Способ оценки воздействия на организм животных низкоинтенсивного лазерного облучения крови
Владельцы патента RU 2519725:
Голубцова Светлана Васильевна (RU)
Шахов Алексей Гаврилович (RU)
Голубцов Андрей Васильевич (RU)
(57) Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для оценки воздействия на организм животных низкоинтенсивного лазерного облучения крови. У животного проводят забор венозной крови до, во время и после низкоинтенсивного лазерного облучения крови, получают из нее плазму. В термостате готовят фацию при температуре равной температуре тела животного и исследуют ее методом световой микроскопии. В случае деструкции - считают воздействие чрезмерным, а в случае упорядочивания структуры - положительным. Заявленный способ позволяет быстро и точно оценить воздействие на организм животных низкоинтенсивного лазерного облучения крови. 9 ил., 1 табл., 1 пр.
Изобретение относится к области ветеринарной медицины, а именно к способу контроля, обеспечивающему недопущение негативного воздействия на организм при низкоинтенсивном лазерном облучении крови животных.
Установлено, что в процессе низкоинтенсивного лазерного облучения крови изменяется активность ее составных элементов эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов и плазмы. Однако благотворное действие находится в рамках определенных дозовых границах. Крайние дозовые границы варьируют у разных индивидуумов в пределах видовой группы. Это связано с различным исходным функциональным состоянием их органов и систем органов, в том числе и крови. Кроме того, патологические процессы протекающие в организме в период болезни оказывают дополнительное воздействие, изменяющее течение обменных процессов, а следовательно, и функционирование всех органов и их систем. Таким образом, доза лазерного воздействия зависит не только от задачи поставленной перед врачом (профилактика или терапия имеющейся патологии), но и от исходного функционального состояния организма пациента. Поэтому подбор дозы должен осуществляться индивидуально. Исходя из выше сказанного оптимальным является осуществление контроля за изменением свойств плазмы крови под действием низкоинтенсивного лазерного излучения, как непосредственного объекта воздействия, сразу после оказанного воздействия, а не оценивать в последующем отсроченный клинический эффект.
В гуманной медицине известно несколько качественных и количественных биохимических способов определения терапевтической курсовой дозы лазерного излучения.
Определение состояния антиоксидантной системы сыворотки крови, определение активности ферментов ксантиноксидазы и каталазы, появление феномена ″алой крови″ при внутривенном методе лазерной терапии, слежение за деформируемостью мембран эритроцитов в процессе лазеротерапии [RU 2262106, С2, 10.10.2005].
Все указанные методы, кроме выявления феномена ″алой крови″, не внедрены в широкую практическую деятельность врачей в силу их сложности, дороговизны, значительной отсроченности результатов с момента взятия материала. А выявление феномена ″алой крови″ может быть использовано только для внутривенного лазерного облучения крови.
Также известна группа методов структурно оптической оценки сыворотки крови при действии лазерного излучения.
В настоящее время в гуманной медицине известен способ оценки эффективности применения сочетанного медикаментозно-лазерного лечения [RU 2208461, С2, 20.07.2003]. При осуществлении способа исследуют жидкокристаллическую структуру в модельной системе с L-α-лецитином, 10% альбумином в 0,9% хлористом натрии и нативных средах организма после облучения низкоинтенсивным лазером, а также с добавками лекарственного препарата и в случаях их синергического влияния на жидкокристаллическую структуру и нативные среды организма рекомендуют сочетанное применение. Для исследования и оценки влияния применяются структурно-оптические методы (рефрактометрия, поляризационная фотометрия и поляризационная микроскопия). При этом оценивается характер и количество жидкокристаллических структур образующихся в высушенной сыворотке крови, а также показатели их оптического преломления.
Недостатками этого способа является сложность выполнения связанная с необходимостью применения специального оборудования, необходимого для осуществления рефрактометрической и поляризационно-фотометрической микроскопии для проведения исследований. Еще одним недостатком является сложность интерпретации связанная с множеством оценочных критериев которые используются авторами (мелкие и средние структуры сферодендритов, пластинчатые, тонкие игольчатые кристаллы, дендриты, концентрационные волны, двулучепреломляющие и недвулучепреломляющие структуры, маслянистые бороздки и жидкокристаллические линии и тяжи, сферолиты миелиновых форм, образования веерной текстуры).
Известен способ определения индивидуальной чувствительности к низкоинтенсивному лазерному воздействию, включающий поляризационно-оптическое исследование плазмы крови [SU 1635999, А1, 23.03.1991].
Недостатком указанного способа является длительность его реализации и сложность выполнения. Кристаллизация плазмы крови происходит в течение 10-30 часов при температуре 17-30°С в присутствии слабого раствора лецитина, нанесенного на предметное и покровное стекло. Полученные таким образом оптические ячейки помещают между скрещенными поляризаторами, а затем приборно определяют относительную интенсивность проходящего через них света. При разности пропускной способности плазмы крови более 15% до и после облучения говорят о чувствительности организма к облучению.
Известен способ подбора индивидуального курса лазеротерапии для детей [RU 2262106, С2, 10.10.2005]. Способ основан на определении показателей альбуминового теста (резерв связывающей способности альбумина и индекс токсичности) с помощью флюоресцентного альбуминового зонда К-35.
Недостатком способа является то, что набор реактивов производства фирмы ″Зонд″ (г.Москва), ″Зонд-Альбумин″, содержащий в том числе флюоресцентный альбуминовый зонд К-35 в настоящее время не адаптирован для применения при исследовании крови животных. Также при проведении анализа необходимо использовать специальное оборудование анализатор-флюориметр ″АКЛ-0,1 Зонд″. Кроме этого на ферме при групповом содержании животных не всегда, возможно контролировать прием корма конкретной особью, в то время как исследование крови необходимо проводить только натощак.
Наиболее близким по технической сущности к заявляемому изобретению является способ определения вида низкоинтенсивного излучения, эффективно действующего на организм больного [RU 2173458, C1, 10.09.2001], включающий исследование сыворотки крови, помещенной равными объемами в набор пробирок, которые, кроме контрольной, облучают различными видами низкоинтенсивного излучения с последующим хранением в течение 18-20 ч при 5-8°С. После чего капли объемом 0,01-0,03 мл из каждой пробирки наносят на поверхность предметного стекла и высушивают при 20-30°С. Оценку высушенных капель проводят с помощью световой микроскопии. При наличии наиболее выраженных радиальных секторов и конкреций в сухой капле по сравнению с контролем до воздействия устанавливают вид излучения, оптимально действующего на организм больного.
Недостатком метода является то, что он определяет вид излучения, благоприятно действующий на больного, но не выявляет дозы необходимые для получения выраженного положительного клинического эффекта от воздействия не превышающие предельно допустимые. Кроме этого при приготовлении высушенной капли сыворотки крови от животных с указанным температурным режимом капля высыхает вообще без образования трещин. Немаловажным минусом является и длительность осуществления теста, составляющая не менее чем 24 часа.
Технический результат изобретения - быстрая и простая оценка воздействия на организм животных низкоинтенсивного лазерного облучения крови.
Достигается использованием способа оценки воздействия на организм животных низкоинтенсивного лазерного облучения крови.
Способ осуществляется следующим образом. У животного проводят забор венозной крови до, во время и после низкоинтенсивного лазерного облучения крови, получают из нее плазму, в термостате готовят фацию при температуре, равной температуре тела обследуемого животного, и исследуют ее методом световой микроскопии; в случае ее деструкции - считают воздействие чрезмерным, а в случае упорядочивания структуры - положительным.
У животного любого вида проводят забор венозной крови до, во время и после низкоинтенсивного лазерного облучения крови. Минимальное количество крови пригодное для получения плазмы достаточной для проведения исследования указанным методом равно 1 мл. Из крови получают плазму по общепринятой методике. Для приготовления фации с помощью автоматической пипетки-дозатора на чистое предметное стекло наносится капля плазмы крови объемом 0,01 мл. Она высушивается в термостате при температуре равной температуре тела обследуемого животного. Полное высыхание капли плазмы крови с образованием фации со специфическим рисунком происходит через 1-3 часа (в зависимости от температуры в термостате). Исследование фации осуществляется с помощью светового микроскопа с увеличением объектива 2,5-4х. В качестве изменяющихся структурных элементов фации учитывают радиальные и поперечные трещины, сектора, отдельности, конкреции.
Терапевтически обоснованные дозы лазерного излучения оказывают положительное биостимулирующее воздействие на организм. Однако дозы, превышающие терапевтические, вызывают снижение активности ферментных систем, иммунитета, обменных процессов и другие негативные изменения в организме.
Исследователи выделяют 3 фазы действия лазерной энергии на организм: фаза адаптации, фаза терапевтического действия, фаза повреждающего действия.
Длительность каждой фазы индивидуальна для каждого организма. Однако в существующих рекомендациях, методиках и наставлениях предлагаемые к использованию дозы сильно варьируют в зависимости от мощности излучения от 1,5 до 30 мВТ, продолжительности воздействия от 5 до 20 минут и терапевтическом курсе в 5-10 дней.
Фаза повреждающего действия имеет клинические проявления, отсроченные во времени, однако ей предшествуют изменения на молекулярном уровне, определение которых позволит врачу предупредить негативное действие лазерного излучения на организм.
Для достижения поставленной цели была использована возможность интегральной оценки состояния метаболизма организма на основании определения изменения кристаллизационных свойств плазмы крови. Для оценки воздействия низкоинтенсивного лазерного облучения крови использовали приготовленную из плазмы крови фацию. Для этого из вены животного до лазерного воздействия, в процессе и в конце проведения лазерного облучения брали кровь. Получали из нее плазму по общепринятой методике. Приготовление фации плазмы крови проводили модифицированным методом клиновидной дегидратации, отличающимся от способа, известного в гуманной медицине. При этом для приготовления фации использовали каплю плазмы, а не сыворотки крови нанесенную на предметное стекло. Ее высушивание проводили не при 18-30°С, а при температуре, равной температуре тела обследуемого животного. Это связано с тем, что белковые и другие структуры плазмы крови адаптированы именно к физиологичной температуре тела животного и могут изменять свои конформационные свойства при ее снижении или повышении. Этот факт влияет на образующуюся при высыхании кристаллическую решетку фации плазмы крови, и непринятие его во внимание будет приводить к ошибкам в получении и последующей интерпретации результатов исследования. Так, в ходе проведения экспериментов было отмечено, что при температуре 18-30°С трещины на фации плазмы крови коров могут формироваться слабо или вообще отсутствовать (Фото 1-2). На фото 1 - полное отсутствие трещин в фации плазмы крови коровы полученной при температуре 18°С. На фото 2 - появление трещин в фации плазмы крови коровы полученной при температуре 30°С.
Тогда как при 39°С образуются в полном объеме (Фото 3).
Использование способа позволяет упростить подбор индивидуальной дозы лазеротерапии для животных и максимально его адаптировать к условиям работы ветеринарных специалистов.
Предложенный нами способ оценки воздействия на организм при низкоинтенсивном лазерном облучении крови животных выгодно отличается от известных способов тем, что впервые в ветеринарной медицине использован именно адаптированный и модифицированный для животных метод клиновидной дегидратации плазмы крови.
Способ успешно устраняет недостатки применяющихся в настоящее время способов и может применяться для животных любых видов. Способ прост в выполнении, эффективен, позволяет полноценно оценивать состояние организма животного в конце сеанса лазеротерапии. Кроме того, выполнение предложенного способа обеспечивает большую достоверность результатов в отношении животных, чем взятый за основу прототип, и обеспечивает реальную возможность выполнения при осуществлении исследований в производственных условиях.
Новизна способа заключается в том, что впервые в ветеринарной практике для оценки воздействия на организм животных при низкоинтенсивном лазерном облучении крови применялся модифицированный для животных метод клиновидной дегидратации плазмы крови.
Пример
Опыт проводился в СПХ Агрофирма ″Грачевское″ Усманского района Липецкой области. В эксперименте были задействованы клинически здоровые коровы, количественные и качественные морфологические и биохимические показатели крови которых находились в пределах физиологических границ характерных для животных данного вида. Коровам осуществляли надвенное и внутривенное лазерное облучение крови с помощью лазерной излучающей головки КЛO4 мощностью 20 мВт и ВЛОК мощностью 1,5 мВт.
У животных измеряли температуру тела. Затем у них до проведения лазерного облучения, в процессе и в конце отбирали образцы крови из яремной вены и получали из нее плазму. Из плазмы готовили фацию, структуру которой оценивали с помощью световой микроскопии. Оценку производили по следующим параметрам: форма, количество и размеры радиальных и поперечных трещин, отдельностей и конкреций, характер краевого волнового ритма.
Было установлено, что у отобранных в опыт коров исходная картина фации крови имеет отличия в форме, количестве и размерах радиальных и поперечных трещин, отдельностей и конкреций, характере краевого волнового ритма. Примерный вид приведен на фото 4-5. На фото 4 изображена исходная картина периферической части фации плазмы крови до облучения. На фото 5 - исходная картина центральной части фации плазмы крови до облучения.
В процессе облучения отмечалось постепенное изменение структуры фации плазмы крови с тенденцией к наибольшей структурируемости, симметричности и уменьшению амплитуды краевого волнового ритма (Фото 6-7). На фото 6 видна оптимальная картина периферической части фации плазмы крови образующаяся через 7 минут после начала облучения. На фото 7 - оптимальная картина центральной части фации плазмы крови образующаяся через 7 минут после начала облучения.
Однако при больших дозах облучения полученных животным происходила общая деструкция картины фации плазмы крови и полное разрушение краевого волнового ритма (Фото 8-9). На фото 8 - полное разрушение краевого волнового ритма, общая деструкция картины фации плазмы крови через 15 минут после начала облучения. На фото 9 - нарушение рисунка центральной зоны фации плазмы крови через 15 минут после начала облучения.
Как время наступления наилучшей структурируемости, так и время наступления деструкции отличалось у подопытных животных между собой, что говорит о необходимости индивидуального подбора дозы.
Одним из установленных критериев, объективно оценивающих влияние любого фактора, в том числе и низкоинтенсивного лазерного излучения на организм, являются показатели системы антиоксидантной защиты организма и перекисного окисления липидов.
| Таблица | |||||
| Показатели системы антиоксидантной защиты организма и перекисного окисления липидов | |||||
| Показатель | СИ | до начала опыта | 20 мВт, 5 минут | 20 мВт, 7 минут | 20 мВт, 15 минут |
| Каталаза | H2O2/л·мин | 20,31 | 23,2 | 31,89 | 25,9 |
| СОД | УЕ/мг Hb | 0,75 | 0,81 | 1,24 | 0,85 |
| ГПО | мкмоль G-SH/л·мин 103 | 9,87 | 11,3 | 14,37 | 11,85 |
| ГР | мкмоль окисл. глут./л·мин | 295,7 | 301,9 | 309,4 | 303,6 |
| АОА плазмы | л·мин-1·10-3 | 1,38 | 1,41 | 1,87 | 1,51 |
| ДК | ед. опт. пл./мг | 0,93 | 0,86 | 0,57 | 0,70 |
| МДА | мМ/л | 0,78 | 0,71 | 0,46 | 0,65 |
Изменение динамики показателей системы антиоксидантной защиты организма имеет направленно благоприятную тенденцию к увеличению, достигающую максимального значения к 7 минуте облучения. При продолжении облучения наблюдалось неблагоприятное снижение этих показателей отмеченное на 15 минуте. Показатели перекисного окисления липидов находились в противоположной зависимости и благоприятно снижались к 7 минуте облучения, после чего вновь начинали увеличиваться.
Таким образом, изменение динамики показателей системы антиоксидантной защиты организма и перекисного окисления липидов коррелируют по времени с изменениями в структуре фации плазмы крови.
Эволюционно сложившийся механизм функционирования белковых систем человека и различных видов животных отличается температурным режимом. У человека эффективно обменные процессы протекают при 36-37°C. При увеличении температуры до 41-42°C происходит изменение как структуры, так и функции белков в первую очередь центров регуляции жизнедеятельности, которые перестают функционировать, а потом и белков других структур. У животных температурная стабильность белковых систем отличается от человека и имеет внутривидовые особенности. Так, у крупного рогатого скота наиболее эффективно белки функционируют при температуре 39,5-40,5°C, а изменяют свою работу при 42-43°C.
На основании всего вышеизложенного следует заключить, что с помощью нашего технического решения расширились возможности ветеринарных специалистов по оценке воздействия на организм животных при низкоинтенсивном лазерном облучении крови.
Предложенный способ оценки воздействия на организм животных при низкоинтенсивном лазерном облучении крови впервые использован в ветеринарной медицине.
Опираясь на данные, полученные в результате наших исследований, можно заключить, что способ информативен, прост в применении, не требует специальной закупки дорогостоящего оборудования и может быть осуществлен практикующим ветеринарным врачом непосредственно в хозяйстве.
Способ оценки воздействия на организм животных низкоинтенсивного лазерного облучения крови, отличающийся тем, что у животного проводят забор венозной крови до, во время и после низкоинтенсивного лазерного облучения крови, получают из нее плазму, в термостате готовят фацию при температуре, равной температуре тела животного, и исследуют ее методом световой микроскопии; в случае деструкции - считают воздействие чрезмерным, а в случае упорядочивания структуры - положительным.
