Аттенуированный холодоадаптированный штамм вируса гриппа а/рr/8/59/m2 (h1n1), предназначенный для получения вакцинных штаммов вируса гриппа в качестве донора аттенуации, вакцинные штаммы вируса гриппа а/59/м2/калифорния/66/2211 (н2n2) и а/59/м2/токио/67/22111 (н2n2)
Владельцы патента RU 2556833:
Учреждение Российской Академии Медицинских Наук Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Северо-западного отделения РАМН (НИИЭМ СЗО РАМН) (RU)
Изобретения касаются штаммов вируса гриппа A/PR/8/59/M2 (H1N1), A/Калифорния/1/66 (H2N2) и A/Токио/3/67 (H2N2). Вакцинные штаммы A/59/M2/Калифорния/66/2211 (H2N2) и A/59/M2/Токио/67/22111 (H2N2) - реассортанты, полученные путем скрещивания эпидемических вирусов A/Калифорния/1/66 (H2N2) и А/Токио/3/67 (H2N2) с холодоадаптированным температурочувствительным вирусом A/PR/8/59/M2 (H1N1). Штаммы A/59/M2/Калифорния/66/2211 (H2N2) и A/59/M2/Токио/67/22111 (H2N2) характеризуются температурочувствительностью, холодоадаптированностью, безвредностью и иммуногенностью для лабораторных животных. Реассортанты унаследовали два гена, кодирующие поверхностные антигены вируса (гемагглютинин и нейраминидазу), от эпидемического вируса и остальные шесть генов, кодирующие негликозилированные белки, от донора аттенуации A/PR/8/59/M2 (H1N1). Представленные изобретения могут быть использованы при получении живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и детей. 3 н.п. ф-лы, 2 ил., 4 табл., 1 пр.
Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в здравоохранении. Создан донор аттенуации для получения вакцинных штаммов живой гриппозной вакцины для профилактики гриппа (Ortomyxoviridae, род Influenza) подтипа A(H2N2) среди взрослых и детей в случае его возвращения в циркуляцию. Также получены два вакцинных штамма вируса гриппа подтипа A(H2N2) - А/59/М2/Калифорния/66/2211 (H2N2) и А/59/М2/Токио/67/22111 (H2N2) на основе заявляемого донора аттенуации.
Известен донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) для получения безвредных живых интраназальных вакцин для взрослых [Александрова Г.И., Климов А.И. Живая вакцина против гриппа. - СПб.: Наука.- 1994.-151 с]. Указанный штамм А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) по антигенным свойствам близок к вирусам A(H2N2), циркулировавшим в 1957-1968 годах, и при подготовке вакцинных штаммов A(H2N2) методом классической реассортации возникают методические сложности, т.к. гипериммунная сыворотка к донору А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) перекрестно реагирует с эпидемическими A(H2N2) вирусами, не позволяя образоваться реассортантам.
Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение нового донора аттенуации с антигенной структурой, отличной от A(H2N2).
Такой штамм был создан в результате тщательного изучения многочисленных вариантов объектов исследования, это - донор аттенуации A/PR/8/59/M2 (H1N1). Прототипом полученного штамма A/PR/8/59/M2 (H1N1) явился известный донор аттенуации A/PR/8/59/1 (H1N1) [Egorov AYu, Medvedeva ТЕ, Polezhaev Fl, et al. Peculiarities of obtaining and characterization of a cold-adapted A/PR/8/34 influenza virus variant // Acta Virol.- 1984.- Vol.28.- No.1.- Р.19-25]. Причиной создания нового донора было следующее (недостатки известного штамма): прототип A/PR/8/59/1 (H1N1) является устойчивым к химиопрепаратам адамантанового ряда (амантадин, ремантадин).
Из литературы известно, что устойчивость вирусов гриппа типа А к адамантанам развивается в результате единичной мутации в любой из следующих позиций аминокислот в М2 белке: 26 (лейцин), 27 (валин), 30 (аланин), 31 (серии) или 34 (глицин) [Belshe RB, Smith МН, Hall СВ, et al. Genetic basis of resistance to rimantadine emerging during treatment of influenza virus infection // J Virol.- 1988.-Vol.62.- P.1508-1512; D.M. Weinstock and G. Zuccotti. Adamantane Resistance in Influenza A // JAMA.- 2006.- Vol.295, No.8, Р.934-936]. По данным полногеномного секвенирования, прототип A/PR/8/59/1 (H1N1) является устойчивым к адамантанам благодаря наличию аминокислот треонина и аргинина в позициях 27 и 31 М2 белка соответственно.
Устойчивость к данным препаратам ограничивает использование вакцинного штамма вируса на его основе для массовой иммунизации населения, поскольку именно ремантадин является наиболее легкодоступным средством для лечения гриппозной инфекции в случае возникновения непредвиденной реакции на вакцинацию.
Для устранения этого недостатка необходимо было модифицировать донор аттенуации A/PR/8/59/1 (H1N1) путем внесения двух мутаций в М2 белок вируса: замена треонина (Thr) на валин (Val) и аргинина (Аrg) на серии (Ser) в позициях 27 и 31 соответственно.
Новый донор аттенуации A/PR/8/59/M2 (H1N1) был получен генно-инженерным путем после модификации набора плазмид, несущих полноразмерные ДНК-копии восьми сегментов «дикого» вируса A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) [Hoffmann, Е., Neumann, G., Hobom, G., et al. "Ambisense" approach for the generation of influenza A virus: vRNA and mRNA synthesis from one template // Virology.- 2000. -Vol.267.- No.2.- P.310-317; Subbarao, K., Chen, H., Swayne, D. et al. Evaluation of a genetically modified reassortant H5N1 influenza A virus vaccine candidate generated by plasmid-based reverse genetics // Virology.- 2003.- Vol.305.- No.1.- Р.192-200]. Полученный штамм A/PR/8/59/M2 (H1N1) по аминокислотной последовательности внутренних генов идентичен вирусу A/PR/8/59/1 (H1N1), за исключением М2 белка, в который были внесены две мутации (Thr-27-Val и Arg-31-Ser), отвечающие за его адамантан-чувствительность.
Известно, что штамм A/PR/8/59/1 (H1N1) является аттенуированным для людей, так как обладает свойствами температурочувствительности и холодоадаптированности [Александрова Г.И., Климов А.И. Живая вакцина против гриппа. - СПб.: Наука.- 1994.-151 с]. Полученный нами донор A/PR/8/59/M2 (H1N1) также обладает признаками температурочувствительности и холодоадаптированности. Поэтому новый донор также является аттенуированным для человека.
Пример выполнения
Штамм A/PR/8/59/M2 (H1N1) был получен с использованием методов обратной генетики, которые включали в себя следующее. Была определена нуклеотидная последовательность шести внутренних генов известного донора A/PR/8/59/1 (H1N1) с использованием автоматического секвенатора. Далее полученный сиквенс сравнивался с нуклеотидной последовательностью генов вируса A/PR/8/34 (H1N1), клонированных в векторы для обратной генетики [Hoffmann, Е., Neumann, G., Hobom, G., et al. "Ambisense" approach for the generation of influenza A virus: vRNA and mRNA synthesis from one template // Virology.- 2000. -Vol.267.- No.2.- Р.310-317].
Найденные аминокислотные различия представлены в Таблице 1. С помощью целенаправленного точечного мутагенеза были модифицированы шесть генов вируса A/PR/8/34 (H1N1) таким образом, чтобы их аминокислотная последовательность стала идентичной вирусу A/PR/8/59/1 (H1N1). Далее в М ген были внесены дополнительные мутации AC-792,793-GT и A-805-G, отвечающие за адамантан-чувствительность вируса. Мутагенез ДНК-копий генов вируса A/PR/8/34 (H1N1) проводили при использовании набора для мутагенеза «QuikChange XL Multi site-directed mutagenesis kit» (Stratagene, La Jolla, Калифорния, США) согласно инструкциям производителя.
Новый донор аттенуации A/PR/8/59/M2 (H1N1) был получен в результате трансфекции линии клеток 293Т набором из восьми плазмид: шесть модифицированных плазмид, несущих внутренние гены вируса A/PR/8/59/1 (H1N1), и две плазмиды, несущие гены гемагглютинина и нейраминидазы вируса A/PR/8/34 (H1N1). Далее полученный вирус накапливали в 10-дневных развивающихся куриных эмбрионах при оптимальных условиях: 33°С, 48 часов.
Используя метод полногеномного секвенирования вируса гриппа, была определена полная нуклеотидная последовательность штамма A/PR/8/59/M2 (H1N1), что подтвердило идентичность аминокислотной последовательности его внутренних генов исходному вирусу A/PR/8/59/1 (H1N1), за исключением двух позиций в М2-белке (Val-27 и Ser-31).
Нуклеотидная последовательность генов гемагглютинина и нейраминидазы была идентична вирусу A/PR/8/34 (H1N1).
Новый донор аттенуации A/PR/8/59/M2 (H1N1) характеризуется признаками температурочувствительности и холодоадаптированности, характерными для исходного вируса A/PR/8/59/1 (H1N1). Он обладает пониженным уровнем репродукции в куриных эмбрионах при 39°С (RCT39, разница в активностях репродукции клона при 33°С и 39°С составляет 6,4 lg ЭИД50/0,2 мл), и активно размножается при температуре 26°С (RCT26, разница в репродукциях при 33°С и 26°С составляет 2,3 lg ЭИД50/0,2 мл). Таким образом, по этим двум признакам модифицированный донор не отличается от исходного донора аттенуации A/PR/8/59/1 (H1N1) (Таблица 2).
Аттенуацию нового донора оценивали по интенсивности его репродукции в респираторном тракте (носовых ходах и легких) мышей линии СВА в сравнении с исходным вирусом A/PR/8/59/1 (H1N1) и вирусом «дикого» типа A/PR/8/34 (H1N1). Репродукция в носовых ходах мышей всех исследованных вирусов колебалась в пределах 3.9-5.3 lg ЭИД50/мл.
«Дикий» вирус активно репродуцировался в легких. Отмечен сниженный уровень репродукции в легких мышей донора аттенуации A/PR/8/59/M2 (H1N1) и его прототипа по сравнению с «диким» вирусом (1,5 Ig ЭИД50/мл против 6,8 Ig ЭИД50/мл соответственно) (Таблица 2). Снижение уровня репродукции вируса гриппа в легких мышей более чем в 10000 раз по сравнению с «диким» вирусом является весьма существенным для созданного донора.
Чувствительность нового донора аттенуации A/PR/8/59/M2 (H1N1) к препаратам адамантанового ряда оценивали путем титрования вируса в культуре клеток MDCK в присутствии или отсутствии в ростовой среде производного адамантана - ремантадина (0,5 или 5,0 мкг/мл). Титр вируса выражали в Ig TCID50/мл, при этом чувствительность вируса к ремантадину оценивали по степени снижения титра вируса в присутствии ремантадина по сравнению с титром вируса без препарата. В качестве контрольного адамантан-устойчивого вируса брали «дикий» штамм вируса гриппа A/PR/8/34 (H1N1).
Из таблицы 3 видно, что добавление ремантадина к новому донору аттенуации A/PR/8/59/M2 (H1N1) приводило к существенному снижению титра вируса в культуре клеток MDCK. Так, добавление рементадина в концентрации 0,5 мкг/мл снижало титр вируса на 1,8 Ig TCID50, а увеличение концентрации препарата до 5,0 мкг/мл привело к снижению титра вируса на 2,3 Ig TCID50, т.е. в 200 раз.
Контрольный вирус A/PR/8/34 (H1N1) не проявлял чувствительности к ремантадину, сохраняя высокий титр даже в присутствии 5,0 мкг/мл препарата.
Таким образом, заявляемый штамм A/PR/8/59/M2 (H1N1) по своим характеристикам соответствует требованиям, предъявляемым к донорам аттенуации для живой гриппозной вакцины.
Штамм A/PR/8/59/M2 (H1N1) депонирован 10.03.2011 года в Государственной коллекции Роспотребнадзора возбудителей вирусных инфекций, риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» под № V-654.
Прототипом полученных на основе нового донора аттенуации A/PR/8/59/M2 (H1N1) вакцинных штаммов является известный холодоадаптированный штамм вируса гриппа A/Москва/21/17/65 (H2N2), входивший в состав живой гриппозной вакцины для детей в 1967 году [Александрова Г.И., Микуцкая Б.А., Сиротенко Е.А. и др. Итоги изучения специализированного варианта живой гриппозной вакцины для иммунизации детей дошкольного и младшего школьного возраста // Вестник АМН СССР. - 1968. - №9. - С.41-45]. Данный вакцинный штамм был приготовлен серийными пассажами при сниженной температуре эпидемического вируса, выделенного в 1965 году.
Однако в последние годы циркуляции (1966-1967) вирусы H2N2 претерпели значительные антигенные изменения, и вакцинный штамм А/Москва/21/17/65 (H2N2) в случае возвращения в человеческую популяцию вирусов, циркулировавших в конце H2N2 волны, не сможет вызвать защитную реакцию у привитых людей [Lindstrom SE, Сох NJ, Klimov A. Genetic analysis of human H2N2 and early H3N2 influenza viruses, 1957-1972: evidence for genetic divergence and multiple reassortment events // Virology.- 2004.- Vol.328.- p.101-119].
Известно, что в конце эпидемического цикла H2N2 циркулирующие вирусы разделились на две ветви, значительно различающиеся по антигенным свойствам.
Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение потенциально пандемических вакцинных штаммов для взрослых и детей с антигенной структурой вирусов H2N2, действовавших в конце эпидемического цикла - вирусов А/Калифорния/1/66 (H2N2) и А/Токио/3/67 (H2N2), принадлежащих к двум разным ветвям вирусов H2N2 конца эпидемической волны 1966-1967 гг.
Вакцинный штамм вируса гриппа А/59/М2/Калифорния/66/2211 (H2N2) получен методом генетической реассортации эпидемического вируса А/Калифорния/1/66 (H2N2) с холодоадаптированным температурочувствительным донором аттенуации A/PR/8/59/M2 (H1N1), с последующей селекцией при пониженной до 26°С температуре инкубации в присутствии антисыворотки к донору аттенуации.
Вакцинный штамм А/59/М2/Калифорния/66/2211 (H2N2) является температурочувствительным (разность в показателях инфекционной активности при температуре инкубации 33°С и 39°С составляет 7,5 lg ЭИД50/0,2 мл) и холодоадаптированным (разность в показателях инфекционной активности при температуре инкубации 33°С и 26°С равна 3,1 lg ЭИД50/0,2 мл).
Ответственный за антигенную специфичность поверхностный белок вакцинного штамма - гемагглютинин (НА) - в РТГА идентичен вирусу А/Калифорния/1/66 (H2N2), антисывороткой к которому полностью нейтрализуется.
Методом полногеномного секвенирования установлено, что вакцинный штамм А/59/М2/Калифорния/66/2211 (H2N2) унаследовал шесть генов, кодирующих внутренние белки (РВ1, РВ2, PA, NP, М, NS), от донора аттенуации A/PR/8/59/M2 (H1N1), а поверхностные белки гемагглютинин и нейраминидазу (NA) от эпидемического вируса А/Калифорния/1 /66 (H2N2).
Таким образом, представленный вакцинный штамм А/59/М2/Калифорния/66/2211 (H2N2) характеризуется сочетанием полезных признаков, необходимых вакцинному штамму: антигенной специфичностью эпидемического вируса А/Калифорния/1/66 (H2N2), структурой генома, оптимальной для реассортантных вакцинных штаммов, температурочувствительностью и холодоадаптированностью, что коррелирует с аттенуацией для человека, характерной для донора аттенуации.
Морфология штамма - полиморфная, типичная для вируса гриппа.
ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММА
Инфекционная активность при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 33-34°С в течение 48 часов - 9,2 lg ЭИД50/МЛ. Гемагглютинирующая активность -1:1024.
Штамм проявляет генетическую стабильность биологических признаков после 5 пассажей на куриных эмбрионах (при использовании больших заражающих доз).
Пример получения вакцинного штамма А/59/М2/Калифорния/66/2211 (H2N2) представлен в прилагаемом паспорте.
Штамм депонирован в коллекции Института вирусологии им. Д.И.Ивановского под №2652.
ПАСПОРТ ШТАММА
1. Название штамма А/59/М2/Калифорния/66/2211 (H2N2).
2. Серия: серия 1 (первая).
3. Метод получения - реассортация; характеристика родительских вирусов:
а) эпидемический вирус-А/Калифорния/1/66 (H2N2);
б) донор аттенуации: A/PR/8/59/M2 (H1N1).
4. Количество пассажей: 5 в процессе реассортации.
5. Характеристика штамма до лиофилизации:
а) оптимальные условия репродукции: 33°С, 48 часов;
б) гемагглютинирующая активность: 1:1024;
в) инфекционная активность: 8.5 lg ЭИД50/0,2 мл;
г) чувствительность к ингибиторам: ингибитороустойчивый в РТГА с нормальной сывороткой крови лошади и морской свинки;
д) разность в показателях инфекционной активности при 33°С / 39°С: 7,5 lg ЭИД50/0,2 мл;
е) разность в показателях инфекционной активности при 33°С / 26°С: 3,1 lg ЭИД50/0,2 мл;
ж) структура генома реассортанта по данным частичного секвенирования генов:
гены от эпидемического вируса: НА, NA;
гены от донора аттенуации: РВ2, РВ1, PA, NP, М, NS.
6. Антигенная специфичность гемагглютинина:
гемагглютинин в РТГА идентичен вирусу А/Калифорния/1 /66 (H2N2), крысиной антисывороткой к которому полностью нейтрализуется. Антигенная специфичность нейраминидазы:
нейраминидаза идентична А/Калифорния/1/66 (H2N2) по данным полного секвенирования генов.
7. Характеристика штамма после лиофилизации:
а) дата лиофилизации - 25 апреля 2011 г.;
б) объем материала в ампуле - 1,0 мл;
в) инфекционная активность - 7,7 lg ЭИД50/0.2 мл;
8. Бактериологический контроль: дата учета - 1 июня 2011 года, результат - стерилен.
9. Безвредность для мышей и морских свинок при подкожном и внутрибрюшинном введении: безвреден.
Вакцинный штамм А/59/М2/Токио/67/22111 (H2N2) получен методом генетической реассортации эпидемического вируса А/Токио/3/67 (H2N2) с холодоадаптированным температурочувствительным донором аттенуации A/PR/8/59/M2 (H1N1) с последующей селекцией при пониженной до 26°С температуре инкубации в присутствии антисыворотки к донору аттенуации.
Вакцинный штамм А/59/М2/Токио/67/22111 (H2N2) является температурочувствительным (разность в показателях инфекционной активности при температуре инкубации 33°С и 39°С составляет 6,9 lg ЭИД50/мл) и холодоадаптированным (разность в показателях инфекционной активности при температуре инкубации 33°С и 26°С равна 3,2 lg ЭИД50/мл).
Ответственный за антигенную специфичность поверхностный белок вакцинного штамма - гемагглютинин (НА) - в РТГА идентичен вирусу А/Токио/3/67 (H2N2), антисывороткой к которому он полностью нейтрализуется.
Методом полногеномного секвенирования установлено, что вакцинный штамм А/59/М2/Токио/67/22111 (H2N2) унаследовал шесть генов, кодирующих внутренние белки (РВ1, РВ2, PA, NP, М, NS), от донора аттенуации A/PR/8/59/M2 (H1N1), а поверхностные белки гемагглютинин и нейраминидазу (NA) от эпидемического вируса А/Токио/3/67 (H2N2).
Таким образом, представленный вакцинный штамм А/59/М2/Токио/67/22111 (H2N2) характеризуется сочетанием полезных признаков, необходимых вакцинному штамму: антигенной специфичностью эпидемического вируса А/Токио/3/67 (H2N2), структурой генома, оптимальной для реассортантных вакцинных штаммов, температурочувствительностью и холодоадаптированностью, что коррелирует с аттенуацией для человека, характерной для донора аттенуации.
Морфология штамма - полиморфная, типичная для вируса гриппа.
ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММА
Инфекционная активность при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 33-34°С в течение 48 часов - 9,0 lg ЭИД50/мл. Гемагглютинирующая активность -1:1024.
Штамм проявляет генетическую стабильность биологических признаков после 5 пассажей на куриных эмбрионах (при использовании больших заражающих доз).
Пример получения вакцинного штамма А/59/М2/Токио/67/22111 (H2N2) представлен в прилагаемом паспорте.
Штамм депонирован в коллекции Института вирусологии им. Д.И.Ивановского под №2653.
ПАСПОРТ ШТАММА
1. Название штамма А/59/М2/Токио/67/22111 (H2N2).
2. Серия: серия 1 (первая).
3. Метод получения - реассортация; характеристика родительских вирусов:
а) эпидемический вирус - А/Токио/3/67 (H2N2);
б) донор аттенуации: A/PR/8/59/M2 (H1N1).
4. Количество пассажей: 5 в процессе реассортации.
5. Характеристика штамма до лиофилизации:
а) оптимальные условия репродукции: 33°С, 48 часов;
б) гемагглютинирующая активность: 1:1024;
в) инфекционная активность: 8.8 lg ЭИД50/0,2 мл;
г) чувствительность к ингибиторам: ингибиторочувствительный в РТГА с нормальной сывороткой крови лошади и морской свинки;
д) разность в показателях инфекционной активности при 33°С / 39°С: 6,9 lg ЭИД50/0,2 мл;
е) разность в показателях инфекционной активности при 33°С / 26°С: 3,2 lg ЭИД50/0,2 мл;
ж) структура генома реассортанта по данным частичного секвенирования генов:
гены от эпидемического вируса: НА, NA;
гены от донора аттенуации: РВ2, РВ1, PA, NP, М, NS.
6. Антигенная специфичность гемагглютинина:
гемагглютинин в РТГА идентичен вирусу А/Токио/3/67 (H2N2), крысиной антисывороткой к которому полностью нейтрализуется. Антигенная специфичность нейраминидазы:
нейраминидаза идентична вирусу А/Токио/3/67 (H2N2) по данным полного секвенирования генов.
7. Характеристика штамма после лиофилизации:
а) дата лиофилизации - 25 апреля 2011 г.;
б) объем материала в ампуле -1,0 мл;
в) инфекционная активность - 7,5 lg ЭИД50/0.2 мл;
8. Бактериологический контроль: дата учета - 1 июня 2011 года, результат - стерилен.
9. Безвредность для мышей и морских свинок при подкожном и внутрибрюшинном введении: безвреден.
| Таблица 1 | |||||||
| Нуклеотидные и аминокислотные различия внутренних генов донора аттенуации A/PR/8/59/1 (H1N1) и генов вируса A/PR/8/34 (H1N1), клонированных в векторы для обратной генетики. | |||||||
| Ген | нуклеотид | Белок | аминокислота | ||||
| позиция | 59/11 | PR-wt2 | позиция | 59/11 | PR-wt2 | ||
| РВ2 | 342 | А | G | РВ2 | 105 | Не | Met |
| 779 | G | А | 251 | Arg | Lys | ||
| 923 | G | А | 299 | Arg | Lys | ||
| 1106 | А | С | 360 | Туr | Ser | ||
| 1537 | А | G | 504 | llе | Val | ||
| 1660 | Т | G | 545 | Leu | Val | ||
| 1916 | А | G | 630 | Lys | Arg | ||
| 2132 | А | G | 702 | Lys | Arg | ||
| РВ1 | 196 | G | А | РВ1 | 58 | Asp | Asn |
| 549 | С | А | 175 | Asn | Lys | ||
| 639 | G | А | 205 | Met | He | ||
| 647 | А | G | 208 | Lys | Arg | ||
| 670 | А | G | 216 | Ser | Gly | ||
| 1335 | С | G | 437 | Cys | Trp | ||
| 294 | G | А | PB1-F2 | 59 | Arg | Lys | |
| 297 | G | А | 60 | Arg | Gin | ||
| РА | 65 | С | Т | РА | 14 | Ala | Val |
| 497 | А | G | 158 | Lys | Arg | ||
| 1101 | А | Т | 359 | Lys | Asn | ||
| 1672 | А | С | 550 | lle | Leu | ||
| NP | 98 | G | А | NP | 18 | Gly | Glu |
| 328 | Т | С | 95 | Ser | Pro | ||
| 1102 | С | G | 353 | Leu | Val | ||
| 1318 | А | G | 425 | lle | Val | ||
| 1334 | А | С | 430 | Asn | Thr | ||
| М | 434 | А | G | М1 | 137 | Thr | Ala |
| 476 | А | Т | 151 | Ser | Cys | ||
| NS | 94 | С | Т | NS1 | 23 | Ala | Val |
| 329 | С | А | 71 | Asp | Glu | ||
| 575 | G | А | NS2 | 25 | Gly | Glu | |
| 763 | А | G | 88 | lle | Val | ||
|
1донор аттенуации A/PR/8/59/1 (H1N1); 2гены вируса A/PR/8/34 (H1N1), клонированные в векторы для обратной генетики. |
| Таблица 2 | |||||
| Фенотипическая характеристика нового донора аттенуации A/PR/8/59/M2 (H1N1) и исходного донора A/PR/8/59/1 (H1N1) в сравнении с вирусом «дикого» типа A/PR/8/34 (H1N1) | |||||
| Вирусы | Показатели репродукции в РКЭ ((Ig ЭИД50/мл) | Титр вируса (Ig ЭИД50/мл) в легких и носовых ходах мышей | Фенотип | ||
| RCT26 | RCT39 | носовые ходы | легкие | ||
| A/PR/8/34 | 6,5 | 1,0 | 5,3 | 6,8 | non-ca, non-ts, non-att |
| A/PR/8/59/1 | 2,8 | 7,3 | 3,9 | 1,5 | Ca, ts, att |
| A/PR/8/59/M2 | 2,3 | 6,4 | 4,3 | 1,5 | Ca, ts, att |
| Таблица 3 | |||||
| Изучение чувствительности нового донора аттенуации A/PR/8/59/M2 (H1N1) к ремантадину в сравнении с вирусом «дикого» типа A/PR/8/34 (H1N1) | |||||
| Вирус | Титр вируса, Ig TCID50/мл | Снижение титра вируса в присутствии ремантадина, Ig TCID50 | |||
| без ремантадина | ремантадин 0,5 мкг/мл | ремантадин 5,0 мкг/мл | 0,5 мкг/мл | 5,0 мкг/мл | |
| A/PR/8/34 | 8,8 | 8,6 | 8,6 | 0,2 | 0,2 |
| A/PR/8/59/M2 | 8,6 | 6,8 | 6,3 | 1,8 | 2,3 |
Пример 1. РЕЗУЛЬТАТЫ ИЗУЧЕНИЯ ИММУНОГЕННОСТИ И ЗАЩИТНОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ H2N2 В ЭКСПЕРИМЕНТАХ НА МЫШАХ
Иммуногенность вакцинных штаммов H2N2
Иммуногенность вакцинных штаммов A/59/M2/Калифорния/66/2211 (H2N2) (59/Кал/2211) и A/59/M2/Токио/67/22111 (H2N2) (59/Ток/22111) оценивали путем двукратной иммунизации мышей линии СВА (18 животных в группе) вакцинными штаммами, взятыми в дозах 100 МИД50 и 1000 МИД50 (50%-ных мышиных инфицирующих доз). Контрольные животные получали препарат плацебо (PBS). Забор образцов сывороток крови проводили на 28 день после первой вакцинации, и на 28 день после второй иммунизации. Титры антигемагглютинирующих антител выявляли в реакции торможения гемагглютинации (РТГА). В качестве антигенов в РТГА использовали эпидемические вирусы A/Калифорния/1/66 (H2N2) и A/Токио/3/67 (H2N2). Из таблицы 4 видно, что иммунизация вакцинными штаммами приводила к формированию гуморальных антител не только против гомологичного вируса, но и против гетерологичного штамма. Иммунизация мышей более высокой дозой 1000 МИД50 вызывала образование достоверно более высоких титров как гомологичных, так и гетерологичных антител. Животные контрольной группы не вырабатывали антитела к вирусам H2N2.
| Таблица 4 | |||||
| Иммуногенность вакцинных штаммов H2N2, введенных в дозах 100 МИД50 и 1000 МИД50, в экспериментах на мышах | |||||
| Вакцинная группа | Доза, МИД50 | Среднее геометрическое обратных титров антигемагглютинирующих антител в РТГА с антигеном H2N2 | |||
| A/Калифорния/1/66 | A/Токио/3/67 | ||||
| День 28 | День 56 | День 28 | День 56 | ||
| 59/Кал/2211 | 100 | 6,8 | 156,6 | 5,0 | 12,3 |
| 1000 | 22,3 | 255,8 | 5,0 | 41,2 | |
| 59/Ток/22111 | 100 | 5,0 | 20,5 | 10,2 | 60,3 |
| 1000 | 6,9 | 42,5 | 20,6 | 122,8 | |
| Плацебо | - | 5,0 | 5,0 | 5,0 | 5,0 |
Защитная эффективность вакцинных штаммов H2N2
Защитную эффективность вакцинных штаммов A/59/M2/Калифорния/66/2211 (H2N2) и A/59/M2/Токио/67/22111 (H2N2) оценивали путем экспериментального заражения иммунизированных мышей эпидемическими вирусами A/Калифорния/1/66 (H2N2) и A/Токио/3/67 (H2N2), взятыми в дозе 105 ЭИД50. По 9 мышей из каждой вакцинной группы заражали вирусом A/Калифорния/1/66, а оставшиеся 9 - вирусом A/Токио/3/67 (H2N2). На 3 сутки после челленджа у 4 мышей из каждой группы забирали органы: легкие, носовые ходы, мозг, селезенку. Титр вируса в органах мышей определяли путем титрования гомогенатов тканей в развивающихся куриных эмбрионах методом предельных разведений. За оставшимися 5 мышами в группе вели наблюдение, взвешивая каждые 2 дня в течение 14 дней после заражения. Как видно из рисунка 1, иммунизированные более высокой дозой вакцинных штаммов (1000 МИД50) мыши были полностью защищены от размножения как гомологичного, так и гетерологичного «дикого» вируса. Мыши, иммунизированные меньшей дозой 100 МИД50, были полностью защищены от размножения гомологичного вируса, тогда как гетерологичный вирус обнаруживался в легких мышей в незначительных титрах. Данные титры были достоверно ниже таковых у мышей контрольных групп (p<0,001 по критерию Манна-Уитни).
Изучение динамики изменения веса мышей, иммунизированных штаммами A/59/M2/Калифорния/66/2211 (H2N2) и A/59/M2/Токио/67/22111 (H2N2), также указывает на защитный эффект вакцинации. Как видно из рисунка 2, снижение веса у вакцинированных мышей не превышало 7,5%, тогда как у мышей контрольной группы потеря веса достигала 15-18% на 8-10 сутки после челленджа.
Таким образом, изучение вакцинных штаммов A/59/M2/Калифорния/66/2211 (H2N2) и A/59/M2/Токио/67/22111 (H2N2), полученных с использованием нового донора аттенуации A/PR/8/59/M2 (H1N1), доказало их иммуногенность и профилактическую эффективность от болезни, вызванной как гомологичным вирусом, так и гетерологичным H2N2 штаммом.
1. Аттенуированный, холодоадаптированный штамм вируса гриппа, Ortomyxoviridae, род Influenza, A/PR/8/59/M2 (H1N1), депонированный в Государственной коллекции Роспотребнадзора возбудителей вирусных инфекций, риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» под № V-654, являющийся донором аттенуации для получения вакцинных штаммов живой гриппозной вакцины подтипа A(H2N2).
2. Реассортантный вакцинный штамм вируса гриппа, Ortomyxoviridae, род Influenza, A/59/M2/Калифорния/66/2211 (H2N2), депонированный в Институте вирусологии им.Д.И.Ивановского под № 2652, полученный с помощью донора аттенуации по п.1, и используемый для получения живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей.
3. Реассортантный вакцинный штамм вируса гриппа, Ortomyxoviridae, род Influenza, A/59/M2/Токио/67/22111 (H2N2), депонированный в Институте вирусологии им.Д.И.Ивановского под № 2653, полученный с помощью донора аттенуации по п.1 и используемый для получения живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей.
