Питательная среда для культивирования консорциума фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов
Владельцы патента RU 2557392:
Государственное научное учреждение Татарский научно-исследовательский институт агрохимии и почвоведения Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ Татарский НИИАХП Россельхозакадемии) (RU)
Изобретение относится биотехнологии и может быть использовано в микробиологии. Питательная среда содержит дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния гептагидрат, хлорид натрия, сульфат кальция дигидрат, молибдат натрия, сульфат железа(II), сахарозу, наносапропель и дистиллированную воду при заданном соотношении компонентов. Изобретение позволяет повысить скорость роста фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов. 1 табл., 15 пр.
Изобретение относится к области создания биопрепаратов на основе индивидуальных микроорганизмов и их сочетаний (консорциумов) и может быть использовано в микробиологии и сельском хозяйстве.
Известна питательная среда для культивирования консорциума фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов, содержащая глюкозу, аспарагин, сульфат калия, кукурузный экстракт, хлорид кальция, фосфат натрия и воду [1]. Недостатком этой питательной среды является относительно низкая скорость роста фосфатмобилизующих микроорганизмов, а также практическое отсутствие на ней роста азотфиксирующих микроорганизмов, что делает ее малопригодной для выращивания их консорциума.
Известна питательная среда для культивирования консорциума фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов, содержащая дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, карбонат кальция, сахарозу и воду [2]. Недостатком этой питательной среды является практическое отсутствие на ней роста фосфатмобилизующих микроорганизмов, что также делает ее малопригодной для выращивания их консорциума.
Известна также питательная среда для культивирования консорциума фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов, содержащая дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат кальция, молибдат натрия, сульфат железа(II), сахарозу и воду, описанная в [3]. Недостатком данной питательной среды также является относительно низкая скорость роста фосфатмобилизующих микроорганизмов.
Наиболее близким к заявляемому нами объекту по совокупности признаков и достигаемому техническому эффекту является питательная среда для культивирования консорциума фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов, содержащая дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат кальция, молибдат натрия, сульфат железа(II), сахарозу, минеральную добавку - сапропель и воду, описанная в [4]. Недостатком данной питательной среды, которая в связи с только что отмеченным обстоятельством выбрана нами в качестве объекта-прототипа, также является относительно низкая скорость роста фосфатмобилизующих микроорганизмов.
Цель данного изобретения - увеличение скорости роста фосфатмобилизующих микроорганизмов при культивировании консорциума фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов.
Поставленная цель достигается тем, что питательная среда для культивирования консорциума фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов, содержащая дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат кальция, молибдат натрия, сульфат железа(II), сахарозу, минеральную добавку и воду, в качестве минеральной добавки содержит наносапропель при следующем соотношении ингредиентов (г/л):
| Дигидрофосфат калия | 0.60-0.70 |
| Гидрофосфат калия | 0.12-0.20 |
| Сульфат магния гептагидрат | 0.15-0.25 |
| Хлорид натрия | 0.15-0.25 |
| Сульфат кальция дигидрат | 0.02-0.06 |
| Молибдат натрия | 0.0005-0.0007 |
| Сульфат железа(II) | 0.002-0.004 |
| Сахароза | 18.0-22.0 |
| Наносапропель | 0.5-1.5 |
| Вода дистиллированная | До 1 л |
В результате использования данной питательной смеси скорость роста фосфатмобилизующих микроорганизмов возрастает в 7-8 раз по сравнению с аналогичным показателем для питательной среды-прототипа [4].
До сих пор в литературе не описывалась питательная среда для культивирования консорциума фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов, содержащая вышеуказанную совокупность ингредиентов вообще и наносапропель в частности; более того, применение последнего в составе питательных сред для микроорганизмов неизвестно вообще. Указанный факт позволяет нам сделать заключение о соответствии заявляемого нами объекта первому установленному патентным законодательством РФ критериальному признаку изобретения - новизна. Сопоставление же известных признаков питательной среды-прототипа [4] и отличительных признаков, характеризующих наш заявляемый объект (а именно введение в нее наносапропеля), априори не позволяет предсказать появления у него новых по сравнению с прототипом свойств, а именно указанного выше резкого увеличения скорости роста фосфатмобилизующих микроорганизмов (при одновременном снижении скорости роста азотфиксирующих микроорганизмов), входящих в состав консорциума. Указанный момент дает нам основания считать, что заявляемый объект явным образом не следует из известного в данной отрасли техники уровня; следовательно, он подпадает под второй из установленных законодательством РФ критериальных признаков изобретения - изобретательский уровень. Заявляемая нами питательная среда легко может быть получена в промышленном масштабе, а ее применение для выращивания консорциума фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов не связано со сколько-нибудь серьезными техническими проблемами; в связи с этим мы вправе утверждать, что данному объекту присущ и третий установленный законодательством РФ критериальный признак изобретения, а именно промышленная применимость.
Заявляемая на предмет изобретения питательная среда для культивирования консорциума фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов может быть продемонстрирована на следующих примерах.
Пример 1
Природный сапропель из месторождения близ озера Белое (Тукаевский район Республики Татарстан) измельчают в муку и смешивают с дистиллированной или деионизированной (обессоленной) водой из расчета 20 г сапропеля на 100 мл воды. Полученную смесь обрабатывают ультразвуком в ультразвуковом диспергаторе УЗУ-0,25 мощностью 80 Вт при частоте 18.5 кГц с амплитудой колебаний ультразвукового волновода 5 мкм в течение (5-20) мин при комнатной температуре, в результате чего получается водно-сапропелевая суспензия с размерами частиц сапропеля от 5 до 100 нм. Приготовленную таким образом суспензию наносапропеля далее используют в качестве одного из компонентов питательной среды для культивирования консорциума фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов.
Пример 2
Приготавливают питательную среду для культивирования консорциума фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов состава, г/л:
| Дигидрофосфат калия | 0.60 |
| Гидрофосфат калия | 0.12 |
| Сульфат магния гептагидрат | 0.15 |
| Хлорид натрия | 0.15 |
| Сульфат кальция дигидрат | 0.02 |
| Молибдат натрия | 0.0005 |
| Сульфат железа(II) | 0.002 |
| Сахароза | 18.0 |
| Наносапропель | 0.5 |
| Вода дистиллированная | До 1 л |
Составляют консорциум фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов с соотношение 1:1 по количеству колониеобразующих единиц на основе коллекционных (депонированных) штаммов поименованных микроорганизмов (Sphingobacterium multivorum, Регистрационный номер в ВКПМ В-10385) и (Pseudomonas brassicacearum, Регистрационный номер в ВКПМ В-10388) соответственно. Для этого предварительно выращивают фосфатмобилизующие микроорганизмы на агаризованной среде Муромцева, азотфиксирующие - на агаризованной среде Эшби; далее эти культуры высеваются на питательную среду указанного выше состава. Выращивание ведут в течение того периода времени, в котором имеет место прирост их численности (4.5 сут), после чего этот процесс прекращают. Для определения численности микроорганизмов сразу же проводят посев консорциума на ага-ризованные питательные среды (среда Муромцева в случае фосфатмобилизующих микроорганизмов и среда Эшби в случае азотфиксирующих) и определяют среднюю скорость их роста в (млн·г-1·сут-1) как частное от деления числа микроорганизмов (в миллионах единиц) на массу питательной среды (в г) и время выращивания (в сут). Данные по скорости роста фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов для вышеуказанной питательной среды представлены в Таблице 1.
Пример 3
Осуществляют, как и Пример 2, но для культивирования консорциума фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов берут питательную среду состава, г/л:
| Дигидрофосфат калия | 0.64 |
| Гидрофосфат калия | 0.16 |
| Сульфат магния гептагидрат | 0.20 |
| Хлорид натрия | 0.20 |
| Сульфат кальция дигидрат | 0.05 |
| Молибдат натрия | 0.0006 |
| Сульфат железа(II) | 0.003 |
| Сахароза | 20.0 |
| Наносапропель | 1.0 |
| Вода дистиллированная | До 1 л |
Данные по скорости роста микроорганизмов для этого случая представлены в Таблице 1.
Пример 4
Выполняют, как и Пример 2, но для культивирования консорциума фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов берут питательную среду состава, г/л:
| Дигидрофосфат калия | 0.70 |
| Гидрофосфат калия | 0.20 |
| Сульфат магния гептагидрат | 0.25 |
| Хлорид натрия | 0.25 |
| Сульфат кальция дигидрат | 0.06 |
| Молибдат натрия | 0.0007 |
| Сульфат железа(II) | 0.004 |
| Сахароза | 22.0 |
| Наносапропель | 1.5 |
| Вода дистиллированная | До 1 л |
Сведения о скорости роста указанных микроорганизмов для данного случая приведены в Таблице 1.
Пример 5 (сравнительный)
Проводят таким же образом, что и Пример 2, но для культивирования консорциума фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов приготавливают питательную среду состава, г/л:
| Дигидрофосфат калия | 0.64 |
| Гидрофосфат калия | 0.16 |
| Сульфат магния гептагидрат | 0.20 |
| Хлорид натрия | 0.20 |
| Сульфат кальция дигидрат | 0.05 |
| Молибдат натрия | 0.0005 |
| Сульфат железа(II) | 0.003 |
| Сахароза | 20.0 |
| Наносапропель | 0.3 |
| Вода дистиллированная | До 1 л |
Сведения о скорости роста вышеуказанных микроорганизмов для данного случая представлены в Таблице 1.
Пример 6 (сравнительный)
Выполняют по общей схеме Примера 2, но для культивирования консорциума фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов применяют питательную среду состава, г/л:
| Дигидрофосфат калия | 0.64 |
| Гидрофосфат калия | 0.16 |
| Сульфат магния гептагидрат | 0.20 |
| Хлорид натрия | 0.20 |
| Сульфат кальция дигидрат | 0.05 |
| Молибдат натрия | 0.0005 |
| Сульфат железа(II) | 0.003 |
| Сахароза | 20.0 |
| Наносапропель | 2.0 |
| Вода дистиллированная | До 1 л |
Показатели скорости роста микроорганизмов для данного случая см. в Таблице 1.
Пример 7 (сравнительный)
Проводят таким же образом, что и Пример 2, но для культивирования консорциума фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов используют питательную среду состава, г/л:
| Дигидрофосфат калия | 0.50 |
| Гидрофосфат калия | 0.09 |
| Сульфат магния гептагидрат | 0.10 |
| Хлорид натрия | 0.15 |
| Сульфат кальция дигидрат | 0.015 |
| Молибдат натрия | 0.0003 |
| Сульфат железа(II) | 0.001 |
| Сахароза | 14.0 |
| Наносапропель | 1.0 |
| Вода дистиллированная | До 1 л |
Показатели скорости роста микроорганизмов для данного случая см. в Таблице 1.
Пример 8 (сравнительный)
Проводят по общей схеме Примера 2, но культивирование консорциума вышеуказанных микроорганизмов осуществляют на питательной среде состава, г/л:
| Дигидрофосфат калия | 0.90 |
| Гидрофосфат калия | 0.30 |
| Сульфат магния гептагидрат | 0.30 |
| Хлорид натрия | 0.35 |
| Сульфат кальция дигидрат | 0.09 |
| Молибдат натрия | 0.0010 |
| Сульфат железа(II) | 0.006 |
| Сахароза | 28.0 |
| Наносапропель | 1.0 |
| Вода дистиллированная | До 1 л |
Сведения о скорости роста микроорганизмов для данного случая см. в Таблице 1.
Пример 9 (сравнительный)
Выполняют таким же образом, как и Пример 2, но для культивирования консорциума микроорганизмов используют питательную среду состава, г/л:
| Дигидрофосфат калия | 0.50 |
| Гидрофосфат калия | 0.09 |
| Сульфат магния гептагидрат | 0.10 |
| Хлорид натрия | 0.15 |
| Сульфат кальция дигидрат | 0.015 |
| Молибдат натрия | 0.0003 |
| Сульфат железа(II) | 0.001 |
| Сахароза | 14.0 |
| Наносапропель | 2.0 |
| Вода дистиллированная | До 1 л |
Значения скорости роста микроорганизмов для данного случая приведены в Таблице 1.
Пример 10 (сравнительный)
Выполняют по той же общей схеме, что и Пример 2, но культивирование консорциума фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов осуществляют на питательной среде состава, г/л:
| Дигидрофосфат калия | 0.90 |
| Гидрофосфат калия | 0.30 |
| Сульфат магния гептагидрат | 0.30 |
| Хлорид натрия | 0.35 |
| Сульфат кальция дигидрат | 0.09 |
| Молибдат натрия | 0.0010 |
| Сульфат железа(II) | 0.006 |
| Сахароза | 28.0 |
| Наносапропель | 2.5 |
| Вода дистиллированная | До 1 л |
Показатели скорости роста микроорганизмов для этого случая даны в Таблице 1.
Пример 11 (по прототипу [4])
Выполняют по той же общей схеме, что и Пример 2, но культивирование консорциума фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов осуществляют на питательной среде состава, г/л:
| Дигидрофосфат калия | 0.64 |
| Гидрофосфат калия | 0.16 |
| Сульфат магния гептагидрат | 0.20 |
| Хлорид натрия | 0.20 |
| Сульфат кальция дигидрат | 0.05 |
| Молибдат натрия | 0.0006 |
| Сульфат железа(II) | 0.003 |
| Сахароза | 20.0 |
| Сапропель | 1.0 |
| Вода дистиллированная | До 1 л |
Показатели скорости роста микроорганизмов для этого случая даны в Таблице 1.
Пример 12 (по прототипу [4])
Выполняют по той же общей схеме, что и Пример 2, но культивирование консорциума фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов осуществляют на питательной среде состава, г/л:
| Дигидрофосфат калия | 0.70 |
| Гидрофосфат калия | 0.20 |
| Сульфат магния гептагидрат | 0.25 |
| Хлорид натрия | 0.25 |
| Сульфат кальция дигидрат | 0.06 |
| Молибдат натрия | 0.0007 |
| Сульфат железа(II) | 0.004 |
| Сахароза | 22.0 |
| Сапропель | 1.5 |
| Вода дистиллированная | До 1 л |
Показатели скорости роста микроорганизмов для этого случая даны в Таблице 1.
Пример 13 (по аналогу [3])
Выполняют по той же технологической схеме, что и Пример 2, но для культивирования консорциума фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов используют питательную среду состава, г/л:
| Дигидрофосфат калия | 0.64 |
| Гидрофосфат калия | 0.16 |
| Сульфат магния гептагидрат | 0.20 |
| Хлорид натрия | 0.20 |
| Сульфат кальция дигидрат | 0.05 |
| Молибдат натрия | 0.0005 |
| Сульфат железа(II) | 0.003 |
| Сахароза | 20.0 |
| Вода дистиллированная | До 1 л |
Данные по скорости роста микроорганизмов для такого случая см. в Таблице 1.
Пример 14 (по аналогу [1])
Выполняют по той же технологической схеме, что и Пример 2, но для культивирования консорциума фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов используют питательную среду состава, г/л:
| Сульфат калия | 0.20 |
| Хлорид кальция гексагидрат | 3.30 |
| Фосфат натрия додекагидрат | 3.80 |
| Кукурузный экстракт | 0.20 |
| Глюкоза | 10.0 |
| Аспарагин | 1.00 |
| Вода дистиллированная | До 1 л |
Данные по скорости роста микроорганизмов для этого случая приведены в Таблице 1.
Пример 15 (по аналогу [2])
Выполняют по той же технологической схеме, что и Пример 2, но для культивирования консорциума фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов используют питательную среду состава, г/л:
| Дигидрофосфат калия | 0.10 |
| Гидрофосфат калия | 0.20 |
| Сульфат магния гептагидрат | 0.20 |
| Хлорид натрия | 0.20 |
| Карбонат кальция | 5.00 |
| Сахароза | 20.0 |
| Вода дистиллированная | До 1 л |
Данные по скорости роста микроорганизмов для этого случая также см. в Таблице 1.
| Таблица 1 | |||
| № примера | Содержание нано-сапропеля в питательной смеси, г/л | Средняя скорость роста фосфатмобилизующих микроорганизмов {Sphingobacterium multivorum), млн·г-1·сут-1 | Средняя скорость роста азотфиксирующих микроорганизмов (Pseudomonas brassicacearum), млн·г-1·сут-1 |
| 2 | 0.5 | 373.3 | 4.7 |
| 3 | 1.0 | 391.1 | 4.9 |
| 4 | 1.5 | 382.2 | 4.9 |
| 5 (сравнительный) | 0.3 | 284.4 | 6.7 |
| 6 (сравнительный) | 2.0 | 311.1 | 5.3 |
| 7 (сравнительный) | 1.0 | 351.1 | 7.1 |
| 8 (сравнительный) | 1.0 | 344.4 | 6.7 |
| 9 (сравнительный) | 2.0 | 337.8 | 5.8 |
| 10 (сравнительный) | 2.0 | 328.9 | 5.3 |
| 11 (по прототипу [4]) | - | 46.7 | 15.1 |
| 12 (по прототипу [4]) | - | 47.1 | 14.9 |
| 13 (по аналогу [3]) | - | 38.9 | 8.0 |
| 14 (по аналогу [1]) | - | 40.0 | 2.7 |
| 15 (по аналогу [2]) | - | 1.3 | 12.5 |
Как можно видеть из приведенных в Таблице 1 данных, использование заявляемой питательной среды, содержащей наносапропель в количестве (0.5-1.5) г/л, позволяет значительно (в 7-8 раз) повысить скорость роста фосфатмобилизующих (Sphingobacterium multivorum) микроорганизмов при снижении скорости роста азотфиксирующих (Pseudomonas brassicacearum} микроорганизмов в рамках их консорциума по сравнению с таковыми для питательной среды-прототипа [4] (и в еще большей степени по сравнению со средами-аналогами [1], [2] и [3]). При этом заявляемые нами количества наносапропеля в питательной смеси являются существенными: при увеличении его сверхуказанного верхнего заявляемого предела (1.5 г/л) дальнейшего прироста скорости роста фосфатмобилизующих микроорганизмов уже не происходит, при уменьшении же нижеуказанного нижнего заявляемого значения (1.0 г/л) отмечается снижение скорости их роста (хотя она и остается значительно большей по сравнению с той, что имеет место на питательной среде [4]).
Аналогичные вышеуказанным результаты были получены нами и на других культурах азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов (в частности, Azotobacter chroococcum, Регистрационный номер в ВКПМ В-10387 и Achromobacter xylosoxidans, Регистрационный номер в ВКПМ В-10386).
ЛИТЕРАТУРА
[1] Основные микробиологические и биохимические методы исследования почвы (Методические рекомендации) / Под ред. Ю.М. Возняковской. - Л.: ВНИИСХМ, 1987. С.31.
[2] Руководство к практическим занятиям по микробиологии. 3-е издание переработанное, под ред. Н.С. Егорова. М: Издательство Московского университета. 1995. С.204.
[3] Патент РФ 2.177.466 (2001), МПК C05F 11/08, C12N 1/20.
[4] Заявка на изобретение РФ №2012145906 от 26.10.2012, МПК C12N 1/00, C12N 1/20, C12N 1/22 (прототип).
Питательная среда для культивирования консорциума фосфатмобилизующих и азотфиксирующих микроорганизмов, содержащая дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния гептагидрат, хлорид натрия, сульфат кальция дигидрат, молибдат натрия, сульфат железа(II), сахарозу, минеральную добавку и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что в качестве минеральной добавки она содержит наносапропель при следующем соотношении компонентов, г/л:
| дигидрофосфат калия | 0.60-0.70 |
| гидрофосфат калия | 0.12-0.20 |
| сульфат магния гептагидрат | 0.15-0.25 |
| хлорид натрия | 0.15-0.25 |
| сульфат кальция дигидрат | 0.02-0.06 |
| молибдат натрия | 0.0005-0.0007 |
| сульфат железа(II) | 0.002-0.004 |
| сахароза | 18.0-22.0 |
| наносапропель | 0.5-1.5 |
| вода дистиллированная | до 1 л |
