Ранозаживляющее средство на основе штамма trichoderma harzianum rifai

Авторы патента:

C12N1/14 - микробные грибки (культуры грибов A01G 1/04; грибы в качестве нового вида растений A01H 15/00); питательные среды для них

A61P17/02 - для обработки ран, язв, ожогов, шрамов, келоидов или подобных заболеваний

A61K39/02 - бактериальные антигены

Владельцы патента RU 2528065:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Российский университет дружбы народов" (РУДН) (RU)

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при заживлении раневых повреждений кожного покрова. Ранозаживляющее средство представляет собой концентрат культуральной жидкости штамма Trichoderma harzianum Rifai, депонированного во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под № ВКПМ: F-180, в качестве продуцента L-лизин-альфа-оксидазы и может быть применен как ранозаживляющее средство при повреждении кожного покрова. Изобретение позволяет расширить арсенал средств, обеспечивающих заживление раневых повреждений кожи. 1 табл., 2 пр.

Изобретение относится к биотехнологии, микробиологической промышленности, ветеринарии, косметологии и предназначено для заживления раневых повреждений кожи.

Известен ранозаживляющий пробиотический препарат, включающий культуры бактерий Bacillus subtilis и Lactobacterium plantarum (Патент РФ №2401116). Недостатком препарата является многокомпонентность используемых культур и сложность приготовления средства.

Известен ингибитор вируса герпеса простого 1-ного типа (Патент РФ №2022012, 1994), известен ингибитор вируса иммунодефицита человека (Патент РФ №2022011,1994). В качестве ингибиторов использовался метаболит штамма Trichoderma harzianum Rifai - ВКПМ F-180-гомогенный фермент L-лизин-а-оксидаза (Патент РФ №2022011, 1994). Сведения о ранозаживляющем свойстве данного препарата отсутствуют.

Техническим результатом изобретения является расширение арсенала средств для заживления ран, возникающих при повреждении кожного покрова.

Технический результат достигается тем, что в качестве ранозаживляющего средства при повреждении кожного покрова, применяют концентрат культуральной жидкости штамма Trichoderma harzianum Rifai, депонированного во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под №F-180.

Данный штамм является известным (Авторское свидетельство №1044043, 1991 г.), однако впервые обнаружено неизвестное из уровня техники свойство, обеспечивающее применение концентрата культуральной жидкости данного штамма в качестве средства для заживления раневых повреждений кожи.

Например, возможно создание мазевой композиции как ранозаживляющего средства, предназначенного для лечения раневых повреждений кожи.

Условия культивирования штамма Trichoderma harzianum Rifai ВКПМ F-180 и получение концентрата культуральной жидкости.

Ферментация штамма производилась на оборудовании Опытной технологической установки ИБФМ РАН им. Г.К. Скрябина (г.Пущино). Использовали ферментер типа БИОР-01 производства ОКБ ТБМ, г.Кириши, объемом 100 л с коэффициентом заполнения 0,6. Ферментер оснащен магнитной мешалкой, фильтрами тонкой очистки воздуха, датчиками температуры и pH. Питательную среду готовили непосредственно в аппарате. Для этого в аппарат заливали 60 л водопроводной воды, вносили 1% пшеничных отрубей, стимулятор - 0,1%, 1,3% сульфата аммония, значение pH 5.8-6,0 устанавливали 10% раствором HCl. Пшеничные отруби и стимулятор предварительно замачивали в 10 литрах воды в течение 4-х часов, стерилизовали в автоклаве 1 час при температуре +125°C.

Подготовленный ферментер засевали посевным материалом из колб. Посевная доза не менее 5%. Культивирование проводили при температуре +26°C, расход воздуха на протяжении всей ферментации 30 л в минуту, скорость вращения мешалки 200 оборотов в минуту. Величину pH в процессе роста корректировали до 6,5. Продолжительность выращивания 94-98 часов, конечные значения pH от 5,3 до 7.5.

По окончании ферментации культуральную жидкость направляли на участок предварительной очистки, где мицелий гриба отделяли фильтрованием под вакуумом на нутч-фильтре. Вес полученной биомассы составил 3,5 кг. Полученный нативный раствор подвергали дополнительному сепарированию на сепараторе типа ОСБ при 9000 об./мин, в течение часа при температуре +2-4°C. Затем нативный раствор в объеме 55 л, полученный после отделения биомассы, концентрировали до 1,5 л (концентрат).

Полученный концентрат культуральной жидкости с активностью L-лизин-α-оксидазы 5,4 Ед/мл представляет собой непрозрачную жидкость светло-желтого цвета со слабым грибным запахом, стабильную при хранении. L-лизин-α-оксидаза, белок, ненасыщенные жирные кислоты, моно- и дисахара, крахмал, клетчатка, органические кислоты, витамин B1, витамин B2 (придает окраску), витамин PP, железо, калий, кальций, магний, натрий, фосфор, нитрат натрия.

Условия создания ранозаживляющего средства

Выбор оптимального количества концентрата культуральной жидкости штамма, обеспечивающей достаточный противовоспалительный и ранозаживляющий эффекты, основывался на проведенных ранее исследованиях, целью которых являлось определение активности фермента L-лизин-α-оксидазы на животных (лабораторные морские свинки). Для разработки состава и технологии геля изготовлены модельные образцы с 1%-концентрацией фермента.

Выбор структурообразующих компонентов для изготовления геля осуществлен с учетом терапевтических, технологических и потребительских требований, предъявляемых к препаратам этой группы (Семкина О.А., Джавахян М.А., Левчук Т.А., Охотникова В.Ф. Вспомогательные вещества, используемые в технологии мягких лекарственных форм (мазей, гелей, линиментов, кремов) // Химико-фармацевтический журнал, Т.39, №9, 2005. - С.45-48; Семкина О.А., Суслина С.Н. Краснюк И.И. Обоснование состава геля Эвкалимина на основе сравнительного изучения реологических параметров редкосшитых акриловых полимеров. // Вестник Российского университета дружбы народов, серия "Медицина", специальность "Фармация", №4 (28), 2004. С.216-222). В качестве основ для геля выбраны гидрофильные основы редкосшитых акриловых полимеров (мАРС и Карбопол) и производных метилцеллюлозы (МЦ).

Таким образом, в результате комплекса физико-химических, биологических и реологических исследований разработан следующий состав геля с L-лизин-α-оксидазой. Состав ранозаживляющего средства, мас.%:

Пример №1

Карбопол (974 Р NF)

Европейская фармакопея 2001 г. ст.«Carbomers»	0,8
Концентрат культуральной жидкости с
L-лизин-α-оксидазной активностью 5,4 Ед/мл	0,8
Раствор натрия гидроксида (30%) (ГОСТ 4328-77)	до pH 6,0-6,5
Вода очищенная (ФС 42-2619-97)	до 100,0

Пример №2

Карбопол (974 Р NF)

Европейская фармакопея 2001 г. ст.«Carbomers»	1,2
Концентрат культуральной жидкости с
L-лизин-α-оксидазной активностью 5,4 Ед/мл	1,2
Раствор натрия гидроксида (30%) (ГОСТ 4328-77)	до pH 6,0-6,5
Вода очищенная (ФС 42-2619-97)	до 100,0

Изготовление геля начинают с подготовки ранозаживляющего вещества и основы. В операцию подготовки основы входит процесс растворения и набухания, а также регулирование значения pH с помощью гидроксида натрия.

Изготовление основы “РАП: вода”. В производственную емкость отмеривают рассчитанное количество воды очищенной. Порошок РАПа (карбопол) наслаивают на поверхность воды и оставляют набухать в течение 1 часа, затем систему перемешивают с помощью механической мешалки (ЭКРОС-8100) со скоростью 100-120 об./мин до получения гомогенного геля. После этого при постоянном перемешивании добавляют рассчитанное количество натрия гидроксид, для получения заданного значения pH среды (5,5-6,5). Введение нейтрализующего агента приводит к загущению системы и повышает уровень вязкости. Ингредиенты тщательно перемешивают с помощью высокоскоростной мешалки (ЭКРОС-8100). Полученный гель оставляют до полного завершения структурообразования в течение 4-6 ч.

Изготовление геля с концентратом культуральной жидкости Trichoderma harzianum Rifai-F-180 и исследование ранозаживляющего средства.

Культуральную жидкость (концентрат к.ж.) вносят в полученную основу геля и гомогенизируют на лопастной мешалке (ЭКРОС-8100, 120 об./мин) в течение 10 минут. Проведен опыт на 20 морских свинках, самцах, массой 320±15 г (табл.). Установлено, что гель с концентратом культуральной жидкости Trichoderma harzianum Rifai-F-180 (1%) оказывает ранозаживляющее действие, сокращая средние сроки заживления ран у животных на 5,4 дня по сравнению с контрольной группой (без лечения) и на 4,2 дня по сравнению с плацебо геля соответственно.

Из данных таблицы видно, что разница в сроках излечения животных, относящихся к разным опытным группам, достоверна.

Таблица
Сроки заживления ран (в сутках)
Форма препарата	Животных в группе	Время заживления раны, (сутки)	t₁	t₂	t_п	t_к
Контроль без лечения (к)	5	12,0±0,4 (11,6÷12,4)	5,4	3,4	1,2	-
Гель с L-лизин-α-оксидазой 1% на карбополе(1)	5	6,60±0,48 (6,12÷7,08)	-	-2	-4,2	-5,4
Гель с L-лизин-α-оксидазой 1% на фосфолипидной основе (2)	5	8,60±0,48 (8,12÷9,02)	2	-	-2,2	-3,4
Гель карбопола (без добавления L-лизин-α-оксидазы)(п)	5	10,80±0,32 (10,48÷11, 12)	4,2	2,2	-	-1,2

Примечание: t₁ - время заживления ран с использованием геля с 1% L-лизин-α-оксидазой на карбополе;

t₂ - время заживления ран с использованием геля с 1% L-лизин-α-оксидазой на фосфолипидной основе;

t_п - время заживления ран на карбополе без L-лизин-α-оксидазы;

t_к - время заживления ран (контроль) без лечения.

Полученные результаты экспериментальных исследований показали высокую ранозаживляющую активность геля с 1% концентратом культуральной жидкости штамма Trichoderma harzianum Rifai-F-180.

Предлагаемое ранозаживляющее средство оказывает выраженный ранозаживляющий эффект, способствует более раннему заживлению раны у животных и может применяться при наличии гнойно-некротических масс в ране в ветеринарии.

Применение концентрата культуральной жидкости штамма Trichoderma harzianum Rifai, депонированного во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под № F-180, в качестве ранозаживляющего средства при повреждении кожного покрова.

Изобретение относится к области биохимии и касается применения концентрата культуральной жидкости штамма Trichoderma harzianum Rifai, депонированного во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под № ВКПМ F-180, в качестве ингибитора Андийского вируса крапчатости картофеля.

Питательная среда для выращивания мицелиальных грибов-дерматомицетов из клинического материала // 2527074

Изобретение относится к биотехнологии. Питательная среда для выращивания мицелиальных грибов-дерматомицетов из клинического материала содержит глюкозу, агар бактериологический, пептон мясной, гидролизат казеина, дрожжевой экстракт, хлористый натрий, углекислый натрий, L-цистин, тиогликолевую кислоту и дистиллированную воду в заданном соотношении компонентов.

Способ восстановления чувствительного слоя биосенсора // 2524438

Изобретение относится к биотехнологии. Способ предусматривает обработку чувствительного слоя биосенсора раствором общей фракции протеаз гепатопанкреаса камчатского краба в буфере состава трис-НСl 50 мМ, СаСl2 3 мМ, NaCl 100 мМ, рН 8,0 при температуре раствора в диапазоне 35-40°С.

Способ получения противовирусного средства и противовирусное средство // 2522880

Группа изобретений относится к фармацевтической промышленности, а именно противовирусному средству. Способ получения противовирусного средства проводят путем приготовления посевного мицелия базидиомицета опенок зимний Flammulina velutipes (Curtis) Singer, приготовления жидкой питательной среды, содержащей воду, в качестве источников углерода - растительное масло и мелассу, в качестве источника азота - кукурузную муку, в качестве минеральных солей дигидрофосфат калия и сульфат магния, ее стерилизации, засева приготовленным посевным мицелием стерильной жидкой питательной среды, культивирование в ней базидиомицета в аэробных условиях, полученную погруженную культуру разделяют на биомассу базидиомицета и культуральную жидкость, из которой выделяют сгусток посредством добавления к последней этилового спирта, который отжимают, высушивают и измельчают с получением противовирусного средства, при определенных условиях.

Штамм мицелиального гриба aspergillus oryzae-продуцент мальтогенной альфа-амилазы // 2514224

Изобретение относится к области биотехнологии. Штамм гриба Aspergillus oryzae Аmу Т-52-3-21 продуцирует мальтогенную α-амилазу и депонирован в ВКМ ИБФМ им.

Штамм fusarium sambucinum - продуцент грибной белковой биомассы // 2511427

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен штамм Fusarium sambucinum, депонированный в коллекции ВКПМ под номером F-1161.

Способ получения грибной белковой биомассы // 2511041

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения пищевой грибной биомассы с высоким содержанием белка.

Мутантный штамм glarea lozoyensis и его применение // 2507252

Изобретение относится к области биотехнологии и касается мутантного штамма Glarea lozoyensis и его применения. Мутантный штамм получен путем воздействия на штамм Glarea lozoyensis АТСС 20957 нитрозогуанидином и депонирован в CGMCC под №CGMCC 2933.

Способ обнаружения микроскопических грибов рода coccidioides poasadasii 36 s и coccidioides immitis c-5 // 2503715

Способ обнаружения микроскопических грибов рода Coccidioides posadasii 36 S и Coccidioides immitis C-5 in vitro включает предварительное выращивание культуры в мицелиальной фазе, приготовление взвеси, соответствующей 5ЕД стандартного образца мутности, обеспечение возможности формирования сферул и обнаружение сферул, заполненных эндоспорами.

Способ получения кератиназы из penicillium citrinum // 2499833

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению препаратов кератиназы, и может быть использовано для получения препаратов кератиназ, применяемых в медицине, косметологии, легкой промышленности и сельском хозяйстве.

Лечение инфекции поверхности тела человека или животного // 2527341

Изобретение относится к медицине. Описан способ лечения инфекции поверхности тела человека или животного, в частности заражения грибами, включающий нанесение водной жидкости на инфицированную поверхность тела, например ногтевую область, с последующим наложением повязки, включающей источник перекиси водорода.

Мазь доктора рустамова // 2527335

Изобретение относится к мази, обладающей ранозаживляющим действием, которая состоит из основы эмульсионного типа и фармакологически активного вещества. В качестве фармакологически активного вещества мазь содержит фракцию с Т.

Концентрированная гидрогелевая микрокапсульная композиция и перевязочное средство из нее // 2527331

Изобретение относится к медицине, а именно к фармацевтической композиции и медицинским средствам для лечения (заживления) ран различной этиологии. Описана гидрогелевая композиция, содержащая акрилат натрия, сшивающий агент, биологически активные вещества, поливинилпирролидон, глицерин, пропандиол, воду, катализатор и инициатор радикальной полимеризации при следующем соотношении компонентов, мас.%: акрилат натрия 2,0-10,0, катализатор 0,045-0,48, сшивающий агент 0,195-0,21, инициатор радикальной полимеризации 0,045-0,06, глицерин 4,5-7,5, пропандиол 3,0-10,5, биологически активные вещества 0-1,5, поливинилпирролидон 0,3-1,5, вода остальное.

Композиция для парентерального введения, способ получения и применение композиции // 2526826

Изобретение относится фармацевтической промышленности, а именно к иммуномодулирующей композиции для инъекционного введения млекопитающему. Иммуномодулирующая композиция для инъекционного введения млекопитающему, содержащая гидролизат, полученный с помощью кислотного и/или ферментативного гидролиза одного или более биоресурсов, выбранных из группы, включающей двустворчатых моллюсков, кольчатых червей, пиявок; и воду, взятые в определенном соотношении.

Способ восстановления кожного покрова у пациентов с обширными ранами с дефектом мягких тканей (варианты) // 2526814

Представленная группа изобретений относится к медицине, а именно к дерматологии и хирургии, и может быть применено для восстановления кожного покрова у пациентов с обширными травматическими ранами с дефектом мягких тканей.

Комбинированный трансплантат дермального матрикса с мезенхимальными мультипотентными стромальными клетками, способ его получения и способ лечения ран с его использованием // 2526813

Группа изобретений относится к медицине, а именно к биотехнологии, и может быть использована для восстановления кожного покрова с обширными травматическими ранами с дефектом мягких тканей.

Способ местного лечения ран с помощью биологической повязки, содержащей живые клетки линии диплоидных фибробластов человека // 2526811

Представленная группа изобретений относится к медицине, а именно к дерматологии и хирургии. Способ местного лечения ран, включающий использование биологической повязки, которую накладывают на поверхность раны.

Медицинский клей // 2526188

Изобретение относится к области медицины, а именно к разработке хирургических клеев нового поколения, и может быть использовано для герметизации швов в абдоминальной, торакальной, сосудистой, челюстно-лицевой и нейрохирургии.

Мазь для лечения ожогов, фолликулита, фурункулеза, васкулита и заживления ран // 2526152

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к мазе для лечения ожогов, фолликулита, фурункулеза, васкулита и заживления ран. Мазь для лечения ожогов, фолликулита, фурункулеза, васкулита и заживления ран, которая содержит: воск пчелиный, льняное масло, керосин и внутренний свиной жир, взятые в определенном соотношении.

Способ лечения гнойных ран с использованием модифицированной монтмориллонит содержащей глины // 2524802

Изобретение относится к медицине и ветеринарии и может быть использовано для лечения гнойных ран. Обработку раны в эксперименте производят ежедневно, сначала изотоническим раствором NaCl, а затем наносят модифицированную монтмориллонит содержащую глину, которая содержит от 0,1 до 4,35 масс.% серебра.

Вакцина для защиты от lawsonia intracellularis // 2523561

Группа изобретений относится к медицине, а именно к ветеринарии, и может быть использована для применения композиции для защиты от инфекции, вызываемой Lawsonia intracellularis.