Диагностика и лечение злокачественных опухолей поджелудочной железы, яичников и других злокачественных опухолей

Изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии. Описано антитело, которое специфически связывает денатурированный CD70. Также раскрыт способ диагностики, прогнозирования, профилактики и лечения злокачественных опухолей яичников, поджелудочной железы и других злокачественных опухолей с использованием антител. Предложенная группа изобретений может быть использована в медицине. 3 н. и 2 з.п. ф-лы, 10 ил., 2 табл., 9 пр.

 

Родственные заявки

По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки США, номер 61/044457, поданной 11 апреля 2008, полное содержание которой приведено в настоящем документе в качестве ссылки.

Предпосылки создания изобретения

CD70 является представителем семейства фактора некроза опухоли (TNF), мембраносвязанных и секретируемых молекул, которые экспрессируются множеством нормальных и малигнизированных типов клеток. CD70 представляет собой трансмембранный белок типа II с C-концом, экспонированным наружу клеток, и с N-концом, на обращенной к цитозолю стороне плазматической мембраны (Bowman et al., 1994, J. Immunol. 152:1756-61; Goodwin et al., 1993, Cell 73:447-56). CD70 человека содержит цитоплазматический домен из 20 аминокислот, трансмембранный домен из 18 аминокислот и внеклеточный домен из 155 аминокислот с двумя вероятными участками N-связанного гликозилирования (Bowman et al., выше; Goodwin et al., выше). С помощью специфической иммунопреципитации меченных радиоактивным изотопом CD70-экспрессирующих клеток посредством антител против CD70 получают полипептиды размером 29 и 50 кДа (Goodwin et al., выше; Hintzen et al., 1994, J. Immunol. 152:1762-73). На основании гомологии с TNF-альфа и TNF-бета, была спрогнозирована тримерная структура CD70 (Petsch et al., 1995, Mol. Immunol. 32:761-72).

CD70 обладает ограниченной экспрессией в нормальных тканях человека. Это делает CD70 привлекательной мишенью для терапии рака. Однако экспрессия CD70 была идентифицирована лишь у небольшого числа злокачественных опухолей, таких как почечно-клеточная карцинома, злокачественная опухоль ободочной кишки, определенные типы неходжкинской лимфомы и множественная миелома. Экспрессию CD70 на клетках злокачественных опухолей, как правило, обнаруживают с помощью антител, которые связываются с нативным CD70, например, посредством иммуногистохимии. Доказано, что обнаружение экспрессии CD70 на фиксированных образцах, полученных у пациентов, затруднено из-за плохого качества антител, у которых отсутствует достаточная специфичность в отношении CD70. В частности, перекрестная реактивность и фоновое окрашивание мешают обнаружению CD70 в фиксированных образцах. Настоящее изобретение решает эту и другие трудности.

Краткое описание изобретения

Изобретение относится к способам диагностики, прогнозирования, профилактики и лечения, и контроля лечения злокачественных опухолей яичников, поджелудочной железы, и других злокачественных опухолей с использованием антител против CD70. Кроме того, изобретение относится к способам диагностики, прогнозирования, профилактики и лечения, и контроля лечения рака легких, головы и шеи (гортань или глотка), меланомы, глиобластомы, множественной миеломы, ходжкинской лимфомы, неходжкинской лимфомы, такой как фолликулярная лимфома, почечно-клеточной карциномы, включая светлоклеточную карциному и папиллярную карциному, карциномы ободочной и прямой кишки и мочевого пузыря.

В одном из аспектов изобретение относится к антителу, которое специфически связывает денатурированный CD70 по сравнению с нативным CD70. В некоторых вариантах осуществления антитело специфически связывает денатурированный CD70 на фиксированной линии клеток злокачественной опухоли яичников SK-OV-3 или поджелудочной железы PANC-1 по сравнению с нативным CD70. Антитело может представлять собой моноклональное антитело, такое как химерное, гуманизированное антитело или антитело человека. Предпочтительно, антитело связывает денатурированный CD70 на фиксированных формалином погруженных в парафин клетках или тканях со специфическим связыванием, таким же или лучше, чем у антитела SG-21.1C1, продуцируемого гибридомой, депонированной в ATCC и с присвоенным инвентарным No. PTA-8733, или у антитела SG-21.5D12, продуцируемое гибридомой, депонированной в ATCC и с присвоенным инвентарным No. PTA-8734. В частности, неспецифическая перекрестная реактивность антитела меньше, чем у антитела SG-21.1C1 или антитела SG-21.5D12. В некоторых вариантах осуществления антитело может конкурировать за специфическое связывание с денатурированным CD70 с антителом SG-21.1C1 или с антителом SG-21.5D12.

В другом аспекте изобретение относится к диагностическому набору, содержащему антитело, которое специфически связывает денатурированный CD70 по сравнению с нативным CD70. В связанном аспекте изобретение относится к способу обнаружения экспрессии CD70 в образце ткани, взятом у пациента. Образец ткани может быть получен из поджелудочной железы, яичников, легкого, гортани, глотки, молочной железы, почки, мозга, ободочной кишки, крови или кожи пациента. Ткань является фиксированной, а белок CD70 является денатурированным. Фиксированный образец ткани приводят в контакт с антителом, которое специфически связывает денатурированный CD70 по сравнению с нативным CD70, и обнаруживают связывание антитела с фиксированным образцом ткани для определения того экспрессируется ли CD70 в образце. Экспрессия CD70 на фиксированном образце ткани указывает на вероятность наличия экспрессирующей CD70 злокачественной опухоли у пациента. В некоторых вариантах осуществления образец фиксируют формалином и погружают в парафин.

В другом аспекте изобретения относится к способу диагностики, прогнозирования, определения способа лечения или контроля лечения пациента со злокачественной опухолью поджелудочной железы, яичников, легкого, гортани, глотки, молочной железы или кожи. Способ включает определение экспрессии CD70 в клетках в образце поджелудочной железы, яичников, легкого, гортани, глотки, молочной железы пациента или кожи пациента, где наличие обнаруживаемой экспрессии CD70 используют для диагностики, прогнозирования, определения способа лечения или контроля лечения пациента. Образец может представлять собой фиксированный формалином погруженный в парафин образец. Кроме того, способ может включать введение эффективного количества антитела против CD70 или конъюгата “антитело против CD70-лекарственное средство” пациенту, если на стадии определения обнаружен детектируемый уровень CD70.

В соответствии с другим аспектом изобретение относится к способу лечения CD70-позитивных злокачественных опухолей. Способ включает введение эффективного количества средства, связывающего CD70, пациенту со злокачественной опухолью поджелудочной железы, яичников, легкого, гортани, глотки, молочной железы или кожи, обладающей детектируемой экспрессией CD70, где связывающее средство представляет собой антитело, производное антитела или конъюгата “антитело-лекарственное средство”. Антитело может обладать эффекторной функцией. Ранее пациент мог быть подвергнут хирургическому лечению, получать лучевую и/или химиотерапию средством, не направленным на CD70, без индукции ремиссии злокачественной опухоли. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой химерное, гуманизированное антитело или антитело человека, такое как химерная или гуманизированная форма моноклонального антитела 1F6 или 2F2. Конъюгат “антитело-лекарственное средство” может содержать цитотоксическое средство, такое как антитубулиновое средство, связывающее малую бороздку ДНК средство или алкилирующее малую бороздку ДНК средство. Антитело в конъюгате “антитело-лекарственное средство” можно конъюгировать с цитотоксическим или цитостатическим средством посредством линкера, такого линкера, который расщепляется во внутриклеточных условиях.

В соответствии с другим аспектом комбинированный диагностический и фармацевтический набор содержит антитело, которое специфически связывает денатурированный CD70, для применения в диагностике и антитело, которое специфически связывает внеклеточный домен нативного CD70, для применения в терапии.

Аспекты изобретения будут более понятны со ссылкой на следующее ниже подробное описание, проиллюстрированное вариантами осуществления, сопровождающимися рисунками, фигурами и таблицами.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

На фигуре 1 показан Вестерн-блот экстрактов белка с использованием антител SG-21.1C1 и SG-21.5D12 для обнаружения денатурированного CD70 в экстрактах белка из трансфицированных клеток 786-О, 293F:CD70 и нетрансфицированных клеток 293F.

На фигуре 2 показана экспрессия белка CD70 на фиксированной формалином погруженной в парафин (FFPE) линии клеток поджелудочной железы PANC-1 с использованием антитела SG21.1C1.

На фигуре 3 показана экспрессия белка CD70 в линиях клеток яичников Ovcar-3, SK-OV-3, Ca-Ov-3 и TOV-21G с использованием антитела SG21.1C1.

На фигуре 4 показана экспрессия белка CD70 в образцах опухоли поджелудочной железы, как было обнаружено посредством антител SG-21.1C1 или SG-21.5D12 по сравнению с контрольным mIgG.

На фигуре 5 показана экспрессия белка CD70 на клетках нормальной поджелудочной железы и клетках опухоли поджелудочной железы, как было обнаружено посредством антитела SG-21.1C1 с использованием хромогена быстрого красного (более темная окраска).

На фигуре 6 показана оценка экспрессии белка CD70 в клетках злокачественной опухоли поджелудочной железы. По x-оси указана интенсивность окраски CD70, а по y-оси указан процент площади, являющийся CD70-положительным.

На фигуре 7 показана оценка экспрессии белка CD70 в опухолях яичников. По x-оси указана интенсивность окраски CD70, а по y-оси указан процент площади, являющийся CD70-положительным.

На фигуре 8 показана оценка цитотоксической активности in vitro различных конъюгатов гуманизированного антитела 1F6 с лекарственными средствами против линии клеток злокачественной опухоли яичника, SKOV-3.

На фигурах 9A-C показаны оценки цитотоксической активности in vitro конъюгата гуманизированного антитела 1F6 с лекарственным средством на следующих линиях клеток: (A) CD70-трансфицированная линия клеток поджелудочной железы, HPAFII; (B) трансфицированная CD70 линия клеток поджелудочной железы PANC-1; и (C) трансфицированная CD70 линия клеток MiaPaCa-2.

На фигуре 10 показана оценка эффективности in vivo конъюгата гуманизированного антитела 1F6 с лекарственным средством для CD70-трансфицированных опухолях-карциномах поджелудочной железы MiaPaCa у мышей nude.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Если не указано другого, следующие термины и фразы, как используется в настоящем документе, обозначают следующее.

Термин «антитело» относится к (a) иммуноглобулиновым полипептидам и иммунологически активным частям иммуноглобулиновых полипептидов, т.е., полипептидам семейства иммуноглобулинов или их фрагментам, содержащим антигенсвязывающий участок, который иммуноспецифически связывает специфический антиген (например, CD70), или (b) обладающим консервативными заменами производным таких иммуноглобулиновых полипептидов или фрагментов, которые иммуноспецифически связывают антиген (например, CD70). Антитела в общем описаны, например, в Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988). Если из контекста не очевидно иначе, ссылка на антитело включает также производные или конъюгаты “антитело-лекарственное средство”, как более подробно описано ниже.

«Производное антитела» обозначает антитело, как определено выше, модифицированное ковалентным присоединением гетерологичной молекулы, например, таким как присоединение гетерологичного полипептида, или гликозилированием, дегликозилированием, ацетилированием или фосфорилированием, в норме не связанным с антителом, и тому подобное.

Термин «моноклональные антитело» относится к антителу, полученному из отдельного клона клеток, включая любой клон эукариотических или прокариотических клеток, или фаговый клон, а не к способу, которым оно получено. Таким образом, термин «моноклональное антитело» не ограничено антителами, полученными гибридными технологиями.

«Антиген» представляет собой частицу, с которой специфически связывается антитело.

Термин «ингибировать» или «ингибирование» означает уменьшение поддающегося измерению количества, или полное предотвращение.

Термин «средство» обозначает элемент, соединение, или молекулярную частицу, включая, например, фармацевтическое, терапевтическое или фармакологическое соединение. Средства могут представлять собой природные или синтетические средства или их сочетание. «Лекарственное средство» представляет собой средство, оказывающее терапевтический (например, благоприятный) эффект на клетки злокачественных опухолей, либо отдельно, либо в сочетании с другим средством (например, превращающий пролекарство фермент в сочетании с пролекарством). Как правило, лекарственные средства, применимые в соответствии со способами и композициями, описанными в настоящем документе, представляют собой средства, оказывающие цитотоксический или цитостатический эффект.

«Цитотоксический эффект», по отношению к эффекту средства на клетки, означает клеточную гибель.

«Цитостатический эффект» означает ингибирование пролиферации клетки.

«Цитотоксическое средство» обозначает средство, которое оказывает цитотоксический или цитостатический эффект на клетку, таким образом, соответственно, истощая клетки или ингибируя рост клеток внутри популяции клеток.

Термин «истощать», в контексте эффекта антитела против CD70 на CD70-экспрессирующие клетки, относится к уменьшению количества или разрушению CD70-экспрессирующих клеток.

Термин «функциональный», в контексте антитела против CD70 или его производного, используемого согласно способам, описанным в настоящем документе, обозначает, что антитело или его производное (1) способно связывать CD70 и/или (2) истощает или ингибирует пролиферацию CD70-экспрессирующих клеток отдельно или при конъюгации с цитотоксическим средством.

Термин «профилактика» относится к введению конъюгата антитело против конъюгата “CD70-лекарственное средство” (ADC) или производного ADC индивиду до проявления клинического или диагностического симптома CD70-экспрессирующей злокачественной опухоли (например, к введению индивидууму с предрасположенностью или с высоким риском возникновения злокачественной опухоли поджелудочной железы или яичников) для (a) блокирования возникновения или проявления CD70-экспрессирующей злокачественной опухоли, или одного или нескольких из ее клинических или диагностических симптомов, (b) ингибирования тяжести проявления CD70-экспрессирующей злокачественной опухоли, или (c) уменьшения вероятности проявления CD70-экспрессирующей злокачественной опухоли.

Термины «лечение» или «лечить» относятся к замедлению, остановке или обращению прогрессирования CD70-экспрессирующей злокачественной опухоли у пациента, как доказывают по уменьшению или прекращению клинического или диагностического симптома заболевания, посредством введения антитела против CD70, конъюгата “антитело-лекарственное средство” или производного ADC индивиду после проявления клинического или диагностического симптома CD70-экспрессирующей злокачественной опухоли на любой клинической стадии. Лечение может включать, например, уменьшение тяжести симптома, количества симптомов или частоты обострений.

Термин «фармацевтически приемлемый» обозначает одобренный регулирующим органом федерального или государственного правительства или перечисленный в Фармакопее США или другой общепризнанной фармакопее для применении у животных, и более конкретно, у человека.

Термин «фармацевтически совместимый ингредиент» относится к фармацевтически приемлемому разбавителю, адъюванту, наполнителю или носителю вместе с которым вводят антитело против CD70.

Термин «эффективное количество», в контексте введения фармацевтического средства, относится к количеству средства, достаточному для ингибирования возникновения или облегчения одного или нескольких клинических или диагностических симптомов CD70-экспрессирующей злокачественной опухоли поджелудочной железы или яичника у пациента. Эффективное количество средства вводят согласно способам, описанным в настоящем документе, в «эффективном режиме». Термин «эффективный режим» относится к сочетанию количества средства и частоты дозирования, адекватному для достижения лечения CD70-экспрессирующей злокачественной опухоли.

Термин «пациент» включает людей и других млекопитающих, получающих диагностическое, профилактическое или терапевтическое лечение.

Аббревиатура «AFP» обозначает диметилвалин-валин-долаизолейин-долапроин-фенилаланин-п-фенилендиамин.

Аббревиатура «MMAE» обозначает монометилауристатин E.

Аббревиатура «AEB» обозначает сложный эфир, полученный реакцией ауристатина E с пара-ацетилбензойной кислотой.

Аббревиатура «AEVB» обозначает сложный эфир, полученный реакцией ауристатина E с бензоилвалериановой кислотой.

Аббревиатура «MMAF» обозначает довалин-валин-долаизолейнин-долапроин-фенилаланин.

Аббревиатуры «fk» и «phe-lys» означают дипептид фенилаланин-лизин.

Аббревиатуры «vc» и «val-cit» обозначают дипептид валин-цитруллин.

Лекарственные средства как правило, являются по существу чистыми от нежелательных загрязнителей. Это означает, что средство, как правило, обладает чистотой по меньшей мере приблизительно 50% масс./масс. (масса/масса), так же как является по существу свободным от связанных белков и загрязнителей. Иногда средства обладают чистотой по меньшей мере приблизительно 80% масс./масс. и, более предпочтительно по меньшей мере 90 или приблизительно 95% масс./масс. Однако с использованием общепринятых способов очистки белка можно получать гомогенные пептиды чистотой по меньшей мере 99% масс./масс.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

I. Общее

Изобретение относится к способам диагностики, прогнозирования, профилактики и лечения, и контроля лечения злокачественных опухолей поджелудочной железы яичников и поджелудочной железы с использованием антител против CD70. Кроме того, изобретение относится к способам диагностики, прогнозирования, профилактики и лечения, и контроля лечения рака легкого, головы и шеи (гортань или глотка), меланомы, глиобластомы, множественной миеломы, ходжкинской лимфомы, неходжкинской лимфомы, такой как фолликулярная лимфома, почечно-клеточной карциномы, включая светлоклеточную карциному и папиллярную карциному, карциномы ободочной и прямой кишки и мочевого пузыря. Способы частично основаны на результатах, представленных в разделе “Примеры”, указывающих на повышенные уровню экспрессии CD70 в конкретных злокачественных опухолях. Повышенную экспрессию обнаруживали в фиксированных формалином погруженных в парафин (FFPE) образцах тканей злокачественных опухолей яичников и поджелудочной железы с использованием антител, которые специфически связывают денатурированный CD70. Кроме того, повышенную экспрессию CD70 обнаруживали также в фиксированных формалином погруженных в парафин (FFPE) образцах тканей других злокачественных опухолей с использованием антител против денатурированного внеклеточного домена CD70.

Хотя осуществление изобретения на практике не зависит от знания механизма, считают, что успех обнаружения CD70 в FFPE образцах тканей яичников и поджелудочной железы в частности, и других злокачественных опухолей в общем, принадлежит к использованию антител, которые предпочтительно связывают денатурированный CD70 в таких образцах по сравнению с нативным CD70. Хотя частота детектируемого CD70 в злокачественных опухолях яичников и поджелудочной железы и/или его уровень не настолько высоки, как в некоторых других злокачественных опухолей, с которыми ранее связывали CD70, они являются очень специфичными для ткани злокачественной опухоли по сравнению с нормальной тканью. Таким образом, у пациентов обладающих злокачественной опухолью яичников или злокачественной опухолью поджелудочной железы, в которых детектируется CD70, CD70 представляет собой крайне эффективную мишень для избирательно направленной токсичности на клетки злокачественных опухолей. Подобным образом, для пациентов с другими злокачественными опухолями (например, опухолями легкого, головы и шеи (гортань или глотка), меланомой, глиобластомой, множественной миеломой, ходжкинской лимфомой, неходжкинской лимфомой, такой как фолликулярная лимфома, почечно-клеточной карциномой, включая светлоклеточную карциному и папиллярную карциному, карциномами ободочной и прямой кишки и мочевого пузыря), настоящее изобретение относится к простому способу обнаружения экспрессии CD70 в фиксированных образцах, полученных у пациентов.

II. Антитела против CD70

В следующем ниже описании сначала рассматривают свойства антител против CD70, которые можно использовать для обнаружения CD70 в злокачественных опухолях яичников и поджелудочной железы и их лечения, и затем подробно описывают предпочтительные свойства антител для соответствующих вариантов использования.

A. Общее описание антител против CD70

Как правило, антитела против CD70 включают моноклональные, химерные (например, содержащие константную область человека и вариабельную область мыши), гуманизированные, замаскированные антитела или антитела человека; одноцепочечные антитела или тому подобное. Молекулы иммуноглобулинов могут принадлежать любому типу или классу (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY) или подклассу (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2).

Антитела против CD70 могут представлять собой антигенсвязывающий фрагмент антитела, такой как Fab, F(ab'), F(ab')₂, цепь Fd, одноцепочечный Fv (scFv), одноцепочечное антитело, Fv с дисульфидными связями (sdFv), фрагмент, содержащий либо V_L, либо V_H домен, включая наноантитела или фрагменты из верблюдов, лам или тому подобное, или фрагменты, полученные посредством экспрессирующей библиотеки Fab, или CD70-связывающие фрагменты любого из вышеупомянутых антител, описанных выше. Антигенсвязывающие фрагменты антител, включая одноцепочечные антитела, могут содержать вариабельную область(области) отдельно или в сочетании с целым или частью из следующего: шарнирная область, CH1, CH2, CH3 и CL домены. Кроме того, антигенсвязывющие фрагменты могут содержать любую комбинацию вариабельной области(областей) с шарнирной областью, CH1, CH2, CH3 и CL доменами. Как правило, антитела являются антителами человека, грызунов (например, мыши и крысы), осла, овцы, кролика, козы, морской свинки, верблюдовых, лошади или курицы.

Антитела могут быть моноспецифическими, биспецифическими, триспецифическими или обладать большей специфичностью (мультиспецифические). Мультиспецифические антитела могут быть специфическими для различных эпитопов CD70 или могут быть специфическими для CD70, а так же для гетерологичного белка. (См., например, WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69; патент США No. 4474893; 4714681; 4925648; 5573920; и 5601819; Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:1547-1553.) Мультиспецифические антитела, включая биспецифические и триспецифические антитела, которые можно использовать в практике способов, описанных в настоящем документе, представляют собой антитела, которые иммуноспецифически связываются как с CD70, так и со вторым рецептором или рецепторным комплексом на поверхности клеток, например, представителем суперсемейства генов иммуноглобулинов, представителем суперсемейства рецепторов TNF, интегрином, рецептором цитокинов, рецептором хемокинов, белком главного комплекса гистосовместимости, лектином (C-типа, S-типа или I-типа) или белком контроля комплемента.

Антитела против CD70 также можно охарактеризовать по их аффинности связывания с CD70, равной 10^-7 M, 5×10^-8 M, 10^-8 M, 5×10^-9 M, 10^-9 M, 5×10^-10 M, 10^-10 M, 5×10^-11 M, 10^-11 M, 5×10^-12 M, 10^-12 M, 5×10^-13 M, 10^-13 M, 5×10^-14 M, 10^-14 M, 5×10^-15 M или 10^-15 M. Антитело против CD70 может представлять собой химерное антитело. Химерное антитело представляет собой молекулу, в которой различные части антитела происходят из различных видов животных, например, антитело имеет вариабельную область, происходящую из моноклонального антитела мыши, и константную область иммуноглобулина человека. Способы получения химерных антител хорошо известны в данной области. (См., например, Morrison, Science, 1985, 229:1202; Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214; Gillies et al., 1989, J. Immunol. Methods 125:191- 202; Патенты США No. 5807715; 4816567; и 4816397.)

Антитело против CD70 также может представлять собой гуманизированное антитело, в том числе замаскированное антитело. Гуманизированные антитела представляют собой молекулы антитела, которые связывают желательный антиген и обладают одной или несколькими определяющими комплементарность областями (CDR) из не относящихся к человеку видов, и каркасом и константными областями из иммуноглобулиновой молекулы человека. Часто каркасные остатки в каркасных областях человека можно заменять соответствующим остатком из CDR донорного антитела для изменения или, предпочтительно, улучшения связывания антигена. Такие замены в каркасе идентифицируют способами, хорошо известными в данной области, например, посредством моделирования взаимодействий CDR и остатков каркаса для идентификации остатков каркаса, важных для связывания антигена, и сравнения последовательностей для идентификации необычных остатков каркаса в конкретных положениях. (См., например, Queen et al., Патент США No. 5585089; Riecbmann et al., 1988, Nature 332:323.) Антитела можно гуманизировать с использованием множества способов, известных в данной области, таких как CDR-прививка (EP 0239400; WO 91/09967; патенты США No. 5225539; 5530101; и 5585089), маскировка или ремоделирование поверхности (EP 0592106; EP 0519596; Padlan, Molecular Immunology, 1991, 28(4/5):489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering 7(6):805-814; Roguska et al., 1994, PNAS 91:969-973) и перетасовка цепей (патент США No. 5565332) (содержание всех из этих ссылок приведено в настоящем документе в качестве ссылки).

Антитело против CD70 может также представлять собой антитело человека. Антитела человека можно получать множеством способов, известных в данной области, такими как способы фагового дисплея (см. выше) с использованием библиотек антител, полученных из последовательностей иммуноглобулинов человека. См. также, например, патенты США No. 4444887 и 4716111; WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 и WO 91/10741. Кроме того, антитело человека, распознающее выбранный эпитоп, можно получать с использованием способа, обозначенного как «направленная селекция», в котором не относящееся к человеку моноклональное антитело, например, антитело мыши, используют для направления отбора полностью человеческого антитела, распознающего тот же самый эпитоп (см., например, Jespers et al., 1994, Biotechnology 12:899-903). Антитела человека можно получать также с использованием трансгенных мышей, экспрессирующих гены иммуноглобулинов человека. Моноклональные антитела, направленные против антигена, можно получать из иммунизированных трансгенных мышей с использованием способа гибридом. Обзор способов для получения антител человека см. в Lonberg and Huszar, 1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93. Подробное обсуждение этого способа для получения антител человека и моноклональных антител человека и способы для получения таких антител см., например, в публикациях PCT WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; Европейском патенте No. 0 598 877; и патентах США No. 5413923; 5625126; 5633425; 5569825; 5661016; 5545806; 5814318; 5885793; 5916771; и 5939598.

Антитела можно анализировать по специфическому связыванию с CD70 известными способами, например, такими как системы конкурентного и не конкурентного иммуноанализа с использованием таких способов, как Вестерн-блоттинг, радиоиммунный анализ, ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), «сэндвич» иммуноанализы, анализы иммунопреципитации, реакции с преципитином, реакции с преципитином и диффузией в геле, анализы иммунодиффузии, реакции агглютинации, анализы связывания комплемента, иммунорадиометрические анализы, флуоресцентные иммуноанализы, иммуноанализы с белком A. (См., например, Ausubel et al., eds., Short Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc., New York, 4th ed. 1999); Harlow & Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1999.)

Кроме того, аффинность связывания антитела против CD70 и скорость диссоциации для взаимодействия антитела-CD70 можно определять анализами конкурентного связывания. Одним примером анализа конкурентного связывания является радиоиммунный анализ, включающий инкубацию меченного CD70 (например, ³H или ¹²⁵I) с интересующим антителом в присутствии увеличивающихся количеств немеченого CD70 и обнаружение антитела, связанного с меченым CD70. Затем аффинность антитела против CD70 и скорости диссоциации для связывания можно определять из данных посредством анализа графика Скэтчарда. Конкуренцию с вторым антителом можно также определять с использованием радиоиммунных анализов. В этом случае, CD70 инкубируют с интересующим антителом, конъюгированным с меченным соединением (например, ³H или ¹²⁵I) в присутствии увеличивающихся количеств немеченого второго антитела. Альтернативно, аффинность связывания антитела с CD70 и скорости связывания и диссоциации для взаимодействия антитело-CD70 можно определять посредством поверхностного плазмонного резонанса.

Антитела можно получать по антиген-содержащим фрагментам белка CD70 общепринятыми способами в соответствии с типом антитела (см., например, Kohler, et al., Nature, 256:495, (1975); Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (C.S.H.P., NY, 1988); Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989) и WO 90/07861; Dower et al., WO 91/17271 и McCafferty et al., WO 92/01047 (содержание каждого из которых приведено в качестве ссылки для всех целей). В качестве примера, моноклональные антитела можно получать с использованием широкого ряда способов, включая, например, использование способа гибридом, рекомбинантных способов и способов фагового дисплея. Способы гибридомы в общих чертах обсуждают, например, в Harlow et al., выше, и Hammerling, et al., In Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, pp. 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981). Примеры способов фагового дисплея, которые можно использовать для получения антител против CD70, включают, например, способы, описанные в Briinnan et al., 1995, J. Immunol. Methods 182:41-50; Ames et al., 1995, J. Immunol. Methods 184:177-186; Kettleborough et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24:952-958; Persic et al., 1997, Gene 187:9-18; Burton et al., 1994, Advances in Immunology 57:191-280; заявке PCT No. PCT/GB91/01 134; Публикациях PCT WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; и патентах США No. 5698426; 5223409; 5403484; 5580717; 5427908; 5750753; 5821047; 5571698; 5427908; 5516637; 5780225; 5658727; 5733743 и 5969108 (описания которых приведены в настоящем документе в качестве ссылки).

Способы получения фрагментов антител, распознающих специфические эпитопы, также являются общеизвестными в данной области. Например, фрагменты Fab и F(ab')₂ можно получать протеолитическим расщеплением молекул иммуноглобулинов с использованием ферментов, таких как папаин (для получения фрагментов Fab) или пепсин (для получения фрагментов F(ab')₂). F(ab')₂ фрагменты содержат вариабельную область, константную область легкой цепи и домен C_H1 тяжелой цепи. Можно применять также способы рекомбинантного получения фрагментов Fab, Fab' и F(ab')₂ с использованием, например, способов, описанных в WO 92/22324; Mullinax et al., 1992, BioTechniques 12(6):864-869; и Sawai et al., 1995, AJRI 34:26-34; и Better et al., 1988, Science 240:1041-1043 (описания которых приведены в настоящем документе в качестве ссылки).

Примеры способов, которые можно использовать для получения одноцепочечных Fv и антител, включают способы, описанные в патентах США No. 4946778 и 5258498; Huston et al., 1991, Methods in Enzymology 203:46-88; Shu et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7995-7999; и Skerra et al., 1988, Science 240:1038-1040.

Антитела против CD70 и их производные, используемые в настоящих способах, можно получать также способами рекомбинантной экспрессии. Для рекомбинантной экспрессии антитела или его производного, которое связывает CD70 и/или вызывает истощение или ингибирование пролиферации CD70-экспрессирующих клеток, необходимо конструирование экспрессирующего вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело или его производное. После получения нуклеиновой кислоты, кодирующей такой белок, вектор для продукции молекулы белка можно получать посредством технологии рекомбинантной ДНК с использованием способов, хорошо известных в данной области. Общепринятые способы, такие как описанные в Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 3rd ed., 2001); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 2nd ed., 1989); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, New York, 4th ed., 1999); и Glick & Pasternak, Molecular Biotechnology: Principles и Applications of Recombinant DNA (ASM Press, Washington, D. C, 2nd ed., 1998), можно использовать для способов рекомбинантных нуклеиновых кислот, синтеза нуклеиновых кислот, культивирования клеток, введения трансгенов и экспрессии рекомбинантного белка.

Например, для рекомбинантной экспрессии антитела против CD70 экспрессирующий вектор может кодировать его тяжелую или легкую цепь, или вариабельный домен тяжелой или легкой цепи, функционально связанный с промотором. Экспрессирующий вектор может включать, например, нуклеотидную последовательность, кодирующую константную область молекулы антитела (см., например, WO 86/05807; WO 89/01036; и патент США No. 5122464), и вариабельный домен антитела можно клонировать в такой вектор для экспрессии полной тяжелой или легкой цепи. Экспрессирующий вектор переносят в клетку-хозяина известными способами, и затем трансфицированные клетки культивируют для продукции антитела против CD70. Как правило, для экспрессии двухцепочечных антител, векторы, кодирующие как тяжелую, так и легкую цепи, можно совместно экспрессировать в клетке-хозяине для экспрессии целой иммуноглобулиновой молекулы.

Множество прокариотических и эукариотических систем хозяин-экспрессирующий вектор можно использовать для экспрессии антитела против CD70 или его производного. Как правило, эукариотические клетки, в частности, для полного рекомбинантного антитела против молекул CD70, используют для экспрессии рекомбинантного белка. Например, клетки млекопитающих, такие как клетки яичника китайского хомяка (CHO) (например, DG44 или CHO-S) в сочетании с вектором, таким как промоторный элемент главного средне-раннего гена цитомегаловируса человека или промотор EF-1α яичника китайского хомяка, представляют собой эффективную систему экспрессии для получения антител против CD70 и их производных (см., например, Foecking et al., 1986, Gene 45:101; Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8:2; Allison, патент США No. 5888809).

Другие системы хозяина-экспрессии включают системы экспрессии на основе плазмид в бактериальных клетках (см., например, Ruther et al., 1983, EMBO 1,2:1791; Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acid Res. 13:3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509); системы насекомых, такие как использование экспрессирующего вектора из вируса ядерного полиэдроза Autographa californica (AcNPV) в клетках Spodoptera frugiperda; и системы экспрессии на основе вирусов в клетках млекопитающих, такие как системы на основе аденовирусов (см., например, Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:355-359; Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol 153:51-544).

B. Антитела для детекции CD70

Отбор антител против CD70 для применения в способах детекции зависит от того, детектируют ли CD70 способом, требующим детекции денатурированного CD70 или нативного CD70 (как экспрессируется на клетках). В таких способах, как Вестерн-блоттинг или иммуногистохимическая детекция, в которых CD70-мишень является денатурированным, является предпочтительным использование антитела, которое связывает CD70 в денатурированной форме (например, CD70 человека или яванского макака). Как правило, такие антитела предпочтительно связывают денатурированную форму по сравнению с нативной формой (т.е., CD70 как он существует в природе или при выделении без подвергания воздействию денатурирующих условий, таких как растворители, детергенты или повышенные температуры (например, выше 50°C)). Такие антитела можно стимулировать с использованием денатурированного иммуногена CD70 (например, CD70 человека или яванского макака) или его иммуногенного фрагмента из внеклеточной части. Денатурацию можно вызывать обработкой иммуногена SDS (например, 0,5%) и, необязательно, нагреванием вплоть до 80°C. Денатурацию можно также просто вызывать элюцией иммуногена из геля с SDS, используемого для очистки иммуногена. Альтернативно, антитела, предпочтительно связывающие денатурированный CD70, можно получать с использованием синтетических пептидов из внеклеточного домена CD70 в качестве иммуногенов. Некоторые из таких пептидов являются слишком короткими для сохранения конформации соответствующего фрагмента нативного пептида. Синтетические пептиды могут присутствовать, но обычно не требуют денатурации для использования в качестве иммуногена.

Проводят скрининг антител, полученных этими или другими способами по предпочтительному связыванию с денатурированным CD70 по сравнению с нативным CD70. Денатурированный и нативный антиген CD70 можно анализировать посредством одного и того же анализа или различных анализов. В частности, при использовании последнего способа, скрининг можно проводить с контрольным антителом, как известно, связывающим нативный CD70, таким как терапевтические антитела, описанные ниже (например, гуманизированные 1F6 или 2F2; см. Публикации патентных заявок США No. 2006-0233794 и 2006-0083736 и Международную публикацию патента WO 06/113909). Если для антитела показано более высокое соотношение связывания с денатурированным CD70 по сравнению с нативным CD70 по сравнению с соотношением для контрольного антитела, тогда антитело предпочтительно связывает денатурированный CD70.

Предпочтительные антитела для детекции CD70 в злокачественных опухолях яичников и поджелудочной железы представляют собой антитела, которые специфически связывают CD70 на образцах злокачественных опухолей поджелудочной железы или яичника, фиксированных формалином и погруженных в парафин (FFPE). Эти антитела предпочтительно распознают эпитопы на CD70, которые выявляются обработкой FFPE, по сравнению с нативными антигенами CD70 на необработанных клетках злокачественной опухоли поджелудочной железы или яичника. Такие антитела обозначены FFPE-специфические антитела против CD70. У таких антител отсутствует детектируемое специфическое связывание с нативным CD70. Предпочтительно, специфическое связывание антитела является таким же или лучшим, чем у антитела SG-21.1C1 или SG-21.5D12. В частности, антитела предпочтительно обладают такой же или более низкой поддающейся обнаружению перекрестной реактивностью с другими клеточными белками, как определяют по Вестерн-блоттингу или окрашиванию фиксированных клеток, в условиях специфического связывания, по сравнению с антителами SG-21.1C1 или SG-21.5D12.

Предпочтительные антитела для обнаружения CD70 в других злокачественных опухолях (как описано ниже в разделе “Примеры”) представляют собой антитела, специфически связывающие CD70 в образцах этих опухолей, фиксированных формалином и погруженных в парафин (FFPE). Эти антитела предпочтительно распознают эпитопы на CD70, выявляемые обработкой FFPE, по сравнению с нативными антигенами CD70 на необработанных клетках злокачественной опухоли поджелудочной железы или яичника. У таких антител отсутствует детектируемое специфическое связывание с нативным CD70. Предпочтительно, специфическое связывание антител является таким же или лучшим, чем у антитела SG-21.1C1 или SG-21.5D12. В частности, антитела предпочтительно обладают такой же или более низкой детектируемой перекрестной реактивностью с другими клеточными белками, как определяют по Вестерн-блоттингу или окрашиванию фиксированных клеток в условиях специфического связывания, по сравнению с антителами SG-21.1C1 или SG-21.5D12.

Некоторые характерные FFPE-специфические антитела против CD70 представляют собой mAb SG-21.1C1 (обозначаемые также SG-21.1C1-B3) и SG-21.5D12.C3 (обозначаемые также SG-21.5D12.C3). Другие предпочтительные антитела конкурируют с SG-21.1C1.B3 или SG-21.5D12.C3 за специфическое связывание с денатурированным CD70. Другие предпочтительные антитела содержат тяжелую цепь, содержащую три CDR из тяжелой цепи SG-21.1C1.B3, и легкую цепь, содержащую три CDR из легкой цепи SG-21.1C1.B3. Другие предпочтительные антитела содержат тяжелую цепь, содержащую три CDR из тяжелой цепи SG-21.5D12.C3 и легкую цепь, содержащую три CDR из легкой цепи SG-21.5D12.C3. Другие предпочтительные антитела содержат зрелую вариабельную область тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности зрелой вариабельной области тяжелой цепи SG-21.1C1.B3, и зрелую вариабельную область легкой цепи, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности зрелой вариабельной области легкой цепи SG-21.1C1.B3. Другие предпочтительные антитела содержат зрелую вариабельную область тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности зрелой вариабельной области тяжелой цепи SG-21.5D12.C3, и зрелую вариабельную область легкой цепи, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности зрелой вариабельной области легкой цепи SG-21.5D12.C3.

C. Антитела против CD70 для терапевтического использования

Антитела, используемые для терапевтического использования, специфически связывают внеклеточный домен нативных антигенов CD70 на клетках злокачественной опухоли поджелудочной железы или яичников. Антитела, используемые для терапевтического использования, могут также специфически связывать внеклеточный домен нативного антигена CD70 рака легких, головы и шеи (гортань или глотка), при меланоме, глиобластоме, множественной миеломе, ходжкинской лимфоме, неходжкинской лимфоме, такой как фолликулярная лимфома, почечно-клеточной карциноме, включая светлоклеточную карциному и папиллярную карциному, карциномах ободочной и прямой кишки и мочевого пузыря. Антитела могут быть агонистическими, не агонистическими или антагонистическими по отношению к связыванию CD70 с его лигандом CD27. Хотя осуществление изобретения на практике не зависит от знания механизма, считают, что антитела могут оказывать цитотоксический или цитостатический эффект либо в результате связывания CD70 и интернализации внутрь клетки, либо посредством связывания с CD70 и накопления вне клеток. В любом случае, цитотоксический или цитостатический эффект можно стимулировать конъюгацией антитела с цитотоксическим или цитостатическим средством. Цитотоксический или цитостатический эффект, проявляемый вне клетки посредством антитела, связанного с CD70, можно дополнительно или альтернативно стимулировать посредством константной (эффекторной) функции антитела. Константные домены антитела опосредуют различные эффекторные функции Ig, такие как участие антитела в антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC), комплементзависимой цитотоксичности (CDC) и/или антителозависимом клеточном фагоцитозе (ADCP). Необязательно, эффекторную функцию CD70-связывающего средства можно усиливать несколькими способами, как описано в WO2006/113909. Цитотоксический или цитостатический эффект, оказываемый антителами, можно также усиливать блокированием взаимодействия CD70 с его лигандом, CD27.

Предпочтительное антитело против CD70 представляет собой mAb 1F6 или 2F2, или их химерные или гуманизированные формы, как описано в WO 2004/073656 и опубликованной Патентной заявке США No. 2006-0233794, и в WO2006/113909. Предпочтительная зрелая вариабельная область тяжелой цепи обладает последовательностью SEQ ID NO:1, и предпочтительная зрелая вариабельная область легкой цепи обладает последовательностью SEQ ID NO:2.

Другие антитела, которые можно использовать, содержат зрелые вариабельные области тяжелой и легкой цепи, которые по меньшей мере на 90% и, предпочтительно, по меньшей мере на 95% или 99% идентичны последовательности SEQ ID NO:1 и 2, соответственно. Руководство, как определить, какие остатки из каркасных остатков вариабельной области необходимы для связывания, представлено в WO2006/113909. Другие антитела против CD70, которые можно использовать, или их производные могут конкурентно ингибировать связывание mAb 1F6 или 2F2 с CD70, как определено, например, посредством иммуноанализа. Под конкурентным ингибированием понимают, что антитело, если присутствует в избытке по меньшей мере в два раза и, предпочтительно, в пять раз, ингибирует связывание 1F6 или 2F2 с CD70 по меньшей мере на 50%, более обычно по меньшей мере на 60%, еще более обычно, по меньшей мере на 70%, и наиболее обычно, по меньшей мере на 75%, или антитело конкурентно ингибирует связывание 1F6 или 2F2 с CD70 по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95%.

Другие предпочтительные антитела содержат тяжелую цепь, содержащую три CDR вариабельной области тяжелой цепи 1F6, и легкую цепь, содержащую три CDR вариабельной области легкой цепи 1F6. Другие предпочтительные антитела содержат зрелые вариабельные области тяжелой цепи, которые по меньшей мере на 90% идентичны последовательности зрелой вариабельной области тяжелой цепи 2F2, и зрелую вариабельную область легкой цепи, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности зрелой вариабельной области легкой цепи 2F2. Другие предпочтительные антитела содержат зрелые вариабельные области тяжелой цепи, которые по меньшей мере на 90, 95 или 99% идентичны последовательности зрелой вариабельной области тяжелой цепи 1F6, и зрелую вариабельную область легкой цепи, которая по меньшей мере на 90, 95 или 99% идентична последовательности зрелой вариабельной области легкой цепи 1F6. Другие предпочтительные антитела содержат зрелую вариабельную область тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 90, 95 или 99% идентична последовательности зрелой вариабельной области тяжелой цепи 2F2 (SEQ ID NO:3), и зрелую вариабельную область легкой цепи, которая по меньшей мере на 90, 95 или 99% идентична последовательности зрелой вариабельной области легкой цепи 2F2 (SEQ ID NO:4).

Многочисленные другие антитела против CD70 описаны, например, в Публикации патентной заявки США No. 2005-0191299; и Международной публикации No. WO 07/038637. Можно проводить скрининг связывания других антител с внеклеточным доменом CD70 на возможность их использования либо отдельно, либо в виде производных и/или конъюгатов, как описано ниже. С помощью Скрининга можно оценить интернализацию в клетки, экспрессирующие CD70, с использованием меченых антител. С помощью Скрининга можно оценить также цитотоксичность. Дополнительный скрининг можно проводить на моделях животных злокачественной опухоли поджелудочной железы или яичников и других злокачественных опухолей. Например, можно использовать линию клеток карциномы яичника SKOV-3, линию клеток карциномы эндометрия AN3CA, клетки карциномы яичника TOV21G. Можно использовать также линии клеток поджелудочной железы PANC1 и MiaPaca2.

Производное антитела против CD70 также можно использовать в осуществлении настоящих способов на практике. Характерные модификации включают, например, гликозилирование, дегликозилирование, ацетилирование, пегилирование, фосфорилирование, амидирование, введение функциональных групп с помощью известных защищающих/блокирующих групп, протеолитическое расщепление, связывание с клеточным лигандом или другим белком и тому подобное. Любые из многочисленных модификаций можно осуществлять, например, посредством специфического химического расщепления, ацетилирования, формилирования или метаболического синтеза в присутствии туникамицина. Кроме того, производное может содержать одну или несколько неклассических аминокислот.

Производное антитела может представлять собой мультимер, такой как димер, содержащий один или несколько мономеров, где каждый мономер содержит (i) антигенсвязывающую область антитела против CD70 или полипептидную область, полученную из нее (например, посредством консервативной замены одной или нескольких аминокислот) и (ii) область для мультимеризации (например, димеризации) полипептида, такую что производное антитела формирует мультимеры (например, гомодимеры), которые специфически связывают CD70. Как правило, антигенсвязывающую область антитела против CD70 или область полипептида, полученную из нее, рекомбинантно или химически сливают с гетерологичным белком, где гетерологичный белок содержит домен для димеризации или мультимеризации. Перед введением производного антитела индивиду для целей лечения или профилактики CD70-экспрессирующих злокачественных опухолей, производное подвергают воздействию в условиях, при которых возможно формирование гомодимера или гетеродимера. Гетеродимер может содержать идентичные домены для димеризации, но различные области связывания антигена CD70, идентичные области связывания антигена CD70, но различные домены для димеризации, или различные области связывания антигена CD70 и домены для димеризации.

Производное антитела против CD70 может быть получено путем конъюгации антитела против CD70 со вторым антителом («гетероконъюгат антитела») (см., например, патент США No. 4676980). Гетероконъюгаты, которые можно использовать в практике настоящего изобретения, содержат антитело, которое связывается с CD70 (например, антитело с CDR и/или тяжелыми цепями моноклональных антител 1F6 или 2F2), и антитело, которое связывается с поверхностным рецептором или рецепторным комплексом, таким как представитель суперсемейства генов иммуноглобулинов, представитель суперсемейства рецепторов TNF, интегрин, рецептор цитокинов, рецептор хемокинов, белок главного комплекса гистосовместимости, лектин (C-типа, S-типа или I-типа) или белок контроля комплемента.

Антитела против CD70 и их производные могут быть конъюгированы с цитотоксическим или цитостатическим агентом с получением конъюгата “антитело-лекарственное средство” (ADC). Особенно подходящими агентами для конъюгации с антителами или производными антител являются химиотерапевтические средства, превращающие пролекарство ферменты, радиоактивные изотопы или соединения, или токсины. Например, антитело против CD70 или его производное может быть конъюгировано с цитотоксическим средством, таким как химиотерапевтическое средство или токсин (например, цитостатическое или разрушающее клетки средство, например, такое как абрин, рицин A, экзотоксин pseudomonas или дифтерийный токсин).

Антитело против CD70 или его производное может быть конъюгировано с превращающим пролекарство ферментом. Превращающий пролекарство фермент может быть рекомбинантно слит с антителом или его производным или химически конъюгирован с ним известными способами. Примерами превращающими пролекарство ферментами являются карбоксипептидаза G2, бета-глюкуронидаза, пенициллин-V-амидаза, пенициллин-G-амидаза, β-лактамаза, β-глюкозидаза, нитроредуктаза и карбоксипептидаза A.

Способы конъюгирования лекарственных средств с белками, и в частности, с антителами, хорошо известны. (См., например, Arnon et al., «Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy», in Antibodies And Cancer Therapy (Reisfeld et al. eds., Alan R. Liss, Inc., 1985); Hellstrom et al., «Antibodies For Drug Delivery», in Controlled Drug Delivery (Robinson et al. eds., Marcel Dekker, Inc., 2nd ed. 1987); Thorpe, « Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review», in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications (Pinchera et al. eds., 1985); «Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy», in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy (Baldwin et al. eds., Academic Press, 1985); и Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62: 119-58. См. также, например, публикацию PCT WO 89/12624).

Лекарственное средство может быть конъюгировано так, что при этом уменьшается его активность, до тех пор пока антитело не будет отщеплено (например, путем гидролиза, деградации антитела или отщепляющего средства). Такое лекарственное средство присоединяют к антителу или его производному с помощью расщепляющегося линкера, который является чувствительным к расщеплению во внутриклеточных условиях CD70-экспрессирующей злокачественной опухоли, но в основном, не чувствителен к внеклеточным условиям, так что конъюгат отщепляется от антитела или его производного при интернализации в клетку CD70-экспрессирующей злокачественной опухоли (например, в эндосоме или, например, посредством чувствительности к pH или чувствительности к протеазам, в лизосомальном окружении или в кавеолярном окружении).

Как правило, ADC содержит линкерную область между лекарственным средством и антителом против CD70 или его производным. Как указано выше, как правило, линкер расщепляется во внутриклеточных условиях, так что расщепление линкера высвобождает лекарственное средство от антитела во внутриклеточном окружении (например, внутри лизосомы или эндосомы или кавеолы). Линкер может представлять собой, например, пептидильный линкер, который отщепляют внутриклеточные пептидазный или протеазный фермент, включая лизосомальную или эндосомальную протеазу. Как правило, пептидильный линкер обладает длиной по меньшей мере две аминокислоты или по меньшей мере три аминокислоты. Расщепляющие средства могут включать катепсины B и D и плазмин (см., например, Dubowchik and Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123). Наиболее характерными являются пептидильные линкеры, которые расщепляются ферментами, присутствующими в CD70-экспрессирующих клетках. Например, можно использовать пептидильный линкер, который поддается расщеплению тиол-зависимой протеазой катепсином-B, которая экспрессируется на высоком уровне в ткани злокачественных опухолей, (например, линкер, содержащий пептид Phe-Leu или Gly-Phe-Leu-Gly). Другие такие линкеры описаны, например, в патенте США No. 6214345. В конкретных вариантах осуществления пептидильный линкер расщепляется под действием внутриклеточной протеазы, содержит линкер Val-Cit или дипептид Phe-Lys (см., например, патент США 6214345, в котором описан синтез доксорубицина с линкером Val-Cit). Одним из преимуществ использования внутриклеточного протеолитического высвобождения лекарственного средства является то, что средство, как правило, ослабляется при конъюгации, а стабильность конъюгатов в сыворотке является, как правило, высокой.

Расщепляющийся линкер может быть pH-чувствительным, т.е., чувствительным к гидролизу при конкретных значениях pH. Как правило, pH-чувствительный линкер гидролизуется в кислых условиях. Например, можно использовать кислото-неустойчивый линкер, который гидролизуется в лизосоме (например, гидразон, семикарбазон, тиосемикарбазон, цис-аконитовый амид, ортоэфир, ацеталь, кеталь или тому подобное). (См., например, патенты США No. 5122368; 5824805; 5622929; Dubowchik and Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123; Neville et al., 1989, Biol. Chem. 264:14653-14661). Такие линкеры относительно стабильны в условиях нейтрального pH, таких как условия в крови, но нестабильны при pH ниже 5,5 или 5,0, приблизительном pH лизосомы. В конкретных вариантах осуществления гидролизующийся линкер представляет собой тиоэфирный линкер (например, такой как тиоэфир, присоединенный к лекарственному средству через ацилгидразоновую связь (см., например, патент США No. 5622929)).

Другие линкеры расщепляются в восстанавливающих условиях (например, дисульфидный линкер). Дисульфидные линкеры включают линкеры, которые могут быть получены с использованием SATA (N-сукцинимидил-S-ацетилтиоацетат), SPDP (N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат), SPDB (N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)бутират) и SMPT (N-сукцинимидил-оксикарбонил-альфа-метил-альфа-(2-пиридил-дитио)толуол), SPDB и SMPT. (См., например, Thorpe et al., 1987, Cancer Res. 47:5924-5931; Wawrzynczak et al., In Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer (C. W. Vogel ed., Oxford U. Press, 1987. См. также патент США No. 4880935.)

Линкер может также представлять собой малонатный линкер (Johnson et al., 1995, Anticancer Res. 15:1387-93), малеимидобензоиловый линкер (Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10):1299-1304), или аналог 3'-N-амида (Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10):1305-12).

Линкер может представлять собой также нерасщепляющийся линкер, такой как малеимидо-алкилен- или малеинимид-ариловый линкер, непосредственно присоединенный к группе лекарственного средства. Активное лекарственное средство-линкер высвобождают посредством деградации антитела.

Как правило, если линкер по существу не является чувствительным к внеклеточным условиям, то это означает, что не более, чем приблизительно 20%, обычно, не более, чем приблизительно 15%, более обычно, не более, чем приблизительно 10%, и даже более обычно, не более, чем приблизительно 5%, не более, чем приблизительно 3%, или не более, чем приблизительно 1% линкеров в образце ADC расщепляется, когда ADC или производное ADC присутствует во внеклеточных условиях (например, в плазме). Является ли линкер по существу чувствительным к внеклеточным условиям или нет, можно определить, например, инкубацией независимо с плазмой как (a) ADC или производного ADC («образец ADC») и (b) равного молярного количества неконъюгированного антитела или лекарственного средства («контрольный образец») в течение предопределенного периода времени (например, 2, 4, 8, 16 или 24 часов) и затем сравнение количества неконъюгированного антитела или лекарственного средства, присутствующего в образце ADC, с количеством, присутствующим в контрольном образце, как измерено, например, высокоэффективной жидкостной хроматографией.

Линкер также может стимулировать клеточную интернализацию. Линкер может стимулировать клеточную интернализацию при конъюгации с лекарственным средством (т.е., в окружении линкер-группа лекарственного средства ADC или производного ADC, как описано в настоящем документе). Альтернативно, линкер может стимулировать клеточную интернализацию при конъюгации как с лекарственным средством, так и с антителом против CD70 или его производным (т.е., в окружении ADC или производного ADC, как описано в настоящем документе).

Множество линкеров, которые можно использовать с настоящими композициями, описаны в WO 2004-010957, имеют форму

где:

-A- представляет собой расширительное звено;

a равно собой 0 или 1;

каждый -W- независимо представляет собой аминокислотное звено;

w независимо представляет собой целое число в диапазоне от 0 до 12;

-Y- представляет собой спейсерное звено; и

y равно 0, 1 или 2.

Характерные линкеры показаны внутри квадратных скобок формул (Ia) и (Ib; см. ниже), где A-, -W-, -Y-, -D, w и y являются такими, как определено выше, и R¹ выбран из -C₁-C₁₀ алкилена-, -C₃-C₈-карбоцикло-, -O-(C₁-C₈-алкил)-, -арилена-, -C₁-C₁₀ алкилен-арилена-, -арилен-C₁-C₁₀-алкилена-, -C₁-C₁₀-алкилена- (C₃-C₈-карбоцикло)-, -(C₃-C₈-карбоцикло)-C₁-C₁₀-алкилена-, -C₃-C₈ гетероцикло-, -C₁-С₁₀алкилен-(C₃-C₈-гетероцикло)-, -(C₃-C₈ гетероцикло)-C₁-C₁₀-алкилена-, -(CH₂CH₂O)_r-, и -(CH₂CH₂O)_r-CH₂-; и r представляет собой целое число в диапазоне 1-10. Ab представляет собой антитело.

Аминокислотное звено (-W-), если присутствует, связывает расширительное звено (-A-) со спейсерным звеном (-Y-), если спейсерное звено присутствует, и связывает расширительное звено с цитотоксическим или цитостатическим средством (звено лекарственного средства; D) если спейсерное звено отсутствует.

Если присутствует, -W_w- представляет собой дипептидное, трипептидное, тетрапептидное, пентапептидное, гексапептидное, гептапептидное, октапептидное, нонапептидное, декапептидное, ундекапептидное или додекапептидное звено, w представляет собой целое число в диапазоне от 2 до 12.

Спейсерное звено (-Y-), если присутствует, связывает аминокислотное звено с звеном лекарственного средства. Спейсерные звенья существуют двух основных типов: саморазрушаемые и несамоуничтожаемые. Несамоуничтожаемое спейсерное звено представляет собой звено, в котором часть или все из спейсерного звена остается связанным с звеном лекарственного средства после ферментативного отщепления аминокислотного звена от конъюгата “антитело против CD70-линкер-лекарственное средство” или соединения лекарственное средство-линкер. Примеры несамоуничтожаемого спейсерного звена включают спейсерное звено (глицин-глицин) и глициновое спейсерное звено. Когда конъюгат “антитело против CD70-линкер-лекарственное средство”, содержащий глицин-глициновое спейсерное звено или глициновое спейсерное звено подвергается ферментативному расщеплению посредством связанной с клеткой опухоли протеазы, связанной с клеткой злокачественной опухоли протеазы или связанной с лимфоцитами протеазы, группа глицин-глицин-лекарственное средство или группа глицин-лекарственное средство отщепляется от Ab-A_a-W_w-. Для высвобождения лекарственного средства независимая реакция гидролиза должна проходить внутри клетки-мишени для расщепления связи глицин-звено лекарственного средства.

Альтернативно, конъюгат “антитело против CD70-лекарственное средство”, содержащий саморазрушающееся спейсерное звено, может высвобождать лекарственное средство (D) без необходимости отдельной стадии гидролиза. В этих вариантах осуществления -Y- представляет собой звено п-аминобензилового спирта (PAB), связанное с -W_w- через атом азота группы PAB, и напрямую связанное с -D через группу карбоната, карбамата или простого эфира. Другие примеры саморазрушающихся спейсеров включают ароматические соединения, электронно эквивалентные группе PAB, такие как производные 2-аминоимидазол-5-метанола (см. примеры в Hay et al., 1999, Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237), и орто- или пара-аминобензилацетали. Можно использовать спейсеры, которые подвергаются простой циклизации при гидролизе амидной связи, такие как замещенные и незамещенные амиды 4-аминомасляной кислоты (Rodrigues et al., 1995, Chemistry Biology 2:223), соответствующим образом замещенные бицикло[2.2.1] и бицикло[2.2.2] кольцевые системы (Storm et al., 1972, J. Amer. Chem. Soc. 94:5815) и амиды 2-аминофенилпропионовой кислоты (Amsberry et al., 1990, J. Org. Chem. 55:5867). Разрушение содержащих амин лекарственных средств, которые являются замещенными в α-положении глицина (Kingsbury, et al., 1984, J. Med. Chem. 27:1447), также является примерами способов с саморазрушающимися спейсерами, которые можно использовать в отношении конъюгатов “антитело против CD70-линкер-лекарственное средство”. Альтернативно, спейсерное звено представляет собой разветвленное звено бис(гидроксиметил)стирола (BHMS), которое можно использовать для введения дополнительных лекарственных средств.

Используемые классы цитотоксических средств включают, например, антрациклины, антитубулиновые средства, связывающие малую бороздку ДНК средства, ингибиторы репликации ДНК, сенсибилизирующие средства для химиотерапии или тому подобное.

Примеры используемых классов цитотоксических средств включают ауристатины, камптотецины, дуокармицины, этопозиды, майтанзиноиды и алкалоиды барвинка.

Подходящие цитотоксические средства включают, например, ауристатины (например, ауристатин E, AFP, MMAF, MMAE), связывающие малую бороздку ДНК средства (например, энедиины и лекситропсины), дуокармицины, таксаны (например, паклитаксел и доцетаксел), алкалоиды барвинка, доксорубицин, морфолино-доксорубицин и цианоморфолино-доксорубицин.

Цитотоксическое средство может представлять собой химиотерапевтическое средство, например, такое как доксорубицин, паклитаксел, мелфалан, алкалоиды барвинка, метотрексат, митомицин C или этопозид. Кроме того, активные средства, такие как аналоги CC-1065, калихеамицин, майтанзин, аналоги доластатина 10, ризоксин и палитоксин, можно связывать с антителами против CD70 или их производными.

В характерных вариантах осуществления цитотоксическое или цитостатическое средство может представлять собой ауристатин E или его производное. Как правило, производное ауристатина E представляет собой, например, сложный эфир, сформированный между ауристатином E и кетокислотой. Например, можно проводить реакцию ауристатина E с параацетилбензойной кислотой или бензоилвалериановой кислотой для получения AEB и AEVB, соответственно. Другие характерные ауристатины включают AFP, MMAF и MMAE. Синтез и структура ауристатина E и его производных описана, например, в публикациях патентных заявок США No. 2005-0238649 и 2006-0074008.

Цитотоксическое средство может представлять собой связывающее малую бороздку ДНК средство. (См., например, патент США No. 6130237). Например, связывающее малую бороздку средство может представлять собой соединение CBI или энедиин (например, калихеамицин).

ADC или производное ADC может включать антитубулиновое средство. Примеры антитубулиновых средств включают в качестве неограничивающих примеров, таксаны (например, Таксол® (паклитаксел), Таксотер® (доцетаксел)), T67 (Туларик), алкалоиды барвинка (например, винкристин, винбластин, виндезин и винорелбин) и ауристатины (например, ауристатин E, AFP, MMAF, MMAE, AEB, AEVB). (Характерные ауристатины показаны ниже в формулах III-XIII. Другие подходящие антитубулиновые средства включают, например, производные баккатина, аналоги таксана (например, эпотилон A и B), нокодазол, колхицин и колцемид, эстрамустин, криптофицины, цемадотин, майтанзиноиды, комбретастатины, дискодермолид и элеутеробин.

Цитотоксическое средство может представлять собой майтанзиноид, другую группу антитубулиновых средств. Например, майтанзиноид представляет собой майтанзин или содержащее майтанзин лекарственное средство с линкером, такое как DM-1 или DM-4 (ImmunoGen, Inc.; см. также Chari et al., 1992, Cancer Res. 52:127-131).

Другие связывающие CD70 средства можно использовать в качестве альтернативы антителам. Такая нацеленная на CD70 группа может включать одну или несколько CDR из антитела, которое связывает CD70, и истощает CD70-экспрессирующие клетки или ингибирует их пролиферацию при конъюгации с цитотоксическим средством. Как правило, белок представляет собой мультимер, наиболее обычно, димер.

Другие нацеленные на CD70 группы могут включать CD27 и его варианты или фрагменты, которые связывают CD70. Кроме того, нацеленные на CD70 группы могут включать пептиды, лиганды и другие молекулы, которые специфически связывают CD70.

Другие нацеленные на CD70 группы, которые можно использовать в способах, описанных в настоящем документе, можно идентифицировать с использованием любого способа, подходящего для скрининга белок-белковых взаимодействий. Как правило, белки сначала идентифицируют по способности специфически связывать CD70, затем по их способности оказывать цитостатический или цитотоксический эффект на активированные лимфоциты или CD70-экспрессирующие клетки злокачественных опухолей при конъюгации с цитотоксическим или цитостатическим средством. Способы, которые можно использовать, включают способы «клонирования по взаимодействию», с последующим анализом экспрессирующих библиотек с помощью зондов с меченым CD70 способом, сходным со способом анализа библиотек λgt11 с помощью зондов с антителами (см., например, Blanar and Rutter, 1992, Science 256:1014-1018). Другой способ представляет собой двухгибридную систему (Chien et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9578-9582) и является коммерчески доступным из Clontech (Palo Alto, CA).

После идентификации CD70-связывающего белка, его способность (отдельно или при мультимеризации или слиянии с доменом для димеризации или мультимеризации, или конъюгации с цитотоксической или цитостатической группой) оказывать цитостатический или цитотоксический эффект на CD70-экспрессирующие клетки злокачественных опухолей (при конъюгации с цитотоксическим средством) определяют сходным образом, как и способность антитела.

III. Детекция CD70

Образцы, подлежащие анализу для диагностического использования, можно получать посредством хирургических процедур, например, биопсии. CD70, как правило, обнаруживают иммуноанализом, в котором образец, содержащий клетки, как известно или как подозревают, происходящие из злокачественной опухоли (например, злокачественной опухоли поджелудочной железы или яичников), приводят в контакт с антителом. После контакта определяют присутствие или отсутствие события связывания антитела с клетками в образце. Связывание относится к присутствию или отсутствию антигена, экспрессированного на клетках злокачественных опухолей в этим образце. Как правило, образец приводят в контакт с меченым специфическим партнером по связыванию антитела против CD70, способного образовывать поддающийся обнаружению сигнал. Альтернативно можно метить само антитело против CD70. Примеры типов меток включают ферментные метки, радиоизотопные метки, нерадиоактивные метки, флуоресцентные метки, токсиновые метки и хемолюминесцентные метки. Обнаружение сигнала от метки указывает на присутствие антитела, специфически связывающего CD70 в образце.

Образец, на котором проводят анализ, может быть фиксированным или замороженным, чтобы позволить получение гистологических срезов. Предпочтительно, образцы из вырезанной ткани фиксируют в альдегидных фиксаторах, таких как формальдегид, параформальдегид, глутаральдегид; или фиксаторах с тяжелыми металлами, таких как хлорид ртути. Более предпочтительно, образцы из вырезанной ткани фиксируют в формалине и погружают в парафиновый воск перед инкубацией с антителом. Преимуществом, достигаемым посредством фиксированных в формалине-погруженных в парафин (FFPE) образцов, является сохранение клеточных и архитектурных морфологических деталей в срезах тканей (см., например, Fox et al., 1985, J. Histochem. Cytochem. 33:845-853). Необязательно, образцы FFPE можно обрабатывать цитратом, ЭДТА, ферментативным расщеплением или нагреванием для увеличения доступности эпитопов (см., например, Shi et al., 1991, J Histochem Cytochem. 39:741-748).

Альтернативно, белковую фракцию можно выделять из клеток из известной или подозреваемой злокачественной опухоли поджелудочной железы или яичников и анализировать посредством ELISA, Вестерн-блоттинга, иммунопреципитации или тому подобное. В другом варианте в клетках можно анализировать экспрессию CD70 посредством анализа FACS, предпочтительно, в сочетании с другим маркером клеток поджелудочной железы или яичников.

В другом варианте мРНК можно выделять из клеток из известной или подозреваемой злокачественной опухоли поджелудочной железы или яичников. мРНК или нуклеиновую кислоту, выделенную из них, такую как кДНК, можно затем анализировать гибридизацией с нуклеиновым зондом, связывающимся с ДНК, кодирующей CD70.

В другом варианте злокачественную опухоль поджелудочной железы или яичников можно обнаружить in vivo введением меченого антитела против CD70 пациенту и обнаружением антитела визуализацией in vivo.

Обнаружение CD70 в образцах ткани может быть качественным или количественным, или и тем, и другим. Качественное обнаружение обозначает обнаружение присутствия или отсутствия экспрессии CD70. Количественная экспрессия обозначает определение уровня экспрессии для экспрессии CD70. Присутствие и/или уровень CD70 в образце ткани поджелудочной железы или яичника можно (но не обязательно) определять по сравнению с одним или несколькими стандартами. Стандарты можно определять заранее или одновременно. Стандарт может представлять собой, например, образец поджелудочной железы или яичника, как известно, не являющийся злокачественным, от другого индивида, ткань либо от пациента, либо от другого индивида, как известно, не экспрессирующую CD70, или линию клеток поджелудочной железы или яичников. Стандарт может представлять собой также образец от пациента, подлежащий анализу, приведенный в контакт с несоответствующим антителом (например, антителом, стимулированным против бактериального антигена). Поскольку CD70 не экспрессируется в какой-либо значительной степени в не относящейся к злокачественной опухоли ткани поджелудочной железы или яичника, такую не относящуюся к злокачественной опухоли ткань можно использовать в качестве нулевого (фонового) стандарта экспрессии.

Присутствие поддающегося обнаружению сигнала от связывания антитела против CD70 с CD70 по сравнению со стандартом (если его используют) указывает на присутствие CD70 в образце ткани, и уровень поддающегося обнаружению связывания предоставляет указание на уровень экспрессии CD70. В анализах, проводимых на срезах тканей, уровень экспрессии можно выражать как процент площади поверхности образца, обладающей детектируемой экспрессией CD70. Альтернативно или дополнительно, уровень (интенсивность) экспрессии можно использовать в качестве меры общей экспрессии в образце или клеток, экспрессирующих CD70, в образце.

IV. Диагностика, прогнозирование, создание и мониторирование лечения

Обнаружение экспрессии CD70 в образце ткани поджелудочной железы или яичников указывает на то, что образец относится к злокачественной опухоли. Подобным образом, обнаружение экспрессии CD70 в другом образце от пациента является указанием на то, что пациент обладает злокачественной опухолью легкого, головы и шеи (гортань или глотка), меланомой, глиобластомой, множественной миеломой, ходжкинской лимфомой, неходжкинской лимфомой, такой как фолликулярная лимфома, почечно-клеточной карциномой, включая светлоклеточную карциному и папиллярную карциному, карциномой ободочной и прямой кишки или мочевого пузыря. Антитела, используемые для терапевтического использования, специфически связывают внеклеточный домен нативных антигенов CD70.

Указание на злокачественную опухоль, предоставленное по присутствию и/или уровню CD70, можно сочетать с такими способами диагностики, как внутреннее или внешнее обследование пациента лечащим врачом, посредством рентгеновского излучения, сканирования CT (компьютерная томография), сканирования PET (позитронная эмиссионная томография), сканирования PET/CT, ультразвука, MRI (магнитно-резонансная томография), эндоскопии, ERCP (эндоскопическая ретроградная холангиопанкреатография), гистологического обследования и культивирования ткани, для достижения общего диагноза.

Возможно с наибольшей значимостью для лечащего врача, присутствие и уровень CD70 предоставляет полезную информацию для разработки способа лечения пациента, и в частности, введения антитела против CD70, производного, ADC или другого связывающего средства пациенту. Из-за отсутствия по существу детектируемой экспрессии CD70 в нормальной ткани поджелудочной железы или яичников, присутствие этого рецептора на злокачественной опухоли предоставляет мишень для терапевтического лечения. Чем выше уровень экспрессии CD70 и/или чем выше процент опухоли, экспрессирующей CD70, тем более эффективным, вероятно, может быть лечение. Продолжающийся анализ CD70 после лечения предоставляет способ контроля, является ли лечение эффективным, где уменьшение уровня CD70-положительного сигнала (т.е., как показатель присутствия CD70-положительных клеток злокачественных опухолей) указывает на то, что лечение является эффективным.

V. Пациенты, подлежащие лечению

Пациенты, подлежащие лечению способами, как правило, обладают детектируемыми уровнями CD70 в ткани их поджелудочной железы, яичников или другой ткани, сопровождаемыми другими признаками или симптомами злокачественных опухолей, как описано выше. Существует множество подтипов и стадий злокачественных опухолей поджелудочной железы и яичников, как более подробно описано ниже. Иногда пациенты, которых лечат настоящими способами, ранее получали другие типы лечения (например, хирургическое вмешательство, химиотерапия и/или радиотерапия), но ремиссия или даже замедление роста злокачественной опухоли не было достигнуто. У некоторых таких пациентов злокачественная опухоль является устойчивой к лечению посредством одного или многих таких видов лечения.

Некоторых пациентов, подверженных риску злокачественной опухоли поджелудочной железы, можно также лечить профилактически до появления признаков и симптомов заболевания. Такие индивидуумы включают тех, у кого есть родственники, пережившие эти заболевания, и тех, чей риск определили анализом генетических или биохимических маркеров.

A. Пациенты со злокачественной опухолью поджелудочной железы

Злокачественная опухоль поджелудочной железы представляет собой злокачественную опухоль внутри поджелудочной железы. Почти 90% пациентов с злокачественной опухолью поджелудочной железы старше 55. Средний возраст на время обнаружения этой злокачественной опухоли составляет 72. Факторы риска для злокачественной опухоли поджелудочной железы включают: возраст, мужской пол, этническую принадлежность к африканцам, курение, диету с высоким содержанием мяса, ожирение, диабет, хронический панкреатит (связан, но не известно, что он является причиной), профессиональное воздействие конкретных пестицидов, красителей и химикатов, родственных бензину, семейный анамнез, инфекцию Helicobacter pylori, гингивит или парадонтоз. (Pancreatic Cancer. Von Hoff et al., ed., Maine; 2005.) Только 10-15% злокачественных опухолей поджелудочной железы считают наследственными. Некоторые генетические маркеры, связанные с злокачественными опухолями поджелудочной железы, могут включать мутации гена PNCA1, PALLD или BRCA2 (см., например, Banke et al., 2000, Med. Clin. North Am. 84: 677-690; Meckler et al., 2001, Am. J. Surg. Path. 25: 1047-1053; Pogue-Geile et al., 2006, PLoS Med. 3: e516; Murphy et al., 2002, Cancer Res. 62: 3789-3793).

Однако, не у всех пациентов в признанных в настоящее время категориях риска могут развиться злокачественные опухоли поджелудочной железы. Многие злокачественные опухоли поджелудочной железы возникают «спорадически» (т.е., у пациентов без семейного анамнеза).

Индивидуумов, страдающих злокачественными опухолями поджелудочной железы, можно распознать согласно гистологии опухоли, полученной в патологическом заключении. Гистология диктует многие аспекты клинического лечения, ведения и прогнозирования. Существует два главных типа злокачественной опухоли поджелудочной железы, основанные на том, из экзокринной или эндокринной части поджелудочной железы начинается опухоль. Опухоли, образованные из экзокринной части поджелудочной железы, являются намного более распространенными. Приблизительно 95 процентов опухолей поджелудочной железы представляют собой аденокарциномы. Оставшиеся 5 процентов включают другие опухоли экзокринной части поджелудочной железы (например, серозные цистаденомы), злокачественные опухоли ацинозных клеток и нейроэндокринные опухоли поджелудочной железы (такие как инсулиномы).

Эндокринные опухоли называют также опухолями островковых клеток и разделяют на несколько подтипов. Большинство являются доброкачественными, но существует несколько, являющихся злокачественными. Особый тип злокачественной опухоли (ампулярная злокачественная опухоль) может возникать, где желчный проток из печени и проток поджелудочной железы опустошаются в тонкий кишечник. Поскольку этот тип злокачественной опухоли часто вызывает пожелтение кожи и глаз, ее обычно обнаруживают на более ранней стадии, чем большинство злокачественных опухолей поджелудочной железы. Шансы на успешное лечение лучше для пациентов, страдающих ампулярной злокачественной опухолью.

Определение стадий злокачественной опухоли поджелудочной железы можно проводить согласно критериям Американского объединенного онкологического комитета (AJCC). Стадии злокачественной опухоли обозначены с использованием римских цифр I-IV, где стадия IV указывает на то, что злокачественная опухоль распространилась и является более тяжелой. Конкретно, стадия I злокачественной опухоли поджелудочной железы включает опухоли, которые не распространились в конкретные запрещенные чувствительные области и в которые не вовлечены регионарные узлы или удаленные метастазы. Стадия II включает опухоли, которые распространились в двенадцатиперстную кишку, желчный проток, или «перипанкреатические» ткани и в которые не вовлечены регионарные узлы или удаленные метастазы. Злокачественные опухоли стадии III включают опухоли, которые могут распространяться или не распространяться в эти области и в которые вовлечены регионарные узлы, но для которых не показано доказательств удаленных метастазов. Стадия IVA включает опухоли, которые распространились в желудок, селезенку, толстый кишечник или соседние крупные сосуды и в которые вовлечены регионарные узлы, но для которых не показано доказательств удаленных метастазов. Стадия IVB включает опухоли поджелудочной железы любого вида с любым видом состояния узлов и с доказательством удаленных метастазов. Несмотря на ссылку, эту систему определения стадий злокачественной опухоли поджелудочной железы редко используют в чистом виде, поскольку стадии не полностью соответствуют прогнозированию или вариантам лечения для пациента. Альтернативой является классификация на три стадии (потенциально операбельная, местнораспространенная и метастазирующая), основанная на радиологических обнаружениях. Другие прогностические факторы также принимают во внимание. Степень злокачественности злокачественной опухоли, показывающая, насколько аномальными клетки выглядят под микроскопом, иногда перечисляют по шкале от G1 до G4, где злокачественные опухоли G1 выглядят наиболее сходными с нормальными клетками и обладают наилучшим внешним видом. Для пациентов, перенесших хирургическую операцию, степень резекции, т.е., вся опухоль удалена или нет, также является важной по отношению к внешнему виду. Это иногда перечисляют по шкале от R0 до R2, где R0 указывает на то, что вся опухоль, которую можно увидеть, удалена, и R2 указывает на то, что некоторую часть опухоли, которую можно увидеть, нельзя удалить.

Симптомы злокачественной опухоли поджелудочной железы на ранней стадии являются неспецифическими и изменчивыми. Распространенные симптомы включают боль в верхнем отделе брюшной полости, которая, как правило, распространяется на спину и облегчается при наклоне вперед (наблюдаемую при карциноме тела или хвостовой части поджелудочной железы), потерю аппетита, значительную потерю массы и безболезненное разлитие желчи, связанное с обструкцией желчного протока (карцинома головки поджелудочной железы). Однако, все эти симптомы могут обладать множеством других причин и не являются ограниченными злокачественной опухолью поджелудочной железы.

B. Пациенты со злокачественной опухолью яичников

Злокачественная опухоль яичников представляет собой злокачественную опухоль, возникающую в яичниках. Злокачественная опухоль яичников обычно возникает у женщин в возрасте более 50, но она может поражать также более молодых женщин. Ее причина является неизвестной. Конкретные популяции, такие как женщины - евреи Ашкенази, подвержены более высокому риску, часто в более раннем возрасте, чем общая популяция. Пациенты с личным анамнезом злокачественной опухоли молочной железы или семейным анамнезом злокачественных опухолей яичников, молочной железы или других родственных злокачественных опухолей, особенно в молодом возрасте, могут быть подвержены повышенному риску. Отягощенный семейный анамнез злокачественной опухоли тела матки, злокачественной опухоли ободочной кишки, или других злокачественных опухолей желудочно-кишечного тракта может указывать на присутствие синдрома, известного как наследственный неполипозный рак ободочной и прямой кишки (HNPCC, известный также как синдром Линча II), подвергающего более высокому риску развития злокачественной опухоли яичников. Цитогенетические исследования и исследования потери гетерозиготности позволяют предполагать, что некоторые гены или области хромосом вовлечены в возникновение и прогрессирование злокачественной опухоли яичников (см., например, Pejovic et al., 1992, Genes Chromosomes Cancer, 4:58-68; Testa et al., 1994, Cancer Res., 54:2778-2784: Yang-Feng et al., 1993, Int. J. Cancer, 54:546-551). Генетические маркеры риска злокачественной опухоли яичников включают в качестве неограничивающих примеров мутации в гене BRCA1 или BRCA2 (Futreal et al., 1994, Science, 266:120-122). Для пациентов с сильным генетическим риском злокачественной опухоли яичников могут рассматривать предупредительную овариоэктомию после завершения детородного периода. Не у всех женщин в распознаваемых в настоящее время категориях риска могут развиться злокачественные опухоли яичников. Большинство злокачественных опухолей яичников возникает спорадически.

Индивидуумов, страдающих злокачественной опухолью яичника, можно распознать согласно гистологии опухоли, полученной в патологическом заключении. Гистология диктует многие аспекты клинического лечения, ведения и прогноза. Существует три главных типа злокачественной опухоли яичника, основанные на типе клеток, с которых начинается опухоль, и на том, является ли опухоль доброкачественной или злокачественной. Опухоли половых клеток начинаются с клеток, образующих яйцеклетки. Стромальные опухоли начинаются с клеток соединительной ткани, удерживающей яичник вместе и продуцирующей женские гормоны эстроген и прогестерон. Эпителиальные опухоли начинаются с клеток, покрывающих внешнюю поверхность яичника. Большинство злокачественных опухолей яичника являются эпителиальными опухолями, где меньшинство опухолей возникает из половых или стромальных клеток.

Злокачественная опухоль яичников часто является первичной, но может также быть вторичной, в результате метастазирования из первичной злокачественной опухоли в другом месте организма. Например, из злокачественной опухоли молочной железы, или из злокачественной опухоли желудочно-кишечного тракта (в этом случае злокачественная опухоль яичников представляет собой опухоль Крукенберга). Опухоли поверхностного эпителия-стромы могут происходить из выстилки брюшной полости, в этом случае злокачественная опухоль яичников является вторичной по отношению к первичной перитонеальной злокачественной опухоли, но лечение в основном является таким же, как для первичной злокачественной опухоли яичников этого типа.

При злокачественных опухолях яичников стадии злокачественной опухоли являются следующими: стадия I ограничена одним или обоими яичниками; стадия II включает распространение или имплантацию в таз; стадия III включает микроскопические перитонеальные метастазы за пределами таза; или ограничена тазом с расширением до тонкой кишки или сальника; и стадия IV включает удаленные метастазы, например, в печени, или вне брюшной полости.

Злокачественная опухоль яичников на ранней стадии часто является бессимптомной или вызывает только слабо выраженные симптомы, которые пациент может игнорировать, поскольку симптомы являются либо слабыми, либо неспецифическими. Симптомы могут включать метеоризм, боль в области таза или живота, проблемы с питанием или чувство быстрого насыщения, симптомы со стороны мочевых путей, такие как срочное или частое желание посетить туалет. (См., например, Smith et al., 2005, Cancer 104(7): 1398-1407; Совместное заключение, выпущенное Американским обществом по борьбе с раком, Фондом гинекологической онкологии и Обществом гинекологов-онкологов 12 июня 2007 г.) Более 60% пациентов с проявлениями этой злокачественной опухоли уже имеют злокачественную опухоль на стадии III или стадии IV, когда она уже распространилась за пределы яичников.

C. Другие пациенты со злокачественными опухолями

Другие пациенты, подлежащие лечению способами, как правило, обладают поддающимся обнаружению уровнями CD70 в образцах легкого, головы и шеи (гортань или глотка), меланомы, глиобластомы, множественной миеломы, ходжкинской лимфомы, неходжкинской лимфомы, такой как фолликулярная лимфома, почечно-клеточной карциномы, включая светлоклеточную карциному и папиллярную карциному, карциномы ободочной и прямой кишки или мочевого пузыря. Такие пациенты могут иметь другие сопровождающие признаки или симптомы злокачественных опухолей. Иногда пациентов, которых лечат настоящими способами, ранее получали другое лечение (например, хирургическое вмешательство, химиотерапию и/или радиотерапию), но ремиссия или даже замедление роста злокачественной опухоли не были достинуты. У некоторых таких пациентов злокачественная опухоль является устойчивой к лечению посредством одного или многих таких видов лечения.

Некоторых пациентов, подверженных риску злокачественной опухоли поджелудочной железы, можно также лечить профилактически до появления признаков и симптомов заболевания. Такие индивидуумы включают тех, у кого есть родственники, пережившие эти заболевания, и тех, чей риск определили анализом генетических или биохимических маркеров.

VI. Способы лечения

Настоящее изобретение относится к способам лечения или профилактики злокачественной опухоли поджелудочной железы или яичников посредством антител, производных и ADC, и других связывающих средств против CD70 (в собирательном значении, средств), описанных в настоящем документе. Композиции можно вводить пациенту.

Различные системы доставки можно использовать для введения средств, включая внутрикожные, внутримышечные, внутрибрюшинные, внутривенные, подкожные, интраназальные, эпидуральные и пероральные способы. Средства можно вводить, например, инфузией или болюсной инъекцией, абсорбцией через эпителиальные или кожно-слизистые выстилки (например, слизистую оболочку полости рта, ректальную и интестинальную слизистую оболочку, и тому подобное) и можно вводить вместе с другими биологически активными средствами, такими как химиотерапевтические средства. Введение может быть системным или местным.

Средства можно вводить инъекцией, посредством катетера, посредством суппозитория или посредством имплантата, где имплантат представляет собой пористый, непористый или желатиновый материал, включая мембрану, такую как силастиковая мембрана, или волокно.

Альтернативно, средства можно доставлять в системе с контролируемым высвобождением. Например, можно использовать насос (см. Langer, 1990, Science 249:1527-1533; Sefton, 1989, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574). Альтернативно, можно использовать полимерные материалы (см. Medical Applications of Controlled Release (Langer & Wise eds., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance (Smolen & Ball eds., Wiley, New York, 1984); Ranger & Peppas, 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61. См. также Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105.). Другие системы с контролируемым высвобождением обсуждают, например, в Langer, выше.

Средства можно вводить в форме фармацевтических композиций, содержащих терапевтически или профилактически эффективное количество средства и один или несколько фармацевтически совместимых ингредиентов. Например, фармацевтическая композиция как правило, содержит один или несколько фармацевтических носителей (например, стерильные жидкости, такие как вода и масла, включая масла нефтяного, животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и тому подобное). Вода является более характерным носителем, когда фармацевтическую композицию вводят внутривенно. Солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина также можно применять в качестве жидких носителей, в частности, для поддающихся инъекции растворов. Подходящие фармацевтические наполнители включают, например, крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, глицеринмоностеарат, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропилен, гликоль, воду, этанол и тому подобное. Композиция, если желательно, может также содержать незначительные количества увлажняющих средств или эмульгаторов, забуферивающих pH средств (например, аминокислот) и/или солюбилизаторов или стабилизаторов (например, неионных поверхностно-активных веществ, таких как твин или сахара, такие как сахароза, трегалоза или тому подобное). Этим композициям можно придавать форму растворов, суспензий, эмульсий, таблеток, пилюль, капсул, порошков, составов с замедленным высвобождением и тому подобное. Композицию можно составлять в форме суппозитория, с общепринятыми связующими веществами и носителями, такими как триглицериды. Пероральный состав может содержать общепринятые носители, такие как маннит, лактозу, крахмал, стеарат магния, сахарин натрия, целлюлоза, карбонат магния и т.д. фармацевтической степени очистки. Примеры подходящих фармацевтических носителей описаны в «Remington's Pharmaceutical Sciences» E.W. Martin. Такие композиции могут содержать терапевтически эффективное количество нуклеиновой кислоты или белка, как правило, в очищенной форме, вместе с подходящим количеством носителя, так чтобы получать форму для надлежащего введения пациенту. Составы соответствуют способу введения.

Как правило, композиции для внутривенного введения представляют собой растворы в стерильном изотоническом водном буфере. При необходимости лекарственное средство может содержать также солюбилизирующее средство и местный анестетик, такой как лигнокаин, для облегчения боли в участке инъекции. Как правило, ингредиенты либо поставляют по отдельности, либо смешивают вместе в единичной дозированной форме, например, в форме сухого лиофилизированного порошка или концентрата в герметически закрытом контейнере, таком как ампула или саше, с указанием количества активного средства. Когда лекарственное средство предназначено для ввведения инфузией, его можно распределять в бутыли для инфузии, содержащей стерильную воду или солевой раствор фармацевтической степени очистки. Когда лекарственное средство вводят инъекцией, можно предоставлять ампулу стерильной воды для инъекций или солевого раствора, так чтобы ингредиенты можно было смешать перед введением.

Количество средства, которое является эффективным для лечения или профилактики злокачественной опухоли поджелудочной железы или яичников, можно определять общепринятыми клиническими способами. Кроме того, необязательно, можно применять анализы in vitro, чтобы помочь идентифицировать оптимальные диапазоны дозирования. Точная доза для применения в составе зависит также от способа введения и стадии злокачественной опухоли поджелудочной железы или яичников, и ее необходимо определять согласно решению практикующего специалиста и состояния каждого пациента. Эффективные дозы можно экстраполировать из кривых зависимости доза-ответ, полученных в тестовых системах in vitro или в модели на животных. Дозу можно формулировать в моделях на животных для достижения диапазона циркулирующих в плазме концентраций, включающего IC₅₀ (т.е., концентрацию тестируемого соединения, при которой достигают половины максимального ингибирования симптомов), как определено в культуре клеток.

Например, токсичность и терапевтическую эффективность средств можно определять в культурах клеток или на экспериментальных животных общепринятыми фармацевтическими способами для определения LD₅₀ (дозы, летальной для 50% популяции) и ED₅₀ (дозы, терапевтически эффективной для 50% популяции). Соотношение для дозы между токсическим и терапевтическим эффектами представляет собой терапевтический индекс, и его можно выражать как соотношение LD₅₀/ED₅₀. Средства, обладающие большими терапевтическими индексами, являются предпочтительными. Когда средство оказывает токсические побочные эффекты, можно использовать систему доставки, нацеливающую средство на участок пораженной ткани, для минимизации потенциального повреждения не экспрессирующих CD70 клеток и, таким образом, для уменьшения побочных эффектов.

Как правило, доза антитела, производного или ADC, вводимая пациенту с CD70-экспрессирующей злокачественной опухолью, обычно составляет 0,1 мг/кг-100 мг/кг массы тела индивида. Более конкретно, доза, вводимая индивиду, составляет 0,1 мг/кг-10 мг/кг массы тела индивида, даже более обычно, 0,1 мг/кг-5 мг/кг или 0,1 мг/кг-3 мг/кг массы тела индивида. Как правило, антитела человека обладают более длительным временем полужизни в организме человека, чем антитела из других видов, из-за иммунного ответа на чужеродные белки. Таким образом, часто возможны более низкие дозы ADC, содержащих гуманизированные, химерные антитела или антитела человека, и менее частое введение.

Антитела против CD70, производные и ADC можно вводить также в сочетании с одним или несколькими другими лекарственными средствами для лечения или профилактики злокачественной опухоли поджелудочной железы или яичников. Например, комбинированная терапия может включать второе цитостатическое или цитотоксическое средство (например, неконъюгированное цитостатическое или цитотоксическое средство, такое как средство, общепринятым образом используемое для лечения злокачественных опухолей). Комбинированная терапия может также включать, например, введение средства, нацеленного на рецептор или рецепторный комплекс, отличный от CD70, на поверхности CD70-экспрессирующих клеток злокачественных опухолей. Как правило, такое антитело или лиганд связывает рецептор на клеточной поверхности CD70-экспрессирующих клеток злокачественных опухолей и усиливает цитотоксический или цитостатический эффект антитела против CD70 доставкой цитостатического или цитотоксического сигнала к CD70-экспрессирующим клеткам злокачественных опухолей.

Другие лекарственные средства, которые можно вводить с средством, включают ингибиторы факторов роста или факторы анти-ангиогенеза. Например, лекарственное средство, называемое эрлотиниб, ингибитор тирозинкиназы рецепторов эпидермального фактора роста, можно использовать для лечения злокачественной опухоли поджелудочной железы на поздней стадии. (Bareschino et al., 2007, Ann Oncol. Suppl 6: 35-41.) Такое комбинированное введение может оказывать аддитивный или синергический эффект на параметры заболевания (например, тяжесть симптома, количество симптомов или частота обострений).

Настоящие способы можно комбинировать с другими способами лечения, такими как хирургическое вмешательство, радиотерапия, направленная терапия, иммунотерапия, использование ингибиторов факторов роста или факторов анти-ангиогенеза.

Хирургическая операция является предпочтительным лечением, и часто необходимо получение образца ткани для дифференциальной диагностики посредством гистологии. Улучшенную выживаемость приписывают более точному определению стадий заболевания и более высокой степени агрессивного хирургического удаления опухоли в брюшной полости. Тип хирургической операции зависит от того, насколько широко распространена злокачественная опухоль на время диагностики (стадия злокачественной опухоли), так же как от предполагаемого типа и степени злокачественности злокачественной опухоли.

Для пациентов, страдающих аденокарциномой поджелудочной железы, хирург может проводить процедуру Уиппла (называемую также панкреатодуоденэктомия). При этой процедуре головку поджелудочной железы и иногда тело поджелудочной железы удаляют вместе с частями желудка и тонкого кишечника, желчным пузырем, частью общего желчевыводящего протока и некоторыми близлежащими лимфатическими узлам. (См., например, Michalski et al., 2007, Nat. Clin. Pract. Oncol. 4(9):526-35). Для пациентов, страдающих эндокринными опухолями поджелудочной железы (опухолями островковых клеток), хирургическая операция является практически осуществимым вариантом. (См., например, Akerström and Hellman, 2007, Best Pract. Res. Clin. Endocrinol. Metab. 21(l):87-109).

У пациентов со злокачественной опухолью яичников хирург может удалить один (односторонняя оофорэктомия) или оба яичника (двусторонняя оофорэктомия), фаллопиевы трубы (сальпингэктомия) и матку (гистерэктомия). Для некоторых опухолей на очень ранней стадии, например, на стадии I, можно удалять только пораженный яичник и фаллопиеву трубу («односторонняя сальпинго-оофорэктомия», USO), особенно у молодых женщин, желающих сохранить фертильность. При злокачественной опухоли на поздней стадии, когда полное удаление невозможно, удаляют так много опухоли, насколько возможно (операция по уменьшению объема опухоли). В случаях, когда этот тип хирургической операции является успешным, прогноз улучшается по сравнению с пациентами, у которых оставлены большие опухолевые массы (более 1 см в диаметре). Минимально инвазивные хирургические способы могут облегчать безопасное удаление очень больших (более 10 см) опухолей с меньшими осложнениями хирургической операции. (См., например, Ehrlich et al., 2007, J. Pediatr. Surg. 42 (5): 890-3).

Химиотерапия относится к применению противораковых или цитотоксических лекарственных средств, чтобы убивать клетки злокачественных опухолей. Химиотерапию можно проводить пациенту до или после хирургической операции. В зависимости от гистологии опухоли, некоторые виды опухоли (в частности, тератома) являются нечувствительными к химиотерапии. Внутривенную химиотерапию такими лекарственными средствами, как, например, гемцитабин, 5-фторурацил, цисплатин или митомицин C, можно использовать для лечения злокачественной опухоли поджелудочной железы. Внутривенную химиотерапию, например, гемцитабином, топотеканом, доксорубицином, липосомным доксорубицином, карбоплатином, паклитакселом можно использовать для лечения злокачественной опухоли яичника. Химиотерапия, которая является частично внутривенной и частично внутрибрюшинной, также может улучшать медианное время выживаемости. (The Chemotherapy Source Book (3rd edition). Ed. Perry. Lippincott, Williams and Wilkins, 2001; Oxford Textbook of Palliative Medicine. (2nd Ed.) Derek Doyle et al. Oxford University Press. 1999).

Радиотерапия представляет собой обработку излучением с высокой энергией, таким как рентгеновское излучение, чтобы убить или уменьшить клетки злокачественных опухолей при нанесении настолько малого вреда, насколько возможно, нормальным клеткам. Радиоактивному излучению можно подвергать пациента до или после хирургической операции. Радиотерапию можно также использовать для лечения злокачественной опухоли поджелудочной железы, которая не распространилась, но которую нельзя удалить хирургически. Радиотерапию не часто используют для лечения злокачественной опухоли яичника, но иногда ее можно использовать, если это целесообразно. Комбинированную радиотерапию и химиотерапию можно использовать для пациентов, опухоли которых распространились слишком широко для хирургического удаления.

Антитело против CD70, производное или ADC можно вводить одновременно пациенту, подвергающемуся лечению хирургией, химиотерапией или радиотерапией. Альтернативно, пациента можно подвергать хирургическому вмешательству, химиотерапии или радиотерапии раньше или позже введения антитела против CD70, производного или ADC по меньшей мере на один час и вплоть до нескольких месяцев, например, по меньшей мере на один час, пять часов, 12 часов, сутки, неделю, месяц или три месяца, раньше или позже введения ADC или производного ADC.

VII. Наборы

Изобретение относится к диагностическим наборам для применения в вышеуказанных способах обнаружения. Наборы, как правило, содержат антитело или его фрагмент, специфически связывающие денатурированный CD70, применимые для обнаружения, как описано выше. Один или несколько дополнительных контейнеров могут содержать такие элементы, как реагенты или буферы, для использования в анализе. Такие наборы могут дополнительно или альтернативно содержать реагент для обнаружения, содержащий репортерную группу, подходящую для непосредственного или опосредованного обнаружения связывания антитела.

Кроме того, изобретение относится к фармацевтическим наборам для лечения злокачественных опухолей поджелудочной железы и яичников. Как правило, такие наборы содержат реагенты, составленные в виде терапевтической композиции, как описано в настоящем документе, и могут присутствовать в любой из множества форм, подходящих для размещения в наборе. Такие формы могут включать жидкость, порошок, таблетку, суспензию и подобный состав для предоставления таких средств, как антитела против CD70, производные или ADC. Наборы могут содержать также фармацевтически приемлемый разбавитель (например, стерильную воду) для инъекции, разведения или растворения лиофилизированного антитела, производного или ADC.

Кроме того, изобретение относится к комбинированным наборам для диагностики и терапии. Такие наборы, как правило, содержат по меньшей мере одно антитело, которое предпочтительно связывает денатурированный CD70 по сравнению с нативным CD70, для использования для обнаружения в фиксированных срезах ткани и другое антитело, которое связывает нативный CD70 по меньшей мере так же хорошо, если не лучше, чем денатурированный CD70, для применения для лечения.

Наборы, как правило, содержат также этикетку или инструкции для применения в способах обнаружения и/или лечения, описанных в настоящем документе. Этикетка или инструкция относится к любому письменному или записанному материалу, который прикреплен к набору или иным образом сопровождает набор в каждый момент времени на протяжении его изготовления, транспортировки, продажи или использования. Она может представлять собой информационное сообщение в форме, предписанной государственным учреждением, регулирующим изготовление, применение или продажу фармацевтических или биологических продуктов, где информационное сообщение отражает одобрение учреждением изготовления, применения или продажи для введения человеку. Этикетка или инструкция может включать также рекламные листовки и брошюры, упаковочные материалы, инструкции, аудио- или видеокассеты, компьютерные диски, так же как надписи, напечатанные непосредственно на фармацевтических наборах.

Изобретение дополнительно описано в следующих примерах, не предназначенных для ограничения объема изобретения. Линии клеток, описанные в следующих примерах, поддерживали в культуре, согласно условиям, определенным в Американской коллекции типовых культур (ATCC) или Немецкой коллекции микроорганизмов и культур клеток GmbH, Braunschweig, Germany (DMSZ). Реагенты для культивирования клеток получены от Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, или других поставщиков.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Получение моноклональных антител SG-21.1C1.B3 и SG-21.5D12.C3.

Моноклональные антитела SG-21.1C1.B3 и SG-21.5D12.C3 получены с использованием B-клеток из селезенки или лимфатических узлов, удаленных у мыши, которую несколько раз стимулировали иммуногеном, денатурированным внеклеточным доменом CD70 (CD70-ECD). Затем эти B-клетки сливали с опухолевыми клетками миеломы для получения гибридом. Большие количества моноклональных антител получали таким образом из этих гибридом. Гибридомы разводили для обеспечения клональности и выращивали.

Антитела из различных клонов тестировали по их способности связывать денатурированный антиген CD70 с помощью теста, такого как ELISA, с использованием Flag-CD70 или дифференциального скрининга FMAT (Applied Biosystems, Foster City, CA) с использованием фиксированных 293F, экспрессирующих CD70 яванского макака («cyno») и денатурированных клеток L540cy, экспрессирующих CD70. Нетрансфицированные клетки 293F и L540cy использовали в качестве отрицательного контроля. (Некоторые клетки L540cy являлись положительными по CD70).

Результаты показали, что более 100 гибридом тестированы как положительные по их способности связывать денатурированный CD70. Антитела из двух положительных гибридом, SG-21.1C1.B3 («1C1») и SG-21.5D12.C3 («5D12»), выбраны для иммуногистохимии.

Пример 2: Получение фиксированных формалином-погруженных в парафин (FFPE) образцов

Фиксированные формалином-погруженные в парафин ткани получали согласно общепринятым способам, как описано и закреплено Theory and Practice of Histotechnology, Second Edition. 1980, Sheehan, D.C. and Hrapchak, B.B., editors (Battelle Press (Columbus, OH). Chapter 3, pp. 59-78).

Получение клеток посредством FFPE являлось сходным с получением тканей. Кратко, клетки рассевали в подходящей культуральной среде при приблизительно 15000 клеток/лунку за 1 сутки перед фиксацией. Клетки фиксировали следующим образом: Клетки промывали 2X PBS и затем фиксировали 10% формалином при комнатной температуре в течение 45 минут. После этого клетки промывали 2x с помощью PBS и затем пермеабилизовали с помощью PBS+0,5% Тритон X-100 при комнатной температуре в течение 15 минут. Затем клетки промывали 1x с помощью PBS и сохраняли в PBS+0,02% азид натрия при 4°C. Перед скринингом FMAT PBS+азид удаляли, и планшет блокировали с помощью PBS+5% сыворотка козы при комнатной температуре в течение 30 минут.

Пример 3: Получение микромассивов тканей для иммуногистохимии

Микромассивы срезов тканей FFPE получали из коммерческих источников, включая US Biomax, TriStar или Cybrdi. Микромассивы тканей получали также согласно Yale Tissue Microassay Construction Protocols, Version 1.0, и более поздних обновлений.

Пример 4. Разработка моноклональных антител SG-21.1C1.B3 и SG-21.5D12.C3 в качестве реагентов для иммуногистохимии для образцов FFPE

A. Иммуногистохимическое тестирование клонов CD70

Экспрессирующую конструкцию, кодирующую CD70 яванского макака, получали клонированием полноразмерного гена CD70 яванского макака в экспрессирующий вектор. Этой конструкцией трансфицировали клетки 293F. Эти трансфицированные клетки 293F:CD70 служили положительным контролем для окрашивания антителами 1C1 и 5D12. Родительская линия клеток 293F служила отрицательным контролем. Для окрашивания тканей клетки 786-0, экспрессирующие CD70, служили положительным контролем.

Клетки и ткани фиксировали и погружали в парафиновый воск согласно способу, описанному в Примере 2. Окрашивание IHC и демаскировку антигенов проводили с использованием системы Vision BioSystems Bond-max™ (в настоящее время Leica Microsystems). Демаскировку антигенов проводили в течение 40 минут с использованием способа демаскировки ЭДТА. Альтернативно, демаскировку антигенов проводили с использованием системы демаскировки антигенов Trilogy (Cell Marque, Hot Springs, AR) при температуре 99-100°C в течение 1 часа.

Первичное антитело 1C1 или первичное антитело 5D12 оба сильно окрашивали все фиксированные 293F:CD70 трансфицированные клетки, где окрашивания не обнаруживали в родительских клетках 293. Результаты показывают также сильное окрашивание в клетках 786-0 (почечно-клеточная карцинома), где фоновое окрашивание обнаруживали в контрольном ксенотрансплантате Ramos.

Клон 1C1 далее субклонировали и отобрали субклон, 1C1-B3 (SG-21.1C1.B3). Подобным образом, 5D12 далее субклонировали и отобрали субклон, 5D12-C3 (SG-21.5D12.C3). Эти два субклона очищали и использовали как первичные антитела для образцов ксенотрансплантата 786-0 и ксенотрансплантата Ramos. Результаты показали, что субклонирование и очистка 1C1-B3 и 5D12-C3 удаляли фоновое окрашивание в ксенотрансплантате Ramos.

Гибридомы, продуцирующие антитела против CD70, депонированы в Американской коллекции типовых культур (ATCC) в 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209. Линия клеток, обозначенная SG-21.1C1.B3, продуцирующая антитело 1C1, имеющая инвентарный номер в ATCC PTA-8733, депонирована в ATCC 24 октября 2007 г.; линия клеток, обозначенная SG-21.5D12.C3, продуцирующая антитело 5D12, имеющая инвентарный номер в ATCC PTA-8734, депонирована в ATCC 24 октября 2007 г.

B. Вестерн-блоттинг с SG-21 антителами 1C1 и 5D12 по сравнению с антителом 2B3

Чтобы определить, детектируют ли SG-21 антитела 1C1 и антитела 5D12 CD70 в клетках и лизатах тканей, проводили эксперименты по Вестерн-блоттингу. Другое связывающее CD70 антитело, 2B3, также использовали для сравнения. Препараты мембран получали из клеток 786-0, клеток 293F:cynoCD70 (экспрессирующих cyno CD70) и клеток 293F в качестве отрицательного контроля. Для получения экстрактов мембран, клетки лизировали в гипотоническом буферном растворе и центрифугировали при 10000×g в течение 10 минут при 4°C для удаления дебриса. Затем супернатанты центрифугировали при 100000×g в течение 30 минут при 4°C для осаждения фракций мембраны. Фракции мембраны (осадок) растворяли в 0,5% NP40 в 50 мМ Трис плюс 150 мМ NaCl и 5 мМ ЭДТА. Всю подготовку проводили в присутствии ингибиторов протеаз, чтобы сохранить CD70 интактным. Количество белков измеряли при 570 нм с использованием набора с BCA (Pierce). CD70 ECD (внеклеточный домен CD70) и меченные Flag CD70-ECD получали также общепринятыми способами. Образцы белка денатурировали при 90°C в течение 3 минут и охлаждали на льду в течение 3 минут. Образцы разделяли с использованием SDS-PAGE и затем переносили на нитроцеллюлозную мембрану для обнаружения. Получали четыре идентичных SDS-PAGE геля и мембраны. Мембраны блокировали в PBS с 1% BSA и 2% обезжиренного молока с 0,05% Твином (полисорбатом). Затем каждое первичное антитело добавляли в раствор при 0,5 мкг/мл и обеспечивали инкубацию в течение 4 часов при комнатной температуре в PBS с 0,05% Твином. Мембраны отмывали и добавляли конъюгат вторичное антитело-фермент, распознающий первичное антитело, и инкубировали в течение 45 минут при комнатной температуре. Мембраны отмывали и инкубировали с хемилюминесцентным субстратом для обнаружения CD70.

Ссылаясь на Фигуру 1, результаты показывают, что SG-21 антитела 1C1 и антитела 5D12 обнаруживали CD70 в 786-0 и трансфектантах 293F:CD70, но не в отрицательном контроле - клетках 293F. Примечательно, что детектируемые полосы имели идентичный размер в 786-0 и трансфектантах 293F:CD70. Антитело SG-21 2B3 не обнаруживало CD70 в образцах 786-0 и 293:cynoCD70, но обнаруживало CD70ECD и flag-CD70-ECD. Результат показал, что антитела 1C1 и 5D12 обнаруживают CD70 в образцах.

C. Экспрессия CD70 в линиях клеток опухоли и линиях не-опухолевых клеток с использованием антитела SG21.1C1

Получали из коммерческих источников или изготавливали по заказу микромассивы тканей, содержащие образцы следующих злокачественных опухолей: карцинома молочной железы, карцинома яичников, мезотелиома, остеосаркома, карцинома предстательной железы, печеночно-клеточная карцинома, глиобластома, анапластическая астроцитома, злокачественная опухоль тела матки, эмбриональные злокачественные опухоли, эпидермоидная карцинома, множественная миелома, лимфома Ходжкина, не-T, не-B гистиоцитарная лимфома ALL, неходжкинская лимфома (NHL) лимфома Беркитта, фолликулярная лимфома NHL, острый миелоидный лейкоз (AML), анапластическая крупноклеточная лимфома (ALCL), эритролейкоз, карцинома ободочной кишки, немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), мелкоклеточный рак легкого (SCLC), почечно-клеточная карцинома (RCC), RCC светлоклеточного типа, RCC папиллярного типа, меланома, карцинома поджелудочной железы и карцинома мочевого пузыря. Использовали также следующие клетки или линии клеток: трансформированная вирусом Эпштейна-Барр лимфобластная B-клеточная линия (EBV-LCL), нормальные эпителиальные клетки молочной железы человека (HMEC), нормальные клетки эндотелия сосудов человека (HUVEC), нормальные мононуклеарные клетки крови (PBMC), нормальные клетки эндотелия аорты человека (HAEC), нормальные клетки эндотелия почки человека (HREC), нормальные клетки эндотелия микрососудов легкого человека (HMVEC-L), нормальные эндо-неонатальные клетки эндотелия микрососудов кожи человека (HMVEC-neo) и нормальные клетки эндотелия легочной артерии человека (HPAEC).

Микромассивы тканей иммунологически окрашивали с помощью антител SG21.1C1 с использованием описанного выше способа. Окрашивание наблюдали в следующих линиях клеток: линия клеток карциномы яичников SK-OV-3; линия клеток глиобластомы GMS-10; линии клеток множественной миеломы LB, LP-1, AMO-1, I-310 (MM.1R), C2E3 (MM.1S), MOLP-8, JJN-3 и L363; линии клеток ходжкинской лимфомы KMH2, HS445, RPMI-1666, L248 и HD-M-YZ; EBV- LCL WIL2-S, Farage и IM-9; NHL, фолликулярная линия клеток WSU-NHL; линии клеток RCC светлоклеточного типа Caki-1, Caki-2, 786-O и 769-P; линии клеток RCC папиллярного типа CAL54, A498; RCC SK-RC-6 и SK-RC-7; линии клеток меланомы A375M и A375SM, линия клеток карциномы поджелудочной железы PANC-1 и карциномы мочевого пузыря T24. Не идентифицированное окрашивание некоторых линий клеток являлось слабым или смешанным. Некоторые линии клеток обладали цитоплазматическим окрашиванием. Окрашивание линий клеток поджелудочной железы и яичников см. на Фигурах 2 и 3, соответственно.

D. Сравнительное окрашивание антителами 1C1 и 5D12

Антитела 1C1 и 5D12 сравнивали по окрашиванию линий клеток 293F, 293F-cynoCF0, RCC Caki-1, нормальных миндалин, скелетной мышцы, мочевого пузыря, лимфоидных тканей (лимфатического узла, тимуса, селезенки) нормального яванского макака, нормального тимуса человека, тканей почки и скелетных мышц и тканей опухолей поджелудочной железы. Способ иммунного окрашивания являлся таким, как описано выше.

Результаты показали, что 1C1 и 5D12 сходным образом окрашивали линии клеток 293F и 293-cyno CD70 (данные не представлены); RCC Caki-1 и ткани миндалин яванского макака (данные не показаны); лимфоидные ткани (лимфатического узла, тимуса, селезенки) от нормального яванского макака (данные не представлены) и ткани опухолей поджелудочной железы (см. Фигуру 4). Некоторое дифференциальное окрашивание 1C1 и 5D12 наблюдали в нормальных тканях скелетных мышц человека и обезьяны и нормальных тканях мочевого пузыря обезьяны, в которых 5D12 окрашивало ткани, а 1C1 - нет. Дифференциальное окрашивание наблюдали также в нормальных тканях тимуса и почки человека, в которых 5D12 окрашивало цитоплазму.

Пример 5: Экспрессия CD70 в тканях нормальной ободочной кишки и злокачественной опухоли ободочной и прямой кишки, и в тканях нормальной поджелудочной железы и злокачественной опухоли поджелудочной железы по антителу 1C1

До оценки полной панели тканей опухолей из различных типов злокачественных опухолей, экспрессию CD70 сначала оценивали в злокачественных опухолях ободочной кишки и поджелудочной железы. Способ иммунного окрашивания являлся таким, как описано в Примере 4. Хромоген, применяемый для этих исследований, представлял собой быстрый красный.

Результаты показывают, что в тканях нормальной ободочной кишки, только редкие лимфоциты являлись окрашенными положительно по CD70. Другие клети являлись отрицательными по CD70. В одном образце ткани злокачественной опухоли толстого кишечника, опухолевые клетки являлись окрашенными положительно. Во втором образце ткани ободочной кишки опухолевые клетки являлись отрицательными, но строма являлась положительной. Подобным образом, в нормальных тканях поджелудочной железы окрашивание являлось отрицательным по CD70. В одном образце тканей злокачественной опухоли поджелудочной железы, опухолевые клетки являлись положительными, а во втором образце опухолевые клетки являлись отрицательными, но строма являлась положительной. (См. Фигуру 5).

Пример 6: Экспрессия CD70 в тканях опухолей по антителу SG21.1C1

Ткани опухолей получали из следующих типов опухолей: ходжкинская лимфома, опухоли почки, лимфома, множественная миелома, опухоли поджелудочной железы, гортани/глотки, яичника, ободочной кишки и молочной железы. Нормальные и опухолевые ткани получали согласно способу массива тканей, описанному в Примере 3 и способ иммунного окрашивания являлся таким, как описано в Примере 4A. Антитело 1C1 использовали в качестве первичного антитела. Затем оценивали иммуногистохимическую (IHC) экспрессию на основании интенсивности окрашивания и процента вовлеченной опухоли. Интенсивность окрашивания распределяли по категориям от 1 до 4, где 1 обозначает минимальное окрашивание; 2 - слабое окрашивание; 3 - среднее окрашивание и 4 - сильное окрашивание. Процент вовлеченной опухоли также распределяли по категориям от 1 до 4, где 1 обозначает 0-5%; 2 - 5-25%; 3 - 25-75% и 4 - 75%-100%. Измерения являлись качественными. В случае ходжкинской лимфомы, IHC экспрессию CD70-положительных клеток анализировали на основании оценки клеток Рид-Штернберга. Клетки Рид-Штернберга представляют собой большие клетки неизвестного происхождения, обычно многоядерные, присутствие которых является общей гистологической характеристикой ходжкинской лимфомы.

Ткани опухоли ходжкинской лимфомы обладали наивысшим процентом (97% или 33/34) CF70-положительных опухолевых клеток из клеток во всех опухолях. Опухоль почки обладала вторым из наивысших процентом (70% или 14/20) CF70-положительных опухолевых клеток из клеток во всех опухолях. Лимфома обладала третьим из наивысших процентом (61% или 72/119) CD70-положительных опухолевых клеток из клеток во всех опухолях. Множественная миелома обладала четвертым из наивысших процентом (42% или 13/31) CF70-положительных опухолевых клеток из клеток во всех опухолях. Злокачественная опухоль поджелудочной железы обладала пятым из наивысших процентом (25% или 35/140) CF70-положительных опухолевых клеток из клеток во всех опухолях.

На фигуре 6 проиллюстрирован график интенсивности окрашивания и % окрашивания опухоли для 35 из 140 образцов поджелудочной железы, дающих положительный сигнал для CD70. На фигуре показана сложная взаимосвязь между интенсивностью окрашивания и процентом окрашивания опухоли. А именно, некоторые опухоли обладают высоким процентом окрашивания клеток, но при низкой интенсивности, другие обладают низким процентом окрашивания клеток, но при высокой интенсивности, а для других показаны промежуточные интенсивность окрашивания и процент окрашивания клеток. Злокачественная опухоль гортани/глотки обладала шестым из наивысших процентом (22% или 18/82) CF70- положительных опухолевых клеток из клеток во всех опухолях. Злокачественная опухоль яичника обладала седьмым из наивысших процентом (15% или 37/241) CF70-положительных опухолевых клеток из клеток во всех опухолях.

На фигуре 7 проиллюстрированы интенсивность окрашивания и процент окрашивания опухоли для 37 из 241 окрашенных по CD70 злокачественных опухолей яичников. Присутствовала некоторая ассоциация между интенсивностью окрашивания и процентом окрашивания клеток. Злокачественная опухоль ободочной и прямой кишки обладала седьмым из наивысших процентом (9% или 17/194) CF70-положительных опухолевых клеток из клеток во всех опухолях. Злокачественная опухоль молочной железы обладала наименьшим процентом (2% или 5/204) CF70-положительных опухолевых клеток из клеток во всех опухолях.

В итоге на основании CD70-положительных опухолей/всех опухолей, интенсивность окрашивания (экспрессия мишени в клетках), процент вовлечения CD70-положительной опухоли (экспрессия мишени в опухоли), общее распределение показателей для типов опухолей следующее: ходжкинская > опухоль почки > лимфома > множественная миелома > опухоль поджелудочной железы > опухоль гортани/глотки > опухоль яичников > опухоль ободочной и прямой кишки > опухоль молочной железы. Результаты для всех тканей опухолей показаны в Таблице 1.

Таблица 1 Экспрессия CD70 в различных злокачественных опухолях
Тип опухоли	CD70+/Всего	% CD70+
Ходжкинская	33/34	97
Опухоль почки	204/283	72
Лимфома	72/119	61
Множественная миелома	13/31	42
Опухоль поджелудочной железы	35/140	25
Опухоль гортани/глотки	18/82	22
Опухоль яичников	37/241	15
Опухоль кожи	4/30	13
Опухоль легких (все)	40/475	8
Аденокарцинома легких	17/172	10
Опухоль ободочной кишки	17/194	9
Опухоль молочной железы	5/204	2

Пример 7: Для конъюгатов h1F6-лекарственное средство показана эффективность для линии клеток карциномы яичников

Для подтверждения эффективности конъюгатов известного антитела против CD70 с лекарственным средством против характерных линий клеток для этих новых опухолей клетки SKOV-3 получали и тестировали, как в общем описано ранее для других линий клеток. (См. Международную публикацию патента WO 2006-113909.) Клетки инкубировали со следующими конъюгатами антитела против CD70 с лекарственным средством: h1F6-vc-MMAF(4), h1F6vc-MMAE(4), 1F6mc-MMAF(4), или h1F6mc-MMAF(8) или свободным MMAF. (См. описание линкеров с лекарственным средством в описании и Публикации патентных заявок США No. 2005-0238649 и 2006-0233794. Номер в скобках после каждого конъюгата показывает среднюю нагрузку лекарственного средства на антитело.) Клетки SKOV-3 инкубировали с конъюгатами при указанных концентрациях в течение 96 часов. Для этих исследований жизнеспособность определяли с использованием Promega CelltiterGlo.

Таблица 2
h1F6vc-MMAF(4)	h1F6vc-MMAE(4)	h1F6mc-MMAF(4)	h1F6mc-MMAF(8)	MMAF
5 нг/мл	60 нг/мл	29 нг/мл	12 нг/мл	18 нМ

Ссылаясь на Фигуру 8, все четыре анти-CD70 ADC являлись активными против этой линии клеток злокачественной опухоли яичников. Ссылаясь на Таблицу 2, показаны IC50. Эти IC50 согласуются с опубликованными для других линий клеток CD70-экспрессирующей злокачественной опухоли. Эти результаты подтверждают, что анти-CD70 ADC, связавшийся с CD70 на этой линии клеток злокачественной опухоли, интернализуется и высвобождает нагруженный ауристатин.

Пример 8: Для конъюгатов h1F6-лекарственное средство показана эффективность для трансфицированной CD70 линии клеток карциномы поджелудочной железы

Для подтверждения эффективности конъюгатов известного антитела против CD70 с лекарственным средством против репрезентативных линий клеток, линии клеток поджелудочной железы HPAFII, PANC-1 и MiaPaCa-2 трансфицировали нуклеиновой кислотой, кодирующей модифицированный CD70 яванского макака. Клетки MiaPaCa-2 не экспрессируют поддающиеся обнаружению уровни белка CD70. h1F6 связывает нативный белок CD70, экспрессируемый этими трансфицированными линиями клеток. Экспрессию CD70 этими трансфицированными линиями клеток подтверждали анализом FACS (данные не представлены). Активность h1F6 mc-MMAF(4) (SGN-75) тестировали на трансфицированных линиях клеток поджелудочной железы, как в общем описано ранее для других линий клеток. (См. Пример 7 Международной публикации патента WO 2006-113909.) (Номер в скобках после конъюгата показывает среднюю нагрузку лекарственного средства на антитело.) Ссылаясь на Фигуры 9A-C, клетки инкубировали с конъюгатом при указанных концентрациях в течение 96 часов. Ссылаясь на Фигуру 9A, показана активность конъюгата на трансфицированных клетках HPAFII. Жизнеспособность клеток определяли с использованием Promega CelltiterGlo. Ссылаясь на Фигуры 9B и 9C, показана активность конъюгата на трансфицированных линиях клеток PANC-1 и MiaPACa-2. Для этих исследований жизнеспособность определяли с использованием резазурина, как описано ранее. Активность PANC-1 с Promega CelltiterGlo. Для конъюгата показали цитотоксическую активность на всех этих линиях клеток in vitro.

Пример 9: Для конъюгатов h1F6-лекарственное средство показана эффективность на модели ксенотрансплантата злокачественной опухоли поджелудочной железы

Самкам мышей nude (nu/nu) (7 животных/группу) имплантировали фрагменты CD70-трансфицированной опухоли MiaPaCa (полученной, как описано в Примере 8) посредством троакара в правый бок. Дозирование либо SGN-75, либо несвязывающего контрольного ADC (3 мг/кг) начинали, когда опухоли достигали 100 мм³ (q4d×4 ip). Объемы опухолей контролировали, и животных подвергали эвтаназии, когда объем опухоли достигал 1000 мм³. Ссылаясь на Фигуру 10, данные наносили на график 2 способами: A. Графики медианного объема опухолей продолжали для каждой группы, пока одно или нескольких животных не подвергали эвтаназии. B. Кривая Каплана-Мейера показывает время для достижения опухолью 800 мм³ для индивидуальных животных в каждой группе. Лечение с помощью SGN-75 являлось эффективным в этой модели ксенотрансплантата.

Объем настоящего изобретения не ограничен конкретными вариантами осуществления, описанными в настоящем документе. Различные модификации изобретения в дополнение к описанным в настоящем документе очевидны специалистам в данной области из предшествующего описания и сопутствующих фигур. Такие модификации предназначены, чтобы попадать в объем прилагаемой формулы изобретения. Если из контекста не очевидно иное, любую стадию, элемент, вариант осуществления, признак или аспект по изобретению можно применять в сочетании с любым другим. Полное содержание всех патентных заявок и научных публикаций, инвентарных номеров и тому подобное, на которые ссылаются в этой заявке, таким образом приведено в качестве ссылки для всех целей в той же степени, как если бы это упоминали отдельно.

1. Моноклональное антитело, которое специфически связывается с денатурированным CD70 человека, экспрессируемым в образце клеток или тканей человека, где образец клеток или тканей человека фиксирован формалином и погружен в парафин, где антитело получено с помощью денатурированного белка CD70 человека.

2. Антитело по п. 1, которое представляет собой антитело SG-21.1C1, продуцируемое гибридомой, депонированной в АТСС под номером РТА-8733, или антитело SG-21.5D12, продуцируемое гибридомой, депонированной в АТСС под номером РТА-8734.

3. Способ детекции экспрессии CD70 в образце ткани пациента, предусматривающий
получение образца ткани поджелудочной железы, яичника, легкого, гортани, глотки, молочной железы, почки, мозга, толстой кишки, крови или кожи от пациента;
фиксацию образца ткани и денатурацию CD70 в образце ткани;
приведение фиксированного образца ткани в контакт с антителом по п. 1 или 2; и
обнаружение связывания антитела с фиксированным образцом ткани для определения экспрессии CD70 в образце;
где экспрессия CD70 на фиксированном образце ткани указывает на вероятность того, что у пациента имеется экспрессирующая CD70 злокачественная опухоль.

4. Способ по п. 3, дополнительно предусматривающий
(а) диагностику злокачественной опухоли у пациента на основании экспрессии CD70 в образце по сравнению с образцом контрольной ткани; или
(b) прогнозирование наличия злокачественной опухоли у пациента на основании экспрессии CD70 в образце по сравнению с образцом контрольной ткани; или
(c) определение способа лечения для пациента, где детектируемая экспрессия CD70 является показанием для того, чтобы протокол лечения включал введение антител против CD70 или конъюгата “антитело - лекарственное средство”.

5. Способ диагностики пациента со злокачественной опухолью поджелудочной железы, яичников, легкого, гортани, глотки, молочной железы или кожи, с глиобластомой, множественной миеломой, лимфомой Ходжкина, неходжкинской лимфомой, карциномой клеток почек, карциномой толстой и прямой кишки или карциномой мочевого пузыря, предусматривающий определение экспрессии CD70 в клетках образца поджелудочной железы, яичников, легкого, гортани, глотки, молочной железы, почки, мозга, толстой кишки, крови или кожи пациента, используя антитело по п. 1 или 2, где наличие детектируемой экспрессии CD70 используют для диагностики.