Способ идентификации полипептидов и белков h.parasuis

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ определения перекрестно реагирующих молекул иммунологического действия, включающих перекрестно реагирующую антигенную детерминанту Н.parasuis. Способ предусматривает иммунизацию животного первой антигенной детерминантой, происходящей из первого серотипа H.parasuis, с последующим выделением образующегося антитела. Далее производят вторую иммунизацию животного второй антигенной детерминатой, происходящей из второго серотипа H.parasuis, с последующим выделением второго образующегося антитела. Затем проводят контактирование выделенных антител с первой и второй антигенными детерминантами и определяют белки H.parasuis, имеющие перекрестно реагирующую детерминанту. Изобретение может быть использовано в области иммунологии и животноводства. 4 з.п. ф-лы, 4 табл., 4 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к композициям и способам для определения перекрестно реагирующих молекул иммунологического действия, включающим перекрестно реагирующая антигенная детерминанта, в частности, для определения белков, включающих перекрестно реагирующая антигенная детерминанта, в частности, для определения белков, которые являются перекрестно реагирующими на основании серологических тестов, использующих последовательные иммунологические стимуляции животного, включая определение перекрестно реагирующих белков Н.parasuis. Также в изобретении предусматриваются композиции, вакцины и наборы, использующие молекулы, для диагностики и способов предупреждения или лечения заболевания, состояния или их симптомов, связанных с инфекционными агентами, в частности, инфекционными микроорганизмами, в частности, для предупреждения и лечения заболевания, нарушения, состояния или их симптомов, связанных с инфекцией, вызванной H.parasuis.

Предпосылки создания изобретения

Принцип вакцинации главным образом базируется на двух ключевых элементах иммунитета, а именно на специфичности и памяти. Для активации и дифференциации В-клеток в ответ на большинство антигенов необходимы различные сигналы, которые побуждают В-клетки к образованию либо клеток плазмы, секретирующих антитела, либо В-клеток памяти, готовых к опосредованию более быстрого ответа на вторичное воздействие антигена. Клетки памяти обеспечивают гораздо более сильный ответ иммунной системы при повторном контакте с антигенами. Этот вторичный ответ проявляется более быстро и является более эффективным по сравнению с первичным ответом. Однако из-за того, что антитела по своей природе являются высоко специфическими и ввиду разнообразия инфекционных агентов, все еще остается актуальной проблема получения антител, которые проявляют перекрестную реактивность с многочисленными различными типами патогенов.

Одним примером инфекционного агента, для которого сохраняется значительный стимул к образованию антител, которые проявляют перекрестную реактивность, является бактерией Haemophilus parasuis (H.parasuis), этиологический агент полисерозита и артрита свиней (болезни Глассера). H.parasuis является грамотрицательной, иногда инкапсулированной, неподвижной, плеоморфной бактерией, выделяемой из серозных экссудатов свиней, пораженных серозно-фибринозным плевритом, перикардитом, перитонитом, артритом и менингитом. Этот микроорганизм, который первоначально описан Glasser в 1910 году, вероятно, впервые выделен Schermer и Ehrlich в 1922 году, хотя предполагаемый организм первоначально был отнесен к Haemophilus suis. Однако в 1969 году Biberstein и White показали, что возбудитель Глассера нуждается только в никотинамидадениндинуклеотиде (НАД). Haemophilus suis, микроорганизм, нуждающийся и в железосодержащем порфирине, и в никотинамидадениндинуклеотиде (НАД), таким образом не играл коварную роль в этом заболевании, и новый организм, путем добавления приставки «para», был переименован в H.parasuis.

Характеристика Н.parasuis в значительной степени была получена за последние пять десятилетий. Bakos и др. использовали реакцию преципитации и идентифицировали четыре серовара, которые они обозначили A-D (Nordic Veterinary Medicine, 4, 1952, cc.241-255). Эти четыре серовара в 1986 году возросли до семи (J Clin Microbiol, 23, 1986, cc.1022-1025). Kielstein и др., Zentralbl Veterinarmed В, 38, 1991, cc.315-320, добавили еще шесть и, совместно с Rapp-Gabrielson, Am J Vet Res, 53, 1992, cc.659-664, еще пять других. В конечном счете, эта классификация была усовершенствована. Все серовары, включая пять с множественными обозначениями, охарактеризованы на основании реакции иммунодиффузии, выполненной со специфической сывороткой кролика. В результате появился список по меньшей мере из пятнадцати общепринятых в мире сероваров. К сожалению, существует также значительное число нетипируемых изолятов. Кроме того, в некоторых публикациях описаны серотипические профили Н.parasuis в определенных странах. Было сделано предположение, что в США, Германии, Японии, Испании, Канаде и Китае довольно распространены серотипы 4 и 5. Серотипы 5 и 13, согласно сообщениям, преобладают в Австралии и Дании.

Вирулентные факторы Н.parasuis не определены. По большей части вирулентность связывают с серотипом, поскольку некоторые серотипы соответствуют более высокой заболеваемости и смертности. Сообщалось, что при внутрибрюшинной инфекции серотипы 1, 5, 10, 12, 13 и 14 вызывают высокую заболеваемость и смертность в течение 4 суток. Поэтому, эти штаммы считаются высоковирулентными. Три серотипа (т.е., 2, 4 и 15) проявляли средние уровни вирулентности, вызывая полисерозит без летальности. Оставшиеся серотипы считаются авирулентными, поскольку у пораженных свиней не обнаруживалось клинического проявления болезни.

Делались попытки определить специфические факторы вирулентности Н.parasuis. Поскольку этот вид является членом семейства Pasteurellaceae, предполагалось, что некоторые кандидаты могли бы включать капсулы, фимбрии, липополисахариды (ЛПС) и белки наружной мембраны (БНМ). Однако в настоящее время выявлено мало корреляций между этими признаками у H.parasuis и вирулентностью. Инкапсулированные штаммы распространены в носовых полостях, как здоровых свиней, так и животных с клиническим проявлением заболевания. Важность ЛПС отчасти была развеяна сообщениями, говорящими об отсутствии значительного различия в продукции ЛПС между вирулентными и авирулентными серотипами и показывающими, что представители, содержащие и ЛПС, и БНМ стимулировали ответы только к БНМ.

Показано, что БНМ генерируют сильный гуморальный ответ, и из этой категории были предложены кандидаты в качестве защитных иммуногенов. Известны и могут быть связаны с вирулентностью два основных профиля БНМ. Большинство вирулентных серотипов характеризуются вторым профилем, в котором преобладает белок с молекулярной массой 37 кДа. Авирулентные серотипы показывают множественные полосы, с интенсивными полосами, характерными для белков с молекулярной массой между 23-40 кДА, а также для белка с молекулярной массой приблизительно 68 кДа.

Предложено несколько других белков, связанных с инфекциями Н.parasuis. Сообщалось о двух белках колонизации, обозначенных Р2 и Р5, оба из которых являются иммуногенными. Неожиданно было установлено, что Р2, по-видимому, различается в зависимости от вирулентности серотипа. В авирулентных серотипах он главным образом представлен в виде белка с молекулярной массой 55 кДа, а в вирулентных серотипах - с молекулярной массой 48 кДа. Этот белок показывает гомологию с белком Р2 Haemophilus influenzae. Также была идентифицирована и описана повышенная регуляция области TonB генома Н.parasuis. Эта область содержит несколько генов, которые реагируют на истощение железа в окружающей среде. В частности, был идентифицирован трансферрин-связывающий белок и показана его повышенная регуляция при ограничении содержания железа. Предполагалось, что при недоступности железа у хозяина такие гены могут быть важными для выживаемости патогена внутри хозяина.

Кроме того, используя поликлональное антитело, направленное против основного белка наружной мембраны (ОБНМ) с молекулярной массой 42 кДа у Pasturella multocida, обнаружен основной белок наружной мембраны с молекулярной массой 42 кДа. Анализ потенциально близкого белка (42 кДа) Haemophilus ducreyi, близкородственного вида, показал антигенный близость этого белка с OmpA. Этот класс термолабильных мембранных белков дополнительно исследован посредством разработки моноклональных антител против мембранных препаратов H.parasuis. В этом эксперименте использованы два моноклональных антитела, одно против БНМ с массой 35 кДа и второе против ЛПС. Сообщалось, что эти моноклональные антитела специфически реагируют с общими серотипами, и выдвинуто предположение об их потенциальной значимости в качестве диагностических средств или потенциальных мишеней вакцины.

Другим мощным вирулентным фактором является нейраминидаза. Более 90% полевых изолятов, по-видимому, образуют нейраминидазу. Этот фермент поздно экспрессируется в ростовой фазе Н.parasuis и коррелирует и с воздействием на рецепторы, необходимые для колонизации, и с распадом муцина внутри хозяина.

Н.parasuis может инфицировать разнообразные места в организме хозяина. В результате клинические симптомы проявляются по-разному, в зависимости от места инфекции. Четырьмя первичными формами инфекции являются болезнь Глассера (фибринозный полисерозит), септицемия (без полисерозита), острый миозит (жевательной мышцы) и респираторное заболевание. Независимо от места инфекции или типа инфекции установлено, что симптомы инфекции Н.parasuis являются до некоторой степени общими. В большинстве случаев описываются повышенная температура, апатия и потеря аппетита. Другие описанные общие симптомы включают кашель, одышку, потерю массы тела, хромоту, отсутствие координации, цианоз и истощение.

Н.parasuis стал основной угрозой после освобождения большинства популяций животных от специфических патогенов (SPF - specific-pathogen-free). Отчасти благодаря развитию свиноводства, которое подразумевает отсутствие в стадах животных специфических патогенов, патоген Н.parasuis приобрел экономическую значимость. Обычно инфекция поражает не подвергнутых какому-либо воздействию животных, содержащихся в условиях, не отвечающих требованиям гигиены, или при плохом кормлении. Кроме того, вспышкам способствовали небезопасная транспортировка и объединение свиней разного возраста. Сочетание повышенного количества животных и относительной чистоты популяции свиней в таких стадах защищенных животных согласно сообщениям привело к повышению случаев заболевания, вызываемого Н.parasuis. Кроме того, обстоятельства усложняются тем фактом, что Н.parasuis существует в нескольких, специфических для регионов, серотипах. Сообщалось, что контакт с одним серотипом или вакцинация к одному серотипу необязательно предохраняют против инфекций, вызываемых другими серотипами. С учетом этого, в качестве контроля против распространения неизвестного серотипа была предложена разработка аутогенной вакцины. Отчасти из-за таких проблем и задержки между генерированием аутогенной вакцины и воздействием на свиней возникла потребность в вакцине, обеспечивающей перекрестную защиту, которая могла бы вводиться независимо от регионального преобладания серотипа.

При развитии клинических симптомов инфекции, вызванной Н.parasuis, в качестве неотложной меры предложено лечение антибиотиками. К сожалению, в связи с инвазивной природой патогена для эффективного лечения необходимы высокие дозы антибиотиков, что часто является непомерно затратным.

Были предприняты попытки контролирования проблемы через вакцинирование с использованием обеих вакцин: коммерческой и аутогенной. Разнообразие серотипов Н.parasuis усложняло режимы вакцинации, поскольку перекрестный иммунитет встречается редко. В соединении с нетипируемыми штаммами это изобилие антигенных профилей затрудняло разработку вакцины.

Предлагалась также защита путем вакцинации против гомологичного заражения. В трех исследованиях предполагалось, что убитая бактериальная вакцина могла бы защитить против гомологичного заражения, если она создана на основе известных серотипов и нетипизированных диких изолятов. Исследования проливают свет на использование аутовакцин для контролирования вспышек, чтобы уменьшить процент смертности.

Предлагалось использование вирулентных штаммов для защиты против гетерологичного заражения другими вирулентными штаммами. В одном исследовании сообщалось, что бивалентная вакцина, содержащая серотипы 4 и 5, предохраняла против серотипов 13 и 14. Однако в других исследованиях не удалось показать перекрестную защиту между серотипами 2 и 5.

Все же, другие исследователи предложили контролируемое воздействие на поросят низкими дозами живой вирулентной бактерии Н.parasuis. Однако, отчасти из-за повреждающих сопутствующих инфекций, вызванных другими патогенами, например вирусом репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRSV - porcine reproductive and respiratory syndrome virus), этот подход не был рекомендован в качестве функционального метода контроля.

Поскольку эффективность доступных в настоящее время способов контроля различных болезнетворных инфекций ограничена, что отчасти происходит из-за разнообразия болезнетворных агентов, например, Н.parasuis, необходимы эффективные способы и композиции для лечения и предупреждения инфекций, в особенности необходимо идентифицировать белки, которые проявляют перекрестную реактивность и могут позволить разработать эффективные вакцины, в частности для лечения и предупреждения инфекции, вызываемой Н.parasuis.

Краткое описание изобретения

В одном из объектов настоящего изобретения предусмотрен способ определения молекулы, включающей перекрестно реагирующую антигенную детерминанту. Способ включает контактирование по меньшей мере одного антитела с первой антигенной детерминантой и второй антигенной детерминантой. По меньшей мере одно антитело получают от животного, последовательно подвергаемого воздействию первого иммунологического стимула, вызываемого первой иммуногенной композицией, включающей первую антигенную детерминанту, и затем второго иммунологического стимула, вызываемого второй иммуногенной композицией, включающей вторую антигенную детерминанту. Связывание по меньшей мере одного антитела с первой и второй антигенной детерминантой свидетельствует о перекрестной реактивности, тем самым, определяя молекулу.

В другом объекте настоящего изобретения предусматривают способ определения молекулы, включающей перекрестно реагирующую антигенную детерминанту; указанный способ включает:

а) активацию В-клеток памяти у животного для образования по меньшей мере одного антитела, причем активация включает иммунологическое стимулирование животного молекулой, чтобы вызвать иммунологический ответ, который активирует В-клетки памяти, и

б) контактирование по меньшей мере одного антитела со второй молекулой, причем связывание по меньшей мере одного антитела с молекулой и второй молекулой определяет молекулу.

Другие объекты настоящего изобретения предусматривают выделенный полипептид. Полипептид включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

ELANAI	(SEQ ID NO:1),
TVLAEKQEII	(SEQ ID NO:2),
APAKGSTIEAGIAYPIST	(SEQ ID NO:3),
MKNLISI	(SEQ ID NO:4),
SPSDKTFKISAIPDYNAAEMT	(SEQ ID NO:5).

Кроме того, выделенный полипептид включает перекрестно реагирующую антигенную детерминант, присутствующую в белке, экспрессируемом по меньшей мере двумя серотипами Н.parasuis.

Некоторые объекты настоящего изобретения предусматривают выделенный полипептид, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

ELANAI	(SEQ ID NO:1),
TVLAEKQEII	(SEQ ID NO:2),
APAKGSTIEAGIAYPIST	(SEQ ID NO:3),
MKNLISI	(SEQ ID NO:4),
SPSDKTFKISAIPDYNAAEMT	(SEQ ID NO:5),

причем выделенный полипептид также включает перекрестно реагирующую антигенную детерминанту и экспрессируется серотипом 5 Н.parasuis.

В одном из объектов настоящего изобретения предусматривают вакцину, включающую профилактически или терапевтически эффективное количество выделенного полипептида и фармацевтически приемлемые растворитель, носитель или эксципиент. Полипептид включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

ELANAI	(SEQ ID NO:1),
TVLAEKQEII	(SEQ ID NO:2),
APAKGSTIEAGIAYPIST	(SEQ ID NO:3),
MKNLISI	(SEQ ID NO:4),
SPSDKTFKISAIPDYNAAEMT	(SEQ ID NO:5).

Кроме того, выделенный полипептид включает перекрестно реагирующую антигенную детерминанту, присутствующую в белке, экспрессируемом по меньшей мере двумя серотипами Н.parasuis.

В другом объекте настоящего изобретения предусмотрен способ лечения или предупреждения заболевания, состояния или их симптомов, связанных с инфицированием животного Н.parasuis. Способ включает введение эффективного количества вакцины, включающей профилактически или терапевтически эффективное количество выделенного полипептида и фармацевтически приемлемые растворитель, носитель или эксципиент. Полипептид включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

ELANAI	(SEQ ID NO:1),
TVLAEKQEII	(SEQ ID NO:2),
APAKGSTIEAGIAYPIST	(SEQ ID NO:3),
MKNLISI	(SEQ ID NO:4),
SPSDKTFKISAIPDYNAAEMT	(SEQ ID NO:5).

Кроме того, выделенный полипептид включает перекрестно реагирующую антигенную детерминанту, присутствующую в белке, экспрессируемом по меньшей мере двумя серотипами Н.parasuis,

Другие объекты в соответствии с настоящим изобретением предусматриваются композиции, способы и наборы для диагностики.

Преимущества и выгоды настоящего изобретения будут очевидны специалистам в данной области из приводимого описания.

Подробное описание изобретения

Различные объекты и варианты осуществления настоящего изобретения, предусмотренные на основании настоящего изобретения, включают идентификацию молекул, которые могут обеспечить перекрестно реагирующие антитела, которые распознают антигенно близкие молекулы, и которые поэтому могут использоваться в вакцинах, диагностических средствах и способах лечения или предупреждения широкого ряда состояний или заболеваний, включая те, которые связаны с инфекционными агентами, например, но ими перечень не ограничивается, бактериями, вирусами и др. Новый описываемый в настоящем изобретении подход использует хозяина для идентификации перекрестно реагирующих молекул, применяя модель ступенчатой иммунологической стимуляции, в которой хозяина последовательно стимулируют, например, одним серотипом Н.parasuis, дают восстановиться, затем стимулируют другим серотипом.

I. Определения.

Понятие «молекула», если не оговаривается иное, включает полипептиды и белки, включая, например, гликопротеины и липопротеиды, полисахариды, включая, например, липополисахариды, нуклеиновые кислоты и их фрагменты.

Понятие «иммуноген» или «иммуногенный» относится к молекуле, которая вызывает специфический иммунный ответ.

Понятие «антигенная детерминанта» в контексте настоящего изобретения относится к первичной, вторичной, третичной или четвертичной структуре молекулы (например, полипептида), распознаваемой В-клетками (т.е. В-лимфоцитами) и антителами, секретируемыми В-клетками.

Понятие «перекрестно реагирующая антигенная детерминанта» в контексте настоящего изобретения относится к способности антигенной детерминанты, присутствующей на двух или нескольких молекулах (например, вариантах бактериального белка), связываться одним и тем же антителом. Кроме того, следует учитывать, что две или несколько молекул, включающие антигенную детерминанту, способную связываться одним и тем же антителом, могут представлять: одну и ту же молекулу или ее фрагмент, варианты друг друга или различные молекулы. Например, белки (например, варианты бактериального белка), включающие антигенную детерминанту, способную связываться одним и тем же антителом, могут иметь одинаковую или разную первичную аминокислотную последовательность, однако каждый из белков включает антигенную детерминанту (т.е., «перекрестно реагирует»), который может связываться одним и тем же антителом.

Понятие «перекрестно реагирующее антитело» в контексте настоящего изобретения относится к антителу, способному к связыванию с перекрестно реагирующей антигенной детерминантой.

Понятие «лечение» в контексте настоящего изобретения относится к улучшению или излечиванию заболевания, расстройства, состояния или симптомов заболевания, расстройства или состояния.

Понятие «предупреждение» означает остановку или торможение заболевания, расстройства, состояния или симптомов заболевания, расстройства или состояния.

II. Определение перекрестной реактивности.

В одной задаче настоящее изобретение предусматривает способ определения молекулы, включающей перекрестно реагирующая антигенная детерминанта. Способ включает контактирование по меньшей мере одного антитела с первой антигенной детерминантой и второй антигенной детерминантой, причем по меньшей мере одно антитело получают от животного, последовательно подвергаемого воздействию первой иммунологической стимуляции, вызываемой первой иммуногенной композицией, включающей первую антигенную детерминанту, и последующей второй иммунологической стимуляции, вызываемой второй иммуногенной композицией, включающей вторую антигенную детерминанту, причем связывание по меньшей мере одного антитела с первой и второй антигенной детерминантой свидетельствует о перекрестной реактивности и таким образом определяет молекулу.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения первая иммуногенная композиция дополнительно включает первый полипептид, содержащий первую антигенную детерминанту, причем вторая иммуногенная композиция дополнительно включает второй полипептид, содержащий вторую антигенную детерминанту, причем первый полипептид экспрессируется первым микроорганизмом, а второй полипептид экспрессируется вторым микроорганизмом, причем первый и второй микроорганизмы отличаются тем, что являются различными серотипами одного и того же вида. В другом варианте осуществления настоящего изобретения первый и второй микроорганизмы являются бактериями. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения бактериями является Н.parasuis.

Таким образом, представляемый способ включает две или несколько последовательных иммунологических стимуляций животного, включая время восстановления между стимуляциями. Затем после последней стимуляции от животного получают по меньшей мере одно антитело, например, путем отбора у животного лимфатических узлов и/или другой богатой клетками памяти ткани, содержащих по меньшей мере одно антитело. Без ссылки на какую-либо теорию высказано предположение, что путем отбора лимфатических узлов и/или другой богатой клетками памяти ткани, можно собрать В-клетки памяти, генерируемые первой стимуляцией, после их активации в ответ на последующую стимуляцию. Активированные В-клетки памяти ответственны за просветление первой антигенной детерминанты, вызывающего первую стимуляцию, и антитела, которые они вырабатывают в ответ на последующую стимуляцию, вызываемую второй антигенной детерминантой, можно исследовать на их перекрестную реактивность с первой и второй антигенной детерминантой, определяя таким образом их соответствующие перекрестно реагирующие молекулы.

К соответствующим животным, пригодным для использования в этом способе, относятся, но ими не ограничиваются, свиньи (например, поросята), коровы, овцы, морские свинки, кролики, мыши, крысы, козы и лошади. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения животное представляет извлеченное кесаревым сечением лишенное молозива животное. В другом варианте осуществления настоящего изобретения животное является свиньей. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения рожденным через кесарево сечение лишенным молозива животным является поросенок. В других вариантах осуществления настоящего изобретения возраст животного составляет по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10 недель.

Животное можно подвергать воздействию первой и второй иммунологической стимуляции каким-либо способом, при условии, что при первой стимуляции генерируются В-клетки памяти и активируются в ответ на последующую стимуляцию животного второй антигенной детерминантой. Предпочтительно, антиген содержится в иммуногенной композиции. Например, первая иммуногенная композиция, включающая первая антигенная детерминанта, и вторая иммуногенная композиция, включающая вторую антигенную детерминанту, могут вводиться животному каким-либо соответствующим способом введения, известным в данной области, включая, но ими не ограничиваясь, внутривенное, внутриартериальное, внутримышечное, подкожное, внутрикожное, чрескожное, пероральное и интраназальное введения.

Другие способы воздействия иммунологическим стимулом в рамках настоящего изобретения также включают вакцинации и естественное воздействие иммуногеном (например, инфекционным агентом). Таким образом, иммунологическая стимуляция также может включать стимуляцию, вызываемую естественным контактом животного с антигенной детерминантой, например, через контакт животного с инфекционным агентом (например, бактериями, вирусами, паразитами). Таким образом, например, первая иммунологическая стимуляция может быть стимуляцией, вызываемой естественным инфицированием животного штаммом бактерии, принадлежащим к первому серотипу, после которой следует вторая стимуляция, включающая внутриносовое введение второй иммуногенной композиции со вторым серотипом (например, второй антигенной детерминантой) штамма.

Иммуногенная композиция, включающая антиген, необязательно дополнительно может включать буфер и/или дополнительно включать другие компоненты, которые помогают достигнуть желаемого иммунологического эффекта и/или минимизировать побочные эффекты, оказываемые на животное, которое получает иммунологический стимул.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения первая и вторая иммуногенная композиция включают пептонный буфер или физиологический раствор. В другом варианте осуществления первая и вторая иммуногенные композиции включают пептонный буфер, причем первая иммуногенная композиция дополнительно включает первую бактерию, причем вторая иммуногенная композиция включает вторую бактерию, причем первая и вторая бактерии принадлежат к различным серотипам одного и того же вида.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения вторую иммунологическую стимуляцию вводят животному по меньшей мере примерно спустя 1 неделю после первой стимуляции животного, например, примерно от 1 недели до примерно 1 года, примерно от 2 недель до примерно 10 месяцев, примерно от 3 недель до примерно 8 месяцев, примерно от 1 месяца до примерно 6 месяцев и примерно от 2 месяцев до 4 месяцев после первой иммунологической стимуляции.

Таким образом, настоящее изобретение базируется на иммунологической памяти. Соответственно способ дополнительно предусматривает получение биологического образца от животного после второй иммунологической стимуляции, причем биологический образец включает клетки памяти, вырабатывающие антитело. Биологический образец может принадлежать к какому-либо соответствующему типу. Биологический образец может происходить из тканей, органов, крови, лимфы или лимфоузлов животного. Биологический образец также можно отбирать из инфицированного участка, или области поражения, или области, близкой к инфицированному участку или области поражения, например, в лимфоузлах. Предпочтительно биологический образец получают путем отбора лимфоузлов животного и/или других тканей с высоким содержанием клеток памяти, которые предоставляют В-клетки памяти.

Обычно биологический образец отбирают у животного после второй иммунологической стимуляции. Время, в течение которого отбирают образец, может варьировать в зависимости от множества факторов, включая конкретное животное, иммуногенную композицию, какие-либо предполагаемые стадии после отбора образца (например, последующие условия культивирования) и т.д., и может предварительно определяться стандартными экспериментами. Предпочтительно биологический образец отбирают у животного после второй стимуляции в то время, когда происходит достаточная активация клеток памяти. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения биологический образец отбирают у животного примерно спустя 24 ч после второй иммунологической стимуляции, например, примерно через 1-14 суток, примерно через 2-12 суток, примерно через 4-10 суток и примерно через 6-8 суток после последней иммунологической стимуляции.

После отбора у животного биологического образца клетки памяти, образующие антитела, которые присутствуют в биологическом образце можно подвергнуть дополнительной обработке, чтобы получить по меньшей мере одно антитело. В одном варианте осуществления настоящего изобретения после отбора у животного биологического образца, клетки памяти, образующие антитела, которые присутствуют в биологическом образце, культивируют in vitro. Культивирование in vitro клеток памяти, образующих антитела можно проводить с проведением или без проведения предварительных этапов по разделению субпопуляций клеток. Методы культивирования известны в данной области.

Супернатант культуры может включать антитела, секретируемые клетками памяти во время культивирования in vitro, поэтому получение по меньшей мере одного антитела можно осуществлять путем сбора супернатанта культуральной среды. Антитела, образуемые культивируемыми клетками, также можно высвобождать из культивируемых клеток, например, путем лизиса клеток В-памяти для высвобождения по меньшей мере одного антитела.

Выработку и/или секрецию in vitro по меньшей мере одного антитела активированными клетками памяти в культуральной среде можно повысить путем добавления в клеточную культуру реагентов, которые способствуют клеточной пролиферации и/или повышают продукцию и/или секрецию антител. Такие реагенты сами по себе или в комбинации включают цитокины, например, но ими не ограничиваясь, интерлейкины, например, IL-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 к 8, колониестимулирующие факторы, интерфероны и какие-либо другие факторы, которые могут обладать усиливающим действием на активацию, пролиферацию и/или продукцию и/или секрецию антител у В-клеток. Например, клеточная активация может включать добавление к культуральной среде активирующего агента, включая, но ими не ограничиваясь, митогены, и факторы, образуемые лейкоцитами, или их синтетические аналоги или их комбинации. Необязательно в культуральную среду включают антимикробные агенты.

Супернатант клеточной культуры, включающий по меньшей мере одно антитело, можно непосредственно использовать для определения связывания по меньшей мере одного антитела с первой и второй антигенными детерминантами. Иначе говоря, по меньшей мере одно антитело можно просто использовать в форме супернатанта, полученного из культуральной среды.

В других вариантах осуществления настоящего изобретения от животного можно получить биологический образец и содержащиеся в нем В-лимфоциты сделать бессмертными (иммортализировать) и/или клонировать. В данной области известны сливающиеся клетки, которые способны к иммортализации В-лимфоцитов. Методы, используемые для слияния, включают соединение В-лимфоцитов со сливающейся клеткой в присутствии фузогена, например, неионного детергента, в течение времени, достаточного для осуществления слияния, с последующей селекцией полученной гибридомы с помощью маркеров, присутствующих в сливающейся клетке. Затем клетки подвергают серийному разведению, чтобы получить клоны, свободные от контаминирующих клеток, таким образом, получая композицию гомогенных антител. Затем гибридомы можно размножить в культуре или ввести в животное-хозяина, например, мышь и крысу, для получения богатой антителами асцитной жидкости.

При желании по меньшей мере одно антитело можно подвергнуть процедурам очистки и/или разделения. Например, можно использовать методы, которые, например, используются для очистки иммуноглобулинов от сыворотки или плазмы, например, абсорбцию, осаждение сульфатом аммония, фракционирование каприловой кислотой, ионообменную хроматографию, или связывание и элюирование из иммобилизованного белка G или белка А. Также в зависимости от структуры или применения по меньшей мере одно антитело также можно соединить с пригодным носителем, например, с носителем для аффинной хроматографии.

Соответственно, например, раствор, содержащий по меньшей мере одно антитело, может также содержать по меньшей мере одно нежелаемое неспецифическое антитело, присутствие которого нежелательно во время этапа контактирования по меньшей мере одного антитела с первой антигенной детерминантой и второй антигенной детерминантой. Соответственно при необходимости нежелательное антитело можно удалить из раствора, включающего по меньшей мере одно антитело, путем абсорбции различными реагентами, включая, например, яичный желток, порошок ткани, суспензии микроорганизмов и т.д. Для абсорбции также можно использовать предиммунную сыворотку, полученную от животного. В качестве иллюстрации в другом примере раствор, включающий по меньшей мере одно антитело, продуцируемое в ответ на стимулирование одним видом бактерии, можно инкубировать, например, с экстрагированной детергентом клеточной суспензией бактерии другого вида, после чего отцентрифугировать и собрать супернатант, включающий по меньшей мере одно антитело. Абсорбцию можно проводить более одного раза, чтобы минимизировать неспецифическое связывание, обусловленное посторонними антителами.

В соответствии с настоящим изобретением способ для определения молекулы, включающей перекрестно реагирующая антигенная детерминанта, включает контактирование по меньшей мере одного антитела с первой антигенной детерминантой и второй антигенной детерминантой. Молекулу определяют по связыванию по меньшей мере одного антитела с первой и второй антигенной детерминантами. Контактирование можно проводить с использованием метода или комбинации методов, которые известны в данной области. В одном варианте осуществления настоящего изобретения способ дополнительно включает определение, связывается или нет по меньшей мере одно антитело с первой антигенной детерминантой и второй антигенной детерминантой. Типичные методы, которые можно использовать отдельно или в комбинации включают, но ими не ограничиваются, вестерн-блоттинг, иммунопреципитацию, радиоиммуноанализ, фермент-связанный иммуносорбентный анализ (ELISA) и иммунофлуоресцентный анализ. Такие методы особо предпочтительны, если молекула, включающая антигенную детерминанту, является белком. В одном варианте осуществления настоящего изобретения, в котором первый и второй белки включают, соответственно, первую и вторю антигенню детерминанты, контактирование включает использование метода вестерн-блоттинга для определения связывания по меньшей мере одного антитела с первой антигенной детерминантой и второй антигенной детерминантой.

Например, если определяемая молекула является белком, первую композицию, включающую первый белок, имеющий первую антигенную детерминанту, и вторую композицию, включающую второй белок, имеющий вторю антигенную детерминанту, каждую можно в отдельности смешать со стандартным буферным раствором и подвергнуть электрофорезу в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS/PAGE), затем перенести на нитроцеллюлозную, нейлоновую или другие мембраны до контактирования по меньшей мере одного антитела с первой антигенной детерминантой и второй антигенной детерминантой. Затем связывание по меньшей мере одного антитела с первой антигенной детерминантой и второй антигенной детерминантой можно визуализировать, например, путем добавления вторичного антитела, которое может быть помечено и отобрано в соответствии с источником (т.е. животным) по меньшей мере одного антитела. Затем можно провести сравнительный анализ обнаруживаемых полос, соответствующих первому и второму белку, чтобы выявить связывание по меньшей мере одного антитела с первой антигенной детерминантой и второй антигенной детерминантой, причем связывание по меньшей мере одного антитела с первой антигенной детерминантой и второй антигенной детерминантой указывает на то, что по меньшей мере одно антитело перекрестно реагирует с первой и второй антигенными детерминантами. Соответственно, первая и вторая антигенные детерминанты являются перекрестно реагирующими, таким образом определяющими молекулы (т.е. белки), которые затем можно охарактеризовать, используя известные в данной области методы.

В качестве примера можно упомянуть, что в случае, если перекрестно реагирующая антигенная детерминанта формируется белком, в данной области известно большое количество методик, позволяющих дополнительно охарактеризовать установленный белок, включая перекрестно реагирующую антигенную детерминанту. Например, после SDS/PAGE или переноса из геля на мембрану область геля или мембраны, соответствующую белку, можно вырезать или элюировать из геля или мембраны, и по меньшей мере частично очистить для дальнейшего анализа с использованием известных методов, включая масс-спектроскопию и секвенирование N-концевых аминокислот (например, расщеплением белков по Эдману). Кроме того, информацию о последовательности аминокислот можно сравнить с известными аминокислотными последовательностями (например, по сопоставлению гомологии), чтобы определить и/или дополнительно охарактеризовать идентичность белка. Кроме того, информация о последовательности аминокислот может использоваться для получения информации о последовательности соответствующих нуклеиновых кислот, на основании которой можно предусмотреть, среди прочего, праймеры и зонды для специфической амплификации нуклеиновых кислот и/или целей клонирования. Поэтому в других вариантах осуществления настоящего изобретения, в которых молекула является белком, способ дополнительно включает определение аминокислотной последовательности по меньшей мере части молекулы.

Таким образом, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусматривают способ определения белка, включающего перекрестно реагирующая антигенная детерминанта. Способ включает контактирование по меньшей мере одного антитела с первой антигенной детерминантой и второй антигенно детерминантой, причем по меньшей мере одно антитело получают от животного, последовательно подвергаемого воздействию первого иммунологического стимула, вызываемого первой иммуногенной композицией, включающей первую антигенную детерминанту, и затем второго иммунологического стимула, вызываемого второй иммуногенной композицией, включающей вторую антигенную детерминант, причем связывание по меньшей мере одного антитела с первой и второй антигенными детерминантами свидетельствует о перекрестной реактивности и таким образом определяет белок. Контактирование описано выше.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения белок экспрессируется бактерией Н.parasuis. В другом варианте осуществления настоящего изобретения первая иммуногенная композиция также включает бактерию Н.parasuis первого серотипа, причем вторая иммуногенная композиция также включает бактерию Н.parasuis второго серотипа. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения первый серотип является серотипом 5 Н.parasuis, а второй серотип является серотипом 13 Н.parasuis.

Соответственно в других вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает способ определения молекулы, включающей перекрестно реагирующая антигенная детерминанта, представляющий:

а) активацию В-клеток памяти у животного, чтобы получить по меньшей мере одно антитело, причем активация включает иммунологическое стимулирование животного второй молекулой для индукции иммунологического ответа, который активирует В-клетки памяти, и

б) контактирование по меньшей мере одного антитела с молекулой и со второй молекулой, причем связывание по меньшей мере одного антитела с молекулой и второй молекулой определяет молекулу.

III. Выделенная молекула

В других объектах настоящее изобретение предусматривает выделенную молекулу или ее фрагмент, включающие перекрестно реагирующая антигенная детерминанта. В одном варианте осуществления настоящего изобретения выделенная молекула является белком. В другом варианте осуществления настоящего изобретения, перекрестно реагирующая антигенная детерминанта присутствует в белке, экспрессируемом по меньшей мере двумя серотипами Н.parasuis.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение предусматривает выделенный полипептид, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

ELANAI	(SEQ ID NO:1),
TVLAEKQEII	(SEQ ID NO:2),
APAKGSTIEAGIAYPIST	(SEQ ID NO:3),
MKNLISI	(SEQ ID NO:4),
SPSDKTFKISAIPDYNAAEMT	(SEQ ID NO:5),

где выделенный полипептид также включает перекрестно реагирующая антигенная детерминанта, присутствующую в белке, экспрессируемом по меньшей мере двумя серотипами Н.parasuis.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает выделенный полипептид, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

ELANAI	(SEQ ID NO:1),
TVLAEKQEII	(SEQ ID NO:2),
APAKGSTIEAGIAYPIST	(SEQ ID NO:3),
MKNLISI	(SEQ ID NO:4),
SPSDKTFKISAIPDYNAAEMT	(SEQ ID NO:5),

где выделенный полипептид дополнительно включает перекрестно реагирующая антигенная детерминанта и экспрессируется серотипом 5 Н.parasuis.

Сравнение аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:1-5 с различными сегментами аминокислотных последовательностей Н.parasuis, представленных в GENBANK, показывает по меньшей мере следующие гомологии: SEQ ID NO:1 и последовательности под номером в каталоге: ZP_02478744, SEQ ID NO:2 и последовательности под номером в каталоге: ZP_02477919, SEQ ID NO:3 и последовательности под номером в каталоге: ZP_02478157, SEQ ID NO:4 и последовательности под номером в каталоге: ZP_02478801 и SEQ ID NO:5 и последовательности под номером в каталоге: ZP_02477404. Последовательности с номерами в каталоге: ZP_02478744, ZP_02477919, ZP_02478157, ZP_02478801 и ZP_02477404 включены в настоящее изобретение в виде ссылок.

IV. Композиции, вакцины, диагностические средства и наборы

В других различных объектах настоящего изобретения предусматриваются способы, композиции и наборы на основе определенной молекулы, включающей перекрестно реагирующая антигенная детерминанта. Предпочтительно, определенная молекула представляет белок, экспрессируемый патогеном, вызывающим заболевание. Вызывающим заболевание патогеном предпочтительно является бактерия, предпочтительно Н.parasuis, однако, настоящее изобретение ею не ограничивается, и в последующем описании только в качестве примера приводятся белки Н.parasuis и белки H.Parasuis, a также полипептиды настоящего изобретения.

Вакцины для активной иммунизации

В одном из объектов настоящего изобретения предусмотрены вакцины для активной иммунизации, предназначенные для лечения и защиты от инфекций, вызванных Н.parasuis, и эти вакцины можно приготовить на основе белка Н.Parasuis или его фрагмента, включающего перекрестно реагирующий антигенный детерминант, согласно изложенному выше, используя традиционные способы приготовления вакцин, которые хорошо известны в этой области. Обычно иммуногенное количество белка или его фрагмента, включающих перекрестно реагирующая антигенная детерминанта, соединяют с соответствующим фармацевтически приемлемым растворителем, носителем или наполнителем, и количество этой вакцины, эффективное для иммунизации человека или животного, соответствующим образом можно вводить человеку или животному. Специалисту в данной области очевидно, что к иммуногенному количеству относится количество белка или его фрагмента, включающих перекрестно реагирующая антигенная детерминанта, которое является достаточным, чтобы вызвать иммуногенный ответ у человека или животного.

Целевые полипептиды, включающие перекрестно реагирующий антигенный детерминант, которые служат в качестве действующих ингредиентов вакцин настоящего изобретения, можно получить, в зависимости от размера, каким-либо из многочисленных, известных в настоящей области методов.

Например, если последовательность целевого полипетида относительно короткая, например, соответствующая аминокислотной последовательности, состоящей главным образом из перекрестно реагирующего антигенного детерминанта, подходит химический синтез с использованием известных в данной области современных стандартных методов. В типичной методике C-концевая аминокислота может быть связана с твердым носителем и взаимодействует со следующей аминокислотой в последовательности, которая защищена по аминогруппе, чтобы предотвратить самоконденсацию. После первоначального соединения NH₂-защитную группу можно удалить, и процесс соединения повторить со следующей по порядку аминокислотой.

Или, например, полипептиды по настоящему изобретению можно получить путем очистки нативного белка, например, из ферментируемых культур, с последующим размножением целевого фрагмента различными методами и очисткой целевого фрагмента. Методология рекомбинации ДНК предусматривает другой путь синтеза целевых пептидов. Кодирующую последовательность ДНК (например, кДНК, геномный гидролизат) для целевого пептида или белка можно лигировать в вектор экспрессии, пригодный для трансформации штамма-реципиента, чтобы экспрессировать ген и получить полипептид.

Кодирующую последовательность, полученную либо из геномной или кДНК библиотеки, либо путем синтеза олигонуклеотида, используя химические методы, можно поместить под контроль промоторной последовательности, совместимой с бактериями-хозяевами, в плазмиды, содержащие подходящие сайты рестрикции для включения целевой кодирующей последовательности. Полученные векторы экспрессии можно трансформировать в соответствующие бактерии-хозяева, используя известные в данной области методы. Удачные трансформанты могут производить целевые полипептидные фрагменты на более высоких уровнях, чем фрагменты, обнаруживаемые в рекомбинантных или нативных штаммах. В другом варианте такие пептиды можно получить в небактериальных рекомбинантных хозяевах, используя соответствующие контролирующие последовательности, векторы и методы трансформации.

Если пептидные последовательности, включающие перекрестно реагирующая антигенная детерминанта, оказываются слишком маленькими, чтобы проявлять иммуногенность, их можно связать с веществами-носителями, чтобы придать им иммуногенное свойство. Для создания таких связей можно использовать любой известный в данной области способ. Например, существует большое количество гетеробифункциональных агентов, которые производят дисульфидную связь на одном конце функциональной группы и пептидную связь на другом конце, и которые широко используются. Наиболее популярным из них является N-сукцидимидил-3-(2-пиридилдитиол)пропионат. Этот реагент создает дисульфидную связь между собой и остатком цистеина в одном белке и амидную связь через аминогруппу лизина или через другую свободную аминогруппу другой аминокислоты. Известно большое разнообразие таких дисульфид/амид-образующих агентов. Другие бифункциональные связывающие агенты скорее образуют тиоэфир, а не дисульфидную связь. Многие из этих образующих тиоэфир агентов коммерчески доступны и включают реактивные сложные эфиры 6-малеимидокапроновой кислоты, 2-бромуксусной кислоты, 2-иодуксусной кислоты, 4-(Н-малеимидометил)циклогексан-1-карбоновой кислоты и др. Карбоксильные группы можно активировать путем соединения их с сукцинимидом или натриевой солью 1-гидрокси-2-нитро-4-сульфоновой кислоты. Если пептид не содержит соответствующего цистеина, можно добавить дополнительный остаток цистеина на одном из концов при получении пептида. Поскольку обычно присоединение к носителю требуется только для более коротких пептидов, эти остатки можно включать во время химического синтеза.

Получение вакцин, которые содержат пептидные последовательности в качестве действующих ингредиентов, хорошо известно в данной области. Обычно такие вакцины получают в инъекционных формах - или в виде жидкого раствора, или в виде суспензии. Можно также получать твердые формы, пригодные для получения раствора или суспензии перед инъекцией. Можно также получать вакцины в виде эмульсий. Действующий иммуногенный ингредиент часто смешивают с наполнителями, которые фармацевтически приемлемы и совместимы с действующим ингредиентом. Соответствующими наполнителя являются, например, вода, физиологический раствор, декстроза, глицерин, этанол или др. близкие соединения и их комбинации. Дополнительно, если требуется, вакцина может содержать незначительные количества вспомогательных веществ, например, увлажнителей или эмульгаторов, буферных агентов, контролирующих рН, или адъювантов, которые повышают эффективность вакцины. Вакцины обычно вводятся парентерально, путем инъекции, например, либо подкожно, либо внутримышечно. Дополнительные составы, которые пригодны для других способов введения, включают суппозитории и, в некоторых случаях, пероральные составы. В случае суппозиториев традиционные связующие вещества и носители могут включать, например, полиалкаленгликоли или триглицериды. Такие суппозитории можно формировать из смесей, содержащих действующий ингредиент в диапазоне от 0,5% до 10%, предпочтительно 1-2%. Пероральные составы включают обычно используемые наполнители, например, фармацевтического качества маннит, лактозу, крахмал, стеарат магния, натриевую соль сахарина, целлюлозу, карбонат магния и им подобных. Эти композиции получают в виде растворов, суспензий, таблеток, пилюль, капсул, лекарственных форм устойчивого высвобождения или порошков и содержат 10-95% действующего ингредиента, предпочтительно 25-70%.

Аминокислотные последовательности по настоящему изобретению включают их фармацевтически приемлемые соли, включая кислые аддитивные соли (сформированные со свободными аминогруппами пептида), и соли, образуемые с неорганическими кислотами, например, соляной или ортофосфорной кислотой, или с органическими кислотами, например, уксусной, щавелевой, винной, миндальной и им подобными. Соли, сформированные со свободными карбоксильными группами, также могут быть производными неорганических оснований, например, гидроокисей натрия, калия, аммония, кальция или железа, и органических оснований, например, изопропиламина, триметиламина, 2-этиламиноэтанола, гистидина, прокаина и им подобных.

Вакцины можно вводить способами, совместимыми с дозировкой состава, и в таком количестве, которое будет профилактически или терапевтически эффективным и иммуногенным. Количество, необходимое для введения может зависеть от субъекта, подлежащего лечению, способности иммунной системы субъекта синтезировать антитела и степени требуемой защиты. Точные количества действующего ингредиента, необходимые для введения, могут зависеть от решения представителя медицинского персонала/практикующего врача. Пригодные диапазоны дозировок для подкожной или мышечной инъекции могут, например, составлять примерно от 1 мкг до примерно 10 мг действующего ингредиента на субъекта. Для пероральных форм, ректальных свечей, уретральных или вагинальных препаратов дозировки могут меняться, например, примерно от 10 мкг до примерно 100 мг. Пригодные режимы для первоначального введения и повторных иммунизации также варьируют, но типичными являются первоначальное введение с последующими инъекциями или другими введениями с интервалами примерно от одной до примерно двух недель.

Антитела

В другом объекте настоящего изобретения предусматривают выделенные антитела, которые могут быть получены от белка или его фрагмента и включают перекрестно реагирующая антигенная детерминанта таким образом, чтобы быть способным к распознаванию перекрестно реагирующая антигенная детерминанта, причем белок экспрессируется Н.parasuis. Эти антитела могут являться моноклональными или поликлональными. Если нужны поликлональные антитела, их можно получить каким-либо из множества известных в данной области традиционных методов. Обычно белок или его фрагмент, включающие перекрестно реагирующую антигенную детерминанту, можно ввести соответствующему животному-хозяину, например мыши или кролику, и спустя соответствующий период времени антитела можно выделить и восстановить из животного-хозяина. Что касается моноклональных антител по настоящему изобретению, их можно получить каким-либо из многочисленных методов, включая, например, хорошо известный метод Kohler и Milstein, Nature 256, 1975, cc.495-497, или методы, описанные в патентах US 6331415, 5981216, 5807715 и 4816567, которые в связи с рекомендациями, касающимися моноклональных антител, включены в настоящее описание в качестве ссылок. Такие методы хорошо известны в данной области и включают получение химерных, гуманизированных и человеческих моноклональных антител. Моноклональные антитела также можно получить из единственной цепи, например, легкой или тяжелой цепей, а также можно получить из активных фрагментов антитела, у которых сохраняются характеристики связывания (например, перекрестная реактивность, специфичность и/или сродство) целого антитела. Поскольку под действующими фрагментами подразумеваются фрагменты антител, которые имеют ту же специфичность связывания, что и целое антитело, которое связывается с определенной перекрестно реагирующей антигенной детерминантой из различных серотипов H.parasuis, понятие «антитело» в контексте настоящего изобретения включает указанные фрагменты. Дополнительно также предусматривают антисыворотку, получаемую с использованием моноклональных или поликлональных антител по настоящему изобретению, которую можно получать большим количеством способов, которые очевидны для квалифицированных специалистов в этой области.

Хотя предпочтительно получение антител с использованием рекомбинантных форм белка или его фрагмента, включающих перекрестно реагирующую антигенную детерминанту, антитела можно получать, используя природные выделенные и очищенные варианты белка или его фрагмента, включающих перекрестно реагирующую антигенную детерминанту, а также моноклональные и поликлональные антитела можно получать, используя белок, или его фрагмент, включающие перекрестно реагирующую антигенную детерминанту, тем же способом, который описан выше для получения таких антител.

Пассивная иммунизация

Помимо действующих вакцин, где антитела у пациента вырабатываются благодаря введению иммуногенного количества белка или его фрагмента, включающих перекрестно реагирующую антигенную детерминанту, выделенные антитела по настоящему изобретению, или их действующие фрагменты, можно также использовать в разработке фармацевтических композиций и/или вакцин для пассивной иммунизации против инфекций Н.parasuis.

Специалисту в данной области очевидно, что антитела по настоящему изобретению (т.е. антитела, способные распознавать перекрестно реагирующую антигенную детерминанту) можно также получить в виде соответствующих фармацевтических композиций для введения человеку или животному для лечения или предупреждения инфекции, вызываемой бактерией Н.parasuis. Фармацевтические композиции, содержащие антитела по настоящему изобретению или их действующие фрагменты, могут быть переработаны в комбинации с каким-либо соответствующим фармацевтическим растворителем, наполнителем или носителем, которые обычно используют в данной области, включая физиологический раствор, декстрозу, воду, глицерин, этанол, другие терапевтические соединения и их комбинации. Также специалисту в данной области очевидно, что конкретные используемые растворители, наполнители и носители варьируют в зависимости от предполагаемого реципиента и состояния реципиента, и для композиций по настоящему изобретению применимы различные способы введения, которые известны специалистам в данной области. Пригодные способы введения фармацевтической композиции включают, но ими не ограничиваются, местное, пероральное, анальное, вагинальное, внутривенное, внутрибрюшинное, внутримышечное, подкожное, интраназальное и внутрикожное введение.

Для местного введения композицию может быть переработана в форму мази, крема, геля, капель (например, глазных капель и ушных капель) или раствора (например, для полоскания рта). Композицией можно пропитывать раневые или хирургические повязки, лигатуры, а также использовать в виде аэрозолей. Композиция может содержать традиционные добавки, например, консерванты, растворители, способствующие проникновению и смягчающие вещества. Составы для местного введения также могут содержать традиционные носители, например, кремовые или мазевые основы, этанол или олеильный спирт.

Композиции на основе антител по настоящему изобретению также можно вводить с пригодным вспомогательным веществом в количестве, эффективном для повышения иммуногенного ответа. Например, пригодные вспомогательные вещества могут включать квасцы (фосфат алюминия или гидроокись алюминия), которые широко используются в медицине, и другие вспомогательные вещества, например, сапонин и его очищенный компонент Quil А, полный адъювант Фрейнда, адъювант RIBBI, и другие вспомогательные вещества, используемые в научных исследованиях и ветеринарии. Примерами других химически определенных препаратов являются мурамилдипептид, монофосфорилированный липид А, фосфолипидные конъюгаты, инкапсуляция конъюгата в протеолипосомы и инкапсуляция белка в липосомы.

Композиции на основе антител по настоящему изобретению, которые распознают перекрестно реагирующую антигенную детерминанту, согласно вышеизложенному описанию, могут использоваться в способах для предупреждения или лечения инфекции, вызываемой Н.parasuis. В одном варианте осуществления, настоящее изобретение предусматривает способ для предупреждения или лечения инфекции, вызываемой Н.parasuis, который включает введение эффективного количества антитела к перекрестно реагирующей антигенной детерминанте по описанию, изложенному выше в настоящем изобретении, для лечения или предупреждения инфекции, вызываемой Н.parasuis.

Обычно предпочтительной дозой для введения композиции на основе антител по настоящему изобретению, является такое количество, которое будет эффективно для предупреждения или лечения инфекции, вызываемой Н.parasuis, и очевидно, что это количество может варьировать в зависимости от природы инфекции и состояния субъекта. «Эффективное количество» антитела или фармацевтического агента для использования по настоящему изобретению означает нетоксичное, но достаточное количество агента, которое способно оказать желаемое профилактическое или лечебное действие. Точное требуемое количество антитела или конкретного агента будет варьировать от субъекта к субъекту, в зависимости от вида, возраста и общего состояния субъекта, тяжести состояния, подлежащего лечению, используемого конкретного носителя или вспомогательного вещества, и его способа введения и т.п. Соответственно, «эффективное количество» какой-либо конкретной композиции на основе антитела будет варьировать в зависимости от конкретных обстоятельств, и соответствующее эффективное количество в каждом случае применения может устанавливаться специалистом в данной области путем рутинного экспериментирования. Доза может подбираться для индивидуального субъекта, которому вводится композиция, и будет меняться в зависимости от возраста, массы и обмена веществ индивидуума. Композиции также могут содержать стабилизаторы или фармацевтически приемлемые консерванты.

Таким образом, антитела по настоящему изобретению обеспечивают способы лечения или предупреждения инфекции, вызываемой Я. parasuis, у человека или животного, когда человеку или животному вводят эффективное количество композиции на основе антител, где эффективное количество является достаточным для предупреждения иди лечения инфекции, вызываемой бактериями. Специалисту в данной области очевидно, что уровень титра антител, необходимый для эффективного лечения или предупреждения инфекции, будет варьировать в зависимости от природы и состояния субъекта и/или серьезности какой-либо предшествующей инфекции.

Кроме того, антитела по настоящему изобретению можно модифицировать, чтобы уменьшить иммуногенность при введении. В качестве примера, касающегося человека - реципиента антитела, антитело может быть «гуманизировано» путем трансплантации дополнительных определяющих областей антитела, полученного от гибридомы, в моноклональное антитело человека, или «облицовано» путем замены поверхностных остатков мышиной рамки считывания в вариабельных областях иммуноглобулина, чтобы имитировать гомологичный дубликат человеческой рамки считывания. Более того, при желании моноклональные антитела по настоящему изобретению можно вводить в сочетании с пригодным антибиотиком, чтобы дополнительно усилить при необходимости способность настоящих композиций бороться с бактериальными инфекциями.

Таким образом, согласно настоящему изобретению белок, или его фрагмент, включающие перекрестно реагирующую антигенную детерминанту, можно использовать в качестве активных вакцин, и антитела по настоящему изобретению можно использовать в качестве пассивных вакцин, применяемых для предоставления пригодных антител, для лечения или предупреждения инфекций, вызываемой Н.parasuis. Специалистам в данной области понятно, что вакцина может быть упакована для введения большим количеством способов, например, путем парентерального (например, внутримышечного, внутрикожного или подкожного) введения или носоглоточного введения (например, интраназального введения). Вакцина может быть лиофилизированной для ресуспендирования во время введения или может быть в виде раствора.

Диагностические средства

В других объектах настоящего изобретения антитела по настоящему изобретению также могут использоваться для специфического выявления белков Н.parasuis или в качестве средств исследования. Вышеописанные антитела можно непосредственно пометить выявляемой меткой для идентификации и определения количества бактерий Н.parasuis. Метки для использования в иммуноанализах известны специалистам в этой области и включают ферменты, радиоизотопы (например, ³²Р, ³H, ¹⁴C, ³⁵S, ¹²⁵I) и флуоресцентные (флюоресцеин и производные, фикоэритрин, аллофикоцианин, фикоцианин, родамин и Texas Red), люминесцентные (например, люциферин светляков) и хромогенные вещества, включая цветные частицы, например, коллоидное золото или латексные шарики. Пригодные иммуноанализы включают фермент-связанный иммуносорбентный анализ (ELISA). При необходимости антитело можно косвенно пометить путем реакции с веществами с меткой, которые имеют сродство к иммуноглобулину. Антитело можно конъюгировать со вторым веществом и выявлять с помощью третьего вещества, имеющего сродство ко второму веществу, конъюгированному с антителом. Например, антитело можно конъюгировать с биотином, и конъюгат антитело-биотин можно выявить, используя меченный авидин или стрептавидин. Антитело можно также конъюгировать с гаптеном и конъюгат антитело-гаптен можно выявить, используя меченное антигаптеновое антитело. Эти и другие методы мечения антител и анализа конъюгатов хорошо известны специалистам в данной области. Выявление метки можно проводить различными методами, включая сцинтилляционный подсчет, гамма-лучевую спектрометрию, радиоавтографию и определение флуоресценции.

Соответственно, при использовании с пригодными метками или другими подходящими обнаруживаемыми биомолекулами или химикатами, описанные в настоящем изобретении антитела полезны, например, для in vivo и in vitro диагностики Н.parasuis инфекций или выявления бактерий Н.parasuis.

Наборы

В другом объекте настоящего изобретения предусматривают набор для выделения и определения бактерий Н.parasuis и инфекции. В одном варианте осуществления настоящего изобретения набор включает выделенные перекрестно реагирующие антитела по настоящему изобретению в соответствующей форме, например, лиофилизированной в одиночном сосуде, которую можно активировать путем добавления водного образца, в котором предполагается наличие бактерии Н.parasuis. Такой набор обычно включает соответствующий контейнер для размещения антител в пригодной форме вместе с соответствующим реагентом для иммунологического анализа. Обычно эти наборы могут содержать антитело по настоящему изобретению и инструкции для определения связывания этого антитела при добавлении к антителу образца от субъекта. Например, пригодный реагент для иммунологического анализа может включать соответствующий выявляемый сигнал или метку, например, биотин или фермент, который производит обнаруживаемую окраску и т.д., который может быть связан с антителом или может использоваться другим соответствующим способом, например, чтобы обеспечить обнаруживаемый результат при связывании антитела с антигеном. В другом варианте осуществления настоящего изобретения набор включает белок H.Parasuis или его фрагмент, включающие перекрестно реагирующую антигенную детерминанту.

Следующие примеры предназначены только в качестве иллюстрации.

Примеры

Пример 1

Последовательное заражение

Всех экспериментальных животных подвергают процедурам, установленным и пересмотренным Законом о защите лабораторных животных Департамента здравоохранения (Public Health Service Policy on Humane Care and Use of Laboratory Animals), Законом о кормлении и содержании животных (Provision of the Animal Welfare Act) и другими соответствующими законами и правилами.

Иммуногенную композицию готовят следующим образом: стерильный ватный тампон погружают в размороженную исходную суспензию Н.parasuis, содержащую примерно 5×10⁸ колониеобразующих единиц (КОЕ)/мл, и осторожно распределяют тампоном по всей поверхности шоколадного агара в чашке Петри. Культуру инкубируют при 37°С в течение 48 ч в атмосфере 5% CO₂. Затем клетки смывают с агара тремя мл пептонного буфера, применяя скрепер для снятия клеток, и пропускают через марлю, чтобы удалить остатки агара. Полученную жидкость затем разводят до оптической плотности (ОП), равной 1, добавляя пептонный буфер. Этот уровень достигается при разведении примерно 1:11. Материал хранят до использования при температуре 4°С в течение примерно 1 ч.

Восемнадцать лишенных молозива извлеченных кесаревым сечением поросят в возрасте 5 недель получают от фирмы Struve Labs, Inc. Животных случайным образом размещают в одну из трех групп: 9 поросят помещают в экспериментальную группу, 4 поросенка - в контрольную группу и 5 поросят - в индикаторную группу (табл.1). Всем животным вводят внутриносовые канюли, чтобы обеспечить прямой доступ к верхней дыхательной системе, и размещают по группам в комнаты с контролируемым доступом.

Таблица 1.
Распределение животных по группам и их заражение
Исследуемая группа	Заражение Н.parasuis, серотип 5	Заражение Н.parasuis, серотип 5
Экспериментальная (9 животных)	Х	Х
Контрольная (4 животных)
Индикаторная (5 животных)		Х

В возрасте 7 недель животных экспериментальной группы иммунизируют интраназальным введением 1 мл серотипа 5, разведенного до оптической плотности 0,001 (ОП) при 530 нм в пептоном буфере. Индикаторных и контрольных свиней стимулируют пептонным буфером. После контрольного заражения свиньям дают возможность восстановиться. По необходимости животным вводят антибиотики широкого спектра действия.

Спустя девять недель после первого заражения животным в экспериментальной и индикаторной группах интраназально вводят 1 мл серотипа 13, разведенного до оптической плотности 0,001 (ОП) при 530 нм в пептоном буфере.

Трех случайно отобранных животных из каждой группы посмертно вскрывают через 24 ч после второго заражения. От этих животных собирают респираторные и лимфатические ткани, мацерируют стерильным скальпелем и помещают в 24-луночные планшеты, содержащие среду для культуры клеток с антибактериальными агентами, для размножения активированных клеток. Супернатант этой среды используют для дальнейших исследований. Оставшихся животных наблюдают еще 2 недели и затем посмертно вскрывают.

Пример 2

SDS/PAGE и вестерн-блоттинг

Один мл замороженной исходной суспензии H.parasuis с плотностью клеток 5×10⁸ КОЕ/мл высевают в чашки Петри, содержащие шоколадный агар. Культуру инкубируют при 37°С в течение 48 ч в атмосфере 5% CO₂. Затем используют 4 мл фосфатно-солевого буфера (ФСБ) для смыва с поверхности в чашке, используя пипетку, с помощью которой создают поток для получения суспензии клеток. Ресуспендированные клетки хранят при температуре 4°С и используют в течение 1 недели. Два мл суспензии центрифугируют (9000 g, 1 ч) и осажденные клетки ресуспендируют в 200 мл ФСБ, дважды промывают ФСБ и разрушают, пропуская через иглу 18-го калибра. Промытую клеточную суспензию смешивают в соотношении 1:1 с ФСБ, содержащим 2% твина-20 и инкубируют на пробирочном ротаторе в течение 90 мин при 37°С. После инкубации клетки удаляют с помощью центрифугирования (48000 g, 1 ч). Культуральный супернатант оставляют, хранят при 4°С и используют в течение 1 недели.

SDS-PAGE проводят, используя систему Criterion™ с 12,5% акриламидными гелями (фирма Bio-Rad Laboratories, Геркулес, Калифорния). Клеточную суспензию Н.parasuis разгоняют на гелях при разведении 1:3 в ФСБ. Экстракт на основе твина-20 разгоняют в неразведенном виде. Гели окрашивают реагентом GelCode Blue Stain Reagent (фирма Pierce Biotechnology, Inc., Рокфорд, Иллинойс), гелевым красителем на основе кумасси. Вестерн-блоттинг проводят, используя набор Protein Detector (фирма KPL, Inc., Гейтерсберг, Мэрилэнд). Первичное зондирование проводят, используя жидкости - носители иммунитета, полученные от иммунизированной антигеном свиньи. В качестве детекторного антитела используют конъюгат козьих анти-свинных антител с пероксидазой хрена (HRP). Визуализацию проводят, используя субстрат Component TMB Membrane Peroxidase Substrate (фирма KPL, Inc., Гейтерсберг, Мэрилэнд).

Собранный супернатант от активированных клеток, выделенных из различных тканей девяти животных, тестируют против целых клеток серотипа 5 Н.parasui. Высокие концентраты этих супернатантов используют для визуализации посредством вестерн-блоттинга. Высокая и специфическая концентрация антитела обнаружена в бронхиальном лимфатическом узле поросенка 47 (BL47). Приближенный характер полос, присутствующих в этом вестерн-блоттинге, указывает на наличие белков, присутствующих в Н. parasui, распознаваемых иммунизированным животным. BL47 выбран для дальнейшего сравнительного анализа.

Белки, распознанные среди серотипов, в дальнейшем характеризуют посредством второго набора вестерн-блоттинга. Первыми протестированы серотипы 5 и 13. Серотип 5 показывал отчетливые полосы приблизительно в областях 28, 33, 45, 56, 63 и 76 кДа. Образец полос серотипа 13 был близок серотипу 5 и содержал отчетливые полосы в областях 28, 45, 55, 62 и 75 кДа. Тестирование с BL47 против серотипа 4, серотипа, не вовлеченного в заражение свиней, также генерирует отчетливые полосы в областях 28, 34, 41, 47, 57, 62 и 77 кДа. В дальнейшем исследуют белки с молекулярной массой примерно 28, 45, 55, 62 и 75 кДа, которые, очевидно, присутствуют во всех исследованных серотипах.

Белки, присутствующие во множественных серотипах, идентифицируют, используя жидкости, полученные в результате последовательного заражения. Для повышения относительных концентраций связанных с мембраной белков в образцах культуру серотипа 5 обрабатывают путем экстракции твином-20. Этот метод ранее был применен для выделения наружных мембран бактерий. Проведение этой процедуры очень незначительно изменяет SDS-PAGE профиль, полученный от необработанных клеток. Характер полос был сходен с вестерн-блоттингом, показывая присутствие целевых белков.

Материал, обработанный твином-20, используют для секвенирования. Этот материал содержит перекрестно реагирующие белки и имеет большое количество клеточных остатков, удаляемых в ходе обработки. Соответственно, этот препарат с твином-20, разделяют на несколько смежных полос на мембране PVDF, полосы вырезают и проводят секвенирование. Полосы серотипа 5, отобранные для секвенирования, включали полосы в областях ~28, ~45, ~56, ~63 и ~76 кДа.

Пример 3

Результаты секвенирования

Образцы для секвенирования сначала разделяют на SDS-PAGE, затем переносят на мембрану PVDF. Эту мембрану окрашивают и полосы вырезают, используя лезвие бритвы. Масс-спектрометрический анализ проводят на вырезанных из геля с помощью лезвия бритвы гелевых пробках. Буфером для переноса служит стандартный буфер трис/глицин с 20% МеОН. Мембрану окрашивают реагентом GelCode Blue Stain Reagent (фирма Pierce Biotechnology, Inc., Рокфорд, Иллинойс) и обесцвечивают ~25% раствором изопропанола в воде. Фрагменты мембраны обильно промывают очищенной, деионизированной водой.

Образцы (т.е. полосы ~28, ~45, ~56, ~63 и ~76 кДа) в дальнейшем характеризуют, используя масс-спектрометрию и N-концевое (деградация по Эдману) секвенирование. На основании результатов N-концевого секвенирования получена информация о частичных последовательностях, которая показаны в табл.2.

Таблица 2.
Результаты N-концевого секвенирования.
SPAKGSTIEAGIAYPISRA
SEPQATX1DAK
MKNLISIAKG
GEIEELALGI
MEKDVKFGNDARVGMLKGVNXKADA
SEIXELANAITFLSMGVG
GKVPETTVLAXKQEIIX
APAKGSTIEAGIAYPISTAXDDMMS
SPSDKTFKISAIPDYNAAEMTS
1Х означает неустановленную аминокислоту.

Затем информацию по последовательностям фрагментов белков обрабатывают в программе BLASTp'd против последовательностей Н.influenzae и Н.ducreyi из базы данных Swiss-Prot. Белки, содержащие более 10 аминокислот или менее 3 положений с множественными аминокислотными возможностями, анализируют дополнительно. Результаты показаны в табл.3.

Таблица 3.
Результаты секвенирования белков.
№№	Молекулярная масса (кДа)	Расчетная молекулярная масса (кДа)	Е-величина	Swiss-Prot ID	Название белка / Описание
1	28	22	0,76	Q4QM69	Монофункциональная биосинтетическая пептидогликан-трансгликозилаза
2	28	34	2,5	Q4QK43	тРНК псевдоуридин-синтаза В
3	28	32	3,4	Q4QJL4	Еноил-[ацил-

					переносящий белок] редуктаза
4	28	68	8	Q4QLZ8	Глутатионзависимая система оттока ионов калия
5	56	60	8,00E-08	Q4QM48	Гем-связывающий белок А
6a	56	58	0,041	Q7VL18	Периплазматический связывающий белок, предполагаемый АВС-транспортер
7	63	61	0,33	Q4QLHO	Периплазматический олигопептид-связывающий белок
8	63	28	1,9	Q4QNT7	TonB (переносчик железа)
9	76	68	4,00E-09	Q4QJW4	Белок шаперон dnaK (HSP70)
10	76	24	0,59	Q4QP42	Предполагаемая N-ацетилманнозамин-6-фосфат-2-эпимераза
11	76	17	1,1	Q4QMR6	Фосфопантетеин-аденилилтрансфераза
12	76	74	2	Q4VJR2	HMW1C, предполагаемая гликозилтрансфераза, вовлеченная в гликозилирование HMW1A и HMW2A
a = Белковая последовательность соотносится с последовательностью Н.ducreyi. Все другие последовательности получены путем сравнения с последовательностью Н.influenzae.

Табл. 3 включает по меньшей мере два белка, которые, вероятно экспонированы на поверхности клеток (белки 6 и 7) и по меньшей мере один белок, который, по-видимому, обладает способностью связывать железо (белок 5).

Пример 4

ПЦР и клонирование

Белки 5 и 6, показанные в табл. 3, иммуногенны, поскольку они оба распознаются жидкостями - носителями иммунитета свиньи. Эти белки связаны с захватом железа. Переносчики ABC-типа имеют широкое разнообразие описанных функций и связаны с поглощением железа у Cyanobacteria. Гем-связывающий белок жизненно необходим для выживания Н.influenzae в кровотоке, поскольку он собирает связанное железо в гем-группы. Кроме того, гем-связывающий белок является высоко консервативным в пределах рода.

На основе опубликованной информации по геномам Н.influenzae и Н.ducreyi, готовят ПЦР праймеры для амплификации двух отобранных белков (т.е. белков 5 и 6) из хромосомного препарата Н.parasuis. Используемые ПЦР праймеры показаны в табл. 4.

Таблица 4.
ПЦР праймеры.
Название	Последовательность(от 5' к 3')	TM
Белок 5
FHpsHemeBam (прямой)	TATAGGATCCATGCTTATGAAACTAAAAGCAACATTAACT	60°С
RHpsHemeXho (обратный)	TATACTCGAGTTATTTACCATCAACACTCACACCATAAAA	61°С
Белок 6
FHpsABCBam (прямой)	TATAGGATCCATGACTTCTCATTTTGAATACAATCAATCT	60°С
RHpsABCXho (обратный)	TATACTCGAGTTATGTACGACCTACACCAAGGAAAGACAA	64°С

Для амплификации нуклеотидной последовательности, соответствующей белку 5, проводят ПЦР с использованием праймеров, показанных в табл.4, полимеразы PFU Turbo и хромосомного препарата Н.parasuis в качестве матрицы. В реакции гема видны две плотные полосы (~1,8 т.п.н. и ~800 п.н.); полосу, соответствующую продукту амплификации ~1,8 т.п.н., очищают в геле.

Для амплификации нуклеотидной последовательности, соответствующей белку 6, проводят ПЦР с использованием праймеров, показанных в табл.4, полимеразы PFU Turbo и хромосомного препарата Н.parasuis в качестве матрицы. В этой реакции виден дублет (~1,5 т.п.н. и ~1,3 т.п.н.); верхнюю полосу (т.е., ~1,5 т.п.н.) этого дублета чистят в геле, используя набор для элюции из геля.

Амплифицированные продукты, содержащиеся в очищенных в гелях жидкостях, полиаденилируют с конца и лигируют с pGEM-T. Получаемым при лидировании продуктом трансформируют компетентные клетки ТОР10 (фирма Invitrogen Corporation, Карлсбад, Калифорния), Трансформанты собирают и выращивают при 37°С в течение ночи. Вставки впоследствии подтверждают и субклонируют в векторе экспрессии pTRCHis-A (фирма Invitrogen Corporation, Карлсбад, Калифорния) рекомбинантных белков, содержащих N-концевые полигистидиновые метки (6xHis Tag).

1. Способ идентификации полипептидов и белков Н. parasuis, которые включают перекрестно реагирующую антигенную детерминанту, который включает получение по меньшей мере одного антитела от животного, которого последовательно подвергают первой иммунологической стимуляции, вызываемой первой иммуногенной композицией, включающей первую антигенную детерминанту первого полипептида, путем подвергания воздействию первым серотипом Н. parasuis, экспрессирующим указанный первый полипептид, и затем второй иммунологической стимуляции, вызываемой второй иммуногенной композицией, включающей вторую антигенную детерминанту второго полипептида, путем подвергания воздействию вторым серотипом Н. parasuis, экспрессирующим указанный второй полипептид, и затем контактирование по меньшей одного антитела с первой антигенной детерминантой и второй антигенной детерминантой, причем связывание по меньшей мере одного антитела с первой и второй антигенными детерминантами свидетельствует о перекрестной реактивности и таким образом идентифицирет полипептиды и белки, которые имеют перекрестно реагирующую антигенную детерминанту,
где полипептиды и белки содержат аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

ELANAI	(SEQ ID NO: 1),
TVLAEKQEII	(SEQ ID NO: 2),
APAKGSTIEAGIAYPIST	(SEQ ID NO: 3),
MKNLISI	(SEQ ID NO: 4) и
SPSDKTFKISAIPDYNAAEMT	(SEQ ID NO: 5),

причем полипептиды и белки дополнительно включают перекрестно реагирующую антигенную детерминанту, присутствующую в белке, экспрессируемом первым и вторым серотипами Н. parasuis.

2. Способ по п. 1, в котором первый серотип является серотипом 5 Н. parasuis, а второй серотип является серотипом 13 Н. parasuis.

3. Способ по п. 2, причем первый и второй полипептиды каждый являются гем-связывающим белком или переносчиком АВС-типа.

4. Способ по п. 1, включающий:
а) активацию В-клеток памяти у животного для образования по меньшей мере одного антитела, причем активация включает иммунологическое стимулирование животного первым полипептидом или белком, чтобы вызвать иммунологический ответ, который активирует В-клетки памяти, культивирование in vitro В-клеток памяти с последующим их активированием и
б) контактирование по меньшей мере одного антитела со вторым полипептидом или белком, причем связывание по меньшей мере одного антитела с первым полипептидом или белком и вторым полипептидом или белком идентифицирует полипептид или белок, который включает перекрестно реагирующую антигенную детерминанту.

5. Способ по п. 4, где первый серотип Н. parasuis представляет собой серотип 5 и второй серотип Н. parasuis представляет собой серотип 13.