Способ диагностики нарушения фагоцитоза у детей
Владельцы патента RU 2512776:
Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (RU)
Изобретение относится к медицине, а именно к способу диагностики нарушения фагоцитоза у детей. Сущность способа состоит в том, что исследуют взвесь лейкоцитов и частиц, содержащих хемоаттрактанты для лейкоцитов, выбранные из ряда нативные зерна пыльцы тимофеевки, ежовника обыкновенного, мелколистного лайма, бирючины обыкновенной, при соотношении 5-30 лейкоцитов на 1 частицу при увеличении микроскопа 15×25. Взвесь наносят на предметное стекло в виде монослоя, определяют количество частиц, присоединивших лейкоциты, до инкубации под микроскопом, инкубируют взвесь при горизонтальном положении предметного стекла, определяют количество частиц, присоединивших лейкоциты, после инкубации. При количестве частиц менее 32% до инкубации или менее 60% после инкубации диагностируют нарушение фагоцитоза у детей. Использование заявленного способа позволяет повысить точность исследования. 3 табл., 6 пр.
Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для диагностики нарушения фагоцитоза у детей при различных заболеваниях.
Известен способ диагностики нарушения фагоцитоза у детей с помощью специальной камеры, снабженной двумя мембранами (верхняя мембрана - проницаемая для лейкоцитов, нижняя мембрана - непроницаемая для лейкоцитов), в верхний отдел которой помещают смесь сыворотки крови и взвеси Staph. Aureus. Камеру инкубируют в термостате в течение нескольких часов, извлекают обе мембраны, фиксируют эти мембраны и окрашивают.Считают количество лейкоцитов на нижней поверхности верхней мембраны и на верхней поверхности нижней мембраны, суммируют их количество и сравнивают с показателями у здорового донора. При снижении этого количества делают заключение о снижении хемотаксиса лейкоцитов у пациента (S.Boyden. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp.Med. 1962. Vol.115. P.453-466).
Недостатки аналога: большой объем крови, требуемый для исследования; необходимость здорового донора для контроля, субъективность оценки нормальных показателей, дорогостоящее, технически сложное оборудование.
Известен способ диагностики нарушения фагоцитоза у детей, согласно которому исследуют взвесь лейкоцитов и нативных пыльцевых зерен тимофеевки (Phleum pratense) до и после ее инкубации в термостатируемой камере при температуре +37°С, определяют процент зерен пыльцы, к которым присоединился хотя бы один лейкоцит. Сравнивают результаты с нормой, полученной в контрольной группе, и при снижении полученных показателей у обследуемого пациента диагностируют нарушение фагоцитоза (Нишева B.C., Звягина И.А., Котина Н.Э., Белова Н.М., Валетова Л.Г., ПлатоноваН.Б., Пешехонова Ю.В., Галустян А.Н., Бутырина ТТ., Бочкова М.Е., Аввакумова А.В., Каплин Н.Н. Особенности иммунного ответа на пыльцевые аллергены у детей раннего возраста. II междисциплинарная конференция по акушерству, перинатологии, неонатологии «Здоровая женщина - здоровый новорожденный», посвященная основоположнику отечественной неонатологии академику А.Ф.Туру.02-03 ноября 2007 г.СПб [Найдено 15.05.2012 г. ON-LINE
http://www.google.ru/url?sa=t&rct=j&q=ybitdf%20t%2Fc%2Fafujwbnjp&source=web&cd=10 &ved=0CF0OFjAJ&url=http%3A%2F%2Fwww.airspb.ru%2F01%2Fzdomov37_doc.doc&ei=l KkuT721DtDt-ga97e2TDg&usg=AFQjCNHGyt LaBO0NxGMDUfZ0a_x3Pendg&cad=rjt]).
Этот способ принят за прототип.
Прототип имеет недостатки:
1. Многослойность лейкоцитов и пыльцевых зерен в исследуемой взвеси. Процент пыльцевых зерен, присоединивших лейкоциты, определяют только на нижней поверхности камеры, куда оседает часть клеток, остальные клетки находятся в верхних слоях, где учет хемотаксиса и адгезии из-за движения клеток и зерен пыльцы невозможен, т.е. выводы о нарушении фагоцитоза делаются на основании анализа только неопределенной части исследуемой смеси.
2. У пациентов с высоким исходным количеством лейкоцитов в плазме крови учет реакции невозможен из-за того, что клетки при оседании на дно камеры формируют сплошной слой и 100% зерен пыльцы становятся окруженными лейкоцитами.
3. У пациентов с низким исходным количеством лейкоцитов в плазме крови учет реакции становится невозможным из-за больших расстояний между зернами пыльцы и лейкоцитами, превышающих расстояния, на которых лейкоциты чувствительны к хемотаксическим факторам.
4. Случайное оседание лейкоцитов под действием силы тяжести на зерна пыльцы, находящиеся на нижней поверхности камеры, приводит к погрешности оценки процента пыльцевых зерен, присоединивших лейкоциты.
5. Необходимость термостатируемой камеры затрудняет проведение исследования в широкой медицинской практике.
Технический результат изобретения состоит в повышении точности способа за счет обеспечения оптимального соотношения лейкоцитов и частиц, содержащих хемоаттрактанты для лейкоцитов, в исследуемой взвеси, а также в упрощении и сокращении времени исследования.
Указанный технический результат достигается тем, что в способе диагностики нарушения фагоцитоза у детей, включающем исследование взвеси лейкоцитов и частиц, содержащих хемоаттрактанты для лейкоцитов, инкубацию взвеси и определение количества частиц, присоединивших лейкоциты, до и после инкубации, согласно изобретению соотношение лейкоцитов и частиц, выбранных из ряда нативные зерна пыльцы тимофеевки, ежовника обыкновенного, мелколистного лайма, бирючины обыкновенной, составляет 5-30 лейкоцитов на 1 частицу при увеличении микроскопа 15×25, взвесь наносят на предметное стекло в виде монослоя, определяют количество частиц, присоединивших лейкоциты, до инкубации, инкубируют взвесь при горизонтальном положении предметного стекла, определяют количество частиц, присоединивших лейкоциты, после инкубации и при количестве частиц менее 32% до инкубации или менее 60% после инкубации диагностируют нарушение фагоцитоза.
В результате проведенных исследований было определено оптимальное соотношение лейкоцитов и частиц, вызывающих хемотаксис, в интервале 5-30 лейкоцитов на 1 частицу.
Исследование стандартного образца с фиксированным соотношением частиц и лейкоцитов исключает ситуации, когда невозможно учесть результаты реакции из-за больших, либо из-за малых расстояний между частицами и лейкоцитами.
Взвесь, наносимая на предметное стекло, образует монослой, что позволяет оценивать способность к хемотаксису и адгезии всех лейкоцитов, а не их неопределенной части.
Горизонтальное расположение монослоя лейкоцитов на предметном стекле позволяет учитывать истинный хемотаксис в отличие от инкубации взвеси лейкоцитов и частиц на поверхности термостатируемой камеры в прототипе, где процесс адгезии лейкоцитов происходит не только за счет хемотаксиса, но и за счет случайного оседания лейкоцитов на частицы под действием силы тяжести.
Исследования проводились с различными частицами: зернами пыльцы таких растений как: тимофеевка, ежовник обыкновенный, мелколистный лайм, бирючина обыкновенная, сосна, береза, ольха, каштан, лещина, яблоня, лилия, одуванчик, мятлик, полынь, роза, черемуха. Были использованы также пекарские дрожжи.
Однако многие из исследованных частиц имеют форму, затрудняющую учет реакции; различные выросты, шипы, впадины между которыми лейкоциты, присоединившиеся к частице, не всегда заметны при микроскопировании. Некоторые частицы, например дрожжи пекарские, имеют меньшие размеры, чем лейкоциты, и после адгезии к ним лейкоцитов быстро фагоцитируются, что также затрудняет учет реакции. Оптимальными частицами для проведения реакции хемотаксиса являются круглые частицы, не имеющие выростов и впадин, размер которых превышает размер лейкоцитов.
Исследования показали, что целесообразно выбрать частицы из ряда нативные зерна пыльцы тимофеевки, ежовника обыкновенного, мелколистного лайма, бирючины обыкновенной. Эти частицы имеют округлую форму и ровную поверхность, их размер превышает размер лейкоцитов.
Контрольная группа в данном исследовании состояла из 36 пациентов в возрасте от 1 месяца до 16 лет без острых и хронических инфекционных и неинфекционных заболеваний, без проявления аллергии на момент обследования, то есть практически здоровых детей, обратившихся для проведения профилактических прививок. Обследование детей проводилось до проведения прививок. Исходные показатели хемотаксиса и адгезии в контрольной группе составляли 32-48% пыльцевых зерен (частиц), присоединивших лейкоциты, показатели хемотаксиса и адгезии после 1-часовой инкубации в термостате при t=+37°С составляли 60-98% и не зависели от возраста, пола и сезона обследования пациентов. Поэтому критериями нарушения фагоцитоза были приняты показатели менее 32% (до инкубации) или менее 60% после инкубации.
Опытная группа состояла из 173 пациентов в возрасте от 1 месяца до 16 лет с различными заболеваниями. Распределение пациентов по заболеваниям и полученным результатам при их обследовании с помощью заявленного способа и способа-прототипа представлено соответственно в табл.1, 2.
Из табл.1 видно, что с помощью заявленного способа нарушения фагоцитоза выявлены у 100% детей с заболеваниями, в патогенезе которых предполагаются дефекты фагоцитарного звена иммунитета: хроническая гранулематозная болезнь, синдром Чедиака-Хигаси. рецидивирующий халязион, хроническая носоглоточная инфекция (хронический тонзиллит, аденоидит), рецидивирующий фурункулез, первичный перитонит.
При исследовании патогенеза заболевания использовался широкий набор иммунологических методов обследования, в том числе показателей фагоцитоза микробов, теста с нитросиним тетразолием, показателей окислительного взрыва лейкоцитов, а также показателей, косвенно влияющих на процессы фагоцитоза, таких как уровень иммуноглобулинов и комплемента в сыворотке крови.
| Таблица 1 | |||||
| Заболевание | Кол-во обследован ных способом-ИЗО |
Кол-во пациентов со сниженными показателями хемотаксиса иадгезии | Кол-во пациентов с выявленными нарушения фагоцитоза (% от общего количества обследованных в данной группе) способом-ИЗО | ||
| до инкубации | после инкубации | до и после инкубации | |||
| Первичный перитонит | 26 | 6 | 8 | 12 | 26 (100%) |
| Острый аппендицит | 12 | 1 | 0 | 0 | 1 (8%) |
| Рецидивирующий фурункулез | 14 | -3 | 3 | 8 | 14 (100%) |
| Острая пневмония | 17 | 0 | 0 | 0 | 0 (0%) |
| Железодефицитная анемия | 8 | 0 | 0 | 0 | 0 (0%) |
| Доброкачественная нейтропения детского возраста | 7 | 0 | 0 | 0 | 0 (0%) |
| Хронический гастродуоденит | 12 | 1 | 0 | 0 | 1(8%) |
| Хроническая носоглоточная инфекция (хронический тонзиллит, аденоидит) | 15 | 2 | 4 | 4 | 10(67%) |
| Врожденные пороки сердца | 5 | 0 | 0 | 0 | 0 (0%) |
| Неущемленные паховые грыжи | 14 | 0 | 0 | 0 | 0 (0%) |
| Острый гастроэнтерит | 12 | 0 | 0 | 0 | 0 (0%) |
| Острая респираторная вирусная инфекция | 16 | 0 | 0 | 0 | 0 (0%) |
| Рецидивирующий халязион | 8 | 3 | 2 | 3 | 8(100%) |
| Хроническая гранулематозная болезнь | 4 | 1 | 1 | 2 | 4 (100%) |
| Синдром Чедиака-Хигаси | 3 | 0 | 0 | 3 | 3 (100%) |
У большинства пациентов с заболеваниями, в патогенезе которых нарушений фагоцитоза обычно не обнаруживается (острая респираторная вирусная инфекция, острый гастроэнтерит, неущемленные паховые грыжи, врожденные пороки сердца, хронический гастродуоденит, доброкачественная нейтропения детского возраста, железодефицитная анемия, острая пневмония, острый аппендицит), не выявлено нарушений фагоцитоза с помощью заявленного способа.
У единичных больных из этой группы выявлены нарушения фагоцитоза - у одного больного с хроническим гастродуоденитом и одного пациента с острым аппендицитом. При подробном сборе анамнеза оказалось, что эти пациенты имели сопутствующие хронические заболевания, которые ассоциируются с дефектами фагоцитарной системы: у пациента с хроническим гастродуоденитом отмечалось плохое заживление ран, даже мелкие ранки часто нагнаивались, в анамнезе у пациента было 2 эпизода фурункулеза, потребовавшего госпитализации в стационар и хирургического лечения. У пациента с острым аппендицитом сопутствующим заболеванием был хронический тонзиллит, при котором также возможны дефекты фагоцитарной системы.
В табл.2 представлены результаты исследования фагоцитоза в опытной группе пациентов с помощью способа-прототипа.
| Таблица 2 | |||||
| Заболевание | Кол-во обследованных (способ-прототип) | Кол-во пациентов, у которых обследование оказалось невозможным из-за низкого или высокого лейкоцитоза | Кол-во пациентов, у которых обследование оказалось возможным | Кол-во пациентов с выявленными нарушениями фагоцитоза (% от кол-ва пациентов, у которых исследование было возможным) | Кол-во пациентов с выявленными нарушениями фагоцитоза (% от общего количества обследованных в данной группе) |
| Первичный перитонит | 26 | 22 | 4 | 2 (50%) | 2 (7,8%) |
| Острый аппендицит | 12 | 10 | 2 | 0 (0%) | 0 (0%) |
| Рецидивирую щий фурункулез | 14 | 11 | 3 | 1 (33,3%) | 1 (7%) |
| Острая пневмония | 17 | 12 | 5 | 0 (0%) | 0 (0%) |
| Железодефицитная анемия | 8 | 2 | 7 | 0 (0%) | 0 (0%) |
| Доброкачественная нейтропения детского возраста | 7 | - 7 | 0 | ||
| Хронический гастродуоденит | 12 | 3 | 9 | 0 (0%) | 0 (0%) |
| Хроническая носоглоточная инфекция (хронический тонзиллит, аденоидит) | 15 | 8 | 7 | 3 (43%) | 3 (20%) |
| Врожденные пороки сердца | 5 | 0 (0%) | 5 | 0 (0%) | 0 (0%) |
| Неущемленные паховые грыжи | 14 | 5 | 9 | 0 (0%) | 0 (0%) |
| Острый гастроэнтерит | 12 | 7 | 8 | 0 (0%) | 0(0%) |
| Острая респираторная вирусная инфекция | 16 | 9 | 7 | 0 (0%) | 0 (0%)11 |
| Рецидивирую щий халязион | 8 | 5 | 3 | 1(33%) | 1 (13%) |
| Хроническая гранулематозная болезнь | 4 | 1 | 3 | 1(33%) | 1(25%) |
| Синдром Чедиака-Хигаси | 3 | 1 | 2 | 1(50%) | 1(33%)ч |
Из табл.2 видно, что исследование с помощью способа прототипа оказалось невозможным у 103 из 173 пациентов (60%) из-за лейкоцитоза, когда лейкоциты оседали на дно камеры и покрывали поля зрения, реже из-за нейтропении, когда в поле зрения были единичные лейкоциты, которые были на большом расстоянии от зерен пыльцы и поэтому не реагировали на хемотаксические стимулы. Из-за этого процент пациентов с выявленными дефектами фагоцитоза был существенно ниже, чем с помощью заявленного изобретения.
В табл.3 представлено сопоставление частоты выявлений нарушения фагоцитоза с помощью заявленного изобретения и способа-прототипа.
Из табл.3 видно, что с помощью заявленного изобретения нарушения фагоцитоза выявлялись достоверно чаще, чем с помощью способа-прототипа.
| Таблица 3 | ||||
| Заболевание | Кол-во обследованных | Кол-во пациентов с выявленными нарушениями фагоцитоза (% от общего кол-ва обследованных в данной группе) | Достоверность различий в частоте выявления нарушений фагоцитоза между изобретением и прототипом | |
| прототип | изобретение | |||
| Первичный перитонит | 26 | 2(7,7%) | 26(100%) | Р<0.05 |
| Острый аппендицит | 12 | 0 (0%) | 1 (8%) | |
| Рецидивирующий фурункулез | 14 | 1 (7%) | 14(100%) | Р<0,05 |
| Острая пневмония | 17 | 0 (0%) | 0 (0%) | |
| Железодефицитная анемия | 8 | 0 (0%) | 0 (0%) | |
| Доброкачественная нейтропения детского возраста | 7 | 0 (0%) | ||
| Хронический гастродуоденит | 12 | 0 (0%) | 1 (8%) | 1 |
| Хроническая носоглоточная инфекция (хронический тонзиллит, аденоидит) | 15 | 3 (20%) | 10(67%) | Р<0,05 |
| Врожденные пороки сердца | 5 | 0 (0%), | 0 (0%) | |
| Неущемленные паховые грыжи | 14 | 0 (0%) | 0 (0%) | |
| Острый гастроэнтерит | 12 | 0 (0%) | 0 (0%) | ' |
| Острая респираторная вирусная инфекция | 16 | 0 (0%) | 0 (0%) | |
| Рецидивирующий халязион | 8 | 1 (13%) | 8 (100%) | Р<0,05 |
| Хроническая грану-лематозная болезнь | 4 | 1(25%) | 4 (100%) | 1 Р<0,05 |
| Синдром Чедиака-Хигаси | 3 | 1(33%) | 3 (100%) | Р<0,05 |
Способ осуществляют, например, следующим образом.
У пациента берут кровь из пальца или из вены в гепаринизированную градуированную пластиковую небольшую пробирку (100 ед гепарина на 1 мл крови). В качестве пробирок используют градуированные эпиндорфы объемом 1-1,5 мл. Для проведения исследования у большинства пациентов достаточно 0,2 мл крови, у пациентов с нейтропенией 0,4-0,5 мл крови для исследования. Пробирку с кровью оставляют на 1 час при комнатной температуре для спонтанного осаждения эритроцитов, при этом над осадком эритроцитов образуется слой плазмы, содержащий лейкоциты. Производят подсчет лейкоцитов в плазме, для этого отбирают из пробирки 10 мкл плазмы с лейкоцитами и смешивают ее со 190 мкл 3% водного раствора уксусный кислоты, заполняют полученной смесью камеру Горяева и определяют концентрацию лейкоцитов общепринятым способом. Образцы плазмы крови, содержащие 3-9×109 лейкоцитов/л пригодны для исследования сразу, а образцы плазмы крови, содержащие менее 3×109 лейкоцитов/л или более 9×109 лейкоцитов/л, подвергают дополнительной обработке, чтобы стандартизовать количество лейкоцитов.
Образцы крови, в плазме которой содержится менее 3×109 лейкоцитов/л в приготовленном для подсчета препарате, центрифугируют 15 мин при 1500 об/мин (перед центрифугированием плазму не отсасывают в отдельную пробирку, а оставляют на осадке эритроцитов, чтобы избежать травматизации лейкоцитов о стенки пробирки при центрифугировании). После центрифугирования лейкоциты оседают на поверхность эритроцитов, над ними образуется слой плазмы без лейкоцитов, лишний объем плазмы удаляют, ресуспендируют кровь путем прокручивания пробирки между ладонями, оставляют пробирку на 1 час и после оседания эритроцитов и образования взвеси плазмы с лейкоцитами кровь исследуют.
Количество плазмы, которую нужно удалить, рассчитывают следующим образом.
Например, исходно у пациента в плазме 1,5×109 лейкоцитов/л. После центрифугирования в пробирке с кровью плазмы содержится 0,2 мл (определяется по градуировке на стенке пробирки). Из пробирки нужно удалить 0,1 мл плазмы, чтобы увеличить количество лейкоцитов до количества, не менее 3×109 лейкоцитов/л.
Образцы плазмы крови, содержащие более 9 х109 лейкоцитов/л, разводят собственной плазмой пациента. Для этого взвесь лейкоцитов с плазмой отсасывают в отдельную пробирку, перемешивают и половину содержимого переносят во вторую пробирку. Вторую пробирку центрифугируют 15 мин при 1500 об/мин, отсасывают плазму и этой плазмой разводят лейкоциты в первой пробирке до необходимого уровня.
Готовят взвесь пыльцевых зерен тимофеевки следующим образом. Пыльцевые зерна разводят физиологическим раствором до такой концентрации, чтобы при смешивании плазмы крови с лейкоцитами и взвеси пыльцевых зерен в равных количествах, на 5-30 лейкоцитов пациента приходилось 1 пыльцевое зерно. Взвесь пыльцевых зерен готовят следующим образом - пыльцевые мешки от одного колоска тимофеевки, собранного в период цветения растения, разводят в 0,4-0,5 мл физиологического раствора и интенсивно пипетируют 20-30 секунд для отделения зерен пыльцы от пыльцевых мешков. Определяют концентрацию зерен пыльцы в растворе с помощью камеры Горяева аналогично определению концентрации лейкоцитов. Разводят полученную взвесь зерен пыльцы таким образом, чтобы концентрация зерен пыльцы была в 5-30 раз меньше, чем количество лейкоцитов у данного пациента. Например, исследуется кровь пациента А. При отстаивании его крови в течение 1 часа получена плазма с концентрацией лейкоцитов 4,5×109/л. При приготовлении раствора пыльцевых зерен в исходном растворе их концентрация составила 1,8×109/л. Этот исходный раствор нужно развести по крайней мере в два раза, тогда концентрация пыльцевых зерен в нем составит 0,9×109/л и при смешивании равных обемов плазмы с лейкоцитами пациента А и взвеси зерен пыльцы соотношение между лейкоцитами и зернами пыльцы составит 5:1.
Полученную взвесь исследуют под микроскопом: 25 мкл взвеси зерен пыльцы помещают на предметное стекло и накрывают ее покровным стеклом 24×24 мм, края которого смазаны вазелином для предотвращения испарения и вытекания исследуемой жидкости. Полученный на стекле препарат рассматривают под микроскопом (увеличение окуляра х15, объектива х25). Подсчитывают количество зерен пыльцы в 10 полях зрения и определяют среднее количество зерен пыльцы в одном поле зрения. Оптимальной является концентрация зерен пыльцы, когда в одном поле зрения видно 2-4 пыльцевых зерна, тогда при смешивании с лейкоцитами на 10-30 лейкоцитов пациента будет приходиться 1-2 пыльцевых зерна (5-30 лейкоцитов на 1 частицу)/
Для оценки фагоцитоза в отдельную пробирку вносят 15 мкл плазмы крови пациента с лейкоцитами, добавляют 15 мкл рабочего раствора пыльцевых зерен, смесь осторожно перемешивают пипетированием и наносят 25 мкл смеси (монослой) на предметное стекло, накрывают смесь покровным стеклом 24×24 мм, края которого смазаны вазелином и сразу же микроскопируют препарат (объектив ×25, окуляр ×15). Подсчитывают 50-100 зерен пыльцы и определяют количество зерен пыльцы, к которым присоединился хотя бы один лейкоцит. Полученный результат выражают в процентах (например, из 50 просмотренных под микроскопом зерен пыльцы к 6 из них присоединились лейкоциты, таким образом, исходные показатели хемотаксиса и адгезии лейкоцитов к зернам пыльцы составляют 12%). После микроскопирования исследуемый препарат (стекло со смесью лейкоцитов и пыльцы) помещают в горизонтальном положении в термостат при температуре +37°С и выдерживают там в течение 1 часа.
После окончания инкубации микроскопируют препарат (объектив ×25, окуляр ×15).
Подсчитывают 50-100 зерен пыльцы и определяют количество зерен пыльцы, к которым присоединился хотя бы один лейкоцит. Полученный результат выражают в процентах (например, из 50 просмотренных под микроскопом зерен пыльцы к 44 из них присоединились лейкоциты, таким образом, конечные показатели хемотаксиса и адгезии лейкоцитов к зернам пыльцы составляют 88%).
Исходя из показателей здоровых детей, указанных ранее, фагоцитоз считают нарушенным при количестве частиц, присоединивших лейкоциты, менее 32% до инкубации или менее 60% после инкубации.
Способ иллюстрируется следующими клиническими примерами.
Пример 1. Девочку 6 лет направили в стационар с диагнозом «Отек Квинке лица», с жалобами на отечность правой стороны лица, повышение температуры до 38,6°. Больна второй день, вначале появилась отечность носа, повысилась температура, затем на второй день отечность распространилась на всю правую половину лица, сохранялась высокая температура. При осмотре отоларингологом в стационаре выявлен фурункул в правом носовом ходе, фурункул вскрыт, назначена антибактериальная терапия, через 2 дня нормализовалась температура тела, через 10 дней ребенок выписан домой. При сборе анамнеза оказалось, что у девочки это был пятый эпизод фурункулеза - с грудного возраста ежегодно бывают фурункулы, локализующиеся на различных областях тела и разрешающиеся либо при местном лечении, либо путем хирургического вскрытия и назначения антибактериальной терапии. У матери девочки также почти ежегодно бывают фурункулы. При клинико-лабораторном обследовании девочки показатели сахара крови, уровень сывороточных иммуноглобулинов, комплемента, фагоцитарная активность и фагоцитарный индекс были в пределах возрастной нормы.
Произвели исследование предлагаемым способом. Приготовили взвесь лейкоцитов и пыльцевых зерен тимофеевки в соотношении 5 лейкоцитов на 1 зерно пыльцы тимофеевки.
При микроскопировании выявлено: количество пыльцевых зерен тимофеевки, присоединивших лейкоциты, до инкубации в термостате составило 12%, а после инкубации при горизонтальном положении предметного стекла - 66%. Сделано заключение о нарушении фагоцитоза у данной пациентки.
Пример 2. Девочка 8 лет, рецидивирующий халязион. В анамнезе 6 эпизодов возникновения халязионов на веках, в трех случаях проводилось хирургическое вскрытие и назначалась антибактериальная терапия. При клинико-лабораторном обследовании девочки показатели сахара крови, уровень сывороточных иммуноглобулинов, комплемента, фагоцитарная активность и фагоцитарный индекс были в пределах возрастной нормы.
Произвели исследование предлагаемым способом. Приготовили взвесь лейкоцитов и пыльцевых зерен тимофеевки в соотношении 15 лейкоцитов на 1 зерно пыльцы тимофеевки.
При микроскопировании выявлено: количество пыльцевых зерен тимофеевки, присоединивших лейкоциты, до инкубации в термостате составило 32%, а после инкубации - 36%. Сделано заключение о нарушении фагоцитоза у данного пациента.
Пример 3. Мальчик 4 лет, жалобы на кашель, повышение температуры до 38,2°. При осмотре выявлена одышка, хрипы мелкопузырчатые в заднемедиальных отделах правого легкого, при рентгенологическом обследовании - инфильтрация в этих же отделах, на основании чего поставлен диагноз «Внебольничная пневмония». Обращало внимание отставание ребенка в психомоторном развитии, горизонтальный нистагм, светлый цвет волос. При клинико-лабораторном обследовании показатели сахара крови, уровень сывороточных иммуноглобулинов, комплемента, фагоцитарная активность и фагоцитарный индекс были в пределах возрастной нормы. В клиническом анализе крови выявлены гигантские гранулы в нейтрофилах, что в совокупности с клинической картиной позволило поставить диагноз «Синдром Чедиака-Хигаси».
Произвели исследование предлагаемым способом. Приготовили взвесь лейкоцитов и пыльцевых зерен тимофеевки в соотношении 30 лейкоцитов на 1 зерно пыльцы тимофеевки.
Количество пыльцевых зерен тимофеевки, присоединивших лейкоциты, до инкубации в термостате составило 4% пыльцевых зерен. После инкубации - 14%. На основании резкого снижения исходных и конечных показателей хемотаксиса и адгезии лейкоцитов к пыльцевым зернам сделано заключение о нарушении фагоцитоза у данного пациента.
Пример 4. Мальчик 10 лет обратился на консультацию к иммунологу с жалобами на рецидивирующие отиты, фурункулез, плохое заживление ран. С 6-месячного возраста перенес 4 гнойных отита, 7 эпизодов фурункулеза, требовавших хирургического вмешательства и антибактериальной терапии. Мать ребенка, отмечает, что любая мелкая травма кожи приводит к нагноению ранки и длительному ее заживлению. При клинико-лабораторном обследовании ребенка показатели сахара крови, уровень сывороточных иммуноглобулинов, комплемента, фагоцитарная активность и фагоцитарный индекс были в пределах возрастной нормы.
Исследование фагоцитоза проводилось как с пыльцевыми зернами тимофеевки, так и с пыльцевыми зернами ежовника обыкновеннго.
При исследовании показателей фагоцитоза с пыльцевыми зернами тимофеевки с помощью заявленного способа выявлено снижение исходных (до инкубации) показателей - 18% пыльцевых зерен. Конечные показатели фагоцитоза находились в пределах нормальных значений - 68% пыльцевых зерен. На основании резкого снижения исходных показателей хемотаксиса и адгезии лейкоцитов к пыльцевым зернам сделано заключение о нарушении фагоцитоза у данного пациента.
При исследовании показателей фагоцитоза с пыльцевыми зернами ежовника обыкновенного с помощью заявленного способа выявлено: до инкубации - 20% пыльцевых зерен, после инкубации - 68% пыльцевых зерен. На основании резкого снижения исходных показателей сделано заключение о нарушении фагоцитоза у данного пациента.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что пыльца ежовника обыкновенного может быть использована в качестве частицы, содержащей хемоаттрактанты для лейкоцитов, для диагностики нарушения фагоцитоза с помощью заявленного способа, поскольку полученные результаты существенно не различались (практически совпадали).
Пример 5. Девочка 12 лет, рецидивирующий фурункулез. В анамнезе 6 эпизодов фурункулезов, в пяти случаях проводилось хирургическое вскрытие и назначалась антибактериальная терапия. При клинико-лабораторном обследовании девочки показатели сахара крови, уровень сывороточных иммуноглобулинов, комплемента, фагоцитарная активность и фагоцитарный индекс были в пределах возрастной нормы.
Исследование фагоцитоза проводилось как с пыльцевыми зернами тимофеевки, так и с пыльцевыми зернами лайма мелколистного.
При исследовании показателей фагоцитоза с зернами пыльцы тимофеевки с помощью заявленного способа исходные (до инкубации в термостате) показатели хемотаксиса и адгезии лейкоцитов к пыльцевым зернам были ниже нормы - адгезия лейкоцитов выявлена к 22% пыльцевых зерен, однако конечные показатели хемотаксиса и адгезии были существенно снижены - 42%. На основании резкого снижения исходных и конечных показателей хемотаксиса и адгезии лейкоцитов к пыльцевым зернам сделано заключение о нарушении фагоцитоза у данной пациентки.
При исследовании фагоцитоза с зернами пыльцы лайма мелколистного получены аналогичные показатели: до инкубации - 22%, после инкубации - 42%. На основании резкого снижения показателей до инкубации и после инкубации сделано заключение о нарушении фагоцитоза у данной пациентки.
Результаты опыта показывают, что пыльцевые зерна лайма мелколистного могут быть использованы в качестве частицы, содержащей хемоаттрактанты для лейкоцитов, для диагностики нарушения фагоцитоза с помощью заявленного способа.
Пример 6. Девочка 5 лет, обратилась в стационар с жалобами на боли в животе, повышение температуры тела до 38°. При осмотре хирургом поставлен диагноз «Аппендицит. Перитонит.» Девочка прооперирована, при операции выявлен перитонит, однако аппендикулярный отросток имел нормальный вид и при его морфологическом исследовании после его удаления признаков его воспаления не выявлено, на основании чего поставлен диагноз «Первичный перитонит».
Исследование фагоцитоза проводилось как с пыльцевыми зернами тимофеевки, так и с пыльцевыми зернами бирючины обыкновенной.
При исследовании показателей фагоцитоза с пыльцевыми зернами тимофеевки с помощью заявленного способа выявлено: до инкубации - 40% пыльцевых зерен, после инкубации - 22%. На основании резкого снижения конечных показателей сделано заключение о нарушении фагоцитоза у данной пациентки.
При исследовании показателей фагоцитоза с пыльцевыми зернами бирючины обыкновенний с помощью заявленного способа получены сходные результаты: до инкубации - 38% пыльцевых зерен, после инкубации - 20%. На основании резкого снижения конечных показателей сделано заключение о нарушении фагоцитоза у данной пациентки.
Таким образом, пыльца бирючины обыкновенной может быть использована в качестве частицы, содержащей хемоаттрактанты для лейкоцитов, при диагностике нарушений фагоцитоза с помощью заявленного способа.
Заявленный способ диагностики нарушения фагоцитоза у детей позволяет во всех случаях повысить точность исследования по сравнению с прототипом (при ряде заболеваний - до 100%), не требует специального оборудования, может быть использован в любой клинической лаборатории у пациентов с различными заболеваниями для выявления нарушений фагоцитоза. Постановка и учет реакции с помощью заявленного способа занимает 10-15 минут, время инкубации в термостате, занимающее 1 час, может быть использовано лаборантом для проведения других исследований.
Способ диагностики нарушения фагоцитоза у детей, включающий исследование взвеси лейкоцитов и частиц, содержащих хемоаттрактанты для лейкоцитов, инкубацию взвеси и определение количества частиц, присоединивших лейкоциты, до и после инкубации, отличающийся тем, что соотношение лейкоцитов и частиц, выбранных из ряда нативные зерна пыльцы тимофеевки, ежовника обыкновенного, мелколистного лайма, бирючины обыкновенной, составляет 5-30 лейкоцитов на 1 частицу при увеличении микроскопа 15×25, взвесь наносят на предметное стекло в виде монослоя, определяют количество частиц, присоединивших лейкоциты, до инкубации, инкубируют взвесь при горизонтальном положении предметного стекла, определяют количество частиц, присоединивших лейкоциты, после инкубации и при количестве частиц менее 32% до инкубации или менее 60% после инкубации диагностируют нарушение фагоцитоза.
