Способ изготовления вакцины против ящура
Владельцы патента RU 2522868:
Федеральное государственное унитарное предприятие "Щелковский биокомбинат" (RU)
Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при изготовлении вакцины против ящура. Способ изготовления вакцины против ящура включает культивирование вирусного антигена в суспензионной культуре клеток ВНК-21 при температуре 36-37 °С, очистку вирусной суспензии от балластных примесей, инактивацию, концентрирование полученного антигена вируса ящура и соединение концентрата антигена с адъювантом, при этом очистку вирусной суспензии от балластных примесей проводят добавлением производных полигуанидинов в конечной концентрации 0,005-0,01% или смеси хлороформа и производных полигуанидинов, взятых в весовых соотношениях (40-160):1, соответственно, в конечной концентрации 0,4-0,8. В качестве производных полигуанидинов используют дигидрохлорид 1,12-дигуанидиногексана, или дигидрохлорид бис(3-гуанидинопропил)пиперазина, или дигидрохлорид 3,6-диоксаоктан-1,8-дигуанидина, или дигидрохлорид 4,9-диоксадодекан-1,2-дибигуанида. Изобретение обеспечивает повышение уровня очистки вирусной суспензии от балластных примесей и повышение иммуногенности целевого продукта. 1 з.п. ф-лы, 1 табл.,16 пр.
Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при изготовлении вакцины против ящура.
Известен способ изготовления вакцины против ящура типа О, включающий культивирование вирусного антигена в суспензионной культуре клеток ВНК-21 в течение 10-15 часов при 36-37 °С, причем культивирование прекращают при достижении количества мертвых клеток 90-95%, после чего вирус ящура подвергают инактивации, очищают от балластных примесей, концентрируют полученный антиген и соединяют концентрат антигена с адъювантом. Вакцина, полученная данным способом, содержит авирулентный и очищенный антигенный материал в виде иммуногенных компонентов (146S+75S) вируса ящура типа О, гель гидроокиси алюминия, сапонин и поддерживающую среду (патент РФ №2212895, МПК А61К 39/135, C12N 7/00, 27.09.2003).
Недостатком известного способа изготовления вакцины является негарантированный уровень полученного антигенного материала в связи с оценкой его количества методом определения (1465+758)-компонентов, т.к. капсид вируса 75S как неполная структура антигена склонен к разрушению до капсомеров 12S при температурных колебаниях и других физико-химических факторах.
Известен также способ изготовления вакцины против ящура, включающий культивирование вирусного антигена в суспензионной культуре клеток ВНК-21 при температуре 36-37 °С, очистку вирусной суспензии от балластных примесей, инактивацию, концентрирование полученного антигена вируса ящура и соединение концентрата антигена с адъювантом, причем начиная с 6-8 часов культивирования вирусного антигена через каждые 2 часа определяют процент мертвых клеток, и при достижении его уровня 95% и выше осуществляют дальнейшее культивирование в течение 2-8 часов в зависимости от типа вируса (патент РФ №2332233, МПК А61К 39/135. Бюл. №24, 27.08.2008).
Однако в известном способе недостаточно эффективно проводится очистка вирусной суспензии от балластных примесей, что ведет к снижению иммуногенности целевого продукта.
Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа изготовления вакцины против ящура, позволяющего повысить уровень очистки вирусной суспензии от балластных примесей и иммуногенность целевого продукта.
Поставленная задача решается в способе изготовления вакцины против ящура, включающем культивирование вирусного антигена в суспензионной культуре клеток ВНК-21 при температуре 36-37 °С, очистку вирусной суспензии от балластных примесей, инактивацию, концентрирование полученного антигена вируса ящура и соединение концентрата антигена с адъювантом тем, что очистку вирусной суспензии от балластных примесей проводят добавлением производных полигуанидинов в конечной концентрации 0,005-0,01% или смеси хлороформа и производных полигуанидинов, взятых в весовых соотношениях (40-160):1, соответственно, в конечной концентрации 0,4-0,8%.
Поставленная задача также решается в способе изготовления вакцины против ящура тем, что в качестве производных полигуанидинов используют дигидрохлорид 1,12-дигуанидиногексана, или дигидрохлорид бис(3-гуанидинопропил)пиперазина, или дигидрохлорид 3,6-диоксаоктан-1,8-дигуанидина, или дигидрохлорида 4,9-диоксадодекан-1,2-дибигуанида.
Известны производные полигуанидинов, в частности дигидрохлорида 1,12-дигуанидиногексана, дигидрохлорида бис(3-гуанидинопропил)пиперазина, дигидрохлорида 3,6-диоксаоктан-1,8-дигуанидина, дигидрохлорида 4,9-диоксадодекан-1,2-дибигуанида, используемые в качестве как антитуберкулезные, противовирусные, фунгицидные, противоплесневые и антитрипаносомные препараты (Патент РФ «Производные полигуанидинов» №2230734, МПК С07С 279/02, 2004).
В патентной и научно-технической литературе не известны технические решения, содержащие режимы в способе изготовления вакцины против ящура, аналогичные заявляемому, т.е. предложение соответствует критерию «новизна».
Все режимы способа осуществимы в лабораторных и промышленных условиях, направлены на решение реальной технической задачи, т.е. предложение «промышленно применимо».
В задачу создания изобретения входило разработать способ технического процесса промышленного производства изготовления вакцины против ящура с учетом современных факторов. Нами впервые установлено, что очистка вирусной суспензии от балластных примесей при получении вакцины против ящура проводят добавлением производных полигуанидинов к вирусной суспензии при определенных режимах.
Пример 1. Для изготовления моновалентной вакцины используют вирус ящура А 22 №550, который культивируют в суспензионной культуре клеток ВНК-21 при температуре 36 °С. Через 6 часов культивирования осуществляют отбор проб через каждые 2 часа и подсчитывают живые и мертвые клетки. При достижении количества мертвых клеток более 95% отбор проб прекращают, а культивирование осуществляют еще в течение 2 часов.
Затем в биореактор добавляют производные полигуанидинов (в частности, дигидрохлорид 1,12-дигуанидиногексана) до конечной концентрации 0,01% и передают вирусную суспензию в сборник с температурой 4 °С. После накопления необходимого количества вирусную суспензию подвергают сепарированию. Очистка вирусной суспензии путем добавления производных полигуанидинов и последующее сепарирование позволяют максимально избавиться от фрагментов клеток и балластных белков, являющихся реактогенными факторами.
Осадок, содержащий фрагменты клеток и производные полигуанидинов, отбрасывают, а осветленную вирусную суспензию отправляют на инактивацию. Инактивацию осуществляют путем добавления при перемешивании димера этиленимина до концентрации 0,04% и температуры до 30 °С. Необходимое содержание 1465-компонента в вакцинальной дозе вакцины получают путем концентрирования антигена на геле гидроокиси алюминия. Конечная концентрация 1465-компонента вируса ящура должна быть, по меньшей мере, 0,8 мкг/мл. Добавляют сапонин в качестве адъюванта.
Полученную вакцину 1 расфасовывают и проверяют на стерильность, авирулентность, безвредность, иммуногенную активность.
Пример 2. Для изготовления моновалентной вакцины используют вирус ящура А 22 №550, который культивируют в суспензионной культуре клеток ВНК-21 при температуре 36 °С. Через 6 часов культивирования осуществляют отбор проб через каждые 2 часа и подсчитывают живые и мертвые клетки. При достижении количества мертвых клеток более 95% отбор проб прекращают, а культивирование осуществляют еще в течение 2 часов.
Затем в биореактор добавляют производные полигуанидинов (в частности, дигидрохлорид бис(3-гуанидинопропил)пиперазина) до конечной концентрации 0,01% и передают вирусную суспензию в сборник с температурой 4 °С. После накопления необходимого количества вирусную суспензию подвергают сепарированию. Очистка вирусной суспензии путем добавления производных полигуанидинов и последующее сепарирование позволяют максимально избавиться от фрагментов клеток и балластных белков, являющихся реактогенными факторами.
Осадок, содержащий фрагменты клеток и производные полигуанидинов, отбрасывают, а осветленную вирусную суспензию отправляют на инактивацию. Инактивацию осуществляют путем добавления при перемешивании димера этиленимина до концентрации 0,04% и температуры до 30 °С. Необходимое содержание 1465-компонента в вакцинальной дозе вакцины получают путем концентрирования антигена на геле гидроокиси алюминия. Конечная концентрация 1468-компонента вируса ящура должна быть, по меньшей мере, 0,8 мкг/мл. Добавляют сапонин в качестве адъюванта.
Полученную вакцину 2 расфасовывают и проверяют на стерильность, авирулентность, безвредность, иммуногенную активность.
Пример 3. Для изготовления моновалентной вакцины используют вирус ящура А 22 №550, который культивируют в суспензионной культуре клеток ВНК-21 при температуре 37 °С. Через 8 часов культивирования осуществляют отбор проб через каждые 2 часа и подсчитывают живые и мертвые клетки. При достижении количества мертвых клеток более 95% отбор проб прекращают, а культивирование осуществляют еще в течение 2 часов.
Затем в биореактор добавляют производные полигуанидинов (в частности, дигидрохлорида 3,6-диоксаоктан-1,8-дигуанидина) до конечной концентрации 0,005% и передают вирусную суспензию в сборник с температурой 8 °С. После накопления необходимого количества вирусную суспензию подвергают сепарированию. Очистка вирусной суспензии путем добавления производных полигуанидинов и последующее сепарирование позволяют максимально избавиться от фрагментов клеток и балластных белков, являющихся реактогенными факторами.
Осадок, содержащий фрагменты клеток и производные полигуанидинов, отбрасывают, а осветленную вирусную суспензию отправляют на инактивацию. Инактивацию осуществляют путем добавления при перемешивании димера этиленимина до концентрации 0,04% и температуры до 30 °С. Необходимое содержание 1465-компонента в вакцинальной дозе вакцины получают путем концентрирования антигена на геле гидроокиси алюминия. Конечная концентрация 1465-компонента вируса ящура должна быть, по меньшей мере, 0,8 мкг/мл. Добавляют сапонин в качестве адъюванта.
Полученную вакцину 3 расфасовывают и проверяют на стерильность, авирулентность, безвредность, иммуногенную активность.
Пример 4. Для изготовления моновалентной вакцины используют вирус ящура А 22 №550, который культивируют в суспензионной культуре клеток ВНК-21 при температуре 37 °С. Через 8 часов культивирования осуществляют отбор проб через каждые 2 часа и подсчитывают живые и мертвые клетки. При достижении количества мертвых клеток более 95% отбор проб прекращают, а культивирование осуществляют еще в течение 2 часов.
Затем в биореактор добавляют производные полигуанидинов (в частности, дигидрохлорида 4,9-диоксадодекан-1,2-дибигуанида) до конечной концентрации 0,005% и передают вирусную суспензию в сборник с температурой 8 °С. После накопления необходимого количества вирусную суспензию подвергают сепарированию. Очистка вирусной суспензии путем добавления производных полигуанидинов и последующее сепарирование позволяют максимально избавиться от фрагментов клеток и балластных белков, являющихся реактогенными факторами.
Осадок, содержащий фрагменты клеток и производные полигуанидинов, отбрасывают, а осветленную вирусную суспензию отправляют на инактивацию. Инактивацию осуществляют путем добавления при перемешивании димера этиленимина до концентрации 0,04% и температуры до 30 °С. Необходимое содержание 1465-компонента в вакцинальной дозе вакцины получают путем концентрирования антигена на геле гидроокиси алюминия. Конечная концентрация 1465-компонента вируса ящура должна быть, по меньшей мере, 0,8 мкг/мл. Добавляют сапонин в качестве адъюванта.
Полученную вакцину 4 расфасовывают и проверяют на стерильность, авирулентность, безвредность, иммуногенную активность.
Пример 5. Для изготовления моновалентной вакцины используют вирус ящура 01 Manisa, который культивируют в суспензионной культуре клеток ВНК-21 при температуре 37 °С. Через 8 часов культивирования осуществляют отбор проб через каждые 2 часа и подсчитывают живые и мертвые клетки. При достижении количества мертвых клеток более 95% отбор проб прекращают, а культивирование осуществляют еще в течение 7 часов.
Затем в биореактор добавляют производные полигуанидинов (в частности, дигидрохлорид 1,12-дигуанидиногексана) до конечной концентрации 0,005% и передают вирусную суспензию в сборник с температурой 4 °С. После накопления необходимого количества вирусную суспензию подвергают сепарированию. Очистка вирусной суспензии путем добавления производных полигуанидинов и последующее сепарирование позволяют максимально избавиться от фрагментов клеток и балластных белков, являющихся реактогенными факторами.
Осадок, содержащий фрагменты клеток и производные полигуанидинов, отбрасывают, а осветленную вирусную суспензию отправляют на инактивацию. Инактивацию осуществляют путем добавления при перемешивании димера этиленимина до концентрации 0,04% и температуры до 30 °С. Необходимое содержание 1465-компонента в вакцинальной дозе вакцины получают путем концентрирования антигена на геле гидроокиси алюминия. Конечная концентрация 1465-компонента вируса ящура должна быть, по меньшей мере, 0,8 мкг/мл. Добавляют сапонин в качестве адъюванта.
Полученную вакцину 5 расфасовывают и проверяют на стерильность, авирулентность, безвредность, иммуногенную активность.
Пример 6. Для изготовления моновалентной вакцины используют вирус ящура 01 Manisa, который культивируют в суспензионной культуре клеток ВНК-21 при температуре 37 °С. Через 8 часов культивирования осуществляют отбор проб через каждые 2 часа и подсчитывают живые и мертвые клетки. При достижении количества мертвых клеток более 95% отбор проб прекращают, а культивирование осуществляют еще в течение 8 часов.
Затем в биореактор добавляют производные полигуанидинов (в частности, дигидрохлорид бис(3-гуанидинопропил)пиперазина) до конечной концентрации 0,005% и передают вирусную суспензию в сборник с температурой 4 °С. После накопления необходимого количества вирусную суспензию подвергают сепарированию. Очистка вирусной суспензии путем добавления производных полигуанидинов и последующее сепарирование позволяют максимально избавиться от фрагментов клеток и балластных белков, являющихся реактогенными факторами.
Осадок, содержащий фрагменты клеток и производные полигуанидинов, отбрасывают, а осветленную вирусную суспензию отправляют на инактивацию. Инактивацию осуществляют путем добавления при перемешивании димера этиленимина до концентрации 0,04% и температуры до 30 °С. Необходимое содержание 146S-компонента в вакцинальной дозе вакцины получают путем концентрирования антигена на геле гидроокиси алюминия. Конечная концентрация 146S-компонента вируса ящура должна быть, по меньшей мере, 0,8 мкг/мл. Добавляют сапонин в качестве адъюванта.
Полученную вакцину 6 расфасовывают и проверяют на стерильность, авирулентность, безвредность, иммуногенную активность.
Пример 7. Для изготовления моновалентной вакцины используют вирус ящура 01 Manisa, который культивируют в суспензионной культуре клеток ВНК-21 при температуре 36 °С. Через 6 часов культивирования осуществляют отбор проб через каждые 2 часа и подсчитывают живые и мертвые клетки. При достижении количества мертвых клеток более 95% отбор проб прекращают, а культивирование осуществляют еще в течение 7 часов.
Затем в биореактор добавляют производные полигуанидинов (в частности, дигидрохлорида 3,6-диоксаоктан-1,8-дигуанидина) до конечной концентрации 0,01% и передают вирусную суспензию в сборник с температурой 8 °С. После накопления необходимого количества вирусную суспензию подвергают сепарированию. Очистка вирусной суспензии путем добавления производных полигуанидинов и последующее сепарирование позволяют максимально избавиться от фрагментов клеток и балластных белков, являющихся реактогенными факторами.
Осадок, содержащий фрагменты клеток и производные полигуанидинов, отбрасывают, а осветленную вирусную суспензию отправляют на инактивацию. Инактивацию осуществляют путем добавления при перемешивании димера этиленимина до концентрации 0,04% и температуры до 30 °С. Необходимое содержание 146S-компонента в вакцинальной дозе вакцины получают путем концентрирования антигена на геле гидроокиси алюминия. Конечная концентрация 146S-компонента вируса ящура должна быть, по меньшей мере, 0,8 мкг/мл. Добавляют сапонин в качестве адъюванта.
Полученную вакцину 7 расфасовывают и проверяют на стерильность, авирулентность, безвредность, иммуногенную активность.
Пример 8. Для изготовления моновалентной вакцины используют вирус ящура 01 Manisa, который культивируют в суспензионной культуре клеток ВНК-21 при температуре 36 °С. Через 6 часов культивирования осуществляют отбор проб через каждые 2 часа и подсчитывают живые и мертвые клетки. При достижении количества мертвых клеток более 95% отбор проб прекращают, а культивирование осуществляют еще в течение 8 часов.
Затем в биореактор добавляют производные полигуанидинов (в частности, дигидрохлорида 4,9-диоксадодекан-1,2-дибигуанида) до конечной концентрации 0,01% и передают вирусную суспензию в сборник с температурой 8 °С. После накопления необходимого количества вирусную суспензию подвергают сепарированию. Очистка вирусной суспензии путем добавления производных полигуанидинов и последующее сепарирование позволяют максимально избавиться от фрагментов клеток и балластных белков, являющихся реактогенными факторами.
Осадок, содержащий фрагменты клеток и производные полигуанидинов, отбрасывают, а осветленную вирусную суспензию отправляют на инактивацию. Инактивацию осуществляют путем добавления при перемешивании димера этиленимина до концентрации 0,04% и температуры до 30 °С. Необходимое содержание 146S-компонента в вакцинальной дозе вакцины получают путем концентрирования антигена на геле гидроокиси алюминия. Конечная концентрация 146S-компонента вируса ящура должна быть, по меньшей мере, 0,8 мкг/мл. Добавляют сапонин в качестве адъюванта.
Полученную вакцину 8 расфасовывают и проверяют на стерильность, авирулентность, безвредность, иммуногенную активность.
Пример 9. Для изготовления моновалентной вакцины используют вирус ящура А 22 №550, который культивируют в суспензионной культуре клеток ВНК-21 при температуре 36 °С. Через 6 часов культивирования осуществляют отбор проб через каждые 2 часа и подсчитывают живые и мертвые клетки. При достижении количества мертвых клеток более 95% отбор проб прекращают, а культивирование осуществляют еще в течение 2 часов.
Затем в биореактор добавляют смесь хлороформа и производных полигуанидинов (в частности, дигидрохлорид 1,12-дигуанидиногексана), взятых в весовых соотношениях 40:1, соответственно, до конечной концентрации 0,4% в реакционной среде и передают вирусную суспензию в сборник с температурой 4 °С. После накопления необходимого количества вирусную суспензию подвергают сепарированию. Очистка вирусной суспензии путем добавления смеси производных полигуанидинов и хлороформа и последующее сепарирование позволяют максимально избавиться от фрагментов клеток и балластных белков, являющихся реактогенными факторами.
Осадок, содержащий фрагменты клеток и смесь хлороформа и производных полигуанидинов, отбрасывают, а осветленную вирусную суспензию отправляют на инактивацию. Инактивацию осуществляют путем добавления при перемешивании димера этиленимина до концентрации 0,04% и температуры до 30 °С. Необходимое содержание 146S-компонента в вакцинальной дозе вакцины получают путем концентрирования антигена на геле гидроокиси алюминия. Конечная концентрация 146S-компонента вируса ящура должна быть, по меньшей мере, 0,8 мкг/мл. Добавляют сапонин в качестве адъюванта.
Полученную вакцину 9 расфасовывают и проверяют на стерильность, авирулентность, безвредность, иммуногенную активность.
Пример 10. Для изготовления моновалентной вакцины используют вирус ящура А 22 №550, который культивируют в суспензионной культуре клеток ВНК-21 при температуре 36 °С. Через 6 часов культивирования осуществляют отбор проб через каждые 2 часа и подсчитывают живые и мертвые клетки.
При достижении количества мертвых клеток более 95% отбор проб прекращают, а культивирование осуществляют еще в течение 2 часов.
Затем в биореактор добавляют смесь хлороформа и производных полигуанидинов (в частности, дигидрохлорид 1,12-дигуанидиногексана), взятых в весовых соотношениях 160:1, соответственно, до конечной концентрации 0,8% в реакционной среде и передают вирусную суспензию в сборник с температурой 4 °С. После накопления необходимого количества вирусную суспензию подвергают сепарированию. Очистка вирусной суспензии путем добавления смеси производных полигуанидинов и хлороформа и последующее сепарирование позволяют максимально избавиться от фрагментов клеток и балластных белков, являющихся реактогенными факторами.
Осадок, содержащий фрагменты клеток и смесь хлороформа и производных полигуанидинов, отбрасывают, а осветленную вирусную суспензию отправляют на инактивацию. Инактивацию осуществляют путем добавления при перемешивании димера этиленимина до концентрации 0,04% и температуры до 30 °С. Необходимое содержание 146S-компонента в вакцинальной дозе вакцины получают путем концентрирования антигена на геле гидроокиси алюминия. Конечная концентрация 146S-компонента вируса ящура должна быть, по меньшей мере, 0,8 мкг/мл. Добавляют сапонин в качестве адъюванта.
Полученную вакцину 10 расфасовывают и проверяют на стерильность, авирулентность, безвредность, иммуногенную активность.
Пример 11. Для изготовления моновалентной вакцины используют вирус ящура А 22 №550, который культивируют в суспензионной культуре клеток ВНК-21 при температуре 37 °С. Через 8 часов культивирования осуществляют отбор проб через каждые 2 часа и подсчитывают живые и мертвые клетки. При достижении количества мертвых клеток более 95% отбор проб прекращают, а культивирование осуществляют еще в течение 2 часов.
Затем в биореактор добавляют смесь хлороформа и производных полигуанидинов (в частности, дигидрохлорид бис(3-гуанидинопропил)пиперазина), взятых в весовых соотношениях 40:1 до конечной концентрации 0,4% и передают вирусную суспензию в сборник с температурой 8 °С. После накопления необходимого количества вирусную суспензию подвергают сепарированию. Очистка вирусной суспензии путем добавления смеси производных полигуанидинов и хлороформа и последующее сепарирование позволяют максимально избавиться от фрагментов клеток и балластных белков, являющихся реактогенными факторами.
Осадок, содержащий фрагменты клеток и смесь хлороформа и производных полигуанидинов, отбрасывают, а осветленную вирусную суспензию отправляют на инактивацию. Инактивацию осуществляют путем добавления при перемешивании димера этиленимина до концентрации 0,04% и температуры до 30 °С. Необходимое содержание 146S-компонента в вакцинальной дозе вакцины получают путем концентрирования антигена на геле гидроокиси алюминия. Конечная концентрация 146S-компонента вируса ящура должна быть, по меньшей мере, 0,8 мкг/мл. Добавляют сапонин в качестве адъюванта.
Полученную вакцину 11 расфасовывают и проверяют на стерильность, авирулентность, безвредность, иммуногенную активность.
Пример 12. Для изготовления моновалентной вакцины используют вирус ящура А 22 №550, который культивируют в суспензионной культуре клеток ВНК-21 при температуре 37 °С. Через 8 часов культивирования осуществляют отбор проб через каждые 2 часа и подсчитывают живые и мертвые клетки. При достижении количества мертвых клеток более 95% отбор проб прекращают, а культивирование осуществляют еще в течение 2 часов.
Затем в биореактор добавляют смеси производных полигуанидинов (в частности, дигидрохлорид бис(3-гуанидинопропил)пиперазина) и хлороформа, взятых в весовых соотношениях 160:1 до конечной концентрации 0,8% и передают вирусную суспензию в сборник с температурой 8 °С. После накопления необходимого количества вирусную суспензию подвергают сепарированию. Очистка вирусной суспензии путем добавления смеси производных полигуанидинов и хлороформа и последующее сепарирование позволяют максимально избавиться от фрагментов клеток и балластных белков, являющихся реактогенными факторами.
Осадок, содержащий фрагменты клеток и смесь хлороформа и производных полигуанидинов, отбрасывают, а осветленную вирусную суспензию отправляют на инактивацию. Инактивацию осуществляют путем добавления при перемешивании димера этиленимина до концентрации 0,04% и температуры до 30 °С. Необходимое содержание 146S-компонента в вакцинальной дозе вакцины получают путем концентрирования антигена на геле гидроокиси алюминия. Конечная концентрация 146S-компонента вируса ящура должна быть, по меньшей мере, 0,8 мкг/мл. Добавляют сапонин в качестве адъюванта.
Полученную вакцину 12 расфасовывают и проверяют на стерильность, авирулентность, безвредность, иммуногенную активность.
Пример 13. Для изготовления моновалентной вакцины используют вирус ящура 01 Manisa, который культивируют в суспензионной культуре клеток ВНК-21 при температуре 37 °С. Через 8 часов культивирования осуществляют отбор проб через каждые 2 часа и подсчитывают живые и мертвые клетки. При достижении количества мертвых клеток более 95% отбор проб прекращают, а культивирование осуществляют еще в течение 7 часов.
Затем в биореактор добавляют смесь хлороформа и производных полигуанидинов (в частности, дигидрохлорид 3,6-диоксаоктан-1,8-дигуанидина), взятых в весовых соотношениях 40:1 до конечной концентрации 0,4% и передают вирусную суспензию в сборник с температурой 4 °С. После накопления необходимого количества вирусную суспензию подвергают сепарированию. Очистка вирусной суспензии путем добавления смеси производных полигуанидинов и хлороформа и последующее сепарирование позволяют максимально избавиться от фрагментов клеток и балластных белков, являющихся реактогенными факторами.
Осадок, содержащий фрагменты клеток и смесь хлороформа и производных полигуанидинов, отбрасывают, а осветленную вирусную суспензию отправляют на инактивацию. Инактивацию осуществляют путем добавления при перемешивании димера этиленимина до концентрации 0,04% и температуры до 30 °С. Необходимое содержание 146S-компонента в вакцинальной дозе вакцины получают путем концентрирования антигена на геле гидроокиси алюминия. Конечная концентрация 146S-компонента вируса ящура должна быть, по меньшей мере, 0,8 мкг/мл. Добавляют сапонин в качестве адъюванта.
Полученную вакцину 13 расфасовывают и проверяют на стерильность, авирулентность, безвредность, иммуногенную активность.
Пример 14. Для изготовления моновалентной вакцины используют вирус ящура 01 Manisa, который культивируют в суспензионной культуре клеток ВНК-21 при температуре 37 °С. Через 8 часов культивирования осуществляют отбор проб через каждые 2 часа и подсчитывают живые и мертвые клетки. При достижении количества мертвых клеток более 95% отбор проб прекращают, а культивирование осуществляют еще в течение 8 часов.
Затем в биореактор добавляют смесь хлороформа и производных полигуанидинов (в частности, дигидрохлорид 3,6-диоксаоктан-1,8-дигуанидина), взятых в весовых соотношениях 160:1 до конечной концентрации 0,8% и передают вирусную суспензию в сборник с температурой 4 °С. После накопления необходимого количества вирусную суспензию подвергают сепарированию. Очистка вирусной суспензии путем добавления смеси производных полигуанидинов и хлороформа и последующее сепарирование позволяют максимально избавиться от фрагментов клеток и балластных белков, являющихся реактогенными факторами.
Осадок, содержащий фрагменты клеток и смесь хлороформа и производных полигуанидинов, отбрасывают, а осветленную вирусную суспензию отправляют на инактивацию. Инактивацию осуществляют путем добавления при перемешивании димера этиленимина до концентрации 0,04% и температуры до 30 °С. Необходимое содержание 146S-компонента в вакцинальной дозе вакцины получают путем концентрирования антигена на геле гидроокиси алюминия. Конечная концентрация 146S-компонента вируса ящура должна быть, по меньшей мере, 0,8 мкг/мл. Добавляют сапонин в качестве адъюванта.
Полученную вакцину 14 расфасовывают и проверяют на стерильность, авирулентность, безвредность, иммуногенную активность.
Пример 15. Для изготовления моновалентной вакцины используют вирус ящура 01 Manisa, который культивируют в суспензионной культуре клеток ВНК-21 при температуре 36 °С. Через 6 часов культивирования осуществляют отбор проб через каждые 2 часа и подсчитывают живые и мертвые клетки. При достижении количества мертвых клеток более 95% отбор проб прекращают, а культивирование осуществляют еще в течение 7 часов.
Затем в биореактор добавляют смесь хлороформа и производных полигуанидинов (в частности, дигидрохлорид 4,9-диоксадодекан-1,2-дибигуанида), взятых в весовых соотношениях 40:1 до конечной концентрации 0,4% и передают вирусную суспензию в сборник с температурой 8 °С. После накопления необходимого количества вирусную суспензию подвергают сепарированию. Очистка вирусной суспензии путем добавления смеси производных полигуанидинов и хлороформа и последующее сепарирование позволяют максимально избавиться от фрагментов клеток и балластных белков, являющихся реактогенными факторами.
Осадок, содержащий фрагменты клеток и смесь хлороформа и производных полигуанидинов, отбрасывают, а осветленную вирусную суспензию отправляют на инактивацию. Инактивацию осуществляют путем добавления при перемешивании димера этиленимина до концентрации 0,04% и температуры до 30 °С. Необходимое содержание 146S-компонента в вакцинальной дозе вакцины получают путем концентрирования антигена на геле гидроокиси алюминия. Конечная концентрация 146S-компонента вируса ящура должна быть, по меньшей мере, 0,8 мкг/мл. Добавляют сапонин в качестве адъюванта.
Полученную вакцину 15 расфасовывают и проверяют на стерильность, авирулентность, безвредность, иммуногенную активность.
Пример 16.
Для изготовления моновалентной вакцины используют вирус ящура 01 Manisa, который культивируют в суспензионной культуре клеток ВНК-21 при температуре 36 °С. Через 6 часов культивирования осуществляют отбор проб через каждые 2 часа и подсчитывают живые и мертвые клетки. При достижении количества мертвых клеток более 95% отбор проб прекращают, а культивирование осуществляют еще в течение 8 часов.
Затем в биореактор добавляют смесь хлороформа и производных полигуанидинов (в частности, дигидрохлорид 4,9-диоксадодекан-1,2-дибигуанида), взятых в весовых соотношениях 160:1 до конечной концентрации 0,8% и передают вирусную суспензию в сборник с температурой 8 °С. После накопления необходимого количества вирусную суспензию подвергают сепарированию. Очистка вирусной суспензии путем добавления смеси производных полигуанидинов и хлороформа и последующее сепарирование позволяют максимально избавиться от фрагментов клеток и балластных белков, являющихся реактогенными факторами.
Осадок, содержащий фрагменты клеток и смесь хлороформа и производных полигуанидинов, отбрасывают, а осветленную вирусную суспензию отправляют на инактивацию. Инактивацию осуществляют путем добавления при перемешивании димера этиленимина до концентрации 0,04% и температуры до 30 °С. Необходимое содержание 146S-компонента в вакцинальной дозе вакцины получают путем концентрирования антигена на геле гидроокиси алюминия. Конечная концентрация 146S-компонента вируса ящура должна быть, по меньшей мере, 0,8 мкг/мл. Добавляют сапонин в качестве адъюванта.
Полученную вакцину 16 расфасовывают и проверяют на стерильность, авирулентность, безвредность, иммуногенную активность.
Качество вакцин 1-16, полученных согласно примерам 1-16, проводилось в сравнении с прототипом, данные приведены в таблице.
Таким образом, заявленный способ изготовления вакцины против ящура позволяет повысить в 1,3-1,7 раз уровень очистки вирусной суспензии от балластных примесей и в 1,3-1,5 раз повысить иммуногенность целевого продукта.
| Группа | Содержание балластного белка (мг/мл) | Содержание ИмД50 | Микробная контаминация (% случаев) |
| Вакцина 1 | 0,61 | 16 | - |
| Вакцина 2 | 0,56 | 18 | - |
| Вакцина 3 | 0,52 | 16 | - |
| Вакцина 4 | 0,60 | 16 | - |
| Вакцина 5 | 0,54 | 18 | - |
| Вакцина 6 | 0,52 | 16 | - |
| Вакцина 7 | 0,58 | 18 | - |
| Вакцина 8 | 0,56 | 18 | - |
| Вакцина 9 | 0,60 | 16 | - |
| Вакцина 10 | 0,54 | 16 | - |
| Вакцина 11 | 0,54 | 16 | - |
| Вакцина 12 | 0,60 | 18 | - |
| Вакцина 13 | 0,58 | 18 | - |
| Вакцина 14 | 0,61 | 16 | - |
| Вакцина 15 | 0,58 | 16 | - |
| Вакцина 16 | 0,56 | 16 | - |
| Прототип (очистка хлороформом) | 0,89 | 12 | 100 |
1. Способ изготовления вакцины против ящура, включающий культивирование вирусного антигена в суспензионной культуре клеток ВНК-21 при температуре 36-37 °С, очистку вирусной суспензии от балластных примесей, инактивацию, концентрирование полученного антигена вируса ящура и соединение концентрата антигена с адъювантом, отличающийся тем, что очистку вирусной суспензии от балластных примесей проводят добавлением производных полигуанидинов в конечной концентрации 0,005-0,01% или смеси хлороформа и производных полигуанидинов, взятых в весовых соотношениях (40-160):1, соответственно, в конечной концентрации 0,4-0,8%.
2. Способ изготовления вакцины против ящура по п.1, отличающийся тем, что в качестве производных полигуанидинов используют дигидрохлорид 1,12-дигуанидиногексана, или дигидрохлорид бис(3-гуанидинопропил)пиперазина, или дигидрохлорид 3,6-диоксаоктан-1,8-дигуанидина, или дигидрохлорид 4,9-диоксадодекан-1,2-дибигуанида.
