Способ прогнозирования течения ишемической болезни сердца

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано в кардиологии и терапии. Способ прогнозирования течения ишемической болезни сердца заключается в том, что до и после лечения исследуют модифицированные ЛП(а) путем обработки 0,5 мл сыворотки крови 0,2 мл 0,1% раствора Тритона Х-100, инкубацией 15 мин при 20°С, перемешиванием смеси методом встряхивания 120 раз в 1 мин с последующим добавлением 7% раствора полиэтиленгликоля 6000 и электрофоретическим разделением в геле агарозы в лунке 4·20 мм и при снижении уровня модифицированных ЛП(а) на 30% и более, а холестерина на 18% и более и увеличением Апо А-1 на 25% и более по сравнению с исходным уровнем оценивают прогноз течения ишемической болезни сердца как благоприятный, способствующий переходу стенокардии напряжения из функционального класса III-IV в функциональный класс I-II, а при снижении уровня модифицированных ЛП(а) менее 30%, а общего холестерина менее 18% и увеличении Апо А-1 менее 25% по сравнению с исходным уровнем прогноз считают неблагоприятным. 2 пр., 1 табл., 6 ил.

 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в кардиологии или терапии.

Известны способы разделения на фракции липопротеинов крови методом аналитического ультрацентрифугирования (А.Н.Климов, Н.Г.Никульчева. Липиды, липопротеины и атеросклероз. - Питер. Пресс., с.98-102).

Известен способ разделения на фракции ЛП в полиакриламидном геле (Н.Н.Шацкая. Биохимические исследования в оценке состояния сердечно-сосудистой системы. В кн. "Методы исследований в профпатологии", Москва, 1988, с.95-97).

Известны также способы разделения на фракции ЛП путем электрофореза в геле агарозы (Лаб. Методы исследования / Под редакцией В.В.Меньшикова. М.: Медицина, 1987, с.248-249), SU 1720015 А, 15.03.1992, RU 2063040 C1, 27.06.1996, RU 2115121 C1, 10.07.1998, RU 2097038 C1, 27.11.1997, RU 2060034 C1, 20.05.1996, EP 0074610 A, 23.03.1983.

Недостатком данных способов является то, что они не позволяют выявить все фракции ЛП крови, включая хиломикроны(ХМ), липопротеины высокой плотности (ЛПВП), липопротеины низкой плотности (ЛПНП), липопротеины очень низкой плотности (ЛПОНП) и ЛП(а), а служат для разделения на фракции ХМ, ЛПВП, ЛПНП, ЛПОНП от комплекса альбумина с неэтерифицированными жирными кислотами, а также не позволяют выявить минорные фракции модифицированных липопротеинов крови, а именно модифицированных Lipoprotein abnormal (Lp(a) или ЛП(а)).

Известен способ определения фракций липопротеинов крови авторов Канской Н.В., Федоровой Н.А., Перовой Н.В., Гарганеевой Н.П., Кожановой А.А., Байкова А.Н., Канского А.В., Похряева Е.Н. RU 2210079 С2 G01 N 33/92, 10.08.2003. Бюл. №22.

Данный способ является наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому результату и выбран в качестве прототипа, однако он не позволяет выявить минорные фракции модифицированных ЛП(а). Минорная фракция модифицированных ЛП(а) является наиболее атерогенной. Поэтому для ранней диагностики заболевания особенно важно выявление ЛП(а) наряду с максимально полным определением фракций других ЛП крови. Модифицированные ЛП(а) являются предиктом атеросклероза и генетически обусловленным фактором, приводящим к инфаркту миокарда или ишемическому инсульту.

Задачей предлагаемого изобретения является повышение точности способа. Указанная задача достигается тем, что кроме липидов крови определяют до и после лечения модифицированные ЛП(а) путем обработки 0,5 мл сыворотки крови 0,2 мл 0,1% раствора Тритон Х-100, инкубацией 15 мин при 20°С, перемешиванием смеси методом встряхивания 120 раз в 1 мин, с последующим добавлением 7% раствора полиэтиленгликоля 6000 и электрофоретическим разделением в геле агарозы в лунке 4×20 мм и при снижении уровня ЛП(а) на 30% и более, а уровня общего холестерина на 18% и более и увеличении Апо А-1 крови на 25% и более по сравнению с исходным уровнем прогноз течения заболевания считают благоприятным, способствующим переходу стенокардии напряжения ФК III-IV в ФК I-II, а при снижении уровня модифицированных ЛП(а) менее 30%, общего холестерина менее 18% и увеличении Апо А-1 крови менее 25% по сравнению с исходным уровнем прогноз заболевания считают неблагоприятным.

Новым в данном способе является то, что пробу сыворотки крови пациента обрабатывают детергентом тритон Х-100, инкубируют 15 мин при 20°С, перемешивают смесь методом встряхивания 120 раз в 1 мин с последующим добавлением 7% раствора полиэтиленгликоля 6000, что позволяет дополнительно выявлять минорные фракции модифицированных липопротеинов крови и одновременно определяют общий холестерин и Апо А-1 крови до и после лечения ишемической болезни сердца.

Следовательно, только комплексная модернизация способа-прототипа позволяет получить желаемый результат.

Исследование ЛП разных классов при диагностике ишемической болезни сердца (ИБС) рекомендовано Всероссийским научным обществом кардиологов согласно положению рекомендаций Европейского общества по изучению атеросклероза - «Диагностика и коррекция нарушений липидного обмена с целью профилактики и лечения атеросклероза» (г. Москва, 2005 г.; Клиническая лабораторная диагностика, №10, 2008 г., с.21-32).

В настоящее время перспективными являются методы исследования липидов с детергентами /Тритон Х-100 и др./ В лабораторной практике все больше используются прямые или гомогенные методы определения липопротеинов (ЛП) и их липидов. Такие методы основаны на использовании различных детергентов, способных блокировать или солюбилизировать классы ЛП для специфического выделения АПО А-1, ЛПНП и других фракций ЛП.

При использовании таких методов изоляция других классов ЛП не требует дополнительных операций и концентрацию холестерина (ХС) в классах ЛП можно определить напрямую в сыворотке крови общепринятыми ферментными методами в той же кювете (Клиническая лабораторная диагностика, №10, 2008 г., с.21-32).

Увеличение концентрации ЛП abnormal или ЛП (а) в крови считают независимым фактором риска атеросклероза. При содержании в крови ЛП(а) более 300 мкг/мл при норме 0-300 мкг/мл риск возникновения коронарного атеросклероза увеличивается вдвое, а при одновременном повышении уровня ЛП(а) ХС и ХС ЛПНП - в 5 раз (J.A. M.A. - 2001. - Vol.285. - p 2486-2497, Eur. Heart. J. - 2003. - Vol.24, - p. 1601-1610).

Для получения ПЭГ-6000 преципитата сыворотки крови использовался 7%-ный раствор ПЭГ-6000. Известно, что 7%-ный ПЭГ-6000 является предельной концентрацией для получения преципитатов сыворотки крови, содержащих иммунные комплексы и не содержащих грубодисперсных белков сыворотки крови. Применение 6 %-ного раствора ПЭГ-6000 не позволяет полностью осадить иммунные комплексы сыворотки крови. Поэтому для повышения точности способа экспериментальным путем была выбрана 7%-ная концентрация ПЭГ-6000, позволяющая, с одной стороны, полностью осадить иммунные комплексы из сыворотки крови с гарантией отсутствия грубодисперсных (высокомолекулярных) белков сыворотки крови, а с другой стороны, позволяющая полностью осадить циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК), присутствующие в сыворотке крови. Так, в случае концентрации ЦИК в сыворотке крови, равной 2,5 г/л, эта же концентрация ЦИК выявлена в 7%-ных преципитатах сыворотки крови (с результатом +3%), что связано с увеличением числа манипуляций, а не изменением концентрации ЦИК в преципитатах сыворотки крови.

Инкубация 7% ПЭГ-6000 преципитата исследуемой сыворотки крови с красителем Судана Б повышает сродство красителя к ЛП преципитатов крови, а большой объем взятого для исследований образца крови позволяет выявить модифицированные ЛП(а), содержащиеся в крови больных ишемической болезнью сердца (ИБС) в очень низких концентрациях. Дополнительная обработка сыворотки крови тритоном Х-100 позволяет повысить точность способа и получить желаемый результат. Предлагаемый способ позволяет выявлять следующие минорные фракции модифицированных ЛП: ЛПВП, ЛПНП, ЛПОНП и ЛП(а).

Каждый вновь введенный в формулу изобретения признак выполняет функцию повышения точности и эффективности способа: обработка 0,5 мл пробы сыворотки крови пациента 0,2 мл 0,1% раствора тритон Х-100, инкубация пробы при 20°С в течение 15 мин, перемешивание смеси методом встряхивания 120 раз в 1 мин с последующим добавлением 7% раствора полиэтиленгликоля 6000 и дополнительное выявление минорных фракций модифицированных липопротеинов одновременно с определением общего холестерина и Апо А-1 крови до и после лечения ишемической болезни сердца.

В настоящее время особое внимание уделяется исследованию минорных фракций модифицированных ЛП(а), в связи с чем разрабатываются способы лабораторной диагностики, позволяющие исследовать этот липопротеин крови. Он относится к апо-В-содержащим липопротеинам, богатым холестерином (ХС). ЛП(а) идентичен "тонущим" пре-Р-ЛП (sinking pre-β-Lp), имеющим при электрофорезе подвижность пре-β-ЛП. ЛП(а) содержат 27% белка, 8% углеводов и 65% липидов, из которых ЭХС составляют 59%, НЭХС 14%, ФЛ 14%.

Белковым компонентом ЛП(а) является высокогликозилированный полипептид-апо(а), имеющий близкое структурное сродство к плазминогену - одному из факторов системы свертывания - противосвертывания крови. При росте концентрации как ЛП(а), так и его модифицированных форм в крови нарушаются процессы микроциркуляции в кровеносных артериях с возможным образованием микротромбов.

Благодаря наличию в структуре апо(а) сиаловых кислот ЛП(а) более отрицательно заряжен по сравнению с В-ЛП в электрическом поле, лучше растворим в воде, может взаимодействовать с ионами металлов (кальция). Этот липопротеин и его модифицированные формы гетерогенны. Все это свидетельствует об особой роли ЛП(а) и модифицированных ЛП(а) в атерогенезе.

ЛП(а) может взаимодействовать с ЛПНП-рецепторами, оказывая слабое влияние на активность ГМК-КоА редуктазы, на этерификацию ХС. Период полураспада ЛП(а) длиннее, чем у ЛПНП, и составляет 3,3 суток. Содержание ЛП(а) в крови в норме не превышает 30 мг/л. При высокой концентрации в крови ЛП(а) выявляется в местах поражения сосудов в области скопления фибриногена. Повышенная концентрация ЛП(а) часто сочетается с II^a, II⁶ типами гиперлипопротеинемий, при которых часто выявляются модифицированные ЛП. Поэтому в клинической практике крайне важно определение ЛП(а) одновременно с определением белков острой фазы воспаления. Установлено, что большинство гиполипидемических препаратов не влияет на повышенный уровень ЛП(а).

Фракция ЛП(а) гетерогенна. Установлено, что при электрофорезе ЛП(а) находятся в области β-глобулинов, но до 5% ЛП(а) при этом могут выявляться в области α-глобулинов. По причине такой выраженной гетерогенности достаточно сложно оценить при электрофорезе всю фракцию ЛП(а), а тем более ее минорные фракции, которые могут оставаться на линии старта, если размер их частиц достаточно велик. Поэтому использование общепринятого в исследованиях последнего пятидесятилетия детергента тритон Х-100 для обработки сыворотки крови, а именно липопротеинов крови, ведущее к частичной делипидизации ЛП и увеличению их подвижности при электрофорезе, позволяет выявлять минорные фракции ЛП(а). В химической промышленности используются различные детергенты (при изготовлении стирального порошка, моющих средств и т.д.), но при работе с биологическим материалом используется преимущественно Тритон Х-100. Режим обработки пробы Тритоном Х-100 подбирался на основе экспериментальных исследований эмпирическим путем. Для этого использовали различные разведения Тритона Х-100, различную температуру и различную экспозицию в минутах. При использовании различных концентраций раствора Тритон Х-100 малые концентрации (ниже 0,1%) не увеличивали выделения минорных фракций ЛП, в том числе ЛП (а), а высокие концентрации (больше 0,1%) вели к полной делипидизации и разрушению структуры ЛП. Результат проведенного исследования представлен в таблице №1.

Обработка 0,5 мл сыворотки крови для исследования липопротеинов разными концентрациями раствора Тритон Х-100 в течение различного времени инкубации пробы при разной температуре.

Следовательно, оптимальными условиями обработки сыворотки крови раствором Тритон Х-100 является концентрация 0,1% в объеме 0,1 мл, при температуре 20 градусов Цельсия в течение 15 минут.

Поскольку ЛП(а) наиболее атерогенен, очень важно на ранних стадиях заболевания выявлять максимальное содержание ЛП(а) в крови каждого пациента. Это позволяет диагностировать ишемическую болезнь сердца еще до стадии значительных изменений других клинико-лабораторных показателей, повышает точность диагностики заболевания. В свою очередь таким пациентам рано назначается патогенетически обоснованная терапия. Не менее важно выявление минорных фракций ЛП(а) для оценки эффективности терапии заболевания и прогнозирования течения ишемической болезни сердца.

Все сказанное свидетельствует о крайней важности разработки способов лабораторной диагностики, позволяющих наиболее полно выявлять ЛП(а), его модифицированные формы и их минорные фракции.

В настоящее время в широкой клинической лабораторной практике недостаточно используют способы определения ЛП(а). В то же время популярность способа электрофоретического разделения на фракции ЛП крови в геле агарозы обусловлена его высокой чувствительностью, простотой осуществления и достаточной адекватностью получаемых результатов (Клиническая лабораторная диагностика, №10, 2008, С.21-32).

Существенные признаки, характеризующие изобретение, проявили в заявляемой совокупности новые свойства, явным образом не вытекающие из уровня техники в данной области, и не являются очевидными для специалиста.

Идентичной совокупности признаков не обнаружено при изучении патентной и научно-медицинской литературы.

Данное изобретение может быть использовано в медицинской практике для повышения точности диагностики степени атеросклероза при ишемической болезни сердца.

Таким образом, следует считать предлагаемое изобретение соответствующим условиям патентоспособности: «новизна», «изобретательский уровень», «промышленная применимость».

Метод основан на электрофоретической подвижности модифицированных липопротеинов и одновременном определении общего холестерина крови и Апо А-1.

Изобретение будет понятно из следующего описания приложенных чертежей.

На фиг.1 представлены результаты электрофоретического разделения на фракции ЛП сыворотки крови: а - в группе контроля способом-прототипом; б - в группе контроля предлагаемым способом.

На фиг.2а, б представлены результаты электрофоретического разделения на фракции ЛП сыворотки крови в группе больных ИБС до лечения;.

На фиг.3 (а и б) представлены результаты электрофоретического разделения на фракции ЛП сыворотки крови больных после лечения.

На фиг.4 (а, б) представлены результаты электрофоретического разделения на фракции ЛП крови больных ишемической болезнью сердца с гиперхолестеринемией.

На фиг.5 (а, б) представлены результаты электрофоретического разделения на фракции ЛП сыворотки крови больного ишемической болезнью сердца по способу-прототипу и предлагаемому способу.

На фиг.6 (а, б, в) представлены результаты электрофоретического разделения на фракции ЛП сыворотки крови больных по предлагаемому способу у больного ишемической болезнью сердца после лечения, а также до и после лечения у другого пациента с ишемической болезнью сердца.

Способ осуществляется следующим образом поэтапно:

1) приготовление раствора Судана Б: 400 мг Судана Б растворяют в 20 мг этиленгликоля на кипящей водяной бане в течение 50 минут, фильтруют, хранят в стеклянной посуде;

2) приготовление геля агарозы: 320 мг агарозы А фирмы "Sigma" растворяют в 20 мл воды при кипячении, затем помещают в термостат при 55°С; добавляют 20 мл раствора альбумина (1 г альбумина в 200 мл веронал-мединалового буфера, рН 8,6), 3 мл геля агарозы наносят на обезжиренное горизонтально установленное предметное стекло, помещают металлический стальной стержень-брусок 20×4 мм (высотой 10 мм), который после застывания геля убирают магнитом;

3) для исследования взят 1 мл сыворотки крови, который разделен на 2 порции. К 0,5 мл пробы сыворотки крови пациента добавляют 0,2 мл 0,1% раствора Тритон Х-100, инкубируют 15 мин при 20°С, перемешивают смесь методом встряхивания 120 раз в 1 мин, затем добавляют 20 мл 7% полиэтиленгликоля (ПЭГ)-6000 и инкубируют 1 ч при 20°С, центрифугируют 40 мин при 25000 g. Осадок дважды промывают.

4) раствор преципитата используют для электрофоретического исследования. К 0,25 мл преципитата сыворотки крови добавляют 0,15 мл раствора Судана Б, помещают на 1 ч в темный термостат при 40°С, затем добавляют 0,2 мл горячего раствора геля агарозы, смешивают, подогревают при 55°С и подогретым вносят в желобок геля агарозы;

5) предметное стекло помещают в камеру для электрофореза слоем агарозы вниз, электрофорез проводят в течение часа в холодильной камере при температуре 4°С при напряжении 100 В и силе тока 40-45 мА;

6) электрофореграмму фиксируют в 5% растворе уксусной кислоты в течение одного часа, затем высушивают между листами фильтровальной бумаги, непрерывно смачивая 96% этиловым спиртом;

7) денситометрию проводят на микрофотометре МФ-4;

8) проводят электрофорез липопротеинов крови.

Усовершенствование способа касается механического встряхивания пробы с частотой 120 раз в 1 мин с последующей дезинтеграцией пробы на лабораторном встряхивателе для приготовления реактивов фирмы «Immunotech a.s.», Чехия. Более частое или длительное встряхивание с последующей дезинтеграцией ведет к повышению температуры пробы и появлению рекомбинантных форм липопротеинов крови, что препятствует дальнейшему проведению исследования и искажает результат электрофоретического анализа пробы. Менее короткий период встряхивания с последующей дезинтеграцией, равный 30 сек, не позволяет улучшить результат исследования.

Количественную оценку фракций при денситометрии проводят следующим образом: определяют площадь каждого пика на хроматограмме по формуле S=h·B1/2h, где S - площадь пика, h - высота пика, B1/2h - ширина пика на половине его высоты.

Расчет проводится автоматически по соответствующей программе и конечным результатом является процентное содержание каждой фракции липопротеидов, если она есть по отношению ко всей сумме фракций, принятой за 100%.

Общий холестерин крови определяют стандартизированным методом в динамике. Предварительная обработка сыворотки крови раствором Тритон Х-100 не влияет на выполнение анализа.

Метод основан на измерении оптической плотности холестерина и его эфиров с реактивом Либермана-Бурхарда. Большая часть холестерина находится в сыворотке крови в этерифицированном виде, продукт реакции холестерина с указанным реактивом поглощает свет в той же области спектра и имеет несколько больший коэффициент экстинкции, чем продукт реакции свободного холестерина. Для учета этого различия, а также частичного учета матричных эффектов (влияния белков и билирубина на результаты анализа), калибровка метода проводится по калибровочной сыворотке, содержание холестерина в которой определено референтным методом Абеля-Кендала.

Приготовление реактива Либермана-Бурхарда:

600 мл уксусного ангидрида и 300 мл уксусной кислоты наливают в двухлитровую колбу, помещают в ледяную баню и перемешивают на магнитной мешалке, затем приливают 100 мл охлажденной серной кислоты. Через 30 мин колбу удаляют из ледяной бани, ставят на мешалку и добавляют 20 г сульфата натрия, перемешивают до полного растворения соли 4-5 часов. Реактив стабилен 2 недели.

Ход анализа:

1. В сухие пробирки разливают по 5 мл реактива Либермана-Бурхарда, помещают в ледяную баню.

2. В первую пробирку наливают 0,2 мл дистиллированной воды (по стенке, медленно в течение 10 мин). Осторожно встряхивают и помещают в водяную баню.

3. С интервалом в 2 мин в остальную пробирку приливают по 0,2 мл исследуемой сыворотки, встряхивают, помещают в водяную баню.

4. Через 25 мин после добавления воды в первой пробирке измеряют оптическую плотность ее содержания против воды. Далее измеряют исследуемые пробы при длине волны (625±10) нм.

5. Рассчитывают концентрацию холестерина в сыворотке крови по сравнению с калибровочной.

Для растворов продуктов реакции Либермана-Бурхарда закон Бугера-Ламберта-Бера соблюдается в пределах 0-400 мг/дл холестерина.

При проведении повторного исследования после лечения величина фракций ЛП(а) до лечения принимается за 100% и рассчитывается процентное значение величины снижения фракции модифицированных ЛП(а) после проведенной терапии ИБС.

А-1 определяли на анализаторе Konelab (код 981662). Аполипопротеины А образуют большинство основных протеинов, обнаруживаемых в липопротеинах высокой плотности, а также встречаются в хиломикронах. Примерно 50% массы липопротеинов высокой плотности принадлежит белкам, при этом Апо А-I и A-II составляют приблизительно 90% этой массы. Количества А-I и A-II соотносятся примерно как 3:1. Апо А-I и A-II образуются в кишечнике и печени. При попадании в кровь после выделения из кишечника в виде фрагментов хиломиконов Апо А-I и A-II, согласно полученным данным, накапливаются в ЛПВП. Исследования показали, что некоторые частицы липопротеинов содержат только аполипопротеин А-I, а другие частицы содержат как А-I, так и A-II. Аполипопротеин A-II играет роль в активации ЛХАТ (лецитинхолестеринацилтрансферазы) и выведении свободного холестерина из внепеченочных тканей. Высокое содержание Апо В и низкое содержание Апо A-II указывает на повышенный риск развития ИБС.

Методика определения

Метод основан на измерении иммунопреципитации, усиленной полиэтиленгликолем (ПЭГ), при 340 нм. В образцы с буферным раствором добавляется избыток специфичной антисыворотки. Затем регистрируется увеличение поглощения света, вызванное иммунопреципитацией, когда реакция достигает своей конечной точки. Изменение светопоглощения пропорционально количеству антигена I (аполипопротеина А-1), содержащегося в растворе.

Результаты вычисляются автоматически с использованием калибровочной кривой. Нормальное содержание Апо А-1 в сыворотке крови составляет 1,0-2,3 г/л.

В группе контроля в случае использования способа-прототипа (п=10) и предлагаемого способа (п=10) липопротеины не выявлены (фиг.1а и б). Оценен уровень общего холестерина крови, который составил у первых 10 пациентов 4,7±0,5 ммоль/л и у второй группы пациентов 5,4±0,5 ммоль/л и уровень апо А-1, который в I-й группе составил 2,0±0,2 г/л, а во II-й 2,2±0,2 г/л. Нами обследованы 2 группы больных ИБС до и после лечения по 10 пациентов для способа-прототипа I группа и 30 пациентов II группа для перелагаемого способа.

Диагноз пациентов: ИБС, стенокардия напряжения, ФК III-IV.

У пациентов I группы до лечения выявились мЛПНП, мЛПОНП (фиг.2а, б). Уровень холестерина сыворотки крови составил у 8,0±0,7 ммоль/л, а уровень Апо А-1 1,4±0,1 г/л. После лечения при электрофорезе фракции мЛПНП и мЛПОНП стали менее интенсивными (фиг.3а и б).

Уровень общего холестерина сыворотки крови после лечения составил 6,3±0,5 ммоль/л, а уровень Апо А-1 1,6±0,1 г/л.

Диагноз после лечения: ИБС, стенокардия напряжения, ФК II-III. Заключение: прогноз течения ИБС благоприятный, но недостаточно точный. У пациентов II группы до лечения выявлялись модифицированные мЛПНП и мЛПОНП, уровень холестерина составил 7,8±0,7 ммоль/л, а АпоА-1 1,3±0,2 г/л.

После лечения ИБС у 6 пациентов выявлялась следовая трудно определяемая фракция модифицированных ЛП(а) (фиг.4а и б). У остальных пациентов эта фракция не выявлялась.

Уровень общего холестерина сыворотки крови после лечения составил во всей группе 5,2±0,5 ммоль/л, Апо А-1 1,9±0,2 г/л. Диагноз после лечения у пациентов этой группы (29 человек): ИБС, стенокардия напряжения, ФК II. Заключение: прогноз течения ИБС благоприятный. Пациенты этой группы представлены в клинических примерах. У одного пациента второй группы при снижении общего холестерина крови после лечения уровень ЛП(а) в сыворотке крови оставался достаточно высоким. Динамики после лечения выявлено не было. Прогноз течения ИБС у этого пациента расценивался как неблагоприятный.

Ложноположительных и ложноотрицательных случаев нами не выявлено, т.к. оценивались только объективные критерии эффективности проводимой терапии ИБС: результаты велоэргометрии, частота приступов стенокардии и соответственно доза принятого глицерина, а также результаты лабораторных методов исследования, выраженные количественно.

Пример 1. Больной П., 66 лет, история болезни №189, поступил в отделение ИБС и атеросклероза НИИ кардиологии г.Томска. Жалобы при поступлении на боли в области сердца колющего характера, иррадиирующие в левую подлопаточную область. Боли возникали при физической и эмоциональной нагрузке, снимались нитратами пролонгированного действия. Велоэргометрия была прекращена при нагрузке 50 Вт по причине усиления загрудинных болей. АД 70/110 мм рт.ст., пульс в покое 60 уд. в мин. Боли купируются нитроглицерином.

Результаты лабораторного исследования: ХС общий 8,8 ммоль/л, триацилглицериды 1,8 ммоль/л, ХС ЛПВП 1,1 ммоль/л, ЛПВП крови 16%, Апо А-1 1,4 г/л.

Результаты электрофоретического исследования ЛП 7% ПЭГ-6000 преципитата сыворотки крови представлены на фиг.5а, а по предлагаемому способу на фиг.56. Выявлены фракции мЛПНП, мЛПОНП и мЛП(а).

Диагноз при поступлении: ишемическая болезнь сердца, стенокардия напряжения, ФК III-IV.

После проведенного лечения результаты лабораторного исследования: ХС общий 5,6 ммоль/л, триацилглицериды 1,4 ммоль/л, ХС ЛПВП 1,2 ммоль/л, ЛПВП крови 34%, Апо А-1 2,1 г/л.

При электрофоретическом исследовании ЛП 7% ПЭГ-6000 преципитата сыворотки крови по предлагаемому способу фракции ЛП(а) не выявлены. Фиг.6а. содержит линию старта и ослабленную фракцию мЛПНП. Заключение: отсутствие мЛП(а), значительное увеличение уровня ЛПВП крови до 34% и снижение холестерина крови на 65% и рост Апо А-1 на 50% свидетельствует о значительном улучшении состояния больного. Фракция ЛПНП ослаблена.

Диагноз при выписке: ишемическая болезнь сердца, стенокардия напряжения ФК II. Заключение: прогноз течения ИБС благоприятный, о чем свидетельствует уменьшение функционального класса стенокардии напряжения с III-IV до II.

Пример 2. Больной М., 58 лет, история болезни №192, поступил в отделение ИБС и атеросклероза НИИ кардиологии г. Томска с жалобами на боли в области сердца, иррадиирующие под лопатку, возникающие при физической нагрузке. Велоэргометрия была прекращена при нагрузке 50 Вт по причине загрудинной боли и одышки. АД 160/100 мм рт.ст., пульс в покое 66 уд. в мин. Боли купируются нитроглицерином.

Результаты лабораторного исследования: ХС общий 7,8 ммоль/л, триацилглицериды 1,8 м моль/л, ХС ЛПВП 0,9 м моль/л, ЛПВП крови 13%, Апо А-1 1,4 г/л.

Результаты электрофореза 7% ПЭГ-6000 преципитата сыворотки крови выявили наличие мЛПНП, мЛПОНП и мЛП(а) (фиг.6). Результаты денситометрии мЛП: мЛПНП - 50%, мЛПОНП - 42%, м ЛП(а) - 8%.

Диагноз при поступлении: ишемическая болезнь сердца, стенокардия напряжения, ФК III-IV.

После проведенного лечения результаты лабораторного исследования: ХС общий 5,4 ммоль/л, триацилглицериды 1,8 ммоль/л, ХС ЛПВП 1,3 ммоль/л, ЛПВП крови 31%, Апо А-1 2,2 г/л.

Результаты электрофоретического исследования мЛП крови по предлагаемому способу после лечения представлены на фиг.6в. Результаты денситометрии мЛП: мЛПНП - 55%, ЛПОНП - 43%, мЛП(а) - 2%.

Диагноз при выписке: ишемическая болезнь сердца, стенокардия напряжения, ФК II. Снижение уровня ЛГТ(а) на 72%, а общего холестерина на 44% по сравнению с исходным и увеличение Апо А-1 на 57% по сравнению с исходным свидетельствовало об эффективности лечения ИБС. Заключение: лечение и прогноз течения ИБС благоприятный, о чем свидетельствует уменьшение функционального класса стенокардии напряжения с III-IV до II.

Итак, при применении способа-прототипа прогноз течения ИБС основывался на уровне общего холестерина сыворотки крови и клинических данных, поэтому был недостаточно точным. Способ применен у 40 пациентов с ИБС и 20 пациентов группы сравнения (контроль) с нейроциркуляторной дистонией. При снижении уровня мЛП(а) на 30% и более общего холестерина сыворотки крови на 18% и более и увеличение Апо А-1 крови на 25% и более прогноз течения ИБС был оценен как благоприятный, о чем свидетельствовало изменение функционального класса (ФК) стенокардии напряжения с III-IV на I-II, а при изменении только одного из показателей был установлен неблагоприятный прогноз течения ИБС (переход стабильного течения в нестабильную форму стенокардии).

Ложноположительных случаев прогнозирования течения ИБС при использовании предлагаемого нами способа не наблюдалось. При этом предлагаемый способ прост в исполнении и интерпретации полученных результатов.

Таблица 1
Детергент	Концентрация	Время инкубации	Температура, ºС	Выявление фракции ЛП(а)
Тритон X-100	0,1 мл 0,01%	10 минут	15	-
Тритон X-100	0,1 мл 0,01%	15 минут	20	-
Тритон X-100	0,1 мл 0,01%	20 минут	25	-
Тритон X-100	0,1 мл 0,1%	10 минут	15	следы
Тритон X-100	0,1 мл 0,1%	15 минут	20	+
Тритон X-100	0,1 мл 0,1%	20 минут	25	следы
Тритон X-100	0,1 мл 0,15%	10 минут	15	-
Тритон X-100	0,1 мл 0,15%	15 минут	20	-
Тритон X-100	0,1 мл 0,15%	20 минут	25	-

Приложение

Таблица 1. Исследование влияния детергента Тритон Х-100 на выявление фракций липопротеидов при разном времени инкубации и разной температуре, то есть определение оптимальных условий.

Фиг.1. Представлены результаты электрофоретического разделения на фракции ЛП сыворотки крови: а - в группе контроля способом-прототипом; б - в группе контроля предлагаемым способом.

Фиг.2 (а, б). Представлены результаты электрофоретического разделения на фракции ЛП сыворотки крови в группе больных ИБС до лечения.

Фиг.3 (а и б). Представлены результаты электрофоретического разделения на фракции ЛП сыворотки крови больных после лечения.

Фиг.4 (а, б). Представлены результаты электрофоретического разделения на фракции ЛП крови больных ишемической болезнью сердца с гиперхолестеролемией.

Фиг.5 (а, б). Представлены результаты электрофоретического разделения на фракции ЛП сыворотки крови больного ишемической болезнью сердца по способу-прототипу и предлагаемому способу.

Фиг.6 (а, б, в). Представлены результаты электрофоретического разделения на фракции ЛП сыворотки крови больных по предлагаемому способу у больного ишемической болезнью сердца после лечения, а также до и после лечения у другого пациента с ишемической болезнью сердца.

Способ прогнозирования течения ишемической болезни сердца путем исследования липидов сыворотки крови, отличающийся тем, что до и после лечения исследуют модифицированные ЛП(а) путем обработки 0,5 мл сыворотки крови 0,2 мл 0,1% раствора Тритон Х-100, инкубацией 15 мин при 20°С, перемешиванием смеси методом встряхивания 120 раз в 1 мин с последующим добавлением 7% раствора полиэтиленгликоля 6000 и электрофоретическим разделением в геле агарозы в лунке 4×20 мм и при снижении уровня ЛП(а) на 30% и более, а уровня общего холестерина на 18% и более и увеличении Апо А-1 крови на 25% и более по сравнению с исходным уровнем прогноз течения заболевания считают благоприятным, способствующим переходу стенокардии напряжения ФК III-IV в ФК I-II, а при снижении уровня модифицированных ЛП(а) менее 30%, общего холестерина менее 18% и увеличении Апо А-1 крови менее 25% по сравнению с исходным уровнем прогноз заболевания считают неблагоприятным.