0,44±0,02*#$ | |
| 5-е | 1 | 1,5±0,21* | 2,8±0,24* | 0,20±0,08 | 0,96±0,1* | 1,22±0,1 |
| 2 | 1,6±0,06* | 2,6±0,29* | 0,09±0,05* | 0,98±0,08* | 1,28±0,26 | |
| 3 | 2,31±0,02*# | 3,4±0,10*# | 0,22±0,05 | 1,34±0,15* | 1,99±0,32# | |
| 4 | 3,49±0,05*#$ | 5,7±0,37#$ | 0,2±0,20 | 2,55±0,25*#$ | 2,78±0,2*#$ | |
| 10-е | 1 | 1,6±0,08* | 4,5±0,3* | 0,56±0,25 | 0,40±0,09 | 1,4±0,04 |
| 2 | 0,80±0,41 | 4,7±0,5* | 0,58±0,10 | 0,61±0,17 | 1,39±0,03 | |
| 3 | 3,6±0,08*# | 6,41±0,4*# | 0,53±0,7 | 0,99±0,31 | 2,36±0,1*# | |
| 4 | 4,3±0,03*#$ | 7,32±0,08*#$ | 0,57±0,14 | 1,07±0,06*# | 3,4±0,07*#$ | |
| * - различия достоверны по отношению к фону при р<0,05; | ||||||
| # - различия достоверны по отношению к группе, получавшей дистиллированную воду на фоне введения циклофосфана при р<0,05; | ||||||
| $ - различия достоверны с группой животных, получавших только пэгГД при р<0,05. |
| Таблица 3 | |||||
| Показатели периферической крови у мышей линии CBA\CaLac после введения дистиллированной воды (1), 2 мг/кг D-глюкуроновой кислоты (2) и 50 ЕД/кг пегилированной гиалуронидазы (пэгГД) (3) и совместно D-глюкуроновую кислоту с пэгГД (4) на фоне моделирования цитостатической миелосупрессии, (Х±m) | |||||
| Сроки исследования, сутки | Ретикулоциты, в промиллях | Палочкоядерные нейтрофилы, Г/л | Сегментоядерные нейтрофилы, Г/л | Тромбоциты, Т/л | |
| Фон | 9,3±0,2 | 0,30±0,02 | 2,34±0,07 | 654,7±23,4 | |
| 3-е | 1 | 10,4±0,14* | 0,01±0,01* | 0,11±0,02* | 544,60±31,1* |
| 2 | 10,89±0,33* | 0,01±0,01* | 0,14±0,01* | 584,6±36,7 | |
| 3 | 14,7±0,5*# | 0,01±0,01* | 0,19±0,02* | 507,9±14,7* | |
| 4 | 16,8±0,59*#$ | 0,01±0,01* | 0,16±0,02* | 577,1±23,0 | |
| 3-е | 1 | 23,7±1,1* | 0,06±0,04* | 1,5±0,43* | 477,8±6,4* |
| 2 | 22,6±1,3* | 0,08±0,03* | 1,62±0,29* | 493,0±37,9* | |
| 3 | 35,7±0,9*# | 0,33±0,04# | 2,8±0,26# | 487,3±17,8* | |
| 4 | 42,4±2,08*#$ | 0,94±0,21*#$ | 3,71±0,11*#$ | 794,5±21,8*#$ | |
| 10-е | 1 | 16,2±1,0* | 1,5±0,2* | 4,23±0,53* | 708,4±17,1 |
| 2 | 15,7±0,7* | 1,72±0,1* | 4,37±0,7* | 869,6±94,3* | |
| 3 | 17,4±0,7* | 1,6±0,3* | 6,3±0,12*# | 1084,7±42,8*# | |
| 4 | 20,1±0,9*#$ | 1,97±0,1* | 7,43±0,45*#$ | 1256,7±21,8*#$ | |
| * - различия достоверны по отношению к фону при р<0,05; | |||||
| # - различия достоверны по отношению к группе, получавшей дистиллированную воду на фоне введения циклофосфана при р<0,05; | |||||
| $ - различия достоверны с группой животных, получавших только пэгГД при р<0,05. |
Способ стимуляции миелопоэза, заключающийся во введении препарата пегилированной гиалуронидазы в дозе 50 ЕД/кг 1 раз в сутки в течение 2 дней, отличающийся тем, что дополнительно однократно внутривенно вводят препарат, содержащий D-глюкуроновую кислоту, в дозе 2 мг/кг.
