Способ получения комплекса антимикробных пептидов насекомого

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения антимикробных белков и пептидов насекомого. Способ получения комплекса антимикробных пептидов насекомого предусматривает инфицирование жирового тела насекомого на стадии личинки бактериями Micrococcus luteus А270 и Escherichia coli D31 с последующим извлечением жирового тела насекомого на стадии личинки. Жировое тело насекомого помещают в питательную среду, содержащую водный раствор сахаров, неорганических солей и антибиотик меропенем в заданном соотношении и инкубируют в течение суток с последующей элюцией комплекса антимикробных пептидов насекомого из культуральной жидкости методом обращенно-фазовой хроматографии на колонке Vydac С18 при линейном градиенте ацетонитрила от 0% до 50%. Изобретение позволяет упростить способ получения антимикробных пептидов. 5 ил., 4 пр.

 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения антимикробных белков и пептидов. Преимущественной областью применения изобретения является получение природных комплексов пептидов с антибактериальной и антифунгальной активностью, предназначенных для лечения бактериальных и грибковых инфекций человека и животных, включая устойчивые к антибиотикам формы.

В медицине и ветеринарии используется большое разнообразие антибиотиков, принадлежащих к различным классам низкомолекулярных органических соединений (бета-лактамы, макролиды, тетрациклины, флуороквинолоны, сульфонамиды, аминогликозиды, имидазолы и др.). В последние годы положение в области терапии бактериальных инфекций значительно осложнилось в связи с широким распространением бактерий, устойчивых к большинству или всем известным антибиотикам. Лечение таких инфекций при помощи современного арсенала антибиотиков оказывается малоэффективным или даже невозможным.

Для решения этой проблемы известно использование в качестве лекарственных средств антимикробных пептидов животного происхождения. В частности, известно использование с этой целью дефензинов человека [1-7], ретроциклинов [8], виргизина, ойстеризина устриц и гиббозина скорпионов [9], дефензинов кольчатого червя [10], производных меланоцит-стимулирующего гормона [11], производных убиквицидина [12], магайнина [13], производных муцина [14], аналогов тета-дефензинов [15], антимикробных пептидов ракообразных [16], криптдина [17]. Кроме того, известно применение синтетических катионных пептидов в качестве антимикробных агентов [18, 19, 20]. В ряде случаев для лечения бактериальных инфекций предлагается использовать антимикробные пептиды насекомых: бактериолитический пептид чешуекрылого Hyalophora cecropia [21], антибактериальный пептид гловерин [22], антибактериальные пептиды жука Oryctes rhinoceros [23], дефензиноподобный пептид стрекозы Aeschna cyanea [24], комплекс антимикробных пептидов мухи Calliphora vicina [25].

Известны три основных метода получения антимикробных пептидов:

1) Химический синтез пептидов,

2) Экстракция из организма-хозяина,

3) Синтез в культуре клеток-продуцентов.

Каждый из указанных выше методов имеет свою область преимущественного использования.

Технология химического синтеза может быть применена для производства относительно коротких (предпочтительно не более 30 аминокислот) пептидов, сохраняющих антимикробную активность своих природных прототипов. Ее преимущество заключается в возможности получения препарата в промышленных масштабах и с максимальной степенью химической чистоты, необходимой, например, при производстве лекарственных форм для внутривенного введения. Ограничение этой технологии состоит в технической трудности и дороговизне синтеза длинных пептидных цепей, особенно в случае пептидов, имеющих сложную трехмерную организацию.

Технология экстракции из организма-хозяина позволяет синтезировать целые природные комплексы антимикробных пептидов и обеспечивает максимально точное воспроизведение структуры активных компонентов, однако представляет значительные трудности в плане стандартизации метода. В качестве источника антимикробных пептидов в данном случае выступает гемолимфа (кровь) насекомого либо цельный гомогенат (измельченные насекомые). При этом предполагается, что синтез антимикробных пептидов происходит in vivo, то есть целевой продукт уже накоплен в организме-хозяине к моменту выделения. Недостатки технологии получения антимикробных пептидов из биомассы насекомых связаны с высоким содержанием балластных соединений в получаемом материале (гемолимфе, гомогенате) и риском активации в нем фенолоксидазной системы, действие которой приводит к необратимой деградации целевых продуктов и их загрязнению меланинами на этапе очистки.

Синтез в культуре клеток-продуцентов обычно сводится к применению генно-инженерных методов. Генная инженерия дает возможность получать пептиды любой длины, однако в ряде случаев не позволяет точно воспроизводить пространственную структуру пептида и обычно отличается значительной стоимостью конечного продукта. Сказать с уверенностью о том, что какой-либо пептид синтезирован корректно, можно по сути лишь тогда, когда его получение осуществляется в культуре клеток, выделенных непосредственно из организма-хозяина и обладающих природной способностью к синтезу данного пептида. Проблема заключается в том, что основным источником антимикробных пептидов в организме насекомого являются клетки жирового тела, которые в большинстве своем терминально дифференцированы и не способны к размножению in vitro - это препятствует получению соответствующих клеточных линий, а потому исключает возможность создания долгосрочной культуры. Одним из решений этой проблемы является получение антимикробных пептидов в краткосрочной, первичной, культуре клеток жирового тела.

Заявленное изобретение относится к третьему методу получения антимикробных пептидов.

Известен способ получения комплекса антимикробных пептидов в культуре жирового тела личинки двукрылого Calliphora vicina [26], наиболее близкий по решению технической задачи с заявляемым изобретением и выбранный в качестве прототипа.

В известном способе из личинки мухи извлекают жировое тело и переносят его в солевой раствор, содержащий вспомогательные антибиотики - пенициллин и стрептомицин - для предупреждения бактериальной контаминации культуры. Около 30% объема культуральной среды составляет термически обработанная плазма гемолимфы личинки, которая служит активатором синтеза антимикробных пептидов клетками жирового тела. Жировое тело культивируют в такой среде на протяжении суток, затем культуральную жидкость отделяют от жирового тела и используют ее в качестве источника антимикробных пептидов.

Основным недостатком прототипа является низкая степень чистоты получаемых антимикробных пептидов, обусловленная повышенным содержанием балластных компонентов в добавляемой к жировому телу культуральной среде и, как следствие, в конечном продукте - культуральной жидкости. Вторым недостатком является невозможность масштабирования описанного способа ввиду сложности и длительности процесса получения требуемых количеств гемолимфы личинок - активатора синтеза бактерицидных молекул в данной модели. Третьим недостатком метода является сложность очистки целевого продукта - комплекса антимикробных пептидов - от вспомогательных антибиотиков - пенициллина и стрептомицина - по истечении времени культивирования.

Заявленное изобретение направлено на решение этих проблем.

Технический результат изобретения состоит в повышении степени очистки получаемых природных комплексов антимикробных пептидов, упрощении процесса получения требуемых их количеств с одновременным сокращением времени проведения этого процесса и его удешевлением, а также существенном упрощении стадии очистки.

Указанный технический результат достигается способом получения комплекса антимикробных пептидов насекомого, заключающимся в извлечении из насекомого на стадии личинки жирового тела, помещении жирового тела в жидкую культуральную среду с добавлением вспомогательных антибиотиков, культивировании жирового тела в течение одних суток и последующем сборе культуральной жидкости, в котором в соответствии с заявленным изобретением, перед извлечением жирового тела насекомое на стадии личинки инфицируют бактериями, в качестве культуральной среды используют водный раствор сахаров и неорганических солей, в качестве вспомогательного антибиотика в культуру вносят меропенем в концентрации не менее 2 мг/л культуральной среды, по истечении времени культивирования из культуральной жидкости методом обращенно-фазовой хроматографии извлекают комплекс антимикробных пептидов насекомого.

Указанный технический результат достигается также тем, что в качестве бактерий для инфицирования насекомого на стадии личинки используют кокка Micrococcus luteus А270 и палочку Escherichia coli D31.

Помимо этого, указанный технический результат достигается тем, что комплекс антимикробных пептидов извлекают из культуральной жидкости методом обращенно-фазовой хроматографии на сорбенте C18.

Указанный технический результат достигается тем, что жировое тело насекомого культивируют в солевом растворе, не содержащем экзогенного белка и смеси гидрофобных антибиотиков. Для продукции антимикробных пептидов жировое тело использует тот запас пластических белковых веществ, который накоплен в нем к моменту извлечения из организма-хозяина. В свою очередь, синтез антимикробных пептидов жировым телом и поглощение им белковых веществ из гемолимфы (на стадии нахождения жирового тела в организме личинки) инициируют путем предварительного инфицирования насекомого бактериями. Для стерилизации культуры изолированного жирового тела используется не смесь гидрофобных антибиотиков - стрептомицина и пенициллина, - а умеренно гидрофобный антибиотик меропенем, обладающий отличной от антимикробных пептидов хроматографической подвижностью - это способствует упрощению процедуры очистки целевого продукта от вспомогательного антибиотика методом ВЭЖХ.

Сущность заявленного способа иллюстрируется Фиг.1 - Фиг.5.

На Фиг.1 представлена посуточная динамика синтеза антимикробных пептидов жировым телом, выделенным из интактной и инфицированной личинок Calliphora vicina.

На Фиг.2 представлена хроматограмма смеси стрептомицина и пенициллина, полученная методом ОФ-ВЭЖХ.

На Фиг.3 представлена хроматограмма меропенема, полученная методом ОФ-ВЭЖХ.

На Фиг.4 представлена хроматограмма культуральной жидкости жирового тела личинки Calliphora vicina, инкубируемого в безбелковом солевом растворе.

На Фиг.5 представлена хроматограмма культуральной жидкости жирового тела личинки Calliphora vicina, инкубируемого в среде, содержащей термически обработанную плазму личинок того же вида.

Заявленное изобретение апробировано в Санкт-Петербургском государственном университете, осуществимость и технический уровень изобретения подтверждаются следующими примерами.

Пример 1: Получение комплекса антимикробных пептидов С.vicina.

Предлагаемый способ получения антимикробных пептидов включает семь этапов:

Этап 1. Получение первичного биологического материала (личинок С.vicina)

Для получения первичного биологического материала имаго С.vicina выращивают в условиях короткого дня (12 часов света: 12 часов темноты) при температуре от +20°C до 22°C, а личинок - в темноте при последовательно сменяющих друг друга температурных режимах: +20°C (в первые сутки после отрождения), от 8°C до 12°C (на стадии активного питания), 6°C (на стадии очищения кишечника от остатков пищи), от 0°C до +2°C (на стадии диапаузы). В опытах используют диапаузирующих личинок С.vicina.

Этап 2. Инфицирование насекомых

Иммунный ответ индуцируют проколом кутикулы личинок тонкой иглой (⌀ 25 мкм), смоченной в концентрированной суспензии клеток кишечной палочки Escherichia coli штамма D31 (2×10¹¹ клеток/мл) и кокка Micrococcus luteus штамма А270 (2×10¹¹ клеток/мл). Инфицированных насекомых хранят при комнатной температуре.

Этап 3. Приготовление культуральной среды

В качестве культуральной среды для клеток жирового тела используют ММ-среду [27] лишенную гидролизата лактальбумина и дрожжевого экстракта, конечного состава: 7 г NaCl, 0,2г NaH₂PO₄, 0,2г KCl, 0,2 г CaCl₂x2H₂O, 0,12г NaHCO₃, 0,1г MgCl₂x6H₂O на 1 л дистиллированной воды. Для предупреждения контаминации культуры в среду вносят антибиотик меропенем в концентрации 2 мкг/мл среды.

Этап 4. Извлечение жирового тела

Перед выделением жирового тела поверхность тела личинок стерилизуют 70% раствором этилового спирта, промывают дистиллированной водой и подсушивают на фильтровальной бумаге. Заднюю часть тела личинки отсекают ножницами и извлекают жировое тело в комплексе с трахеями, кишечником и мальпигиевыми сосудами в чашку Петри, заполненную культуральной средой. Жировое тело очищают от трахей, кишечника, мальпигиевых сосудов и, после предварительной промывки, переносят в культуральную среду фиксированного объема. Объем культуральной среды составляет 400-1000 мкл на жировое тело одной личинки.

Этап 5. Культивирование жирового тела

Емкость (планшет либо чашку Петри) с культурой жирового тела устанавливают на платформу орбитального шейкера OS-10 (Вектор-Бест) с заданной частотой вращения платформы 50-90 оборотов/мин. Культуру инкубируют при комнатной температуре (приемлемый диапазон температур - от +20°C до +28°C) в течение суток.

Этап 6. Экстракция гидрофобных соединений из культуральной жидкости

Образцы подкисляют равным по объему количеством 0,1% водного раствора уксусной кислоты и центрифугируют в течение 5 минут при 10000 g для удаления нерастворимого осадка. Экстракцию гидрофобных соединений из культуральной жидкости производят на картриджах Sep-Pak С18 Classic (Waters). Вначале картридж активируют 5 мл ацетонитрила и промывают 5 мл 0,05% водного раствора уксусной кислоты. Затем на картридж последовательно наносят подкисленную (0.05% раствор уксусной кислоты) культуральную жидкость и промывают кратридж 5 мл 0.05% водного раствора уксусной кислоты для удаления гидрофильных соединений. Гидрофобный экстракт, содержащий антимикробные пептиды, элюируют 50%-ным раствором ацетонитрила в 0.05% кислоте. Элюат подвергают лиофилизации на вакуумной сушилке FreeZone 2,5 (Labconco).

Этап 7. Экстракция комплекса антимикробных пептидов

Для очистки комплекса антимикробных пептидов от гидрофобных примесей используют метод ОФ-ВЭЖХ на колонке Vydac С18 (5×250 мм, Waters). Колонку уравновешивают 0.1% раствором трифторуксусной кислоты и наносили подкисленный образец. Пептиды элюируют линейным градиентом ацетонитрила от 0 до 50% в течение 50 мин, собирая элюат по 1 мл в виалы при скорости элюции 1 мл/мин и регистрируя изменение поглощения света с длиной волны 220 нм. Элюат, вышедший с колонки при содержании ацетонитрила 24%-39%, объединяют и сушат в вакууме. Лиофилизат представляет собой очищенный от гидрофобных примесей комплекс антимикробных пептидов насекомого.

Пример 2: Количественные характеристики антимикробной активности жирового тела личинки С.vicina.

В этом примере приведены сравнительные данные, характеризующие производительность органной культуры жирового тела интактной и инфицированной личинок.

Получение личинок и их инфицирование проводили по методике, описанной в Примере 1. Жировое тело выделяли через 2 часа после инфицирования личинок бактериями и инкубировали на протяжении 3 суток в солевом растворе, содержащем глюкозу и антибиотики - стрептомицин и пенициллин - в концентрациях 100 мкг и 100 ЕД соответственно на 1 мл среды. Объем среды составлял 400 мкл на жировое тело одной личинки. Культивирование жирового тела проводили согласно методике, описанной в Примере 1. Сбор и замену среды производили ежедневно. Контрольный вариант отличался тем, что перед выделением жирового личинок не инфицировали.

Титр антимикробных компонентов в культуральной жидкости оценивали с помощью стандартного метода агаровых пластинок [28], используя в качестве тест-организма грамотрицательную бактерию Escherichia coli штамма D31. Согласно методике, аликвоты анализируемых образцов объемом 5 мкл наносили на поверхность застывшей агаровой среды, содержащей бактериальные клетки Escherichia coli штамма D31 (5×10⁷ клеток/мл). Чашки Петри с нанесенными образцами инкубировали в течение суток в термостате при температуре 37°C. осле инкубации среда в чашках становилась непрозрачной вследствие появления видимых бактериальных колоний, за исключением области вокруг нанесенных проб, в пределах которой антимикробные вещества подавляли рост бактерий. Так как площадь свободной от бактерий области пропорциональна содержанию анти-E.coli пептидов в пробе, описанный метод использовали для оценки количественного содержания соответствующих антимикробных пептидов в материале.

Согласно результатам теста, антимикробная активность культуральной жидкости жирового тела инфицированной личинки (Фиг.1, темно-серые столбцы) выше, чем активность культуральной жидкости жирового тела интактной личинки (Фиг.1, светлосерые столбцы). Данная закономерность сохраняется на протяжении 3 суток культивирования жирового тела. Это означает, что инфицирование личинки бактериями стимулирует синтез и выделение антимикробных пептидов жировым телом, а потому является неотъемлемым этапом предлагаемого способа получения антимикробных пептидов.

Пример 3: Хроматографическая подвижность вспомогательных антибиотиков.

В этом примере приведены сравнительные данные, характеризующие хроматографическую подвижность смеси стрептомицина и пенициллина, хроматографическую подвижность меропенема и хроматографическую подвижность антимикробных пептидов.

Смесь стрептомицина и пенициллина (Биолот, Россия) наносили на хроматографическую колонку Vydac С18 (5×250 мм, Waters) в количестве 300 мкг (для стрептомицина) и 300 ЕД (для пенициллина). Меропенем (Sumitomo Pharmaceuticals, Япония) наносили на колонку в количестве 100 мкг. Антибиотики элюировали линейным градиентом ацетонитрила от 0 до 50% в течение 30-50 мин. Элюат собирали по 1 мл в виалы при скорости элюции 1 мл/мин, регистрируя изменение поглощения света с длиной волны 220 нм.

Согласно результатам эксперимента, стрептомицин и пенициллин выходят с колонки при содержании ацетонитрила 23%-42% (Фиг.2), меропенем - при содержании ацетонитрила 15%-17% (Фиг.3).

Антимикробные пептиды в заданных условиях элюируются 24%-39% ацетонитрила (Фиг.4). Это означает, что хроматографическая подвижность антимикробных пептидов частично совпадает с таковой смеси стрептомицина и пенициллина, а это затрудняет очистку антимикробных пептидов. Меропенем же выходит с колонки значительно раньше целевых компонентов. При этом, так же как стрептомицин и пенициллин, меропенем эффективно подавляет рост бактерий-симбионтов личинки Calliphora vicina, предотвращая контаминацию культуры жирового тела (установленная минимальная ингибирующая концентрация составляет 2 мкг/мл). Эти обстоятельства делают меропенем более предпочтительным стерилизующим агентом, который по окончании процесса экстракции антимикробных компонентов можно легко отделить от целевого продукта.

Пример 4: Хроматографическое картирование культуральной жидкости жирового тела

В этом примере приведены сравнительные данные, характеризующие степень чистоты комплекса антимикробных пептидов, получаемых при культивировании жирового тела инфицированной личинки в безбелковой среде и при культивировании жирового тела интактной личинки в среде, содержащей термически обработанную плазму интактных личинок (сравнение со способом-прототипом).

В первом случае жировое тело выделяли из 12 инфицированных личинок. Инфицирование насекомых, выделение жирового тела, его культивирование и экстракцию антимикробных пептидов из культуральной жидкости проводили по методике, описанной в Примере 1. Отличие состояло в том, что полученные в результате хроматографии фракции не объединяли, а сушили индивидуально. Затем к каждой из фракций добавляли по 30 мкл деионизированной воды. Титр антимикробных компонентов в каждой из полученных хроматографических фракций оценивали с помощью стандартного метода агаровых пластинок, используя в качестве тест-организмов грамположительную бактерию Micrococcus luteus штамма А270 и грамотрицательную бактерию Escherichia coli штамма D31 (см. Пример 2). Объем аликвоты, наносимой на поверхность агаровой среды, составлял 5 мкл.

Согласно результатам хроматографического картирования (Фиг.4), антиграмположительные пептиды культуральной жидкости элюируются с колонки 26%-39% ацетонитрила, антиграмотрицательные пептиды - 24%-39% ацетонитрила. «Пики» анти-M.luteus активности соответствуют фракциям №№28 и 33, «пики» анти-E.coli активности - фракциям №№26, 31 и 37.

Во втором случае жировое тело выделяли из 3 интактных личинок и инкубировали его в 30%-ном растворе термически обработанной плазмы интактных личинок (термическая обработка в течение 1 минуты при температуре +95°C), содержащем стрептомицин и пенициллин, из расчета 1 мл культуральной среды на жировое тело одной личинки. Цикл культивирования жирового тела также ограничивали одними сутками. Экстракцию гидрофобных соединений из культуральной жидкости проводили по методике, описанной в Примере 1. Хроматографическое фракционирование гидрофобных соединений культуральной жидкости и дальнейшее картирование проводили по методике, описанной выше.

Согласно результатам хроматографического картирования (Фиг.5), антиграмположительная активность культуральной жидкости сосредоточена во фракциях №№30-36, а антиграмотрицательная - во фракциях №№28-39. «Пики» акти-M.luteus активности соответствуют фракциям №№31 и 36, «пики» анти-E.coli активности - №№28, 33 и 37.

Поскольку «пики» бактерицидной активности (на гистограмме) соответствуют основным семействам антимикробных пептидов, представленным в культуральной жидкости, то на основании сходного распределения антимикробной активности по фракциям в одном и в другом случаях можно заключить, что и состав пептидных антибиотиков в образцах идентичен. При этом в первом случае на самой хроматограмме прослеживаются четкие пики элюированных с колонки антимикробных пептидов, в то время как на второй - доминируют «пики» балластных компонентов, не обладающих прямой антибактериальной активностью (хотя личинок в эксперименте было использовано вчетверо меньше). Это означает, что чистота антимикробных пептидов при культивировании жирового тела в безбелковой среде выше, чем при его культивировании в среде, содержащей экзогенный белок - термически обработанную плазму.

Технико-экономическая эффективность заявленного способа состоит в возможности производства бактерицидных препаратов местного и системного действия, в которых эффекторными компонентами являются антимикробные пептиды насекомого, что стало осуществимым за счет значительного повышения степени чистоты получаемых природных комплексов антимикробных пептидов, упрощении и удешевлении процесса получения требуемых их количеств с одновременным сокращением его длительности.

Использованные источники информации

1. Patent No.: WO 081486 Oral administration of defensins to treat intestinal diseases

2. Patent No.: US 034820 Use of antimicrobial proteins and peptides for the treatment of otitis media and paranasal sinusitis

3. Patent No.: WO 9807833 Compositions and methods for use of defensin

4. Patent No.: JP 288105 Antibacterial peptides for the treatment of periodontitis

5. Patent No.: WO 038349 Beta-defensins for antibiotics

6. Patent No.: WO 9421672 Beta-defensins: novel antimicrobial peptides from bovine neutrophils

7. Patent No.: US 110553 Use of antibiotic peptides produced by human corneal epithelial cells to manage infection

8. Patent No.: WO 044998 Retrocyclins: antiviral and antimicrobial peptides

9. Patent No.: WO 053565 Protein and cDNA sequences and heterologous expression of antimicrobial peptides from spruce, oyster and scorpion, and uses thereof

10. Patent No.: WO 097110 Defensin family polypeptides having antimicrobial activity and polynucleotides encoding them from Arenicola marina

11. Patent No.: US 6887846 Antimicrobial amino acid sequences derived from alpha-melanocyte-stimulating hormone

12. Patent No.: US 6884776 Antimicrobial peptides derived from ubiquicidine

13. Patent No.: US 6872705 Use of antimicrobial peptides as preservatives in ophthalmic preparations, including solutions, emulsions, and suspensions

14. Patent No.: US 6790833 Antifungal and antibacterial agents

15. Patent No.: US 014669 Antimicrobial theta defensins, analogs there of, and methods of use

16. Patent No.: US 6642203 Crustacean antimicrobial peptides

17. Patent No.: WO 9616075 Antibiotic cryptdin peptides and their complementary and genomic DNA sequences

18. Patent No.: US 6906035 Antimicrobial cationic peptides

19. Patent No.: US 6624140 Synthetic peptides with antimicrobial and endotoxin neutralizing properties for management of the sepsis syndrome

20. Patent No.: US 6172185 Antimicrobial cationic peptide derivatives of bactenecin

21. Patent No.: US http://patft.uspto.gov/netacgi/nph-Parser?Sect2=PTO1&Sect2=HITOFF&p=1&u=%2Fnetahtml%2Fsearch-bool.html&r=1&f=G&1=50&d=PALL&RefSrch-yes&Query=PN%2F4355104-h0http://patft.uspto.gov/netacgi/nph-

Parser?Sect2=PTO1&Sect2=HITOFF&p=1&u=%2Fnetahtml%2Fsearch-bool.html&r=1&f-G&1=50&d=PALL&RefSrch=yes&Query=PN%2F4355104-h24355104 Bacteriolytic proteins

22. Patent No.: US http://patft.uspto.gov/netacgi/nph-Parser?Sect2=PTO1&Sect2=HITOFF&p=1&u=%2Fnetahtml%2Fsearch-bool.html&r=1&f=G&1=50&d=PALL&RefSrch=yes&Query=PN%2F6063765-h0http://patft.uspto.gov/netacgi/nph-

Parser?Sect2=PTO1&Sect2=HITOFF&p=1&u=%2Fnetahtml%2Fsearch-bool.html&r=1&f=G&1=50&d=PALL&RefSroh=yes&Query=PN%2F6063765-h26063765 Antibacterial protein

23. Patent No.: US 6476189 Antibacterial peptides and antibacterial agents containing such peptides as an effective ingredient

24. Patent No.: FR 2695392 Antibacterial peptides from the hemolymph of the dragonfly Aeschna cyanea and their purification and use

25. Patent No.: US 6337093 Immunomodulatory and antimicrobial materials, their preparation and use

26. Яковлев А.Ю. Индукция синтеза антимикробных пептидов клетками жирового тела личинки Calliphora vicina R.-D. (Diptera, Calliphoridae) // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. - 2011. - Т.47, №6. - С.461-468 (прототип).

27. Mitsuhashi J., Maramorosch K. Leafhopper tissue culture: embryonic, nymphal and imaginal tissues from aseptic insects // Contrib. Boyce Thomson Inst. - 1964. - Vol.22. - P.435-460.

28. Lambert J., Keppi E., Dimarcq J.-L. Insect immunity: isolation from immune blood of the dipteran Phormia terranovae of two insect antibacterial peptides with sequence homology to rabbit lung macrophage bactericidal peptides // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. - 1989. - Vol.86. - P.262-266.

Способ получения комплекса антимикробных пептидов насекомого, заключающийся в извлечении из насекомого на стадии личинки жирового тела, помещении жирового тела в жидкую культуральную среду с добавлением вспомогательных антибиотиков, культивировании жирового тела в течение одних суток и последующем сборе культуральной жидкости, отличающийся тем, что перед извлечением жирового тела насекомое на стадии личинки инфицируют бактериями Micrococcus luteus А270 и Escherichia coli D31, в качестве культуральной среды используют водный раствор сахаров и неорганических солей, в качестве вспомогательного антибиотика в культуру вносят меропенем в концентрации не менее 2 мг/л культуральной среды, по истечении времени культивирования из культуральной жидкости методом обращенно-фазовой хроматографии на колонке Vydac С18 элюируют комплекс антимикробных пептидов насекомого линейным градиентом ацетонитрила от 0% до 50%.