Полисахариды, содержащие карбоксильные функциональные группы, замещенные производным гидрофобного спирта
Изобретение относится к новым полимерам на основе полисахаридов. Предложен полисахарид, содержащий карбоксильные функциональные группы, по меньшей мере одна из которых замещена производным гидрофобного спирта. Предложена также фармацевтическая композиция, содержащая один из полисахаридов по изобретению и по меньшей мере одно действующее начало. Изобретение позволяет получить новые амфифильные производные полисахаридов, обладающие хорошей биосовместимостью. 3 н. и 23 з.п. ф-лы, 1 табл., 12 пр.
Настоящее изобретение относится к новым биосовместимым полимерам на основе полисахаридов, содержащим карбоксильные функциональные группы, которые могут быть пригодны, в частности, для введения активных веществ (РА) человеку или животным в целях лечения и/или профилактики.
Гидрофобные спирты представляют интерес в составах фармацевтических активных веществ, в частности, в связи с их биосовместимостью и их гидрофобным характером, позволяющим модулировать гидрофобность полимеров, на которые они могут быть привиты.
Их биосовместимость является превосходной в той мере, в которой они играют роль во многочисленных биохимических процессах и присутствуют в этерифицированной форме в большей части тканей.
Тем не менее, специалисту известно, что трудно привить спирт на полисахарид, содержащий карбоксильные функциональные группы, т.к. трудно выбирать между гидроксильными функциональными группами полисахарида и гидроксильной функциональной группой гидрофобного спирта. В момент привитой полимеризации спирты полимера могут вступать в конкуренцию со спиртом привитой молекулы, если не используются технологии защиты, снятия защиты со спиртов полимера, и эта побочная реакция приводит к сшивке полимерных цепочек. Таким образом, гидрофобные спирты, представляющие интерес, такие как холестерин, до настоящего времени не могли быть привиты на полисахариды, содержащие карбоксильные функциональные группы.
Dellacherie et al., разработали сложные эфиры полисахаридов, т.е. альгинатов, гиалуронатов (Pelletier, S. et al., Carbohydr.Polym. 2000, 43, 343-349) или галактуронанов (Dellacherie Edith et al., Langmur 2001, 17, 1384-1391) способом синтеза с использованием альфа-алкилгалогенидов, бромододекана и бромооктадекана. Синтез сложных эфиров заключается в замещении галогенидов карбоксилатами тетрабутиламмония. Этот метод обеспечивает доступ к сложным эфирам гидрофобных спиртов, но он ограничен алкильными галогенированными производными, которые могут претерпевать нуклеофильное замещение. Таким образом, его нельзя применять для привитой полимеризации гидрофобных спиртов, таких как холестерин. К тому же эти галогенированные производные могут быть токсичными и, следовательно, не всегда могут использоваться для приготовления фармацевтического продукта.
Другие исследователи обошли эту проблему, прививая гидрофобные кислоты вместо гидрофобных спиртов. Nichifor et al., например, использовали холевую кислоту, стероидное производное, для ее прямой привитой полимеризации со спиртами декстрана (Nichifor, Marieta t al., Eur.Polym.J. 1999, 35, 2125-2129). Этот способ позволяет обойти проблему холестерина путем применения производного, являющегося карбоновой кислотой, способной взаимодействовать со спиртами полисахарида. Тем не менее, холевая кислота не одобрена FDA для инъекций в отличие от холестерина и эта стратегия не может применяться к полисахаридам, содержащим карбоксильные функциональные группы.
Другие исследователи использовали неанионные полисахариды для того, чтобы иметь возможность прививать гидрофобные спирты. Akiyoshi et al., например, преобразовали нуклеофильный холестерин в электрофильное производное (Biomacromolecules 2007, 8, 2366-2373). Это электрофильное производное холестерина может быть привито на спиртовые функциональные группы пуллулана или маннана, нейтральных полисахаридов. Эта стратегия также не может применяться к полисахаридам, содержащим карбоксильные функциональные группы.
В недавнем обзоре функциональных полимеров на основе декстрана (Heinze, Thomas et al., Adv Polym Sci 2006, 205, 199-291) говорится о модификации при помощи в том числе гидрофобных кислот, но не принимается во внимание декстран, функционализированный гидрофобными спиртами.
Настоящее изобретение относится к новым амфифильным производным полисахаридов, содержащим карбоксильные функциональные группы, частично замещенные по меньшей мере одним производным гидрофобного спирта. Эти новые производные полисахаридов, содержащие карбоксильные функциональные группы, обладают хорошей биосовместимостью и их гидрофобность может легко модулироваться без изменения биосовместимости.
Оно также относится к способу синтеза, позволяющему решать упомянутые выше проблемы синтеза. Этот способ позволяет получать полисахариды, содержащие карбоксильные функциональные группы, частично замещенные гидрофобными спиртами, к которым относится, например, холестерин.
Таким образом изобретение относится к полисахаридам, содержащим карбоксильные функциональные группы, по меньшей мере одна из которых замещена производным гидрофобного спирта, обозначенного Ah:
- указанный гидрофобный спирт (Ah), привитый или связанный с анионным полисахаридом связующим звеном R, причем указанное связующее звено соединено с анионным полисахаридом функциональной группой F, при этом указанная функциональная группа F получена в результате взаимодействия между аминной функциональной группой связующего звена R и карбоксильной группой анионного полисахарида и указанное связующее звено соединено с гидрофобным спиртом функциональной группой G, полученной в результате взаимодействия между карбоксильной, изоцианатной, тиокислотной или спиртовой группой связующего звена и функциональной группой гидрофобного спирта, при этом незамещенные карбоксильные группы анионного полисахарида находятся в форме катионного карбоксилата щелочного металла, предпочтительно Na+или К+.
- при этом F является амидной группой,
- при этом G является группой сложного эфира, сложного тиоэфира, карбонатной, карбаматной группой,
- при этом R является цепочкой, содержащей от 1 до 18 атомов углерода, возможно разветвленной и/или ненасыщенной, возможно содержащей один или несколько гетероатомов, таких как O, N или/и S, и содержащей по меньшей мере одну кислотную группу,
- Ah при этом является остатком гидрофобного спирта, продукта взаимодействия между гидроксильной функциональной группой гидрофобного спирта и по меньшей мере одной электрофильной функциональной группой, связанной с группой R,
- при этом указанный полисахарид, содержащий карбоксильные функциональные группы, является амфифильным с нейтральным рН.
В варианте осуществления G является группой сложного эфира.
В соответствии с изобретением полисахарид, содержащий карбоксильные функциональные группы, частично замещенные гидрофобными спиртами, выбирают из полисахаридов, содержащих карбоксильные функциональные группы общей формулы I:
-в которой n обозначает молярную фракцию карбоксильных функциональных групп полисахарида, замещенных F-R-G-Ah и составляет от 0,01 до 0,7,
- F, R, G и Ah соответствуют приведенным выше определениям и если карбоксильная функциональная группа полисахарида не замещена F-R-G-Ah, то одна или несколько карбоксильных функциональных групп полисахарида являются катионными карбоксилатами щелочного металла, предпочтительно Na+ или K+.
В варианте осуществления полисахариды, содержащие карбоксильные функциональные группы, являются полисахаридами, естественным образом несущими карбоксильные функциональные группы, и выбираются из группы, образованной альгинатом, гиалуронаном, галактуронаном.
В варианте осуществления полисахариды, содержащие карбоксильные функциональные группы, являются синтетическими полисахаридами, полученными из полисахаридов, естественным образом содержащих карбоксильные функциональные группы, или из нейтральных полисахаридов, на которые привиты по меньшей мере 15 карбоксильных функциональных групп на 100 сахаридных звеньев, общей формулы II.
-натуральные полисахариды при этом выбирают из группы полисахаридов, состоящих главным образом из гликозидных мономеров, связанных гликозидными связями типа (1,6) и/или (1,4) и/или (1,3) и/или (1,2),
- при этом L является связью, полученной в результате взаимодействия между связующим звеном Q и группой -ОН полисахарида, и является группой сложного эфира, сложного тионоэфира, карбонатной, карбаматной или простого эфира,
-i является молярной фракцией заместителей L-Q на сахаридное звено полисахарида,
-при этом Q является цепочкой, содержащей от 1 до 18 атомов углерода, возможно разветвленной и/или ненасыщенной, содержащей один или несколько гетероатомов, таких как O, N или/и S, и содержащей по меньшей мере одну карбоксильную функциональную группу, -СО2Н.
В варианте осуществления n составляет от 0,05 до 0,5.
В варианте осуществления полисахарид состоит главным образом из гликозидных мономеров, связанных гликозидными связями типа (1,6).
В варианте осуществления полисахарид, состоящий главным образом из гликозидных мономеров, связанных гликозидными связями типа (1,6), является декстраном.
В варианте осуществления полисахарид состоит главным образом из гликозидных мономеров, связанных гликозидными связями типа (1,4).
В варианте осуществления полисахарид, состоящий главным образом из гликозидных мономеров, связанных гликозидными связями типа (1,4), выбирают из группы, образованной пуллуланом, альгинатом, гиалуронаном, ксиланом, галактуронаном или целлюлозой, растворимой в воде.
В варианте осуществления полисахарид является пуллуланом.
В варианте осуществления полисахарид является альгинатом.
В варианте осуществления полисахарид является гиалуронаном.
В варианте осуществления полисахарид является ксиланом.
В варианте осуществления полисахарид является галактуронаном.
В варианте осуществления полисахарид является целлюлозой, растворимой в воде.
В варианте осуществления полисахарид, главным образом состоит из гликозидных мономеров, связанных гликозидными связями типа (1,3).
В варианте осуществления полисахарид, главным образом состоящий из гликозидных мономеров, связанных гликозидными связями типа (1,3), является курдланом.
В варианте осуществления полисахарид состоит главным образом из гликозидных мономеров, связанных гликозидными связями типа (1,2).
В варианте осуществления полисахарид, главным образом состоящий из гликозидных мономеров, связанных гликозидными связями типа (1,2), является инулином.
В варианте осуществления полисахарид состоит главным образом из гликозидных мономеров, связанных гликозидными связями типа (1,4) и (1,3).
В варианте осуществления полисахарид, главным образом состоящий из гликозидных мономеров, связанных гликозидными связями типа (1,4) и (1,3), является глюканом.
В варианте осуществления полисахарид состоит главным образом из гликозидных мономеров, связанных гликозидными связями типа (1,4), и (1,3) и (1,2).
В варианте осуществления полисахарид, главным образом состоящий из гликозидных мономеров, связанных гликозидными связями типа (1,4), и (1,3) и (1,2), является маннаном.
В варианте осуществления полисахарид по изобретению отличается тем, что группу Q выбирают из следующих групп:
В варианте осуществления i составляет от 0,1 до 2.
В варианте осуществления i составляет от 0,2 до 1,5.
В варианте осуществления группа R по изобретению отличается тем, что ее выбирают из аминокислот.
В варианте осуществления аминокислоты выбирают из альфа-аминокислот.
В варианте осуществления альфа-аминокислоты выбирают из натуральных альфа-аминокислот.
В варианте осуществления натуральные альфа-аминокислоты выбирают из лейцина, аланина, изолейцина, глицина, фенилаланина, триптофана, валина.
В варианте осуществления гидрофобный спирт выбирают из жирных спиртов.
В варианте осуществления гидрофобный спирт выбирают из спиртов, состоящих из ненасыщенной или насыщенной, разветвленной или неразветвленной алкильной цепочки, содержащей от 4 до 18 атомов углерода.
В варианте осуществления гидрофобный спирт выбирают из спиртов, состоящих из ненасыщенной или насыщенной, разветвленной или неразветвленной алкильной цепочки, содержащей от 6 до 18 атомов углерода.
В варианте осуществления гидрофобный спирт выбирают из спиртов, состоящих из ненасыщенной или насыщенной, разветвленной или неразветвленной алкильной цепочки, содержащей от 8 до 16 атомов углерода.
В варианте осуществления гидрофобным спиртом является октанол.
В варианте осуществления гидрофобным спиртом является 2-этилбутанол.
В варианте осуществления жирный спирт выбирают из меристила, цетила, стеарила, цетеарила, бутила, олеила, ланолина.
В варианте осуществления гидрофобный спирт выбирают из производных холестерина.
В варианте осуществления производным холестерина является холестерин.
В варианте осуществления гидрофобный спирт выбирают из производных ментола.
В варианте осуществления гидрофобным спиртом является ментол в рацемической форме.
В варианте осуществления гидрофобным спиртом является изомер D ментола.
В варианте осуществления гидрофобным спиртом является изомер L ментола.
В варианте осуществления гидрофобный спирт выбирают из токоферолов.
В варианте осуществления токоферолом является альфа-токоферол.
В варианте осуществления альфа-токоферолом является рацемическая форма альфа-токоферола.
В варианте осуществления токоферолом является изомер D альфа-токоферола.
В варианте осуществления токоферолом является изомер L альфа-токофера.
В варианте осуществления гидрофобный спирт выбирают из спиртов, несущих арильную группу.
В варианте осуществления спирт, несущий арильную группу, выбирают из бензилового спирта, фенетилового спирта.
Полисахарид может иметь степень полимеризации m от 10 до 10000.
В варианте осуществления он имеет степень полимеризации m от 10 до 1000.
В варианте осуществления он имеет степень полимеризации m от 10 до 500.
Изобретение также относится к синтезу полисахаридов, содержащих карбоксильные функциональные группы, частично замещенные по изобретению.
Указанный синтез включает стадию получения аминированного промежуточного соединения Ah-G-R-NH2 или соли аммония Ah-G-R-NH3 +, контр-ион который является анионом, выбранным из галогенидов, сульфатов, сульфонатов, карбоксилатов, и стадию привитой полимеризации этого аминированного промежуточного соединения на карбоксильную функциональную группу полисахарида, при этом R, G и Ah соответствуют приведенным выше определениям.
В варианте осуществления стадия функционализации полисахарида по меньшей мере 15 карбоксильными функциональными группами на 100 сахаридных звеньев осуществляют путем привитой полимеризации соединений формулы Q-L', при этом L'является ангидридной, галогенидной, карбоновой кислотной, тиокислотной или изоционатной функциональной группой на по меньшей мере 15 спиртовых функциональных групп на 100 сахаридных звеньев полисахарида, причем Q и L соответствуют приведенным выше определениям.
В варианте осуществления аминированный промежуточный продукт формулы Ah-G-R-NH2 или Ah-G-R-NH3 + получают взаимодействием соединения формулы G'-R-NH2, причем G'является карбоксильной кислотной, изоцианатной, тиокислотной или спиртовой группой со спиртовой функциональной группой гидрофобного спирта, при этом R, G и Ah соответствуют приведенным выше определениям.
В случае необходимости на этой стадии получения аминированного промежуточного продукта используют технологию защиты, снятия защиты, хорошо известную специалисту в области пептидного синтеза.
Предпочтительно стадию привитой полимеризации аминированного промежуточного соединения на кислотную функциональную группу полисахарида проводят в органической среде.
Изобретение также относится к применению функционализированных полисахаридов по изобретению для получения фармацевтических соединений, таких как описаны выше.
Изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей один из полисахаридов по изобретению, такой как описан выше, и по меньшей мере одно действующее начало.
Изобретение также относится к фармацевтической композиции по изобретению, такой как описана выше, отличающейся тем, что действующее начало выбирают из группы, состоящей из белков, гликопротеинов, пептидов и непептидных терапевтических молекул.
Под действующим началом понимают продукт в форме одного химического вещества или в форме комбинации, обладающей физиологической активностью. Указанное действующее начало может быть экзогенным, т.е. вводиться композицией по изобретению. Оно также может быть эндогенным, например, факторами роста, которые секретируются в ране на первой стадии рубцевания и которые могут удерживаться в указанной ране композицией по изобретению.
В зависимости от целевых патологий она предназначена для местного или системного лечения.
В случае местных или системных высвобождений пригодные способы введения осуществляются внутривенным, подкожным, внутрикожным, чрескожным, внутримышечным, пероральным, назальным, вагинальным, глазным, через рот, легочным и т.д. путем.
Фармацевтические композиции по изобретению находятся или в жидкой форме, в водной суспензии, или в в форме порошка, имплантата или пленки. Кроме того они содержат обычные фармацевтические эксципиенты, хорошо известные специалисту.
В зависимости от патологий и способов введения фармацевтические композиции могут преимущественно дополнительно содержать эксципиенты, позволяющие формировать их в форме геля, губки, растворов для инъекций, питьевых растворов, лиока и т.д.
Изобретение также относится к фармацевтической композиции по изобретению, такой как описана выше, отличающейся тем, что ее можно вводить в форме стента, пленки или «оболочки» имплантируемых биоматериалов, имплантата.
Пример 1: Синтез декстранметилкарбоксилата натрия, модифицированного лейцинатом холестерина
Лейцинат холестерина, соль паратолуолсульфоновой кислоты получают способом, описанном в патенте (Kenji, M et al., US4826818).
8 г (или 148 ммоль гидроксильных функциональных групп) декстрана со средневесовой молярной массой примерно 40 кг/моль (Fluka) растворяют в воде из расчета 42 г/л. В этот раствор вводят 15 мл NaOH 10N (148 ммол. NaOH). Смесь нагревают до 35°С, затем вводят 23 г (198 ммол.) хлорацетата натрия. Температуру реакционной среды доводят до 60°С, поднимая на 0,5°С/мин, затем поддерживают 60°С в течение 100 минут.Реакционную среду разводят 200 мл воды, нейтрализуют уксусной кислотой и очищают ультрафильтрацией через мембрану PES 5kD с противотоком 6 объемов воды. Конечный раствор титруют по сухому остатку для определения концентрации полимера; затем титруют кислотно-основным методом количественного определения в воде/ацетоне 50/50 (V/V) для определения степени замещения метилкарбоксилатами.
По сухому остатку: [полимер]=31,5 мг/г
По результатам кислотно-основного метода количественного определения: степень замещения гидроксильных функциональных групп метилкарбоксилатными функциональными группами составляет 1,04 на сахаридное звено.
Раствор декстранметилкарбоксилата натрия проходит через смолу Purolite (анионную) для получения декстранметилкарбоновой кислоты, которую затем лиофилизируют в течение 18 часов.
8 г декстранметилкарбоновой кислоты (37 ммоль группы метилкарбоновой кислоты) растворяют в DMF в концентрации 45 г/л, затем охлаждают до 0°С. 0,73 г лейцината холестерина, соли паратолуолсульфоновой кислоты (1 ммоль) суспендируют в DMF в концентрации 100 г/л. Затем в эту суспензию вводят 0,11 г триэтиламина (1 ммоль). При температуре раствора полимера, равной 0°С, вводят 0,109 г (1 ммоль) NMM и 0,117 г (1 ммоль) EtOCOCI. Через 10 минут с начала реакции вводят суспензию лейцината холестерина. Затем температуру среды поддерживают равной 4°С в течение 15 минут.Затем среду нагревают до 30°С. После подъема температуры до 30°С среду вливают в раствор 3,76 г NMM (37 ммоль) в концентрации 5 г/л при интенсивном перемешивании. Раствор подвергают ультрафильтрации через мембрану PES 10kD с противотоком 10 объемов раствора NaCl 0,9%, затем 5 объемов воды. Концентрацию раствора полимера определяют по сухому экстракту. Фракцию раствора лиофилизируют и анализируют ЯМР 1Н в D2O для определения содержания кислотных функциональных групп, превращенных в амид лейцината холестерина.
По сухому остатку: [модифицированный полимер]=12,9 мг/г
По результатам ЯМР 1Н: молярная фракция кислот, модифицированных лейцинатом холестерина, на сахаридную единицу составляет 0,03.
Пример 2: Синтез декстрансукцината натрия, модифицированного лейцинатом холестерина
Лейцинат холестерина, соль паратолуолсульфоновой кислоты получают способом, описанном в патенте (Kenji, M et al., US 4826818).
Декстрансукцинат натрия получают из декстрана 40 способом, описанным в статье Sanchez-Chaves et al., (Sanchez-Chaves, Manuel et al., Polymer 1998, 39(13), 2751-2757). Содержание кислотных функциональных групп на гикозидную единицу (i) составляет 1,46 по результатам ЯМР 1Н в D2O/NaOD.
Раствор декстрансукцината натрия проходит через смолу Purolite (анионную) для получения декстран-янтарной кислоты, которую затем лиофилизируют в течение 18 часов.
7,1 г декстран-янтарной кислоты (23 ммоля) растворяют в DMF в концентрации 44 г/л. Раствор охлаждают до 0°С. 0,77 г лейцината холестерина, соли паратолуолсульфоновой кислоты (1 ммоль) суспендируют в DMF в концентрации 100 г/л. Затем в эту суспензию вводят 0,12 г триэтиламина (ТЕА) (1 ммоль).При температуре раствора полимера 0°С вводят 0,116 г (1 ммоль) NMM и 0,124 г (1 ммоль) EtOCOCI. Через 10 минут с начала реакции вводят суспензию лейцината холестерина. Затем температуру среды поддерживают равной 4°С в течение 15 минут. Затем среду нагревают до 30°С. После подъема температуры до 30°С среду вливают в раствор 3,39 г NMM (33 ммоля) в концентрации 5 г/л при интенсивном перемешивании. Раствор подвергают ультрафильтрации через мембрану PES 10kD с противотоком 10 объемов раствора NaCl 0,9%, затем 5 объемов воды. Концентрацию раствора полимера определяют по сухому экстракту. Фракцию раствора лиофилизируют и анализируют ЯМР 1Н в D2O для определения содержания кислотных функциональных групп, превращенных в амид лейцината холестерина.
По сухому остатку: [модифицированный полимер]=17,5 мг/г
По результатам ЯМР 1Н: молярная фракция кислот, модифицированных лейцинатом холестерина на сахаридную единицу составляет 0,05.
Пример 3: Синтез пуллулан-янтарного карбоксилата натрия, модифицированного лейцинатом холестерина
Лейцинат холестерина, соль паратолуолсульфоновой кислоты, получают способом, описанном в патенте (Kenji, M et al., US4826818).
10 г пуллулана со средневесовой молярной массой примерно 100 кг/моль (Fluka) растворяют в DMSO в концентрации 400 мг/г при 60°С. Температуру этого раствора устанавливают 40°С, затем два раствора DMF, содержащих 9,27 г янтарного ангидрида (371 г/л) и 9,37 г NMM (375 г/л) вводят в раствор пуллулана. Продолжительность реакции составляет 240 минут с момента введения раствора NMM. Полученный таким образом раствор разводят в 1 л воды и подвергают ультрафильтрации через мембрану PES 10 kD с противотоком раствора натрия хлорида 0,9%, затем с противотоком бидистилированной воды. Концентрацию пуллулан-янтарного карбоксилата натрия в конечном растворе определяют по сухому экстракту, а сухой продукт анализируют ЯМР 1Н в D2O/NaOD для определения содержания гидроксильных функциональных групп, превращенных в сложные эфиры янтарной кислоты на сахаридную единицу.
По сухому экстракту: [пуллулан-янтарный карбоксилат]=15,8 мг/г
По результатам ЯМР 1Н: молярная фракция спиртов, несущих сукцинат натрия на сахаридную единицу составляет 1,35.
Раствор пуллулан-янтарного карбоксилата натрия подкисляют на смоле Purolite (анионной), затем лиофилизируют в течение 18 часов.
5 г пуллулан-янтарной кислоты растворяют в DMF в концентрации 51 г/л. Раствор охлаждают до 0°С. Затем вводят 0,08 г NMM и 0,08 г EtOCOCI. Через 10 минут с начала реакции вводят суспензию, содержащую 0,51 г лейцината холестерина, соли паратолуолсульфоновой кислоты (APTS) и 0,08 г ТЕА в 5,1 мл DMF. Время привитой полимеризации составляет 29 минут после введения производного холестерина. Затем среду нагревают до 30°С, после чего вливают в водный раствор NMM (2,09 г в концентрации 5 мг/мл). Полученный раствор разводят, добавляя 100 мл воды, затем подвергают диафильтрации через мембрану PES 10 kD с противотоком раствора натрия хлорида 0,9%, затем с противотоком бидистилированной воды. Концентрацию пуллулан-янтарного карбоксилата натрия, модифицированного лейцинатом холестерина, в конечном растворе определяют по сухому остатку и сухой продукт анализируют ЯМР 1Н в D2O/NaOD для определения содержания кислотных функциональных групп, превращенных в амид лейцината холестерина.
По сухому остатку: [модифицированный полимер]=2,9 мг/г
По результатам ЯМР 1Н: молярная фракция кислот, модифицированных лейцинатом холестерина на сахаридную единицу составляет 0,04.
Пример 4: Синтез пуллулан-янтарного карбоксилата натрия, модифицированного аланинатом цетилового спирта
Аланинат цетилового спирта получают способом, описанном в патенте (Kenji, M et al., US 4826818).
Раствор пуллулан-янтарного карбоксилата натрия, полученный как описано в примере 3, подкисляют на смоле Purolite (анионной), затем лиофилизируют в течение 18 часов.
5 г пуллулан-янтарной кислоты растворяют в DMF в концентрации 51 г/л. Раствор охлаждают до 0°С. Затем вводят 0,32 г NMM (3,2 ммоля) и 0,32 г EtOCOCI (3,2 ммоля). Через 10 минут с начала реакции вводят суспензию, содержащую 1,55 г аланината цетилового спирта, соли паратолуолсульфоновой кислоты (3,2 ммоля) и 0,32 г ТЕА (3,2 ммоля) в 20,4 мл DMF. Время привитой полимеризации составляет 20 минут после введения производного цетилового спирта. Затем среду нагревают до 30°С, после чего вливают в водный раствор NMM (8,36 г в концентрации 5 мг/мл). Полученный раствор разводят, добавляя 100 мл воды, затем подвергают диафильтрации через мембрану PES 10 kD с противотоком раствора натрия хлорида 0,9%, затем с противотоком бидистилированной воды.
Концентрацию пуллулан-янтарного карбоксилата натрия, модифицированного аланинатом цетилового спирта, в конечном растворе определяют по сухому остатку и сухой продукт анализируют ЯМР 1Н в D2O/NaOD для определения содержания кислотных функциональных групп, превращенных в амид аланината цетилового спирта.
По сухому остатку: [модифицированный полимер]=5,2 мг/г
По результатам ЯМР 1Н: молярная фракция кислот, модифицированных аланинатом цетилового спирта на сахаридную единицу составляет 0,18.
Пример 5: Синтез декстранметилкарбоксилата натрия, модифицированного аланинатом додеканола Аланинат додеканола, соль паратолуолсульфоновой кислоты, получают способом, описанном в патенте (Kenji, M et al., US 4826818).
Раствор декстранметилкарбоксилата натрия, полученный как описано в примере 1, пропускают через смолу Purolite (анионную) для получения декстранметилкарбоновой кислоты, затем лиофилизируют в течение 18 часов.
5 г декстранметилкарбоновой кислоты (23,2 ммоля группы метилкарбоновой кислоты) растворяют в DMF в концентрации 45 г/л, затем охлаждают до 0°С. 1,99 г аланината додеканола, соли паратолуолсульфоновой кислоты (4,6 ммоля), суспендируют в DMF в концентрации 100 г/л. Затем в эту суспензию вводят 0,47 г триэтиламина (4,6 ммоля). При температуре раствора полимера, равной 0°С, вводят 2,35 г (23,2 ммоля) NMM и 2,52 г (23,2 ммоля) EtOCOCI. Через 10 минут с начала реакции вводят суспензию аланината додеканола. Затем температуру среды поддерживают равной 4°С в течение 15 минут. Затем среду нагревают до 30°С.После подъема температуры до 30°С, реакционную среду вводят в раствор имидазола (3,2 г в 9,3 мл воды). Раствор полимера подвергают ультрафильтрации через мембрану PES 10kD с противотоком 10 объемов раствора NaCl 0,9%, затем 5 объемов воды. Концентрацию раствора полимера определяют по сухому остатку. Фракцию раствора лиофилизируют и анализируют ЯМР 1Н в D2O для определения содержания кислотных функциональных групп, модифицированных аланинатом додеканола.
По сухому остатку: [модифицированный полимер]=22 мг/г
По результатам ЯМР 1Н: молярная фракция кислот, модифицированных аланинатом додекнола на сахаридную единицу составляет 0,19.
Пример 6: Синтез декстранметилкарбоксилата натрия, модифицированного глицинатом L-ментола
Глицинат L-ментола, соль паратолуолсульфоновой кислоты, получают способом, описанном в патенте (Kenji, M et al., US 4826818).
Поскольку полученное масло содержит примеси, соль амина нейтрализуют путем стехиометрического введения гидроксида натрия и экстрагируют простым диизопропиловым эфиром. Затем органическую фазу подкисляют раствором HCl в простом этиловом эфире и соль HCl ментольного производного экстрагируют водой. После лиофилизации получают глицинат L-ментола, соль соляной кислоты.
Раствор декстранметилкарбоксилата натрия, полученный как описано в примере 1, пропускают через смолу Purolite (анионную) для получения декстранметилкарбоновой кислоты, затем лиофилизируют в течение 18 часов.
12 г декстранметилкарбоновой кислоты (59,22 ммоля группы метилкарбоновой кислоты) растворяют в DMF в концентрации 60 г/л, затем охлаждают до 0°С. 1,32 г глицината L-ментола, соли соляной кислоты (5,29 ммоля), суспендируют в DMF в концентрации 100 г/л. Затем в эту суспензию вводят 0,54 г триэтиламина (5,29 ммоля). При температуре раствора полимера, равной 0°С, вводят раствор NMM (6,59 г, 65,1 ммоля) в DMF (530 г/л) и 7,07 г (65,1 ммоля) EtOCOCI. Через 10 минут с начала реакции вводят суспензию глицината L-ментола. Затем температуру среды поддерживают равной 10°С в течение 45 минут. Затем среду нагревают до 50°С. В реакционную среду вводят раствор имидазола (14,7 г в 22 мл воды) и 65 мл воды. Раствор полимера подвергают ультрафильтрации через мембрану PES 10kD с противотоком 6 объемов раствора NaCl 0,9%, 4 объемов гидроксида натрия 0,01 N, 7 объемов раствора NaCl 0,9%, затем 3 объемов воды. Концентрацию раствора полимера определяют по сухому остатку. Фракцию раствора лиофилизируют и анализируют ЯМР 1Н в D2O для определения содержания кислотных функциональных групп, превращенных в амид глицината L-ментола.
По сухому остатку: [модифицированный полимер]=25,7 мг/г
По результатам ЯМР 1Н: молярная фракция кислот, модифицированных глицинатом L-ментола на сахаридную единицу составляет 0,09.
Пример 7: Синтез декстранметилкарбоксилата натрия, модифицированного аланинатом (±) α-токоферола
Аланинат (±) α-токоферола, соль соляной кислоты, получают способом, описанном в J.Pharm. Sci. 1995, 84(1), 96-100.
Способом, подобным описанному в примере 6, получают декстранметилкарбоксилат натрия, модифицированный аланинатом (±) α-токоферола.
По сухому остатку: [модифицированный полимер]=28,1 мг/г
По результатам ЯМР 1Н: молярная фракция кислот, модифицированных аланинатом (±) α-токоферола на сахаридную единицу составляет 0,04.
Пример 8: Синтез декстранметилкарбоксилата натрия, модифицированного глицинатом октанола
Глицинат октанола, соль паратолуолсульфоновой кислоты, получают способом, описанном в патенте (Kenji, M et al., US 4826818).
Способом, подобным описанному в примере 6, получают декстранметилкарбоксилат натрия, модифицированный глицинатом октанола.
По сухому остатку: [модифицированный полимер]=34,1 мг/г
По результатам ЯМР 1Н: молярная фракция кислот, модифицированных глицинатом октанола, на сахаридную единицу составляет 0,27.
Пример 9: Синтез декстранметилкарбоксилата натрия, модифицированного фенилаланинатом октанола
Фенилаланинат октанола, соль паратолуолсульфоновой кислоты, получают способом, описанном в патенте (Kenji, M et al., US 4826818).
Способом, подобным описанному в примере 6, получают декстранметилкарбоксилат натрия, модифицированный фенилаланинатом октанола.
По сухому остатку: [модифицированный полимер]=30,2 мг/г
По результатам ЯМР 1Н: молярная фракция кислот, модифицированных фенилаланинатом октанола, на сахаридную единицу составляет 0,09.
Пример 10: Синтез декстранметилкарбоксилата натрия, модифицированного фенилаланинатом бензилового спирта
Способом, подобным описанному в примере 6, декстранметилкарбоксилат натрия, модифицированный фенилаланинатом бензилового спирта, получают с использованием фенилаланината бензилового спирта, соли соляной кислоты (Bachem).
По сухому остатку: [модифицированный полимер]=47,7 мг/г
По результатам ЯМР 1Н: молярная фракция кислот, модифицированных фенилаланинатом бензилового спирта, на сахаридную единицу составляет 0,41.
Пример 11: Синтез декстранметилкарбоксилата натрия, модифицированного фенилаланинатом изогексанола
Фенилаланинат изогексанола, соль паратолуолсульфоновой кислоты, получают способом, описанном в патенте (Kenji, M et al., US 4826818).
Способом, подобным описанному в примере 6, получают декстранметилкарбоксилат натрия, модифицированный фенилаланинатом изогексанола.
По сухому экстракту: [модифицированный полимер]=29,8 мг/г
По результатам ЯМР 1Н: молярная фракция кислот, модифицированных фенилаланинатом изогексанола, на сахаридную единицу составляет 0,18.
Пример 12: Растворение лиофилизата ВМР-2.
Тест на растворение лиофилизата костного морфогенетического белка (ВМР-2) был разработан для выявления растворяющей способности различных полимеров с физиологическим рН. ВМР-2 растворяют в буфере, содержащем сахарозу (Sigma), глицин (Sigma), глютаминовую кислоту (Sigma), хлорид натрия (Riedel-de-Haen), полисорбат 80 (Fluka). рН этого раствора устанавливают равным 4,5 путем введения гидроксида натрия, затем раствор лиофилизируют.283,2 мг лиофилизата содержат примерно 12 мг ВМР-2.
В этом тесте используют полимеры по изобретению. В качестве сравнения полимер, описанный в заявке на патент FR 0702316, декстранметилкарбоксилат натрия, модифицированный фенилаланинатом этила, также используют в этом тесте.
Тест заключается в том, чтобы вводить приблизительно точно 4 мг лиофилизата, содержащего 0,168 мг ВМР-2. Затем лиофилизат обрабатывают 210 мкл водного раствора до получения конечной концентрации ВМР-2 0,8 мг/мл при физиологическом рН, при этом конечная концентрация полимера составляет 5 мг/мл.
Внешний вид раствора отмечают через 5 минут с начала перемешивания с небольшой скоростью на ролике.
Результаты по разным растворам приведены в нижеследующей таблице.
| раствор | внешний вид | рН |
| вода | прозрачный | 4,3 |
| пример 9 | прозрачный | 7,4 |
| пример 8 | прозрачный | 7,5 |
| пример 5 | прозрачный | 7,4 |
| сравнительный пример FR 0702316 | мутный | 7,5 |
Добавление воды дает прозрачный раствор ВМР-2, но с кислым рН.
Этот тест позволяет выявить улучшение растворения ВМР-2 с физиологическим рН полимерами по изобретению. В противоположность этому декстранметилкарбоксилат натрия, модифицированный фенилаланинатом этила, не позволяет получать прозрачный раствор ВМР-2.
1. Полисахарид, содержащий карбоксильные функциональные группы, по меньшей мере одна из которых замещена производным гидрофобного спирта, обозначенного Ah:
- указанный гидрофобный спирт (Ah), привитый или связанный с анионным полисахаридом связующим звеном R, причем указанное связующее звено соединено с анионным полисахаридом функциональной группой F, при этом указанная функциональная группа F получена в результате взаимодействия между аминной функциональной группой связующего звена R и карбоксильной группой анионного полисахарида и указанное связующее звено соединено с гидрофобным спиртом функциональной группой G, полученной в результате взаимодействия между карбоксильной, изоцианатной, тиокислотной или спиртовой группой связующего звена и функциональной группой гидрофобного спирта, при этом незамещенные карбоксильные группы анионного полисахарида находятся в форме катионного карбоксилата щелочного металла, предпочтительно Na+ или К+,
- при этом F является амидной группой,
- при этом G является группой сложного эфира, сложного тиоэфира, карбонатной, карбаматной группой,
- при этом R является цепочкой, содержащей от 1 до 18 атомов углерода, возможно разветвленной и/или ненасыщенной, возможно содержащей один или несколько гетероатомов, таких как О, N или/и S, и содержащей по меньшей мере одну кислотную функциональную группу,
- Ah при этом является остатком гидрофобного спирта, продукта взаимодействия между гидроксильной функциональной группой гидрофобного спирта и по меньшей мере одной электрофильной функциональной группой, связанной с группой R,
при этом указанный полисахарид, содержащий карбоксильные функциональные группы, является амфифильным с нейтральным рН.
2. Полисахарид по п.1, отличающийся тем, что его выбирают из полисахаридов, содержащих карбоксильные функциональные группы, по меньшей мере одна из которых замещена производным гидрофобного спирта общей формулы I:
- в которой n обозначает молярную фракцию карбоксильных функциональных групп полисахарида, замещенных F-R-G-Ah, и составляет от 0,01 до 0,7,
- F, R, G и Ah соответствуют приведенным выше определениям и, если одна или несколько карбоксильных функциональных групп полисахарида не замещены F-R-G-Ah, то одна или несколько карбоксильных функциональных групп полисахарида являются катионными карбоксилатами щелочного металла, предпочтительно Na+ или К+.
3. Полисахарид по п.1, отличающийся тем, что анионный полисахарид естественным образом несет кислотные функциональные группы и выбран из группы, образованной альгинатом, гиалуронаном, галактуронаном.
4. Полисахарид по п.1, отличающийся тем, что анионный полисахарид является синтетическим анионным полисахаридом, полученным из натурального анионного или неанионного (нейтрального) полисахарида, на который привита по меньшей мере одна кислотная группа общей формулы II:
- натуральный полисахарид при этом выбирают из группы полисахаридов, состоящих, главным образом, из гликозидных мономеров, связанных гликозидными связями типа (1,6), и/или (1,4), и/или (1,3) и/или (1,2),
- при этом L является связью, полученной в результате взаимодействия между связующим звеном Q и группой -ОН нейтрального или анионного полисахарида, являющейся группой сложного эфира, сложного тионоэфира, карбонатной, карбаматной или простого эфира,
- при этом Q является цепочкой, содержащей от 1 до 18 атомов углерода, возможно разветвленной и/или ненасыщенной, содержащей один или несколько гетероатомов, таких как О, N или/и S, и содержащей по меньшей мере одну кислотную функциональную группу, -CO2H,
- при этом I является молярной фракцией заместителей L-Q на сахаридное звено полисахарида.
5. Полисахарид по п.4, отличающийся тем, что полисахарид состоит, главным образом, из гликозидных мономеров, связанных гликозидными связями типа (1,6).
6. Полисахарид по п.5, отличающийся тем, что полисахарид состоит, главным образом, из гликозидных мономеров, связанных гликозидными связями типа (1,6), является декстраном.
7. Полисахарид по п.4, отличающийся тем, что полисахарид состоит, главным образом, из гликозидных мономеров, связанных гликозидными связями типа (1,4).
8. Полисахарид по п.7, отличающийся тем, что полисахарид, состоящий, главным образом, из гликозидных мономеров, связанных гликозидными связями типа (1,4), выбирают из группы, образованной пуллуланом, альгинатом, гиалуронаном, ксиланом, галактуронаном или целлюлозой, растворимой в воде.
9. Полисахарид по п.4, отличающийся тем, что полисахарид состоит, главным образом, из гликозидных мономеров, связанных гликозидными связями типа (1,3).
10. Полисахарид по п.4, отличающийся тем, что полисахарид состоит, главным образом, из гликозидных мономеров, связанных гликозидными связями типа (1,2).
11. Полисахарид по п.4, отличающийся тем, что группу Q выбирают из следующих групп:
12. Полисахарид по п.1, отличающийся тем, что группу R выбирают из аминокислот.
13. Полисахарид по п.1, отличающийся тем, что группу R выбирают из альфа-аминокислот.
14. Полисахарид по п.13, отличающийся тем, что альфа-аминокислоты выбирают из натуральных альфа-аминокислот, к которым относятся лейцин, аланин, изолейцин, глицин, фенилаланин, триптофан или валин.
15. Полисахарид по п.1, отличающийся тем, что гидрофобный спирт выбирают из жирных спиртов.
16. Полисахарид по п.15, отличающийся тем, что гидрофобный спирт выбирают из спиртов, состоящих из ненасыщенной или насыщенной алкильной цепочки, содержащей от 4 до 18 атомов углерода.
17. Полисахарид по п.15, отличающийся тем, что жирный спирт выбирают из меристила, цетила, стеарила, цетеарила, бутила, олеила, ланолина.
18. Полисахарид по п.15, отличающийся тем, что гидрофобный спирт является холестерином.
19. Полисахарид по п.15, отличающийся тем, что гидрофобный спирт является ментолом.
20. Полисахарид по п.15, отличающийся тем, что гидрофобный спирт выбирают из токоферолов, предпочтительно альфа-токоферола.
21. Полисахарид по п.15, отличающийся тем, что гидрофобный спирт выбирают из спиртов, несущих арильную группу.
22. Полисахарид по п.21, отличающийся тем, что спирт, несущий арильную группу, выбирают из бензилового спирта, фенетилового спирта.
23. Фармацевтическая композиция, содержащая полисахарид по п.1 и по меньшей мере одно действующее начало.
24. Фармацевтическая композиция по п.23, которая может быть введена пероральным, назальным, вагинальным, щечным путем.
25. Фармацевтическая композиция по п.23, в которой действующее начало выбирают из группы, состоящей из белков, гликопротеинов, пептидов и терапевтических непептидных молекул.
26. Применение функционализированного полисахарида по п.1 для получения фармацевтической композиции по п.23.
