Рекомбинантный штамм escherichia coli, обладающий конститутивной аспартазной активностью и способ синтеза l-аспарагиновой кислоты с использованием этого штамма в качестве биокатализатора

Авторы патента:

C12P13/20 - аспарагиновая кислота; аспарагин

C12N1/21 - модифицированные введением чужеродного генетического материала

Владельцы патента RU 2546239:

Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика" (RU)

Группа изобретений относится к биотехнологии и представляет собой рекомбинантный штамм Escherichia coli ВКПМ В-11864, обладающий конститутивной аспартазной активностью и полученный путем введения в штамм E. coli ВКПМ 7188 плазмиды, содержащей ген aspA под контролем промотора pEftu из Corynebacterium glutamicum АТСС13032. Группа изобретений относится также к способу синтеза L-аспарагиновой кислоты, согласно которому фумарат аммония смешивают с суспензией биокатализатора, причем в качестве биокатализатора используют указанный рекомбинантный штамм. Группа изобретений позволяет получать L-аспарагиновую кислоту с высокой степенью эффективности. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл., 5 пр.

Заявляемая группа изобретений относится к биотехнологии и касается рекомбинантного штамма E.coli с аспартазной активностью, а также способа синтеза L-аспарагиновой кислоты из фумарата аммония с использованием клеток этого штамма в качестве биокатализатора.

L-аспарагиновая кислота является широко востребованным органическим соединением, используемым, прежде всего, для синтеза искусственного подсластителя - аспартама, а также для изготовления лекарственных препаратов и кормовых добавок.

Основным способом получения L-аспарагиновой кислоты в настоящее время является биокаталитический синтез из фумаровой кислоты и аммония с помощью фермента аспартазы (аспартат-аммиак-лиазы).

Альтернативой этой технологии является химический синтез аспарагиновой кислоты из малеиновой кислоты и аммиака. Важнейшим недостатком химического способа является отсутствие стереоселективности и, как следствие, получение в результате синтеза смеси D и L-изомеров аспарагиновой кислоты, разделение которых является дорогостоящим процессом.

В качестве биокатализаторов L-аспарагиновой кислоты используются бактериальные штаммы разных видов, преимущественно бактерий E.coli, с аспартазной активностью в виде свободных или иммобилизованных клеток (1). Для повышения аспартазной активности штаммов используют широкий арсенал генетических методов, в том числе мутагенез (2) и клонирование гена аспартазы в составе плазмидных векторов (3). Однако во всех случаях для появления аспаратазной активности клетки выращивают в питательных средах с добавлением дорогостоящих индукторов синтеза аспаратазы.

Известен способ биокаталитического синтеза L-аспарагиновой кислоты с помощью биокатализатора - клеток мутантного штамма E.coli ВКПМ 7188, обладающих аспартазной активностью (2). Способ является недостаточно эффективным из-за невысокой аспартазной активности штамма. Кроме того, L-аспарагиновая кислота, получаемая с помощью этого способа, содержит до 5% яблочной кислоты - побочного продукта, снижающего качество аспарагиновой кислоты. Образование яблочной кислоты связано с присутствием в штамме фумаразной активности.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ получения L-аспарагиновой кислоты, в котором в качестве биокатализатора используют штамм E.coli PUaspE2 (3), содержащий ген аспаратазы в составе плазмидного вектора. Недостатком способа является сложность культивирования штамма, связанная с необходимостью вносить на определенной стадии роста дорогостоящий индуктор синтеза аспартазы изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид (ИПТГ).

Задача заявляемой группы изобретений - создание рекомбинантного штамма E.coli, синтезирующего аспартазу конститутивно, т.е. в отсутствие в среде индуктора, и разработка биокаталитического способа синтеза L-аспарагиновой кислоты с использованием клеток этого штамма в качестве биокатализатора.

Задача решена путем:

- конструирования рекомбинантного штамма бактерий Е.coli ВКПМ В-11864, обладающего конститутивной аспартазной активностью, полученного путем введения в штамм E.coli ВКПМ 7188 плазмиды, содержащей ген aspA под контролем промотора pEftu из Corynebacterium glutamicum АТСС13032;

- разработки способа синтеза L-аспарагиновой кислоты, с использованием в качестве биокатализатора заявляемого штамма бактерий Е.coli ВКПМ В-11864.

Заявляемый штамм Е.coli ВКПМ В-11864, содержащий плазмиду pAsp 161-3, с геном aspA, под контролем промотора pEftu из С.glutamicum АТСС13032, обладает конститутивной аспартазной активностью и способностью синтезировать L-аспарагиновую кислоту. При смешивании водных растворов фумаровой кислоты и биокатализатора на основе клеток Е.coli ВКПМ В-11864 происходит синтез L-аспарагиновой кислоты.

Характеристика заявляемого штамма

Штамм Е.coli ВКПМ В-11864 является производным штамма Е.coli ВКПМ В-7188 (2) и обладает следующими морфологическими и культуральными свойствами. Культура представлена грамотрицательными, факультативно анаэробными палочковидными подвижными клетками, со слегка закругленными концами, размером 0,4-0,8×1-3 мкм. Реакция Фогес-Проскауэра отрицательная, реакция с метиловым красным положительная. Культура отрицательна по признакам образования H₂S и гидролиза мочевины. Штамм оксидазоотрицательный, каталазоположительный. Клетки хорошо растут на простых богатых питательных средах, например МПА и LB (4). Оптимальная температура роста 37°C, оптимальный pН 7,2. Колонии на плотных питательных средах (МПА, LB) (4) беловатые блестящие, размером 2-3 мм, края ровные, спор не образует. Штамм Е.coli ВКПМ В-11864 дополнительно содержит маркер устойчивости к ампицилину.

Получение биомассы заявляемого штамма

Для получения биомассы клеток заявляемого штамма с аспартазной активностью штамм выращивают при 28-30°C в течение 12-15 часов на обычных для E.coli средах: полноценных (LB) либо синтетических, содержащих в качестве источника углерода глюкозу или ацетат в концентрациях 0.1-1%, а в качестве источника азота аммонийные, нитратные соли или дрожжевой экстракт в концентрациях 0.4-2%. Полученные клетки отделяют от культуральной жидкости центрифугированием при 3-4 тыс. об/мин, ресуспендируют в 10 мМ фосфатном буфере pН 7,0-8,0 до концентрации 20-40 г по сухой массе/л и хранят в таком виде при 4°C.

Аспартазную активность штамма определяют по скорости синтеза L-аспарагиновой кислоты следующим образом: к 1 мл 1 М раствора фумарата аммония прибавляют 0,5 мл этой клеточной суспензии, предварительно активированных микробных клеток и инкубируют смесь 10 минут при 37°C. Количество L-аспарагиновой кислоты в образцах определяют спектрофотометрическим методом при длине волны 510 нм. Активность клеток выражают в мкМ L-аспарагиновой кислоты, образующейся за 1 мин при 37°C.

Активирование микробных клеток перед получением L-аспарагиновой кислоты проводят инкубированием суспензии клеток в 1М растворе фумарата аммония при 37°C в течение 16-18 ч. Цель активирования - увеличение проницаемости клеточной мембраны для фумарата и аспартата.

Отличительная особенность заявляемого штамма, содержащего ген aspA в составе плазмиды под контролем промотора pEftu из С.glutamicum АТСС13032, состоит в его способности синтезировать фермент аспартазу конститутивно, в отсутствие в среде индуктора (табл.1).

Таблица 1
Сравнение аспартазной активности заявляемого и родительского штаммов при культивировании на различных средах
№	Условия культивирования штамма	Аспартазная активность, ∗∗∗ мкМ аспарагиновой кислоты/мин мг клеток
ВКПМ В-11864	ВКПМ В-7188
1	Среда LB∗	25	1
2	Среда МФС∗∗	32	1,5
Штаммы выращивались на средах:
∗ - LB (4);
∗∗ - среда, содержащая (г/л воды деионизированной) Na₂HPO₄∗12H₂O - 15,0; KН₂РО₄- 2,0; СН₃СОONa - 7; Дрожжевой экстракт - 20; MgSO₄∗7H₂O - 0,25; фумарат натрия - 3, рН - 6,5-7,0.
∗∗∗ - представлены усредненные значения трех независимых опытов

При тех же условиях культивирования (среда LB) штамм E.coli PUaspE2 (ближайший аналог) обладает аспартазной активностью (17,5 мкМ аспарагиновой кислоты/мин мг клеток), сравнимой с активностью заявляемого штамма. Однако такой уровень активности штамма E.coli PUaspE2 наблюдают только при добавлении индуктора (ИПТГ) в среду культивирования (3).

Способ в общем виде

Заявляемый способ синтеза L-аспарагиновой кислоты осуществляют путем смешивания следующих водных растворов: фумарата аммония в концентрациях 1 М - 1,5 М (рН 8,0-8,5), содержащего 0,001М MgCl₂ и суспензии биокатализатора в концентрациях 0,4-4 мг/мл в термостатируемом реакторе с системой перемешивания и последующей инкубации при температуре 30-37°C в течение 1-6 часов. В качестве биокатализатора в заявляемом способе используют биомассу клеток штамма Е.coli ВКПМ В-11864 в нативном или иммобилизованном виде. Содержание целевого продукта - L-аспарагиновой кислоты - определяют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Изобретение включает следующую иллюстрацию.

Фиг 1. Структура плазмиды pAspl61-3.

Amp - ген устойчивости к ампицилину; Asp - ген aspA; Prom - промоторная область р Eftu из Corynebacterium glutamicum АТСС13032; Rep - репликон.

Пример 1. Конструирование плазмиды, содержащей ген аспартазы aspA под контролем промотора pEftu из Corynebacterium slutamicum АТСС13032

Гибридную плазмиду, содержащую ген аспартазы aspA под контролем промотора pEftu, получают путем встраивания фрагментов, содержащих ген aspA (1423 п.о. фрагмент) и промотор pEftu (239 п.о. фрагмент) в правильной ориентации по сайту Sma I в плазмиду pTZ19R, согласно общепринятым методикам (5). 1423 п.о. - фрагмент, содержащий ген aspA, получен с помощью ПЦР, при использовании в качестве матрицы геномной ДНК штамма Escherichia coli ВКПМ В-7188 и праймеров AN226 (tttccatggcaaacaacattcgtatcgaagaagatctgttgg), AN287 (gtggtggtgatggtgatggcctgctttgtaagccgggtgcatc), структура которых рассчитана на основе сиквенса U14003 (GeneBank). 239 п.о. - фрагмент, содержащий промотор pEftu, получен с помощью ПЦР, при использовании в качестве матрицы геномной ДНК штамма Corynebacterium glutamicum АТСС13032 и праймеров AN 253 (ggg teg acg ata tct ggc cgt tac cct gcg aat g) и AN269 (ctt cga tac gaa tgt tgt ttg аса ttg tat gtc etc ctg gac ttc), структура которых была рассчитана на основе сиквенса NC_006958(GeneBank).

Гибридную плазмиду правильной конструкции отбирают в клетках E.coli XL 1-Blue среди клонов, обладающих аспартазной активностью. Структуру плазмиды подтверждают секвенированием. Один из вариантов гибридной плазмиды, содержащий ген аспартазы aspA под контролем промотора pEftu, обозначен как pAsp 161-3.

Пример 2. Конструирование заявляемого штамма

Заявляемый штамм Escherichia coli ВКПМ В-11864 получен путем введения ДНК плазмиды pAsp 161-3, изолированной из клеток E.coli XL1-Blue (pAspl61-3), в клетки Е. coli ВКПМ В-7188 с помощью электропорации. Среди трансформантов, выросших на среде LB с ампициллином, обнаружен клон, проявляющий максимальную аспартазную активность при культивировании в пробирках на среде следующего состава (г/л воды деионизированной): Na₂HPO₄∗12H₂O - 15,0; KН₂РО₄- 2,0; CH₃COONa - 7; Дрожжевой экстракт - 20; MgSO₄∗7H₂O - 0,25; фумарат натрия - 3, pH - 6,5-7,0 (далее среда МФС). Этот клон депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) как Escherichia coli ВКПМ В-11864.

Пример 3. Наработка биомассы заявляемого штамма

Наработку биомассы Е.coli ВКПМ В-11864 осуществляют в 750-мл колбах, содержащих 100 мл среды МФС, содержащей 100 мг/мл ампициллина, в которые вносят по 1 мл культуры, предварительно выращенной в пробирках на среде LB, содержащей 100 мг/мл ампициллина, в течение ночи при 37°C. Колбы культивируют 2 часа при 37°C, затем снижают температуру до 30°C и продолжают культивирование в течение 8 часов с постоянным перемешиванием. Затем биомассу штамма Е.coli ВКПМ В-11864 отделяют центрифугированием при 5 тыс. об/мин и хранят при +4°C. Аспартазная активность клеток E.coli ВКПМ 11864 составляет 31 мкм аспарагиновой кислоты/мин/ мг клеток по сухой массе.

Пример 4. Синтез L-аспарагиновой кислоты с использованием свободных клеток заявляемого штамма

Синтез L-аспарагиновой кислоты проводят в стеклянном реакторе объемом 100 мл путем смешивания субстрата - 1,5М раствора фумарата аммония (pH 8), содержащего 0,001М MgCl₂ и суспензии активированного биокатализатора в концентрации 0.4 мг/мл, полученного как указано в примере 3. Процесс проводят при 37°C в течение 4 час. Концентрацию L-аспарагиновой и яблочной кислот в реакционной смеси определяют с помощью ВЭЖХ. Концентрация L-аспарагиновой кислоты в полученном образце составляет 198 г/л, конверсия - 99%. Содержание яблочной кислоты составило 0,1%.

Пример 5. Синтез L-аспарагиновой кислоты с использованием иммобилизованных клеток заявляемого штамма

Биомассу клеток штамма E.coli ВКПМ В-11864 в количестве 7 г, полученную как в примере 3, суспензируют в 27,3 г раствора аспарагината натрия с концентрацией 20%, pH 7,5. Смесь охлаждают до 5°C и к охлажденной смеси добавляют последовательно 6,15 г акриламида, 0,36 г N,N′-метилен-бис-акриламида, 1,0 г 5% водного раствора N,N,N′,N′-тетраметилэтилендиамина и 0,2 г 5% водного раствора персульфата аммония. Полученный гель измельчают, промывают деионизованной водой, затем 1,5М раствором фумарата аммония (pH 8). Синтез L-аспарагиновой кислоты проводят в стеклянном реакторе объемом 200 мл путем смешивания субстрата - 1,5М раствора фумарата аммония (pH 8) с 0,001М MgCl₂ и 12,5 г гранул иммобилизованного биокатализатора. Процесс проводят при 37°C в течение 3 час. Концентрация L-аспарагиновой кислоты в полученном образце составляет 197 г/л, конверсия - 98,5%. Содержание яблочной кислоты составило 0,1%.

Таким образом, заявляемый штамм E.coli ВКПМ В-11864, по сравнению с ближайшим аналогом, обеспечивает более эффективное получение L-аспарагиновой кислоты за счет более высокой аспартазной активности этого биокатализатора и конститутивного синтеза аспартазы, что делает ненужным использование индуктора. Кроме того, заявляемый штамм обеспечивает снижение содержания в растворах L-аспарагиновой кислоты побочного продукта - яблочной кислоты.

Список источников информации

1. TOMOHIRO MIZOBATA AND YASUSHI KAWATA (2007) ASPARTASES: MOLECULAR STRUCTURE, BIOCHEMICAL FUNCTION AND BIOTECHNOLOGICAL APPLICATIONS In Industrial Enzymes (eds. J. Polaina and A.P. MacCabe) Springer, 549-565.

2. RU 2174558.

3. US 6,214,589.

4. Ф. Герхардт и др. Методы общей бактериологии в 3 т., Мир, 1984.

5. J. Sambrook, E.F. Fritsch, Т. Maniatis, Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Pr., 1989.

1. Рекомбинантный штамм Escherichia coli ВКПМ В-11864, обладающий конститутивной аспартазной активностью и полученный путем введения в штамм E. coli ВКПМ 7188 плазмиды, содержащей ген aspA под контролем промотора pEftu из Corynebacterium glutamicum АТСС13032.

2. Способ синтеза L-аспарагиновой кислоты, согласно которому фумарат аммония смешивают с суспензией биокатализатора, причем в качестве биокатализатора используют рекомбинантный штамм по п. 1.

3. Способ по п. 2, в котором в качестве биокатализатора используют свободные или иммобилизованные клетки рекомбинантного штамма по п. 1.

Изобретение относится к способу получения L-аспарагиновой кислоты, применяемой в пищевой, микробиологической промышленности и медицине. .

Патент 159473 // 159473

Рекомбинантный штамм escherichia coli-продуцент l-треонина // 2546237

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к штамму - продуценту треонина. Штамм Escherichia coli ВКПМ В-11820 получен путем инактивации у штамма Escherichia coli ВКПМ В-3996 генов poxB и sstT на фоне увеличенной экспрессии гена galP за счет замены его природного промотора на синтетический промотор Ptac3 и увеличенной экспрессии генов оперона thrABC за счет замены его природного промотора на фаговый промотор PA1, удаления последовательности регуляторного пептида thrL и введения десенсибилизирующей мутации thrA433.

Композиции и способы получения изопрена // 2545699

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения изопрена и культуру рекомбинантных клеток, предназначенную для его осуществления.

Штамм бактерии esherichia coli ex pqe30, продуцент эндоксиланазы бактерии geobacillus stearothermophillus 22 // 2542486

Изобретение относится к области биотехнологии. Предлагаемый штамм Esherichia coli EX pQE30 получен трансформацией клеток бактерии E.coli XL1-blue плазмидой pQE30-endo-xylanase-lx1, разработанной на основе вектора pQE30.

Рекомбинантный полипептид stv, обладающий протективными свойствами в отношении streptococcus agalactiae, рекомбинантная днк stv, его кодирующая и рекомбинантный штамм escherichia coli m15-stv, содержащий рекомбинантную плазмиду pqe-stv // 2542483

Изобретение относится к области микробиологии и молекулярной генетики и касается рекомбинантного полипептида StV, рекомбинантной ДНК stV, кодирующей указанный рекомбинантный полипептид StV, рекомбинантной плазмидной ДНК PQE-stV, представляющей собой плазмидную ДНК PQE-30, несущую указанную рекомбинантную ДНК stV, и штамма-продуцента Escherichia coli M15-StV, продуцирующего рекомбинантный полипептид StV.

Бактерия bacillus subtilis, продуцирующая 5`-аминоимидазол-4-карбоксамидрибозид (аикар), и способ микробиологического синтеза аикар путем культивирования такой бактерии // 2542387

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложена бактерия Bacillus subtilis, продуцирующая 5′-аминоимидазол-4-карбоксамидрибозид (АИКАР).

Вектор для нокаута гена ацетаткиназы в clostridium thermocellum, клетка-хозяин, генетически модифицированный микроорганизм clostridium thermocellum, способ получения такого микроорганизма и способ преобразования лигноцеллюлозной биомассы в этанол. // 2541785

Изобретения относятся к области биотехнологии и касаются вектора, клетки-хозяина, содержащего вектор, генетически модифицированного микроорганизма Clostridium thermocellum, способа получения такого микроорганизма и способа преобразования лигноцеллюлозной биомассы в этанол.

Штамм бактерии escerichia coli xl1-blue/pqs-g3, продуцент термостабильной липазы бактерии geobacillus stearothermophilus g3 // 2540873

Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой штамм Esherichia coli В-1298, депонированный в ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор». Штамм получен трансформацией клеток бактерии E.

Рекомбинантная плазмида pesat6-cfp10-dbd, рекомбинантный штамм escherichia coli m15 [prep4, pesat6-cfp10-dbd], способ получения, иммобилизации, концентрирования и очистки рекомбинантного белка esat6-cfp10-dbd на декстране, рекомбинантный белок esat6-cfp10-dbd и иммуногенная композиция, содержащая белок esat6-cfp10-dbd // 2539026

Группа изобретений относится к генной инженерии, биохимии, биотехнологии и иммунологии и представляет собой рекомбинантную плазмиду pESAT6-CFP10-DBD, рекомбинантный штамм Escherichia coli M15 [pREP4, pESAT6-CFP10-DBD], способ получения, иммобилизации, концентрирования и очистки рекомбинантного белка ESAT6-CFP10-DBD на декстране, рекомбинантный белок ESAT6-CFP10-DBD с молекулярной массой 26,4 кДа, иммуногенную композицию, содержащую белок ESAT6-CFP10-DBD, иммобилизованный на декстране, специфически активирующую Т-лимфоциты, синтезирующие ИФН-гамма при стимуляции антигенами микобактерий.

Рекомбинантная плазмидная днк pet40cmap/mbl-t, кодирующая гибридный бифункциональный полипептид cmap/mbl-t со свойствами высокоактивной щелочной фосфатазы cmap и маннан-связывающего лектина с-типа mbl-t, рекомбинантный штамм e.coli rosetta(de3)/pet40cmap/mbl-t - продуцент гибридного бифункционального полипептида cmap/mbl-t и способ его получения // 2538169

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой плазмиду pET40CmAP/MBL-T, определяющую синтез гибридного бифункционального полипептида CmAP/MBL-T со свойствами высокоактивной щелочной фосфатазы морской бактерии Cobetia marina (CmAP) и маннан-связывающего лектина С-типа дальневосточного трепанга Apostichopus japonicus (MBL-T).

Рекомбинантная плазмидная днк ppa-oprfi, кодирующая гибридный рекомбинантный белок f-i наружной мембраны pseudomonas aeruginosa, штамм escherichia coli pa-oprfi-продуцент гибридного рекомбинантного белка f-i наружной мембраны pseudomonas aeruginosa и способ получения гибридного рекомбинантного белка f-i наружной мембраны pseudomonas aeruginosa // 2537006

Изобретение относится к области биотехнологии и касается рекомбинантной плазмидной ДНК pPA-OPRFI, кодирующей гибридный рекомбинантный белок F-I наружной мембраны Pseudomonas aeruginosa, штамма бактерий E.coli PA-OPRFI, продуцента такого гибридного белка и способа получения указанного рекомбинантного белка.

Гидролаза пептидогликана, экспрессионная плазмида, содержащая фрагмент днк, кодирующий гидролазу пептидогликана, бактерия-продуцент и способ микробиологического синтеза гидролазы пептидогликана // 2547584

Группа изобретений относится к биотехнологии, в частности к биосинтезу гидролазы пептидогликана, и представляет собой белок с активностью гидролазы пептидогликана, плазмиду, содержащую фрагмент, кодирующий гидролазу пептидогликана, бактерию-продуцент, способ микробиологического синтеза гидролазы пептидогликана, а также фармацевтическую композицию, содержащую полученную гидролазу пептидогликана, для терапии заболеваний, вызванных грамотрицательной микрофлорой. Разработанный способ микробиологического синтеза позволяет эффективно получать гидролазу пептидогликана бактериофага S-394. 6 н. и 16 з.п. ф-лы, 2 ил., 9 пр.

Микроорганизм с повышенной продукцией l-аминокислот и способ получения l-аминокислот с его применением // 2549689

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой микроорганизм рода Escherichia, продукцирующий L-аминокислоты, причем микроорганизм трансформирован так, чтобы он имел повышенную НАД-киназную активность и инактивированный фермент с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2, кодируемой геном tehB, и способ получения L-аминокислот с использованием такого микроорганизма рода Escherichia. Изобретение позволяет получать аминокислоты с высокой степенью эффективности. 2 н. и 9 з.п. ф-лы, 1 ил., 14 табл., 4 пр.

Самоиндуцируемая экспрессионная система и ее применение для получения полезных метаболитов с помощью бактерии семейства enterobacteriaceae // 2549708

Изобретение относится к биотехнологии и предоставляет собой способ получения полезных метаболитов с использованием бактерии семейства Enterobacteriaceae, в частности бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, которая модифицирована таким образом, что она содержит генетическую экспрессионную систему, включающую транскрипционный аппарат, регулируемый белком типа LysR, и модифицированную таким образом, что самоиндуцируемая положительная регуляция по типу обратной связи указанной системы опосредована коиндуктором. Данный способ пригоден для продукции L-аминокислот с разветвленной цепью, в частности L-валина, L-изолейцина и L-лейцина, высших спиртов и D-пантотеновой кислоты. Изобретение позволяет получать L-аминокислоты с высокой степенью эффективности. 3 н. и 20 з.п. ф-лы, 2 ил., 5 табл., 6 пр.

Способ очистки рекомбинантного белка интерфероноподобного фактора iii типа // 2549710

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ получения рекомбинантного белка интерфероноподобного фактора III типа (ИПФ III) штамма-продуцента E. coli. Осуществляют отмывку и растворение тел включения E. coli с использованием 2% водного раствора γ-циклодекстрина. Далее последовательно проводят хроматографии на Ni-Sepharose, Q-Sepharose и SP-Sepharose. Далее осуществляют рефолдинг целевого белка с использованием смеси цистеамина и цистамина при рН 10,5. Затем последовательно проводят хроматографии на Amberchrome Profile ХТ20, Amberchrome Profile HPR10 и Kromasil 300-5С18. Изобретение позволяет оптимизировать условия очистки ИПФ III на этапах отмывки и растворения тел включения клеток E.coli и обеспечивает 12% выход целевого белка.3 ил., 4 пр.

Экспрессионная плазмида, содержащая фрагмент днк, кодирующий мутеин [c245s] тканевого фактора человека с неотделяемым с-концевым тагом, бактерия e. coli - продуцент белка-предшественника мутеина [c245s] тканевого фактора человека с неотделяемым с-концевым тагом, способ получения рекомбинантного мутеина [c245s] тканевого фактора человека с неотделяемым с-концевым тагом, рекомбинантный мутеин [c245s] тканевого фактора человека с неотделяемым с-концевым тагом // 2550027

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для рекомбинантного получения тканевого фактора человека (чТФ). Конструируют плазмиду pHYP-10ETFCS6 длиной 5912 п.о. с физической картой, представленной на Фиг. 2, для экспрессии в бактерии рода Escherichia предшественника мутеина [C245S] чТФ, содержащего отщепляемый N-концевой лидерный пептид, содержащий декагистидиновый кластер и последовательность узнавания энтерокиназы, слитую в рамке с последовательностью, кодирующей указанный мутеин, слитый в рамке с последовательностью, кодирующей дополнительный неотщепляемый C-концевой пептид, содержащий гексагистидиновый кластер. Способ получения предшественника мутеина [C245S] чТФ включает культивирование бактерии-продуцента в питательной среде, выделение телец включения, солюбилизацию белка-предшественника, металлохелатную хроматографию в денатурирующих условиях, рефолдинг и диафильтрацию раствора белка. Способ получения зрелого мутеина [C245S] чТФ, включает отделение N-концевого лидерного пептида от указанного предшественника мутеина с использованием энтерокиназы и выделение целевого белка. Изобретение позволяет повысить уровень биосинтеза и выход прокоагуляционно активного чТФ. 6 н. и 3 з.п.ф-лы, 5 ил., 1 табл., 7 пр.

Рекомбинантная днк pa3, рекомбинантная днк pqe 30-pa3, обеспечивающие получение полипептида a3, штамм e. coli м 15-a3, трансформированный рекомбинантной плазмидной днк pqe 30-pa3 и экспрессирующий рекомбинантный полипептид a3, рекомбинантный полипептид a3, обладающий способностью селективно связывать чса, и тест-система рфа для качественного выявления микроальбуминурии, тест-система для количественного определения микроальбуминурии // 2550255

Изобретения касаются рекомбинантной ДНК pA3, рекомбинантной плазмидной ДНК pQE 30-pA3, штамма Е.coli М 15-A3, рекомбинантного полипептида A3, тест-систем для качественного выявления и количественного определения микроальбуминурии. Охарактеризованная рекомбинантная ДНК pA3 получена методом полимеразной цепной реакции с использованием хромосомной ДНК штамма DG 13 стрептококков группы G и сконструированных праймеров. Амплификационный фрагмент клонировали посредством системы экспрессионных векторов pQE-pQE 30 в Е.coli М 15 с получением рекомбинантной ДНК pQE 30-pA3, которая кодирует аминокислотную последовательность рекомбинантного полипептида A3, обладающего способностью селективно связывать человеческий сывороточный альбумин (ЧСА). Представленные изобретения могут быть использованы в медицинской практике и промышленности для производства тест-систем по выявлению и количественному определению микроальбуминурии - одного из ранних признаков поражения почек у больных сахарным диабетом и эссенциальной артериальной гипертензией. 6 н.п. ф-лы, 9 ил., 1 табл., 8 пр.

Способ получения l-аргинина с использованием бактерии семейства enterobacteriaceae, содержащей n-ацетилорнитиндеацетилазу с нарушенной активностью // 2550269

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения L-аминокислоты, такой как L-аргинин, ферментацией с использованием бактерии рода Escherichia, которая модифицирована таким образом, что содержит ген argJ, который кодирует фермент, имеющий, по меньшей мере, орнитинацетилтрансферазную активность, и при этом бактерия модифицирована таким образом, что содержит N-ацетилорнитиндеацетилазу с нарушенной активностью. Изобретение позволяет получать L-аргинин с высокой степенью эффективности. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 2 ил., 4 табл., 7 пр.

Белки, связанные с формой зерен и листьев риса, гены, кодирующие указанные белки, и их применения // 2553206

Изобретение относится к области биохимии, в частности к применению гена, кодирующего белок, который состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO.2, для получения трансгенного риса с длинными, большими и многочисленными зернами и увеличенной урожайностью, увеличенным количеством зерен в метелке и скрученными листьями. Раскрыто применение трансгенной линии клеток риса и рекомбинантного вектора для получения трансгенного риса с длинными, большими и многочисленными зернами и увеличенной урожайностью, увеличенным количеством зерен в метелке и скрученными листьями. Изобретение позволяет эффективно получать трансгенный рис с длинными, большими и многочисленными зернами и увеличенной урожайностью, увеличенным количеством зерен в метелке и скрученными листьями. 3 н. и 2 з.п. ф-лы, 16 ил., 4 табл., 2 пр.

Генетически модифицированный бактериальный штамм wsj-ia, продуцирующий изовалерилспирамицин i с высоким содержанием и высоким выходом // 2553564

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и представляет собой генетически модифицированный штамм бактерии Streptomyces thermotolarences WSJ-IA, продуцирующий изовалерилспирамицин I. Настоящее изобретение также раскрывает способ получения указанного штамма. Способ включает этапы конструирования рекомбинантной плазмиды, содержащей двойной ген ist-acyB2, и трансформации указанной плазмиды в штамм WSJ-2, продуцирующий изовалерилспирамицин I. Изобретение также раскрывает способ получения изовалерилспирамицина I культивированием штамма Streptomyces thermotolarences WSJ-IA в питательной среде. Настоящее изобретение позволяет повысить выход получаемого изовалерилспирамицина I. 3 н.п. ф-лы, 3 ил., 5 табл., 4 пр.