Комплекс, образованный полисахаридом и нвр

Настоящее изобретение относится к медицине и описывает комплекс, образованный из полисахарида, в частности из декстрана, и из гепаринсвязывающего белка, причем вышеуказанный полисахарид образован за счет гликозидных связей типа (1,6), и/или (1,4), и/или (1,3), и/или (1,2) и функционализирован с помощью по меньшей мере одного солеобразующего или превращенного в соль производного триптофана. Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, включающей комплекс согласно изобретению. Посредством применения комплекса достигается улучшенная растворимость и стабильность гепарин-связывающих белков. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 12 пр., 2 табл.

 

Настоящее изобретение относится к композиции из терапевтических белков и, более конкретно, к композиции из белков, связывающихся с гепарином, так называемых гепаринсвязывающих белков, НВР, которые ассоциируются, in vivo, с гепарином в форме комплекса, что позволяет стабилизировать и сохранить их активность in vivo.

Гепарин представляет собой природный полисахарид, обладающий карбоксилатными и сульфатными функциональными группами, суммарный заряд которого является отрицательным (анион). Однако этот полисахарид известен своей ангикоагулирующей активностью, так как он принимает активное участие в образовании комплекса между тромбином и антитромбином III, и эта антикоагулирующая активность несовместима с терапевтическим использованием, например, при лечениях в случае заживления, регуляции роста, костной реконструкции.

Некоторые из этих HBP составляют объект фармацевтической разработки. Однако эти белки известны тем, что являются физически (агрегация) и химически (ферментативная или химическая деструкция) нестабильными. Эта нестабильность может проявляться в композициях и/или в месте введения. Она может провоцировать иммунологические реакции или потерю эффективности. Для компенсации потери активности принимают такие меры, как увеличение дозирови или регулирование частоты введения. Они являются неудовлетворительными, в частности, из-за высокой стоимости этих белков.

Например, фирмой Genentech получена композиция на основе VEGF для заживления язв диабетической стопы. Было осуществлено первое клиническое исследование, в случае которого проведение лечения осуществлялось каждые два дня. Второе исследование было реализовано при осуществлении ежедневного введения, вероятно, как мера в отношении слишком короткой продолжительности действия VEGF в случае применения каждые два дня.

Кроме того, было показано, что возможно образование комплексов между фактором роста и полимером в целях его стабилизации, увеличения его растворимости и/или повышения его активности.

Так, в патенте Франции 0509803 на имя заявителя показано, что образование комплекса между PDGF-BB в его короткой форме и полимером позволяет, в частности, увеличивать растворимость этого очень гидрофобного белка.

Однако PDGF-BB в его короткой форме прикрепляется к гепарину в 100 раз меньше, чем PDGF-AA, Lustig F. et al, Journal of molecular recognition, 12, 112-120 (1999), следовательно, не может рассматриваться как фактор роста, относящийся к семейству HBP.

В случае FGF, известного тем, что он является относительно гидрофильным, показано, что образование комплекса с полимером может благоприятствовать его клеточной активности, Rouet et al, Journal of biomedical materials research, 78A, 792-797 (2006), однако, используемые полимеры были сульфатированными, так как были функционализированы с помощью бензиламинсульфата, и, следовательно, обладали антикоагулирующей активностью, несовместимой с фармацевтической композицией.

Logeart-Avramoglou D. et al, в статье в Biomedical Pharmacology, 63, 129-137 (2002), также описывают декстраны, модифицированные бензиламином и/или сульфатами. Эти полимеры в растворе образуют комплексы с TGF-β 1, как показано в опыте по взаимодействию путем гель-электрофореза. Однако несульфатированные полимеры не показывают реального взаимодействия даже при соотношениях выше 2000. В случае сульфатированных полимеров, показано взаимодействие для глубоко сульфатированных полимеров, которые обладают антикоагулирующими свойствами.

Кроме того, также известно, что бензиламин может обладать некоторой токсичностью и может наносить вред биосовместимости полимеров, описанных в двух вышеуказанных патентах.

Галеновая композиция на основе белков для терапевтической цели должна обязательно отвечать требованиям в отношении безвредности эксципиентов, и, для достижения выполнения этих требований, необходимо использовать соединения, которые являются биосовместимыми, однако, также ограничивать их количество по отношению к действующему началу.

HBP относятся к восьми семействам белков, они имеют очень различные размеры, биохимические свойства и активности, однако они все способны ассоциироваться с гепарином в форме комплекса, Bernfield M. et al, Annu. Rev. Biochem., 68, 729-777 (1999).

Среди них находятся белки, принадлежащие, в частности, к следующим семействам:

- гормоны,

- факторы роста.

Эти различные семейства могут быть определены следующим образом.

Под гормонами понимают белки-посредники, продуцируемые эндокринной системой. Эти белки оказывают затем воздействие на расстоянии, после того как переносятся в систему организма кровью или лимфой или поступают в нее извне. Среди гормонов находится гормон роста (hGH: human growth hormone) и паращитовидный гормон (РТН: parathyroid hormone).

Под факторами роста понимают белки, обычно продуцируемые в организме, стимулирующие пролиферацию клеток или их дифференцировку. Среди них находятся белки, такие как трансформирующие факторы роста β1 и β2 (TGF-β: transforming growth factor beta), аналогичный инсулину фактор роста типа 2 (IGF-2: Insulin-like growth factor 2 [инсулиноподобный фактор роста]), фактор роста, связывающий гепарин и аналогичный эпидермическому фактору роста (HB-EGF: Heparin Binding EGF-like Growth Factor), факторы роста фибробластов типа 1-14 (FGF: fibroblast growth factors), фактор роста кератиноцитов (KGF: Keratinocyte Growth Factor), фактор роста нервов бета (NGF-beta: Nerve Growth Factor beta), фактор роста соединительной ткани (CTGF: Connective Tissue Growth Factor), плацентарный фактор роста (PlGF: Placental Growth Factor), R-спондины 1-4 и факторы роста васкулярного эндотелия А и В (VEGF: Vascular Endothelial Growth Factors).

Все описанные комплексы получают с полимерами, которые имеют структурное или биологическое сходство с гепарином.

Решаемой согласно настоящему изобретению задачей является идентификация очень ограниченного семейства биосовместимых полисахаридов, способных образовывать комплексы с HBP, в целях, кроме того, их стабилизации и увеличения их растворимости, так, чтобы этот полимер не обладал биологической активностью в отношении антикоагуляции гепарина.

Кроме того, обнаружено, что, для увеличения аффинности полисахарида к белкам и его селективности по отношению к HBP, нет необходимости увеличивать еще амфифильность полимера, в противоположность решению, указанному в заявке на патент Франции 0509803.

Еще, для уравновешивания слишком значительной гидрофобности, решение, изложенное в вышецитированной заявке на патент, состоит в прививке гидрофильных групп Х или Y к полисахаридным цепям, кроме гидрофобных групп.

Эти результаты являются тем более неожиданными, что за счет прививки солеобразующей или превращенной в соль гидрофобной группы, такой как триптофановый остаток, который обладает кислотной функциональной группой, увеличивают аффинность полисахарида к белку и селективность по отношению к HBP, без уменьшения числа карбоксильных функциональных групп исходного полисахарида.

За счет выбора этих заместителей значительно возрастает селективность по отношению к HBP.

Настоящее изобретение, следовательно, относится к применению полисахарида, замещенного триптофаном или производным триптофана, причем вышеуказанный триптофан или производное триптофана является солеобразующим или превращенным в соль, для стабилизации HBP.

Настоящее изобретение, более конкретно, относится к применению вышеуказанного полисахарида для получения фармацевтической композиции на основе стабильных HBP.

Оно также относится к комплексу, образованному полисахаридом и НВР.

Полисахариды согласно изобретению образованы за счет гликозидных связей типа (1,6), и/или (1,4), и/или (1,3), и/или (1,2). Они могут быть нейтральными, то есть не несущими функциональные кислотные группы, или анионными, то есть несущими функциональные кислотные группы.

Они функционализированы с помощью по меньшей мере одного остатка триптофана или производного триптофана, обозначаемого Trp, причем:

- вышеуказанное производное триптофана привито или связано с полисахаридами за счет связывания с кислотной группой, причем вышеуказанная кислотная группа может быть кислотной группой анионного полисахарида и/или кислотной группой, которую несет связывающий фрагмент R, связанный с полисахаридом через группу F, причем вышеуказанная группа F происходит от связывания между связывающим фрагментом R и группой -ОН нейтрального или анионного полисахарида,

- F означает сложноэфирную группу, группу сложного тиоэфира, амидную группу, карбонатную группу, карбаматную группу, простую эфирную группу, группу простого тиоэфира или аминогруппу,

- R представляет собой цепь, включающую от 1 до 18 атомов углерода, необязательно разветвленную и/или ненасыщенную, включающую один или несколько гетероатомов, таких как О, N и/или S, и имеющую по меньшей мере одну кислотную группу,

- Trp означает остаток триптофана или производного триптофана, L или D, получаемый за счет связывания между аминогруппой триптофана и по меньшей мере одной кислотной группой, которую несет группа R, и/или кислотной группой, которую несет анионный полисахарид, причем вышеуказанный триптофан или производное триптофана является солеобразующим или превращенным в соль.

Согласно одному варианту осуществления, Trp представляет собой остаток триптофана или производного триптофана конфигурации D.

Согласно одному варианту осуществления, Trp представляет собой остаток триптофана или производного триптофана конфигурации L.

НВР выбирают из группы, состоящей из:

- гормонов, таких как гормон роста (hGH: human growth hormone) или паращитовидный гормон (РТН: parathyroid hormone);

- факторов роста, таких как белки, такие как трансформирующие факторы роста β1 и β2 (TGF-β: transforming growth factor beta), аналогичный инсулину фактор роста типа 2 (IGF-2: Insulin-like growth factor 2), фактор роста, связывающий гепарин и аналогичный эпидермическому фактору роста (HB-EGF: Heparin Binding EGF-like Growth Factor), факторы роста фибробластов типа 1-14 (FGF: fibroblast growth factors), фактор роста кератиноцитов (KGF: Keratinocyte Growth Factor), фактор роста нервов β (NGF-β: Nerve Growth Factor β), фактор роста соединительной ткани (CTGF: Connective Tissue Growth Factor), плацентарный фактор роста (PlGF: Placental Growth Factor), R-спондины 1-4 и факторы роста васкулярного эндотелия А и В (VEGF: Vascular Endothelial Growth Factors).

Согласно изобретению, функционализированные полисахариды могут отвечать следующим общим формулам:

где:

- F, происходящий от связывания между связывающим фрагментом R и группой -ОН нейтрального или анионного полисахарида, означает сложноэфирную группу, группу сложного тиоэфира, амидную группу, карбонатную группу, карбаматную группу, простую эфирную группу, группу простого тиоэфира или аминогруппу,

- R означает цепь, включающую от 1 до 18 атомов углерода, необязательно разветвленную и/или ненасыщенную, включающую один или несколько гетероатомов, таких как О, N и/или S, и имеющую по меньшей мере одну кислотную группу,

- Trp означает остаток производного триптофана, L или D, получаемый за счет связывания между аминогруппой триптофана или производного триптофана и по меньшей мере одной кислотной группой, которую несет группа R, и/или кислотной группой, которую несет анионный полисахарид, причем вышеуказанный триптофан или производное триптофана является солеобразующим или превращенным в соль,

- n означает мольную долю групп R, замещенных с помощью Trp, и составляет от 0,2 до 0,7,

- о означает мольную долю кислотных групп замещенных с помощью Trp полисахаридов и составляет от 0,2 до 0,7,

- i означает мольную долю кислотных групп, которые несет группа R, на сахаридную единицу, и составляет от 0 до 2,

- j означает мольную долю кислотных групп, которые несет анионный полисахарид, на сахаридную единицу, и составляет от 0 до 1,

- (i+j) означает мольную долю кислотных групп на сахаридную единицу и составляет от 0,5 до 2,

- когда R не является замещенным с помощью Trp, тогда кислотная или кислотные группы группы R являются карбоксилатами с катионом щелочного металла, предпочтительно Na⁺ или K⁺,

- когда полисахаридом является анионный полисахарид, когда кислотная группа или кислотные группы полисахарида не являются замещенными с помощью Trp, тогда они являются превращенными в соль за счет катиона щелочного металла, предпочтительно Na или K,

- причем вышеуказанные полисахариды имеют нейтральное значение рН.

Согласно одному варианту осуществления, F означает сложный эфир, карбонат, карбамат или простой эфир.

Согласно одному варианту осуществления, полисахарид образован в большинстве за счет гликозидных связей типа (1,6).

Согласно одному варианту осуществления, полисахарид, образованный в большинстве за счет гликозидных связей типа (1,6), представляет собой декстран.

Согласно одному варианту осуществления, полисахарид образован в большинстве за счет гликозидных связей типа (1,4).

Согласно одному варианту осуществления, полисахарид, образованный в большинстве за счет гликозидных связей типа (1,4), выбирают из группы, состоящей из пуллулана, альгината, гиалуронана, ксилана, галактуронана или водорастворимой целлюлозы.

Согласно одному варианту осуществления, полисахарид представляет собой пуллулан.

Согласно одному варианту осуществления, полисахарид представляет собой альгинат.

Согласно одному варианту осуществления, полисахарид представляет собой гиалуронан.

Согласно одному варианту осуществления, полисахарид представляет собой ксилан.

Согласно одному варианту осуществления, полисахарид представляет собой галактуронан.

Согласно одному варианту осуществления, полисахарид представляет собой водорастворимую целлюлозу.

Согласно одному варианту осуществления, полисахарид образован в большинстве за счет гликозидных связей типа (1,3).

Согласно одному варианту осуществления, полисахарид, образованный в большинстве за счет гликозидных связей типа (1,3), представляет собой курдлан.

Согласно одному варианту осуществления, полисахарид образован в большинстве за счет гликозидных связей типа (1,2).

Согласно одному варианту осуществления, полисахарид, образованный в большинстве за счет гликозидных связей типа (1,2,), представляет собой инулин.

Согласно одному варианту осуществления, полисахарид образован в большинстве за счет гликозидных связей типа (1,4) и (1,3).

Согласно одному варианту осуществления, полисахарид, образованный в большинстве из гликозидных связей типа (1,4) и (1,3), представляет собой глюкан.

Согласно одному варианту осуществления, полисахарид образован в большинстве за счет гликозидных связей типа (1,4) и (1,3) и (1,2).

Согласно одному варианту осуществления, полисахарид, образованный в большинстве за счет гликозидных связей типа (1,4) и (1,3) и (1,2), представляет собой маннан.

Согласно одному варианту осуществления, полисахарид согласно изобретению отличается тем, что группу R выбирают из следующих групп:

или их солей с катионами щелочных металлов.

Согласно одному варианту осуществления, полисахарид согласно изобретению отличается тем, что триптофан или производное триптофана выбирают из группы, состоящей из триптофана, триптофанола, триптофанамида, 2-индолэтиламина и их солей с катионом щелочного металла.

Этот заместитель на основе триптофана или производного триптофана представляет собой солеобразующий или превращенный в соль заместитель, то есть, он обладает по меньшей мере одной гидрофильной, анионной или катионной, группой, а именно кислотной группой, спиртовой группой или аминогруппой, способной образовывать карбоксилаты, алкоголяты или соли аминов.

Полисахарид может иметь степень полимеризации m, составляющую от 10 до 10000.

Согласно одному варианту осуществления, полисахарид имеет степень полимеризации m, составляющую от 10 до 1000.

Согласно одному другому варианту осуществления, полисахарид имеет степень полимеризации m, составляющую от 10 до 500.

Согласно одному варианту осуществления, комплекс согласно изобретению отличается тем, что массовое соотношение полисахарид/НВР составляет от 0,5 до 500, предпочтительно от 1 до 300.

Согласно одному варианту осуществления, комплекс согласно изобретению отличается тем, что массовое соотношение полисахарид/НВР составляет от 0,5 до 100, предпочтительно от 1 до 10.

Согласно одному варианту осуществления, комплекс согласно изобретению отличается тем, что НВР выбирают из группы, состоящей из гормонов, таких как гормон роста (hGH: human growth hormone) или паращитовидный гормон (РТН: parathyroid hormone).

Согласно одному варианту осуществления, комплекс согласно изобретению отличается тем, что НВР выбирают из группы факторов роста, таких как белки, такие как трансформирующие факторы роста β1 и β2 (TGF-β: transforming growth factor beta), аналогичный инсулину фактор роста типа 2 (IGF-2: Insulin-like growth factor 2), фактор роста, связывающий гепарин и аналогичный эпидермическому фактору роста (HB-EGF: Heparin Binding EGF-like Growth Factor), факторы роста фибробластов типа 1-14 (FGF: fibroblast growth factors), фактор роста кератиноцитов (KGF: Keratinocyte Growth Factor), фактор роста нервов β (NGF-β: Nerve Growth Factor β), фактор роста соединительной ткани (CTGF: Connective Tissue Growth Factor), плацентарный фактор роста (PlGF: Placental Growth Factor), R-спондины 1-4 и факторы роста васкулярного эндотелия А и В (VEGF: Vascular Endothelial Growth Factors).

Данное изобретение также относится к способу получения вышеуказанных полисахаридов путем прививки производного триптофана, такого, как указано выше, к нейтральному полисахариду за счет связывания между аминогруппой триптофана или производного триптофана и кислотной группой, получаемой за счет прививки группы R, несущей по меньшей мере одну кислотную группу, такой, как указано выше, к спиртовой группе полисахарида, для получения полисахаридов формулы (I), в которой j=0.

Согласно одному варианту осуществления, полисахариды согласно изобретению получают путем прививки производного триптофана, такого, как указано выше, к кислотной группе анионного полисахарида за счет связывания между аминогруппой триптофана или производного триптофана и кислотной группой, которую несет анионный полисахарид, для получения полисахаридов формулы (I), в которой i=0.

Согласно одному варианту осуществления, когда полисахарид представляет собой анионный полисахарид, группы R могут быть привиты к спиртовым группам полисахарида, и может быть осуществлена прививка триптофана или производного триптофана:

- либо селективно, к кислотным группам групп R, для получения полисахаридов формулы (I), в которой о=0, за счет реакций защиты/удаления защиты, хорошо известных специалисту в данной области,

- либо одновременно к двум типам кислотных групп для получения полисахаридов формулы (I), в которой n>0 и o>0.

Согласно всем вышеописанным вариантам осуществления, за реакциями связывания следуют реакции нейтрализации кислотных групп, непрореагировавших с производным триптофана, путем солеобразования при использовании способов, хорошо известных специалисту в данной области, для получения соли с катионом щелочного металла, предпочтительно, Na или K.

Данное изобретение также относится к фармацевтической композиции, включающей комплекс согласно изобретению, такой, как описано выше.

Данное изобретение также относится к фармацевтической композиции согласно изобретению, такой, как указано выше, отличающейся тем, что ее получают путем высушивания и/или лиофилизации.

НВР может быть экзогенным, то есть, что он вносится за счет композиции согласно изобретению. Он может быть также эндогенным, например, факторы роста, которые секретируются в ране во время первой фазы заживления и которые могут быть стабилизированы за счет образования комплекса согласно изобретению in vivo в ране.

В зависимости от имеющихся в виду патологий, фармацевтическая композиция предназначена для локального или системного лечения.

В случае локальных и системных высвобождений, предусматриваемыми способами введения являются способы введения внутривенным, подкожным, интрадермальным, трансдермальным, внутримышечным, пероральным, назальным, вагинальным, глазным, буккальным, пульмонарным и т.д. путем.

Фармацевтические композиции согласно изобретению находятся либо в жидкой форме, в виде водного раствора, либо в форме порошка, имплантата или пленки. Они включают, кроме того, классические фармацевтические эксципиенты, хорошо известные специалисту в данной области.

В зависимости от патологий и способов введения, фармацевтические композиции могут преимущественно включать, кроме того, эксципиенты, позволяющие получать их в форме геля, губки, инъецируемого раствора, раствора для питья, лиофилизата и т.д.

Данное изобретение также относится к фармацевтической композиции согласно изобретению, такой, как описано выше, отличающейся тем, что ее вводят в форме стента, пленки или «покрытия» имплантируемых материалов, имплантата.

ПРИМЕРЫ

А - Синтез полимеров

Пример 1

Синтез декстранметилкарбоксилата натрия, модифицированного натриевой солью триптофана, полимер 1

70 г (или 1295 ммоль гидроксильных групп) декстрана со среднемассовой молекулярной массой около 40 кг/моль (Fluka) растворяют в воде при концентрации 42 г/л. К этому раствору добавляют 130 мл 10н раствора NaOH (1295 ммоль NaOH). Смесь доводят до температуры 35°С, затем добавляют 201 г (1727 ммоль) хлорацетата натрия. Температуру реакционной смеси доводят до 60°С со скоростью 0,5°С в минуту, после чего выдерживают при температуре 60°С в течение 100 минут. Реакционную среду разбавляют с помощью 200 мл воды, нейтрализуют уксусной кислотой и очищают путем ультрафильтрации при использовании мембраны PES 5 кДа против 6 объемов воды. Конечный раствор дозируют по сухому экстракту для определения концентрации полимера; затем дозируют по содержанию кислота/основание в смеси вода/ацетон в соотношении 50/50 (об./об.) для определения степени замещения метилкарбоксилатами.

По сухому экстракту: [полимер] = 51,5 мг/г.

По содержанию кислота/основание: степень замещения гидроксильных групп метилкарбоксилатными группами составляет 1,04 на сахаридное звено.

Раствор декстранметилкарбоксилата натрия пропускают через смолу Purolite (анионная) для получения декстранметилкарбоновой кислоты, которую затем лиофилизируют в течение 18 часов.

14,5 г Декстранметилкарбоновой кислоты (или 66 ммоль кислотных групп метилкарбоновой кислоты) растворяют в диметилформамиде (ДМФА) в концентрации 57 г/л, затем охлаждают до температуры 0°С. После этого добавляют 6,67 г (66 ммоль) N-метилморфолина (NMM) и 7,15 г (66 ммоль) EtOCOCl. После протекания реакции в течение 10 минут добавляют 6,06 г (30 ммоль) TrpOH. Среду затем нагревают до температуры 10°С и выдерживают при этой температуре в течение 30 минут. Затем добавляют раствор имидазола с концентрацией 340 г/л (8,97 г, 132 ммоль) в воде, реакционную среду кратковременно нагревают при температуре 30°С. Реакционную среду затем разбавляют 70 мл воды, после этого фильтруют через фильтр из пористого стекла № 1, потом через фильтр из пористого стекла № 3, тогда она становится прозрачной. Раствор подвергают ультрафильтрации при использовании мембраны PES 10 кДа против 10 объемов 0,9 %-ного раствора NaCl, потом 6 объемов воды. Концентрацию раствора полимера 1 определяют по сухому экстракту. Одну часть раствора лиофилизируют и анализируют путем ¹Н-ЯМР в D₂O для определения степени замещения (DS) привитым триптофаном.

По сухому экстракту: [полимер] = 54 мг/г.

По ¹Н-ЯМР: мольная доля модифицированных триптофаном кислот составляет 0,38.

Пример 2

Синтез пуллуланметилкарбоксилата натрия, модифицированного натриевой солью триптофана, полимер 2

8 г (или 148 ммоль гидроксильных групп) пуллулана со среднемассовой молекулярной массой около 100 кг/моль (Fluka) растворяют в воде при концентрации 42 г/л. К этому раствору добавляют 15 мл 10н раствора NaOH (148 ммоль NaOH). Смесь доводят до температуры 35°С, затем добавляют 23 г (198 ммоль) хлорацетата натрия. Температуру реакционной смеси доводят до 60°С со скоростью 0,5°С в минуту, после чего выдерживают при температуре 60°С в течение 100 минут. Реакционную среду разбавляют с помощью 200 мл воды, нейтрализуют уксусной кислотой и очищают путем ультрафильтрации при использовании мембраны PES 5 кДа против 6 объемов воды. Конечный раствор дозируют по сухому экстракту для определения концентрации полимера; затем дозируют по содержанию кислота/основание в смеси вода/ацетон в соотношении 50/50 (об./об.) для определения степени замещения метилкарбоксилатами.

По сухому экстракту: [полимер] = 31,5 мг/г.

По содержанию кислота/основание: степень замещения гидроксильных групп метилкарбоксилатными группами составляет 1,17 на сахаридное звено.

Раствор пуллуланметилкарбоксилата натрия пропускают через смолу Purolite (анионная) для получения пуллуланметилкарбоновой кислоты, которую затем лиофилизируют в течение 18 часов.

3,51 г пуллуланметилкарбоновой кислоты (или 18 ммоль кислотных карбоксиметильных групп) растворяют в диметилформамиде (ДМФА) в концентрации 57 г/л, затем охлаждают до температуры 0°С. После этого добавляют 1,81 г (18 ммоль) N-метилморфолина (NMM) и 1,94 г (18 ммоль) EtOCOCl. После протекания реакции в течение 10 минут, добавляют 1,40 г (7 ммоль) TrpOH. Среду затем нагревают до температуры 10°С и выдерживают при этой температуре в течение 30 минут. Затем добавляют раствор имидазола (2,43 г, 36 ммоль) с концентрацией 340 г/л в воде, реакционную среду кратковременно нагревают при температуре 30°С. Реакционную среду затем разбавляют с помощью 70 мл воды, после этого фильтруют через фильтр из пористого стекла № 1, потом через фильтр из пористого стекла № 3, тогда она становится прозрачной. Раствор подвергают ультрафильтрации при использовании мембраны PES 10 кДа против 10 объемов 0,9 %-ного раствора NaCl, потом 6 объемов воды. Концентрацию раствора полимера 2 определяют по сухому экстракту. Одну часть раствора лиофилизируют и анализируют путем ¹Н-ЯМР в D₂O для определения степени замещения привитым триптофаном.

По сухому экстракту: [полимер] = 17,2 мг/г.

По ¹Н-ЯМР: мольная доля модифицированных триптофаном кислот составляет 0,40.

Пример 3

Синтез декстранметилкарбоксилата натрия, модифицированного этиловым эфиром триптофана, полимер 3

Полимер 3 представляет собой декстранметилкарбоксилат натрия, модифицированный этиловым эфиром L-триптофана, получаемый из декстрана со среднемассовой молекулярной массой 40 кг/моль (Pharmacosmos) согласно способу, описанному в примере 1, используя этиловый эфир L-триптофана вместо натриевой соли L-триптофана.

Пример 4

Синтез декстранметилкарбоксилата натрия, модифицированного этиловым эфиром фенилаланина, полимер 4

Полимер 4 представляет собой декстранметилкарбоксилат натрия, модифицированный этиловым эфиром L-фенилаланина, получаемый из декстрана со среднемассовой молекулярной массой 40 кг/моль (Pharmacosmos) согласно способу, описанному в примере 1, используя этиловый эфир L-фенилаланина вместо натриевой соли L-триптофана.

В - Выявление аффинности полимера к белку, связывающемуся с гепарином, путем коэлектрофореза

Пример 3: соотношение белок/полимер 1/500

Получение комплекса белок/полимер при соотношении 1/500

1,5 мкг белка добавляют к 750 мкг полимера в 15 мкл буфера для миграции 10× (трис-ацетат, рН=7). Раствор дополняют до 150 мкл с помощью Н₂О. Этот раствор инкубируют при комнатной температуре в течение 20 минут. 5 мкл этого второго раствора, содержащего 50 нг белка и 25 нг полимера, разводят в 5 мкл буфера для миграции 1×. В качестве контроля готовят подобные растворы, содержащие только белок или полимер.

Выявление образования комплекса между белком и полимером

Раствор, содержащий белок/полимер, (10 мкл) смешивают с 3 мкл буфера для нагрузки (глицерин, трис-ацетат и бромфеноловый синий в воде). Эти 13 мкл, содержащие 50 нг белка и 25 нг полимера, помещают в лунку с 0,8%-ным агарозным гелем. Контрольные растворы (содержащие отдельно белок или полимер) помещают подобным образом. Кювету для электрофореза закрывают, и генератор устанавливают при значении 30 В. Миграция продолжается в течение 1 часа.

После миграции гель переносят на мембрану из PVDF за счет капиллярного эффекта с помощью системы Apelex в течение 2 часов при комнатной температуре. Мембрану затем насыщают обезжиренным молоком в течение 1 часа при комнатной температуре, затем инкубируют с первичными кроличьими антителами, направленными против белка (в течение ночи при температуре 4°С), и, наконец, инкубируют с вторичными кроличьими антителами против козьего HRP (в течение 1 часа при комнатной температуре). Проявление устанавливают по реакции HRP в отношении Opti-4CN. Проявление прекращают путем промывания в воде, когда окрашивание является достаточным, так как продукт реакции поглощает в видимой части спектра.

Когда белок является одним или не образует комплекс с полимером, он может мигрировать, если он является анионным, или оставаться в месте внесения, если он является катионным. Белок тогда детектируют либо на уровне лунок для нагрузки, либо в виде единственного пятна на расстоянии 0,3-0,4 см от места внесения. Когда белок образует комплекс с полимером, комплекс более сильно захватывается нагрузками полимера и перемещается к аноду. Его детектируют в виде единственного пятна на расстоянии 0,7 см от места внесения.

Результаты, полученные при использовании полимера 1, получаемого в примере 1, полимера 2, получаемого в примере 2, и белков, выбираемых из групп, состоящих из адгезивных клеточных молекул; гормонов; коагулирующих белков; связывающих гепарин факторов роста; белков, связывающихся с факторами роста; цитокинов и белков метаболизма липидов, представлены в нижеприведенной таблице I.

Результаты, полученные при использовании несвязывающего гепарин белка (IGF-1) и полимеров 1 и 2, полученных согласно примеру 1 и примеру 2, и результаты, полученные при использовании гепаринсвязывающих белков, указанных выше, и незамещенного триптофаном полимера, также представлены в нижеприведенной таблице I в качестве проверочного примера.

Таблица I
Семейство белков	Белок	Полимеры
Полимер 1 (замещенный триптофаном декстран-метил-карбоксилат)	Полимер 2 (замещенный триптофаном пуллулан-метил-карбоксилат)	Проверочный пример 1 (декстран-метил-карбоксилат)
Гормоны	hGH	+	+	-
Фактор роста, связывающий гепарин	VEGF 165	+	+	-
	FGF-2	+	+	-
NGF-betaβ	+	+	-
Фактор роста, не связывающий гепарин	IGF 1	-	-	-

Полученные результаты показывают, что замещенный триптофаном декстранметилкарбоксилат, полимер 1, (пример 1) или замещенный трипофаном пуллуланметилкарбоксилат, полимер 2, (пример 2) могут образовывать комплекс с белками, которые связывают гепарин, тогда как незамещенный декстранметилкарбоксилат (проверочный пример 1) не может его образовывать.

Полученные результаты также показывают, что замещенный или нет триптофаном декстранметилкарбоксилат (пример 1 и проверочный пример 1) не образуют комплекс с факторами роста, не фиксирующих гепарин.

Пример 4: соотношение белок/полимер 1/1

Получение комплекса белок/полимер при соотношении 1/1

1,5 мкг белка добавляют к 1,5 мкг полимера в 3 мкл буфера для миграции 10× (трис-ацетат, рН=7). Раствор дополняют до 60 мкл с помощью Н₂О. Этот раствор инкубируют при комнатной температуре в течение 20 минут. 2 мкл этого второго раствора, содержащего 50 нг белка и 50 нг полимера, разводят в 8 мкл буфера для миграции 1×.

Выявление образования комплекса между белком и полимером

Раствор, содержащий белок/полимер, (10 мкл) смешивают с 3 мкл буфера для нагрузки (глицерин, трис-ацетат и бромфеноловый синий в воде). Эти 13 мкл, содержащие 50 нг белка и 50 нг полимера, помещают в лунку с 0,8%-ным агарозным гелем. Кювету для электрофореза закрывают, и генератор устанавливают при значении 30 В. Миграция продолжается в течение 1 часа.

После миграции гель переносят на мембрану из PVDF за счет капиллярного эффекта с помощью системы Apelex в течение 2 часов при комнатной температуре. Мембрану затем насыщают обезжиренным молоком в течение 1 часа при комнатной температуре, затем инкубируют с первичными кроличьими антителами, направленными против белка (в течение ночи при температуре 4°С), и, наконец, инкубируют с вторичными кроличьими антителами против козьего HRP (в течение 1 часа при комнатной температуре). Проявление устанавливают по реакции HRP в отношении Opti-4CN. Проявление прекращают путем промывания в воде, когда окрашивание является достаточным, так как продукт реакции поглощает в видимой части спектра.

Когда белок является одним или не образует комплекс с полимером, он может мигрировать, если он является анионным, или оставаться в месте внесения, если он является катионным. Белок тогда детектируют либо на уровне лунок для нагрузки, либо в виде единственного пятна на расстоянии 0,3-0,4 см от места внесения. Когда белок образует комплекс с полимером, комплекс более сильно захватывается нагрузками полимера и перемещается к аноду. Его детектируют в виде единственного пятна на расстоянии 0,7 см от места внесения.

Результаты, полученные при использовании полимеров 1, 3 и 4 и двух факторов роста, FGF-2 и NGF-β, представлены в нижеприведенной таблице II.

Все комплексы полимер/белок исследуют при массовом соотношении 1/1.

Таблица II
	NGF-β	FGF-2
Полимер 1	+	+
Полимер 2	-	-
Полимер 3	-	-

Этот тест позволяет выявить, что взаимодействие между полимером 1 и HBP является достаточно сильным для возможности уменьшения количества полимера, что является благоприятным в целях фармацевтической разработки. Полимеры 3 и 4 не обладают достаточно сильным взаимодействием с двумя тестируемыми HBP для получения комплекса при соотношении 1/1.

С - Выявление аффинности полимера к белку, связывающемуся с гепарином, посредством ITC

Пример 5: взаимодействие РТН (1-34) с гепарином и полимером 1

В литературе показано (Kamerzell, 2007), что РТН (1-84) связывается с гепарином с Kd 300 нМ во время эксперимента с использованием ITC (изотермальная титрационная калориметрия, титрование путем изотермальной калориметрии). При идентичных условиях, авторы настоящей заявки показали, что РТН (1-34) взаимодействует с гепарином с Kd 227 нМ.

Гепарин вносят в ячейку при концентрации 2 мкМ в буфере из 4,8 мМ цитрата, рН=5,3, 42 мМ NaCl. РТН (1-34) вносят в шприц при концентрации 208,6 мкМ. Осуществляют 50 инъекций по 5 мкл, и результаты подгоняют к модели из n независимых мест, которые позволяют вычислить Kd 227 нМ.

При подобных условиях, полимер 1 вносят в ячейку при концентрации 0,5 мкМ в буфере из 4,8 мМ цитрата, рН=5,3, 42 мМ NaCl. РТН (1-34) вносят в шприц при концентрации 191 мкМ. Осуществляют 50 инъекций по 5 мкл, и результаты подгоняют к модели из n независимых мест, которые позволяют вычислить Kd 6,9 мкМ, что показывает взаимодействие полимера 1 с РТН, это взаимодействие является близким к взаимодействию гепарина.

D - Примеры композиций

Пример 6

Получение комплекса полимер/белок, связывающийся с гепарином

Следующие операции проводят в подходящей области. 5 г лиофилизата полимера, описанного в примере 1, полимера 1, растворяют в 50 мл воды для получения раствора 1 (концентрация полимера 1 составляет 100 мг/мл). Параллельно, 10 мкг лиофилизата VEGF растворяют в 5 мкл воды для получения раствора 2 (концентрация VEGF составляет 2 мг/мл). 5 мкл раствора 1 смешивают с 5 мкл раствора 2 при комнатной температуре для получения раствора 3, содержащего полимер 1 в концентрации 50 мг/мл и VEGF в концентрации 1 мг/мл. Раствор 3 фильтруют через фильтр 0,22 мкм для получения стерильного раствора. Образование комплекса в растворе 3 может быть выявлено при использовании коэлектрофореза.

В заключение, комплекс между полимером согласно изобретению и связывающимся с гепарином белком образуется путем простого смешивания водных растворов при комнатной температуре без добавления органического растворителя.

Пример 7

Получение комплекса полимер/белок, связывающийся с гепарином

Операции, описанные в примере 6, таким образом, приводят к получению комплекса полимер 1/VEGF в соотношении 1/10, используя 1 мкл раствора 1, дополненный до 5 мкл водой, и 5 мкл раствора 2. Получают 10 мкл раствора 4, содержащего полимер 1 в концентрации 10 мг/мл и VEGF в концентрации 1 мг/мл.

Пример 8

Получение комплекса полимер/белок, связывающийся с гепарином

Операции, описанные в примере 6, таким образом, приводят к получению комплекса полимер 1/VEGF в соотношении 1/2, используя 0,2 мкл раствора 1, дополненные до 5 мкл водой, и 5 мкл раствора 2. Получают 10 мкл раствора 5, содержащего полимер 1 в концентрации 2 мг/мл и VEGF в концентрации 1 мг/мл.

Пример 9

Получение комплекса полимер/белок, связывающийся с гепарином

Операции, описанные в примере 6, таким образом, осуществляют при использовании полимера, описанного в примере 2, полимера 2, и FGF-2 в качестве связывающегося с гепарином белка. Получают различные водные растворы комплекса полимер 2/FGF-2, в которых соотношения полимер 2/FGF-2 изменяются от 1 до 100.

Пример 10

Получение комплекса полимер/белок, связывающийся с гепарином

Следующие операции проводят в подходящей области. 5 г лиофилизата полимера, описанного в примере 2, полимера 2, растворяют в 100 мл воды для получения раствора 1 (концентрация полимера 2 составляет 50 мг/мл). 10 мкл этого раствора вводят в склянку емкостью 50 мкл. Затем 10 мкг лиофилизата VEGF добавляют к этому раствору при комнатной температуре. Полученный раствор содержит полимер 2 в концентрации 50 мг/мл и VEGF в концентрации 1 мг/мл. Этот раствор является прозрачным после умеренного перемешивания в течение 15 минут и может быть отфильтрован через фильтр 0,22 мкм для получения стерильного раствора. Образование комплекса в конечном растворе может быть выявлено при использовании коэлектрофореза.

Наоборот, тот же самый конечный раствор получают путем добавления 500 мкг лиофилизированного полимера 2 к 10 мкл раствора VEGF с концентрацией 1 мг/мл.

В заключение, комплекс между полимером согласно изобретению и белком, связывающимся с гепарином, может быть получен простым добавлением лиофилизата полимера или белка к водному раствору белка или полимера при комнатной температуре без добавления органического растворителя.

1. Комплекс, образованный полисахаридом, замещенным триптофаном или производным триптофана, и НВР, отличающийся тем, что полисахарид выбирают из группы нейтральных или анионных полисахаридов, образованных в большинстве за счет гликозидных связей типа (1,6), и/или (1,4), и/или (1,3), и/или (1,2), функционализированных по меньшей мере одним триптофаном или одним производным триптофана, обозначаемым Trp, причем:
- вышеуказанный триптофан или производное триптофана привит(то) или связан(но) с полисахаридами за счет связывания с кислотной группой, причем вышеуказанная кислотная группа может быть кислотной группой анионного полисахарида и/или кислотной группой, которую несет связующий фрагмент R, связанный с полисахаридом через группу F, причем вышеуказанная группа F происходит от связывания между связующим фрагментом R и группой -OH нейтрального или анионного полисахарида,
- F означает сложноэфирную группу, группу сложного тиоэфира, амидную группу, карбонатную группу, карбаматную группу, простую эфирную группу, группу простого тиоэфира или аминогруппу,
- R представляет собой цепь, включающую от 1 до 18 атомов углерода, необязательно разветвленную и/или ненасыщенную, включающую один или несколько гетероатомов, таких как О, N и/или S, и имеющую по меньшей мере одну кислотную группу,
- Trp означает остаток триптофана или производного триптофана, L или D, получаемый за счет связывания между аминогруппой триптофана и по меньшей мере одной кислотной группой, которую несет группа R, и/или кислотной группой, которую несет анионный полисахарид,
- вышеуказанный триптофан или производное триптофана является солеобразующим или превращенным в соль и выбираемым из группы, состоящей из триптофана, триптофанола, триптофанамида, 2-индолэтиламина и их солей,
- вышеуказанный НВР выбирают из группы, состоящей из:
- гормонов, таких как гормон роста (hGH: human growth hormone) или паращитовидный гормон (РТН: parathyroid hormone);
- факторов роста, таких как белки, такие как трансформирующие факторы роста β1- и β2 (TGF-β: transforming growth factor beta), аналогичный инсулину фактор роста типа 2 (IGF-2: Insulin-like growth factor 2), фактор роста, связывающий гепарин и аналогичный эпидермическому фактору роста (HB-EGF: Heparin Binding EGF-like Growth Factor), факторы роста фибробластов типа 1-14 (FGF: fibroblast growth factors), фактор роста кератиноцитов (KGF: Keratinocyte Growth Factor), фактор роста нервов β (NGF-β: Nerve Growth Factor β), фактор роста соединительной ткани (CTGF: Connective Tissue Growth Factor), плацентарный фактор роста (PlGF: Placental Growth Factor), R-спондины 1-4 и факторы роста васкулярного эндотелия А и В (VEGF: Vascular Endothelial Growth Factors).

2. Комплекс по п.1, отличающийся тем, что полисахарид выбирают из группы, состоящей из полисахаридов общей формулы (I)

где
- F, происходящий от связывания между связующим фрагментом R и группой -OH нейтрального или анионного полисахарида, означает сложноэфирную группу, группу сложного тиоэфира, амидную группу, карбонатную группу, карбаматную группу, простую эфирную группу, группу простого тиоэфира или аминогруппу,
- R означает цепь, включающую от 1 до 18 атомов углерода, необязательно разветвленную и/или ненасыщенную, включающую один или несколько гетероатомов, таких как О, N и/или S, и имеющую по меньшей мере одну кислотную группу,
- Trp означает остаток производного триптофана, L или D, получаемый за счет связывания между аминогруппой триптофана или производного триптофана и по меньшей мере одной кислотной группой, которую несет группа R, и/или кислотной группой, которую несет анионный полисахарид,
- n означает мольную долю групп R, замещенных с помощью Trp, и составляет от 0,2 до 0,7,
- o означает мольную долю кислотных групп замещенных с помощью Trp полисахаридов и составляет от 0,2 до 0,7,
- i означает мольную долю кислотных групп, которые несет группа R, на сахаридную единицу и составляет от 0 до 2,
- j означает мольную долю кислотных групп, которые несет анионный полисахарид, на сахаридную единицу и составляет от 0 до 1,
- (i+j) означает мольную долю кислотных групп на сахаридную единицу и составляет от 0,5 до 2,
- когда R не является замещенным с помощью Trp, тогда кислотная или кислотные группы группы R являются карбоксилатами с катионом щелочного металла, предпочтительно Na⁺ или K⁺,
- когда полисахаридом является анионный полисахарид, когда кислотная группа или кислотные группы полисахарида не являются замещенными с помощью Trp, тогда они являются превращенными в соль за счет катиона щелочного металла, предпочтительно Na или K,
- причем вышеуказанные полисахариды имеют нейтральное значение pH.

3. Комплекс по п.2, отличающийся тем, что F означает сложный эфир, карбонат, карбамат или простой эфир.

4. Комплекс по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что полисахарид представляет собой декстран.

5. Комплекс по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что группу R выбирают из следующих групп:

или их солей с катионами щелочных металлов.

6. Комплекс по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что отношение полисахарид/HBP составляет от 0,5 до 500, предпочтительно от 1 до 300.

7. Комплекс по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что отношение полисахарид/HBP составляет от 0,5 до 100, предпочтительно от 1 до 10.

8. Комплекс по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что НВР выбирают из группы гормонов, таких как гормон роста (hGH: human growth hormone) или паращитовидный гормон (PTH: parathyroid hormone).

9. Комплекс по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что НВР выбирают из группы факторов роста, таких как белки, такие как трансформирующие факторы роста β1 и β2 (TGF-β: transforming growth factor beta), аналогичный инсулину фактор роста типа 2 (IGF-2: Insulin-like growth factor 2), фактор роста, связывающий гепарин и аналогичный эпидермическому фактору роста (HB-EGF: Heparin Binding EGF-like Growth Factor), факторы роста фибробластов типа 1-14 (FGF: fibroblast growth factors), фактор роста кератиноцитов (KGF: Keratinocyte Growth Factor), фактор роста нервов β (NGF-β: Nerve Growth Factor β), фактор роста соединительной ткани (CTGF: Connective Tissue Growth Factor), плацентарный фактор роста (PlGF: Placental Growth Factor), R-спондины 1-4 и факторы роста васкулярного эндотелия A и B (VEGF: Vascular Endothelial Growth Factors).

10. Фармацевтическая композиция, включающая комплекс по любому из предыдущих пунктов.