Сорбцинно-флуоресцентный способ определения доксициклина в лекарственных препаратах
Владельцы патента RU 2471184:
Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского" (RU)
Изобретение относится к аналитической химии применительно к экспресс-анализу лекарственных препаратов, преимущественно для обнаружения и количественного определения активнодействующего вещества. В способе определения содержания доксициклина в лекарственных препаратах, включающем пробоподготовку, осуществляют модификацию силикагеля, нанесенного на подложку, неионным ПАВ Бридж-35 с последующим добавлением пробы анализируемого раствора лекарственного препарата, о содержании судят по интенсивности окраски в зоне нанесения пробы, соответствующей интенсивности флуоресценции, определяемой с помощью видеоденситометра и компьютерной обработки на основе градуировочного графика, построенного в аналогичных условиях для стандартных растворов доксициклина. Достигается упрощение, ускорение и повышение эффективности анализа. 3 пр., 4 табл., 1 ил.
Изобретение относится к аналитической химии, конкретно к способу сорбционно-флуоресцентного определения доксициклина в лекарственных препаратах, и может быть использовано для экспресс-анализа лекарственных препаратов, преимущественно для определения количественного содержания активнодействующего вещества и его наличия.
Доксициклин относится к группе антибиотиков тетрациклинового ряда и широко используется в клинической практике. Для его определения используют различные методики, основанные на принципах вольтамперометрии, спектрофотометрии, люминесценции, тонкослойной и жидкостной хроматографии (Charoenraks Т., Palaharn S. Flow injection analysis of doxycycline or chlorotetracycline in pharmaceutical formulations with pulsed amperometric detection // Talanta. 2004. Vol.64, №5. P.1247-1252; Sunaric S. ML, Mitic S.S. Determination of doxycycline in pharmaceuticals based on its degradation by Cu(II)/H2O2 reagent in aqueous solution // Журнал аналитической химии. 2009. Vol.64, №3. P.248-253; Zhang Li-Wei, Luo Li. Спектрофлуориметрическое определение следовых количеств доксициклина с системой диэтил-O-β-циклодекстрин-доксициклин-Eu3+ // Chin. J. Anal. Chem. 2008. Vol.36, №11. P.1547-1550; Березкин В.Г. и др. Применение нового варианта капиллярной тонкослойной хроматографии для анализа антибиотиков группы тетрациклина // Сорбционные и хроматографические процессы. 2008. Т.8, вып.4. С.570-576; Fiori J., Grassigli G. HPLC-DAD and LC-ESI-MS analysis of doxycycline and related impurities in doxipan mix, a medicated premix for incorporation in medicated feedstuff // J. Pharm. and Biomed. Anal. 2005. Vol.37, №5. P.979-985).
Данные методы обладают высокой чувствительностью, но мало подходят для массового анализа, также к недостатку относится необходимость в дорогостоящем оборудовании и квалифицированном персонале.
Известен фармакопейный метод определения антибиотиков [Фирсов А.А., Алексеева М.Е., Кулешов С.У. // Хим.-фарм. журн. 1995. №3. С.24], который предполагает диффузию антибиотика в агар, содержащий питательную среду для микроорганизмов и сопоставление степени угнетения их роста испытуемым препаратом со стандартными растворами антибиотика. Минимальная определяемая концентрация составляет 0.05 мкг/мл.
Микробиологические способы широко используются на практике, просты и не требуют дорогостоящего оборудования. Однако они характеризуются длительностью анализа, зависимостью аналитического сигнала от свойств антибиотика (его растворимости, молярной массы и т.п.); не связанного с его биологической активностью, чувствительностью питательной среды к качеству агара.
Известен способ экспрессного определения антибиотиков в различных объектах биологическим методом (патент РФ №2188421, МПК G01N 33/48, опубликован 27.08.2002). Способ включает инкубацию тест-культуры совместно с пробой исследуемого объекта. В качестве тест-культуры берут высокочувствительные (предел обнаружения 0,0025 до 0,005 мкг/мл) к антибиотикам штаммы термофильных бактерий Bacillus licheniformis или Bacillus stearothermophilus с оптимумом роста при температуре 50-60°С и по отсутствию роста определяют наличие антибиотика в объекте.
Недостатком этого способа является использование дорогостоящих реагентов.
Наиболее близким по технической сущности является способ определения соединений тетроциклинового ряда, включая доксициклин, включающий пробоподготовку, модифицирование реагентом сорбента, нанесенного на подложку, и добавление к сорбенту анализируемой пробы (SU 1742713 A1, 23.06.1992).
Задачей изобретения является разработка сорбционно-флуоресцентного экспресс-метода определения доксициклина в лекарственных препаратах, исключающего использование дорогостоящих реагентов. Технический результат заключается в возрастании интенсивности собственной флуоресценции антибиотика. Кроме того, предлагаемый способ позволяет упростить методику определения при сокращении времени, необходимого для анализа и снижении его себестоимости.
Поставленная задача решается тем, что в способе определения содержания доксициклина в лекарственных препаратах, включающем пробоподготовку, модификацию реагентом сорбента, нанесенного на подложку, и добавление к сорбенту анализируемой пробы, согласно изобретению в качестве сорбента выбран силикагель, а в качестве реагента - неионный ПАВ Бридж-35 в количестве не менее 1.5 мкл 1·10-1М, определяют интенсивность флуоресценции в зоне нанесения пробы, по которой судят о содержании доксициклина на основе градуировочного графика, при этом объем исследуемого раствора выбран в диапазоне от 1.5-3.0 мкл.
Изобретение поясняется чертежом, на котором приведен градуировочный график определения доксициклина, где по оси абсцисс указан рС(ДЦ) - отрицательный логарифм концентрации доксициклина, М; а по оси ординат - RGB (G)-интенсивность флуоресценции доксициклина.
Способ реализуется следующим образом. В качестве пробы берут раствор лекарственного препарата. Если препарат в виде таблеток, то для приготовления раствора таблетки измельчают в ступке и растворяют в кислоте HCl. Полученный раствор наносят на силикагель, предварительно модифицированный неионным ПАВ, и измеряют интенсивность окраски RGB (G), обусловленной собственной флуоресценцией антибиотика, которую записывают с помощью видеоденситометра. В состав видеоденситометра входит осветительная камера (λ=365 нм), цветная видеокамера, платы ввода и захвата изображения, компьютер и программы расчета параметров RGB (G). В качестве основного цвета флуоресценции доксициклина является зеленый - RGB (G), который обусловлен собственной флуоресценцией доксициклина (λвозб=365 нм, λфл=540 нм). Для обработки полученного изображения использовалась программа Adobe Photoshop CS3 (цветовая модель RGB). Содержание доксициклина в лекарственном препарате определяют методом градуировочного графика.
Пример 1. Построение градуировочного графика зависимости интенсивности флуоресценции доксициклина RGB (G) от концентрации его в растворе.
Готовят стандартный раствор гидрохлорида доксициклина (фирмы «Fluka BioChemika», содержание основного вещества не менее 99,0%) 1.0·10-2 М в 0.01 М HCl, раствор неионного ПАВ - оксиэтилированного спирта Бридж-35 (фирмы «Acros», основного вещества не менее 99,0%) концентрации 1-10-1 М в бидистиллированной воде.
На пластины наносят на расстоянии 3 см друг от друга 0.5-5.0 мкл 1.0·10-1 М Бридж-35 и к ним добавляют 2.0 мкл 2·10-5-1·10-3 М раствора доксициклина. Интенсивность флуоресценции на пластинах силикагеля «Сорбфил АТСХ» измеряют с помощью видеоденситометра «Сорбфил» 02-29-50-01 (λ=365 нм) с привлечением компьютерной программы Adobe Photoshop CS3 (цветовая модель RGB). Содержание определяют по интенсивности флуоресценции RGB(G) (см. чертеж). В таблице 1 представлены некоторые метрологические характеристики предлагаемого способа определения доксициклина.
| Таблица 1 | |||
| Некоторые метрологические характеристики доксицикцина | |||
| Диапазон определяемых концентраций, М | Предел обнаружения, М | Уравнение градуировочного графика | r2 |
| 2·10-5-1·10-3 | 1·10-5 | у=15.9х+77,5 | 0.993 |
Пример 2. Определение оптимальной концентрации Бридж-35 из условия получения максимального аналитического сигнала.
На пластины наносят на расстоянии 3 см друг от друга 0.5-5.0 мкл 1.0·10-1 M Бридж-35, добавляют к ним 2.0 мкл 5·10-3 M раствора доксициклина, измеряют интенсивность флуоресценции доксициклина.
| Таблица 2 | |||||||
| Определение оптимальной концентрации Бридж-35 | |||||||
| п/№ | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| VБридж-35, мкл | 0,5 | 1,0 | 1,5 | 2,0 | 3,0 | 4,0 | 5,0 |
| RGB (G) | 15 | 20 | 29 | 27 | 29 | 27 | 30 |
Как видно из таблицы 2, при заявляемых концентрациях Бридж-35 наблюдается максимальная флуоресценция (п/№3-7), которая практически не изменяется в случае использования больших концентраций.
Пример 2. Определение необходимого объема анализируемого раствора.
На пластины наносят на расстоянии 3 см 1.5 мкл 1·10-1 М Бридж-35, добавляют различные объемы 0,5-5,0 мкл раствора доксициклина (1·10-2-1·10-3 М), оставляя постоянным количество вещества, измеряют интенсивность флуоресценции доксициклина RGB (G).
| Таблица 3 | |||||||
| Определение необходимого объема анализируемого раствора | |||||||
| п/№ | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| Vдоксицикл, МКЛ | 0,5 | 1,0 | 1,5 | 2,0 | 3,0 | 4,0 | 5,0 |
| Сдоксицикл, М | 1·10-2 | 5.0·10-3 | 3.3·10-3 | 2.5·10-3 | 1.7·10-3 | 1.3·10-3 | 1·10-3 |
| υ, кол-во в-ва, моль | 5·10-12 | 5·10-12 | 5·10-12 | 5·10-12 | 5·10-12 | 5·10-12 | 5·10-12 |
| RGB (G) | 15 | 20 | 30 | 27 | 29 | 20 | 10 |
Где V - объем раствора, мкл; С - концентрация, М; υ - количество вещества, моль.
Установлено, что максимальная интенсивность флуоресценции достигается при использовании объема анализируемого раствора доксициклина от 1.5 до 3.0 мкл (п/№3-5), которая уменьшается при использовании больших объемов раствора антибиотика (п/№6, 7).
Пример 3. Определение доксициклина в лекарственном препарате «Доксициклин».
20 таблеток препарата «Доксициклин» (фирма ОАО «Синтез») измельчали в ступке и 0,35 г полученного порошка растворяли в 25 мл 0,01 М HCL, с помощью бумажного фильтра (синяя лента) отделяли нерастворившуюся часть лекарственного препарата, 1.0-2.0 мл фильтрата помещали в мерную колбу емкостью 25 мл и разбавляли дистиллированной водой до метки. 2 мкл полученного раствора наносили на силикагель, предварительно модифицированный 1.5 мкл 1·10-1 М Бридж-35 и измеряли интенсивность флуоресценции доксициклина. Содержание доксициклина определяли по градуировочному графику и рассчитывали по формуле:
, где а - концентрация доксициклина, найденная по градуировочному графику, М; V - объем исследуемого раствора, взятого для анализа, мл.
Результаты определения доксициклина в фармпрепарате «Доксициклин» представлены в таблице 4. Правильность контролировали методом стандартной добавки, погрешность определения Sr не превышала 0,48.
| Таблица 4 | |||
| Результаты определения доксициклина в фармацевтическом препарате «Доксициклин» (n=6, p=0.95) | |||
| № пробы | Аттестованное содержание, г | Хср+ΔХ, г | Sr |
| 1 | 0,1 | 0,13±0,05 | 0,38 |
| 2 | 0,13±0,06 | 0,46 |
Sr - относительное стандартное отклонение, Sr=S/χ, где S - стандартное отклонение, равное S=∑(χi-χ)2/(n-1)1/2, χi - единичный результат определения, χ - средний результат, n - число определений, p - доверительная вероятность.
Предлагаемый способ позволяет отказаться от дорогостоящего оборудования и привлечения квалифицированного персонала.
Способ определения содержания доксициклина в лекарственных препаратах, включающий пробоподготовку, модификацию реагентом сорбента, нанесенного на подложку, и добавление к сорбенту анализируемой пробы, отличающийся тем, что в качестве сорбента выбран силикагель, а в качестве реагента - неионный ПАВ Бридж 35 в количестве не менее 1.5 мкл 1·10-1 М, определяют интенсивность флуоресценции в зоне нанесения пробы, по которой судят о содержании доксициклина на основе градуировочного графика, при этом объем исследуемого раствора выбран в диапазоне 1.5-3.0 мкл.
