Соли метил(r)-7-[3-амино-4-(2,4,5-трифторфенил)-бутирил]-3-трифторметил-5,6,7,8-тетрагидро-имидазо[1,5-a]пиразин-1-карбоксилата
![Соли метил(r)-7-[3-амино-4-(2,4,5-трифторфенил)-бутирил]-3-трифторметил-5,6,7,8-тетрагидро-имидазо[1,5-a]пиразин-1-карбоксилата](https://img.findpatent.ru/img_data/1179/11799067-s.jpg)
![Соли метил(r)-7-[3-амино-4-(2,4,5-трифторфенил)-бутирил]-3-трифторметил-5,6,7,8-тетрагидро-имидазо[1,5-a]пиразин-1-карбоксилата](https://img.findpatent.ru/img_data/1179/11799068-s.jpg)
Изобретение относится к фармацевтически приемлемым солям метилового эфира (R)-7-[3-амино-4-(2,4,5-трифторфенил)-бутирил]-3-трифторметил-5,6,7,8-тетрагидро-имидазо[1,5-а]пиразин-1-карбоновой кислоты, которые выбраны из группы, состоящей из фосфатной соли, гидрохлоридной соли, сульфатной соли, мезилатной соли, малеатной соли или малатной соли. Также изобретение относится к способу получения указанных солей, их примненеию и фармацевтической композиции на основе указанных солей. Технический результат: получены новые фармацевтически приемлемые соли метилового эфира (R)-7-[3-амино-4-(2,4,5-трифторфенил)-бутирил]-3-трифторметил-5,6,7,8-тетрагидро-имидазо[1,5-а]пиразин-1-карбоновой кислоты, полезные при лечении диабета. 5 н.п. ф-лы, 3 табл., 8 пр.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение относится к фармацевтически приемлемым солям метил(R)-7-[3-амино-4-(2,4,5-трифторфенил)-бутирил]-3-трифторметил-5,6,7,8-тетрагидро-имидазо[1,5-а]пиразин-1-карбоксилата и способам их получения, а также их применению для получения антидиабетических лекарственных препаратов.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
На основании соответствующих данных от ВОЗ, отражающих коэффициент заболеваемости, показатель нетрудоспособности, уровень смертности при сахарном диабете и общий уровень здоровья больных сахарным диабетом, сахарному диабету уже присвоено третье место среди неинфекционных заболеваний, диабеты наряду с опухолями и кардиоваскулярными заболеваниями являются тремя основными болезнями, которые составляют опасность для здоровья человека. Сахарные диабеты обычно классифицируются на 1-й и 2-й типы, существует более 240 миллионов больных диабетом, и 90% из них страдают от диабета 2-го типа, кроме того, их число увеличивается с каждым годом на 1%, таким образом, диабет 2-го типа будет основной новой растущей позицией на рынке диабетических лекарств. Доля заболеваний диабетом в Китае составляет около 5%, количество больных им занимает второе место сразу после Индии. На рынке существует множество антидиабетических лекарств, инъекции инсулина, метформин, росиглитазон, пиоглитазон являются их представителями. Однако не существует лекарства, которое в одиночку способно поддерживать уровень НbА1с у больных диабетом 2-го типа в нужном интервале в течение долгого времени. Даже при использовании в комбинации эффект от лекарств будет уменьшаться год за годом после 3-4 лет. Побочные реакции являются одной из проблем многих гипогликемических препаратов, среди которых в основном беспокойство врачей вызывает фатальная гипогликемия; во-вторых, многие пероральные гипогликемические препараты, такие как сульфонилмочевины, ингибиторы α-гликозидазы и тиазолидиндионы, все могут приводить к увеличению веса у пациентов, некоторые из препаратов могут также способствовать развитию кардиоваскулярных заболеваний.
Вследствие этого, разработка нового типа гипогликемических препаратов, имеющих принципиально новый механизм действия, более высокую безопасность и эффективность, является важной задачей, которую ученым следует скорее выполнить.
В ходе процесса постоянного поиска новых методов было установлено, что эндокринные гормоны играют важную роль в патологии и физиологии диабетов 2-го типа. Дипептидилпептидаза-IV (ДПП-IV) - важный фермент, связанный с диабетами, лечение диабетов 2-го типа за счет ингибирования его действия является новым методом, обладающим хорошими перспективами. Ингибиторы ДПП-IV могут косвенно стимулировать секрецию инсулина, этот эффект появляется за счет ингибирования ДПП-IV для стабилизации эндокринных гормонов, таких как инкретиновые гормоны, глюкагоноподобный пептид-1 (ГПП-1) и глюкозозависимый инсулинотропный полипептид (ГИП).
ГПП-1 - это продукт, экспрессируемый протогеном глюкагона после приема пищи и, в основном, секретируемый L-клетками слизистой оболочки кишечника, он может стимулировать секрецию инсулина β-клетками поджелудочной железы, что играет значительную роль в стабилизации уровня сахара в крови. Эксперименты доказали, что ГПП-1 выполняет следующие физиологические функции: действует на β-клетки поджелудочной железы глюкозозависимым способом, способствует транскрипции генов инсулина, повышает биосинтез и секрецию генов инсулина, стимулирует рост и дифференциацию β-клеток, ингибирует апоптоз β-клеток для увеличения числа β-клеток поджелудочной железы; ингибирует секрецию глюкагона; уменьшает аппетит и прием пищи; замедляет опорожнение содержимого желудка, и т.д., все эти функции способствуют восстановлению уровня сахара в крови после приема пищи и поддержанию сахара в крови на постоянном уровне. Кроме того, это не вызывает опасности появления сильной гипогликемии. ГПП-1 за счет различных механизмов хорошо контролировал уровень сахара в крови при диабете 2-го типа у тестируемых животных и пациентов. Однако ГПП-1 может терять биологическую активность из-за быстрого разрушения под действием ДПП-IV, его период полураспада составляет меньше 2-х минут, что значительно ограничивает клиническое применение ГПП-1. В ходе исследований было установлено, что ингибиторы ДПП-IV могут полностью защитить эндогенный и даже внешний ГПП-1 от дезактивации под действием ДПП-IV, повысить уровень активированного ГПП-1 и уменьшить антагонистический эффект метаболитов ГПП-1. Более того, ингибиторы ДПП-IV могут также препятствовать заболеваемости диабетом за счет стимулирования регенерации β-клеток поджелудочной железы и улучшения толерантности к глюкозе и чувствительности к инсулину.
Ингибиторы дипептидилпептидазы (ДПП-IV) представляют новый класс агентов, которые разрабатывались для лечения или улучшения контроля гликемии у больных диабетом 2-го типа. В обзорах по применению ингибиторов ДПП-IV для лечения диабетов 2-го типа приведены ссылки на следующие публикации: (1) Н.-U.Demuth. et al. “Type 2 diabetes-Therapy with dipeptidyl peptidase IV inhibitors”, Biochim.Biophvs. Acta. 1751:33-44 (2005) и (2) K.Augustyns. et al. “Inhibitors of proline-specific dipeptidyl peptidases: DPP4 inhibitors as a novel approach for the treatment of Type 2 diabetes”, Expert Opin. Ther. Patents, 15:1387-1407 (2005).
В настоящее время некоторые ингибиторы ДПП-IV уже раскрыты (US 5462928, US 5543396, WO 9515309, WO 2003004498, WO 2003082817, WO 2004032836, WO 2004085661), включая МК-0431, как ингибитор ДПП-IV, выпущенный компанией Merck, который показал хорошую ингибиторную активность и селективность и который присутствовал на рынке к 2006 году.
МК-431
Метиловый эфир (R)-7-[3-амино-4-(2,4,5-трифторфенил)-бутирил]-3-трифторметил-5,6,7,8-тетрагидро-имидазо[1,5-а]пиразин-1-карбоновой кислоты, представленный нижеследующей формулой, является соединением А, которое имеет код SP2086.
Соединение А (SP2086)
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Данное изобретение относится к фармацевтически приемлемым солям соединения А и способам их получения, предпочтительно касается преимуществ фосфата и гидрохлорида соединения А по сравнению с другими солями в стабильности, антидиабетической активности и фармакокинетике.
Один аспект данного изобретения относится к фармацевтически приемлемым солям метилового эфира (R)-7-[3-амино-4-(2,4,5-трифторфенил)-бутирил]-3-трифторметил-5,6,7,8-тетрагидро-имидазо[1,5-а]пиразин-1-карбоновой кислоты, где в качестве вышеупомянутых солей выступают обычные для данной области техники неорганические и органические соли, причем неорганическую соль выбирают из группы, состоящей из гидрохлоридной соли, гидробромидной соли, сульфатной соли, нитратной соли или фосфатной соли, предпочтительно из гидрохлоридной соли, сульфатной соли или фосфатной соли, наиболее предпочтительно из гидрохлоридной соли или фосфатной соли; и органическую соль выбирают из группы, состоящей из мезилатной соли, малеатной соли, тартратной соли, сукцинатной соли, ацетатной соли, трифторацетатной соли, фумаратной соли, цитратной соли, бензолсульфанатной соли, бензоатной соли, нафталинсульфонатной соли, лактатной соли или малатной соли, предпочтительно малатной соли, мезилатной соли или малеатной соли. Особенно предпочтительными фармацевтически приемлемыми солями являются гидрохлоридные соли и фосфатные соли, которые более выгодны с точки зрения стабильности, антидиабетической активности и фармакокинетики по сравнению с другими солями.
Другой аспект данного изобретения относится к способам получения фармацевтически приемлемых солей метилового эфира (R)-7-[3-амино-4-(2,4,5-трифторфенил)-бутирил]-3-трифторметил-5,6,7,8-тетрагидро-имидазо[1,5-а]пиразин-1-карбоновой кислоты, которые могут быть получены согласно обычным способам образования солей, используемым в данной области техники.
Данное изобретение дополнительно относится к фармацевтическим композициям, содержащим терапевтически эффективное количество фармацевтически приемлемых солей метилового эфира (R)-7-[3-амино-4-(2,4,5-трифторфенил)-бутирил]-3-трифторметил-5,6,7,8-тетрагидро-имидазо[1,5-а]пиразин-1-карбоновой кислоты и фармацевтически приемлемые носители.
Данное изобретение также относится к применению фармацевтически приемлемых солей метилового эфира (R)-7-[3-амино-4-(2,4,5-трифторфенил)-бутирил]-3-трифторметил-5,6,7,8-тетрагидро-имидазо[1,5-а]пиразин-1-карбоновой кислоты и содержащих их фармацевтических композиций для приготовления антидиабетических лекарственных средств.
Гидрохлоридная соль и фосфатная соль соединения А превосходят само соединение А и другие его соли в стабильности, антидиабетической активности и фармакокинетике.
СПОСОБ СИНТЕЗА ИСХОДНОГО СОЕДИНЕНИЯ SM2086-15 ДЛЯ ДАННОГО ИЗОБРЕТЕНИЯ
Способ синтеза метилового эфира (R)-7-[3-амино-4-(2,4,5-трифторфенил)-бутирил]-3-трифторметил-5,6,7,8-тетрагидро-имидазо[1,5-а]пиразин-1-карбоновой кислоты соответствует способу получения, описанному в примере 1 публикации PCT/CN2008/001936, которая включена в данное описание посредством ссылки.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Пример 1. Получение гидрохлорида соединения A (SP2086-HCL)
Метиловый эфир (R)-7-[3-трет-бутоксикарбониламино-4-(2,4,5-трифторфенил)-бутирил]-3-трифторметил-5,6,7,8-тетрагидро-имидазо[1,5-а]пиразин-1-карбоновой кислоты (SM2086-15) (1,35 кг, 2,40 моль), HCl-этил ацетат (более чем 2М) (12,3 кг) добавляют в 100 л реакционный сосуд и перемешивают до растворения. Смесь реагирует в течение более 2-х часов при нормальной температуре. Предварительно зафиксировав по ТСХ окончание реакции, реакционную смесь упаривают и высушивают откачиванием на масляном насосе, получая 1,15~1,20 кг твердого продукта от белого до светло-желтого цвета с [α]D 20-28,0~-33,0° (С=1, метанол), выход 96,0~100%. Продуктом является гидрохлорид метилового эфира (R)-7-[3-амино-4-(2,4,5-трифторфенил)-бутирил]-3-трифторметил-5,6,7,8-тетрагидро-имидазо[1,5-а]пиразин-1-карбоновой кислоты. (ТСХ детектирование: пластина силикагель GF254, проявляющий реагент-хлороформ:метанол:аммиак=40:1:0,1; исходный материал 15: Rf=0,80, продукт 1:Rf=0,50; проявление в ультрафиолете).
Пример 2. Получение фосфата соединения А (SР2086-H3PO4)
SP2086-HCL (1,20 кг, 2,40 моль) добавляют в 100 л реакционный сосуд и растворяют в дихлорметане (15,2 кг), затем промывают насыщенным раствором бикарбоната натрия (5,8 кг). Водный слой экстрагируют один раз дихлорметаном (6,0 кг). Органические слои объединяют и промывают один раз водой (5 кг), сушат безводным сульфатом натрия. Смесь фильтруют и концентрируют насухо при пониженном давлении при 40°С, получая 1,12 кг масла. Масло перемешивают и растворяют в 30-кратном избытке изопропанола (26,0 кг). Раствор 85% фосфорной кислоты (305,2 г, 2,65 моль) в изопропаноле (1,22 кг) добавляют сразу после полного растворения масла. Выделяют твердое вещество, его отфильтровывают после 2-х часов перемешивания и промывают холодным изопропанолом. Влажный продукт сушат при пониженном давлении при 40°С, получая 1,16~1,24 кг твердого вещества от белого до светло-желтого цвета с выходом 86,0~92,0% (влажный продукт может быть сразу суспендирован в изопропаноле без высушивания).
Пример 3. Получение мезилата соединения А
Гидрохлорид метилового эфира (R)-7-[3-амино-4-(2,4,5-трифторфенил)-бутирил]-3-трифторметил-5,6,7,8-тетрагидро-имидазо[1,5-а]пиразин-1-карбоновой кислоты (SP2086-HCL) (1,20 кг, 2,40 моль) добавляют в 100 л реакционный сосуд и растворяют в дихлорметане (15,2 кг), затем промывают насыщенным раствором бикарбоната натрия (5,8 кг). Водный слой экстрагируют один раз дихлорметаном (6,0 кг). Органические слои объединяют и промывают один раз водой (5 кг), сушат безводным сульфатом натрия. Смесь фильтруют и концентрируют насухо при пониженном давлении при 40°С, получая 1,12 кг масла. Масло перемешивают и растворяют в 30-кратном избытке изопропанола (26,0 кг). Раствор метансульфоновой кислоты (254,7 г, 2,65 моль) в изопропаноле (1,22 кг) добавляют сразу после полного растворения масла. Выделяют твердое вещество, его отфильтровывают после перемешивания в течение 2-х часов и промывают холодным изопропанолом. Влажный продукт высушивают при пониженном давлении при 40°С, получая 1,08~1,21 кг твердого вещества от белого до светло-желтого цвета с выходом 79,5~89,3%.
Пример 4. Получение сульфата соединения А
Гидрохлорид метилового эфира (R)-7-[3-амино-4-(2,4,5-трифторфенил)-бутирил]-3-трифторметил-5,6,7,8-тетрагидро-имидазо[1,5-а]пиразин-1-карбоновой кислоты (SP2086-HCL) (1,20 кг, 2,40 моль) добавляют в 100 л реакционный сосуд и растворяют в дихлорметане (15,2 кг), затем промывают насыщенным раствором бикарбоната натрия (5,8 кг). Водный слой экстрагируют один раз дихлорметаном (6,0 кг). Органические слои объединяют и промывают один раз водой (5 кг), сушат безводным сульфатом натрия. Смесь фильтруют и концентрируют насухо при пониженном давлении при 40°С, получая 1,12 кг масла. Масло перемешивают и растворяют в 30-кратном избытке изопропанола (26,0 кг). Раствор 98% серной кислоты (265,0 г, 2,65 моль) в изопропаноле (1,22 кг) добавляют сразу после полного растворения масла. Выделяют твердое вещество, его отфильтровывают после перемешивания в течение 2-х часов и промывают холодным изопропанолом. Влажный продукт высушивают при пониженном давлении при 40°С, получая 1,14~1,25 кг твердого вещества от белого до светло-желтого цвета с выходом 85,5~93,0% (влажный продукт может быть сразу суспендирован в изопропаноле без высушивания).
Пример 5. Получение малата соединения А
Гидрохлорид метилового эфира (R)-7-[3-амино-4-(2,4,5-трифторфенил)-бутирил]-3-трифторметил-5,6,7,8-тетрагидро-имидазо[1,5-а]пиразин-1-карбоновой кислоты (SP2086-HCL) (1,20 кг, 2,40 моль) добавляют в 100 л реакционный сосуд и растворяют в дихлорметане (15,2 кг), затем промывают насыщенным раствором бикарбоната натрия (5,8 кг). Водный слой экстрагируют один раз дихлорметаном (6,0 кг). Органические слои объединяют и промывают один раз водой (5 кг), сушат безводным сульфатом натрия. Смесь фильтруют и концентрируют насухо при пониженном давлении при 40°С, получая 1,12 кг масла. Масло перемешивают и растворяют в 30-кратном избытке изопропанола (26,0 кг). Раствор L-яблочной кислоты (355,34 г, 2,65 моль) в изопропаноле (26,0 кг) добавляют сразу после полного растворения масла. Выделяют твердое вещество, его отфильтровывают после перемешивания в течение 2-х часов и промывают холодным изопропанолом. Влажный продукт высушивают при пониженном давлении при 40°С, получая 1,19~1,32 кг твердого вещества от белого до светло-желтого цвета с выходом 87,5~92,0% (влажный продукт может быть сразу суспендирован в изопропаноле без высушивания).
Пример 6. Получение малеата соединения А
Гидрохлорид метилового эфира (R)-7-[3-амино-4-(2,4,5-трифторфенил)-бутирил]-3-трифторметил-5,6,7,8-тетрагидро-имидазо[1,5-а]пиразин-1-карбоновой кислоты (SP2086-HCL) (1,20 кг, 2,40 моль) добавляют в 100 л реакционный сосуд и растворяют в дихлорметане (15,2 кг), затем промывают насыщенным раствором бикарбоната натрия (5,8 кг). Водный слой экстрагируют один раз дихлорметаном (6,0 кг). Органические слои объединяют и промывают один раз водой (5 кг), сушат безводным сульфатом натрия. Смесь фильтруют и концентрируют насухо при пониженном давлении при 40°С, получая 1,12 кг масла. Масло перемешивают и растворяют в 30-кратном избытке изопропанола (26,0 кг). Раствор малеиновой кислоты (307,59 г, 2,65 моль) в изопропаноле (1,22 кг) добавляют сразу после полного растворения масла. Выделяют твердое вещество, его отфильтровывают после перемешивания в течение 2-х часов и промывают холодным изопропанолом. Влажный продукт высушивают при пониженном давлении при 40°С, получая1,19~1,32 кг твердого вещества от белого до светло-желтого цвета с выходом 87,5~92,0% (влажный продукт может быть сразу суспендирован в изопропаноле без высушивания).
Пример 7: стабильность соединения А и его солей
(1) Метод определения содержания
Элюирование осуществляют в градиентном режиме с детектированием при длине волны 230 нм при использовании октадецилсилана, химически связанного с силикагелем, в качестве наполнителя и 0,1% водного раствора смеси аммоний-ацетонитрил (65:35) в качестве подвижной фазы. Берут соответствующие количества тестируемого образца и референтного раствора, добавляют воду для их растворения так, чтобы образующиеся растворы содержали в 1 мл 0.2 мг вещества соответственно. Отбирают по 10 мкл раствора тестируемого образца и референтного раствора и вводят в жидкостный хроматограф. Производят запись хроматограммы и выполняют расчет по площади пика в соответствии с методом внутреннего стандарта.
| 0,1% водная смесь | ||
| Время (мин) | ||
| аммоний (%) | ацетонитрил (%) | |
| 0 | 65 | 35 |
| 25 | 45 | 35 |
| 35 | 45 | 35 |
(2) Результаты определения
Стабильность различных видов фармацевтически приемлемых солей соединения А при различных условиях
(чистота исходного материала: 98,6%, применение ВЭЖХ для определения содержания проб)
| Название Условия | |||||||
| Соедине ние А |
Гидрохло рид |
Мези лат |
Сульфат | Фосфат | Малат | Малеат | |
| 10 дней свет | |||||||
| 95,2% | 98,1% | 97,6% | 97,6% | 98,6% | 95,7% | 94,2% | |
| 40°С 10 дней | |||||||
| 95,2% | 98,7% | 96,7% | 96,6% | 98,7% | 96,8% | 94,2% | |
| 60°С 10 дней | |||||||
| 95,7% | 98,2% | 96,5% | 97,7% | 98,5% | 96,5% | 96,2% | |
| 0 В 75% 6 мес. 40°С | |||||||
| 92,2% | 97,7% | 95,4% | 96,2% | 98,3% | 97,2% | 93,8% | |
| ОВ 60% 9 мес. 25°С | |||||||
| 93,3% | 97,5% | 95,6% | 96,7% | 98,6% | 94,9% | 94,6% | |
Вывод: Результаты тестов на стабильность показали, что гидрохлориды и фосфаты соединения А наиболее соответствуют требованиям, особенно стабильность фосфатов и стабильность вышеупомянутых двух солей лучше по сравнению с самим соединением А.
Пример 8: Изучение соответствующей биологической активности фармацевтически приемлемых солей соединения А
Тестовый пример 1: Изучение in vitro активности и селективности соединения А, МК-0431
Способ: Размороженный DPP4-Glo. помещают в буфер и доводят до комнатной температуры и криоконсервированный флуоресцирующий тестовый агент помещают в буфер перед применением. DPP4-Glo. суспендируют с субстратом и добавляют ультрачистой воды, смесь слегка перемешивают до однородности для получения 1 мМ раствора субстрата. Флуоресцирующий тестовый агент помещают в бутыль темного стекла и добавляют DPP4-Glo. Флуоресцирующий тестовый агент следует растворить в течение 1 минуты. Тестируемое соединение растворяют в ДМСО в концентрации в 50 раз превышающей его конечную концентрацию в процессе. В каждую тестовую пробирку добавляют 2 мкл тестируемого соединения в 50-кратной концентрации и 2 мкл ДМСО добавляют в отрицательный контроль и контроль бланка. В каждую тестовую пробирку добавляют 46 мкл Трис-буфера и 48 мкл Трис-буфера добавляют в контроль бланка. 2 мкл фермента ДПП4 добавляют в каждую тестовую пробирку отрицательного контроля и тестируемого образца, тестовые пробирки встряхивают и перемешивают и затем центрифугируют. Все содержимое тестовых пробирок переносят в 96-луночный планшет и субстраты смешивают с DPP4-Glo. в пропорции 1:49. Смесь встряхивают и перемешивают в достаточной мере. После выдерживания в течение 30-60 минут при комнатной температуре 50 мкл смеси DPP4-Glo. и субстрата добавляют в каждую ячейку 96-луночного планшета и планшет герметично закрывают пленкой. Содержимое 96 лунок медленно перемешивают на планшетном шейкере при 300-500 об/мин/30 с. После культивирования от 30 мин до 3 ч при комнатной температуре, значение хемолюминисценции измеряют на микропланшетном ридере NOVOstar.
| [Таблица 1] | |||||
| ДПП4 | ДПП8 | ДПП9 | |||
| Тестируемые соединения | |||||
| Отношение селективности (ДПП8/ДПП4) | Отношение селективности (ДПП8/ДПП4 | ||||
| IC50(М) | IC50(М) | IC50(М) | |||
| Соединение А | 0,008 | 26,1 | 3263 | 75,5 | 9438 |
| МК-0431 | 0,019 | 25,8 | 1358 | 92,7 | 4879 |
Результаты: Активность ингибирования ДПП4 у соединения А выше, чем у контрольного лекарственного препарата МК-0431, и его селективность также выше, чем у МК-0431. Более высокое значение соотношения ДПП8/ДППIV и ДПП9/ДППIV означает более высокую активность.
Тестовый пример 2: Эффекты 6 солей соединения А при генетическом ожирении крыс линии Вистар с диабетом.
Крыс линии Вистар возрастом от 14 до 19 недель разделяют на пять групп, от 5 до 6 крыс в каждой, им вводят соответственно 6 солей соединения А в течение 14 дней (каждая 10 мг/кг веса / в день, перорально), которые смешивают с коммерческим кормом в соотношении 5 ppm. Кровь отбирают из хвостовой вены, для измерения глюкозы и гемоглобина А1 плазмы энзиматическим методом используют коммерческий набор реагентов (NC-ROPET, Nippon Chemiphar CO.). Результаты представляют в виде среднего значения для каждой группы (n=5-6)±стандартное отклонение и анализируют при помощи теста Даннетта, результаты приведены в таблице 2. Применяют уровень значимости 1%.
| [Таблица 2] | ||
| Глюкоза плазмы | Гемоглобин | |
| Контрольная группа | 352±32 | 5,9±0,5 |
| Фосфат соединения А | 158±24* | 4,3±0,6* |
| Сульфат соединения А | 327±46 | 5,4±0,6 |
| Гидрохлорид соединения А | 165±13* | 4.5±0,5* |
| Малеат соединения А | 294±51* | 5,3±0,3 |
| Малат соединения А | 295±42 | 5,2±0,6 |
| Мезилат соединения А | 287±34 | 5,8±0,4 |
| *: В сравнении с контрольной группой, р<0,01 |
В таблице 2 гидрохлорид и фосфат соединения А явно уменьшают концентрацию глюкозы и гемоглобина в крови сильнее, чем другие соли. Наиболее предпочтительным является фосфат.
Тестовый пример 3: Исследование переносимости глюкозы при генетическом ожирении крыс линии Вистар с диабетом при использовании различных солей соединения А.
Мужских особей крыс возрастом 13~14 недель разделяют на пять групп по пять особей в каждой группе. Им соответственно вводят 6 солей соединения А (каждая 30 мг/кг/в день, перорально) в течение 7 дней. После голодания в течение ночи сразу проводят оральный тест на переносимость глюкозы (2 г глюкозы/кг/5 мл, перорально). Перед проведением теста на переносимость глюкозы и через 120 и 240 минут после его выполнения проводят забор крови из хвостовой вены и анализируют содержание глюкозы в плазме энзиматическим методом (Encore Chemical System, Baker). Результаты представляют в виде среднего значения для каждой группы (n=5-6)±стандартное отклонение, проведя анализ и использованием теста Даннетта, результаты представлены в таблице 3.
| [Таблица 3] | |||
| Глюкоза плазмы (мг/дл) | |||
| 0 мин | 120 мин | 240 мин | |
| Контрольная группа | 121±8 | 243±60 | 139±20 |
| Фосфат соединения А | 107±3 | 95±10* | 68±5* |
| Сульфат соединения А | 120±12 | 224±62 | 117±21 |
| Гидрохлорид соединения А | 109±5 | 116±7* | 106±3* |
| Малеат соединения А | 103±11 | 137±17* | 102±9* |
| Малат соединения А | 110±9 | 114±12* | 95±6* |
| Мезилат соединения | 108±8 | 115±9* | 92±7* |
| *В сравнении с контрольной группой, р<0,01 |
Таблица 3 явно демонстрирует, что гидрохлориды и фосфаты соединения А значительно ингибируют повышение уровня сахара в крови после тестов на переносимость глюкозы, что проявляется сильнее, чем у других солей. Фосфат соединения А особенно предпочтителен.
Тестовый пример 4: Тесты на абсорбцию у крыс различных солей соединения А
Схема приема лекарственных средств:
16 здоровых мужских особей крыс весом 200~220 г в случайном порядке разделяют на четыре группы. 6,0 мг/кг (по свободному основанию) фосфатной соли (А), гидрохлоридной соли (В), малеатной соли (С), метансульфонатной соли (D) соединения А вводят зондовым питанием через желудок (вводимый объем составляет 10 мл/кг, соответственно в виде 0,60 мг/мл (по свободному основанию) суспензии, приготовленной с 0,5% Na-КМЦ) в течение 12 часов, перед введением применяют голодание и позволяют свободный прием жидкости. 0,3 мл венозной крови соответственно отбирают у крыс из венозного сплетения позади глазного яблока перед введением и через 0,167, 0,333, 0,50, 1,0, 2,0 3,0, 4,0, 5,0, 6,0, 8,0, 12 часов после введения кровь помещают в гепаринизированные пробирки и центрифугируют при 3500 об/мин в течение 10 мин. Концентрацию крови анализируют при помощи ВЭЖХ тандемного масс-спектра.
Средние параметры фармакокинетики после введения 6,0 мг/кг различных солей соединения А крысам посредством зондового питания
| t1/2 | Cmax | Tmax | AUC0-t | AUC0-∝ | MRT | CL/F | |
| Препарат | (ч) | (нг/мл) | (ч) | (нг·ч/мл) | (нг·ч/мл) | (ч) | (мл/мин/кг) |
| А | 1,54 | 242 | 0,50 | 409 | 425 | 1,96 | 545 |
| В | 1,07 | 148 | 0,63 | 317 | 319 | 1,86 | 348 |
| С | 0,75 | 231 | 0,50 | 306 | 307 | 1,24 | 326 |
| D | 0,87 | 133 | 0,88 | 274 | 275 | 1,61 | 397 |
Вывод: Фармакокинетический профиль фосфата соединения А является лучшим.
1. Фармацевтически приемлемые соли метилового эфира (R)-7-[3-амино-4-(2,4,5-трифторфенил)-бутирил]-3-трифторметил-5,6,7,8-тетрагидро-имидазо[1,5-а]пиразин-1-карбоновой кислоты, которые выбраны из группы, состоящей из фосфатной соли, гидрохлоридной соли, сульфатной соли, мезилатной соли, малеатной соли или малатной соли.
2. Способ получения солей по п.1, включающий реакцию солеобразования метилового эфира (R)-7-[3-амино-4-(2,4,5-трифторфенил)-бутирил]-3-трифторметил-5,6,7,8-тетрагидро-имидазо[1,5-а]пиразин-1-карбоновой кислоты с соответствующей кислотой.
3. Применение солей по п.1 для получения лекарственных средств для лечения диабета.
4. Фармацевтическая композиция для приготовления антидиабетических лекарственных средств, содержащая терапевтически эффективное количество солей по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель.
5. Применение фармацевтической композиции по п.4 для получения лекарственных средств для лечения диабета.
