Штамм культивируемых клеток cho-il7/13 - продуцент интерлейкина-7 человека

Изобретение относится к биотехнологии и касается штамма клеток CHO-IL7/13. Охарактеризованный штамм получен трансфекцией клеток CHOdhfr плазмидой pIPvES-DHFR/IL7, содержащей ген интерлейкина-7 человека. Плазмида pIPvES-DHFR/IL7 была синтезирована амплифицированием кДНК интерлейкина-7 человека с помощью праймеров: ecoIL CCTGAATTCCACCATGTTCCATGTTTCTTTTAG, содержащего сайт рестрикции EcoRI и последовательность Козак, и bamIL CCAGGATCCTCAGTGTTCTTTAGTGCCCATC, содержащего сайт рестрикции BamHI, с последующим клонированием по данным сайтам рестрикции в вектор pIRES-DHFR. Предложенный штамм обладает более высокой продуцирующей способностью рекомбинантного интерлейкина-7 человека и может быть использован для лечения ряда патологических состояний, связанных с низким содержанием В- и Т-лимфоцитов. 4 ил., 3 пр.

 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к технологии получения рекомбинантного интерлейкина-7 человека.

Интерлейкин-7 (ИЛ-7) представляет собой цитокин, стимулирующий пролиферацию В- и Т-лимфоцитов и их предшественников. Утрата организмом гена ИЛ-7 (нокаут) вызывает опустошение тимуса, тотальную лимфопению, тяжелый иммунодефицит, снижение интенсивности (в 7-10 раз) ответа иммунокомпетентных клеток на действие стимуляторов. При этом полностью блокируется процесс формирования гамма/дельта Т-лимфоцитов, ослабляется процесс образования альфа/бета Т-клеток. При избытке ИЛ-7 уровень В- и Т-лимфоцитов в крови повышен.

Предполагается, что ИЛ-7 можно будет успешно использовать для лечения ряда патологических состояний, связанных с низким содержанием В- и Т-лимфоцитов, в частности:

- для восстановления содержания Т-клеток, главным образом CD4+, в сочетании с высокоактивной антиретровирусной терапией ВИЧ-инфицированных;

- для лечения лимфопении, связанной с применением цитостатиков и радиационной терапии при лечении онкологических заболеваний;

- для терапии онкологических заболеваний в сочетании с локальной гипертермией;

- для регенерации Т-клеток после пересадки гематопоэтических стволовых клеток.

Молекула интерлейкина-7 представляет собой гликозилированную полипептидную цепь длиной 152 аминокислотных остатка. В молекуле присутствуют 6 остатков цистеина, образующих три дисульфидных мостика, а также три сайта N-гликозилирования и один сайт O-гликозилирования. Секрецию синтезированного белка направляет сигнальная последовательность, содержащая 25 аминокислотных остатков [ru.wikipedia.org/wiki/Интерлейкин_7; Кетлинский С.А., Симбирцев А.С. Цитокины. С.-Пб., 2008].

Для получения ИЛ-7 используются рекомбинантные клетки бактерий, дрожжей, высших эукариот, трансформированные соответствующими векторами, экспрессирующими ИЛ-7 человека. Однако в клетках бактерий синтезируется негликозилированная форма ИЛ-7, отличающаяся нестабильностью при введении in vivo по сравнению с нативной (гликозилированной) формой. ИЛ-7, синтезированный в клетках дрожжей, содержит углеводные цепи, отличающиеся от углеводных цепей нативного белка, что приводит к изменению его антигенных свойств.

Наиболее перспективными продуцентами ИЛ-7 человека для использования в качестве лекарственного средства могут служить рекомбинантные культивируемые клетки высших эукариот, в частности клетки BHK, COS, CHO, РУЛ-293, в которых обеспечиваются синтез, гликозилирование, фолдирование, отщепление сигнальной последовательности и секреция в среду культивирования белков, идентичных нативным белкам человека. В частности, описан синтез ИЛ-7 человека в ряде культивируемых клеток млекопитающих (WO 2004018681, WO 8903884). В результате были получены клетки HEK-293, COS-7, BHK, синтезировавшие ИЛ-7 человека при культивировании в течение 10 дней. Идентичность полученных продуктов интерлейкину-7 человека была установлена, однако не приведены какие-либо данные о продуктивности полученных клеток-продуцентов.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому изобретению является технология, описанная в патенте WO 2004018681, где описывается получение ИЛ-7 продуцированном клеток яичников китайского хомячка (CHO), HEK-293. Недостатком данной технологии является относительно невысокий выход ИЛ-7.

Задачей, стоявшей перед авторами, являлось расширение диапазона штаммов-продуцентов с целью создания более высокопроизводительных клеточных линий -продуцентов ИЛ-7 человека.

Данная задача решена тем, что предложен штамм культивируемых клеток овариев китайского хомячка CHO-IL 7/13, стабильно экспрессирующий высокоактивный рекомбинантный интерлейкин-7 (ИЛ-7) человека, полученный трансфекцией клеток CHOdhfr плазмидой pIRES-DHFR/IL7, содержащей ген ИЛ-7 человека, схема которой приведена на фиг. 1. Штамм характеризуется следующими свойствами.

Морфологические признаки: Клетки правильной округлой формы, одиночные или сгруппированные в кластеры.

Культуральные признаки: Тип роста - суспензионный.

Устойчивость к селективным факторам: Растет на среде с 500 нг/мл метатрексата.

Криоконсервация. Среда для криоконсервации - 90% фетальной сыворотки и 10% диметилсульфоксида. Температура хранения -196°C (жидкий азот).

Контаминация. Клетки штамма CHO-IL7/13 свободны от микоплазмы.

Родословная штамма: Родительская клеточная линия CHOdhfr-. Трансфекция плазмидой pIRES-DHFP/IL7, отбор стабильного высокопродуктивного клона на среде без гипоксантина/тимидина с увеличением концентрации метотрексата.

Стандартные условия выращивания: Среда PF-CHO LS без гипоксантина/тимидина с 4 нМ глутамина, 500 нМ метатрексата, 37°C, 5% CO2.

Культуральные свойства: Суспензионное культивирование в пробирках, колбах или 6-луночных платах на орбитальном шейкере с частотой вращения 150-180 об/мин. Посевная доза 0,3-0,5×106/мл, пересев каждые 3-4 суток. Время удвоения 22-24 часа.

Данные по видовой принадлежности: Cricetulus griseus (ПЦР-анализ с видоспецифичными праймерами).

Характеристики полезного вещества, продуцируемого штаммом: рекомбинантный интерлейкин-7 человека (оценка с помощью твердофазного иммуно-ферментного анализа, вестерн-блота, биологического теста).

Характеристика биосинтеза полезных продуктов (выход продукта в среду, уровень активности и способ ее определения): Рекомбинантный интерлейкин-7 человека секретируется в культуральную среду в концентрации не менее 10 мкг/мл за 4 суток. Стабильность культивирования - 15 пассажей. Метод определения активности - Conlon P.J. et al. Murine thymocytes proliferate in direct response to interleukin-7 // Blood. - 1989. - V.74(4). - P.1368-73.

Способ криоконсервирования: фетальная сыворотка с 10% DMSO, заморозка до -70°C со скоростью 1°C/мин, далее помещение в жидкий азот, жизнеспособность после размораживания и отмывки от криоконсерванта 85% (с трипановым синим).

Другие особенности штамма: Возможно культивирование клеток в среде DMEM/F12 с 10% фетальной сыворотки (адгезионный тип роста) без дополнительной адаптации.

Сущность изобретения иллюстрируется следующими рисунками. Фиг.1 - Карта экспрессионной плазмиды pIRES-DHFR/IL

Кольцевая схема плазмиды pIRES-DHFR/IL7, где используются следующие обозначения: Amp R - ген бета-лактамазы: Р CMV IE - промотор предранних белков цитомегаловируса; IL7 - ген интерлейкина-7 человека; IVS - синтетический интрон; mDHFR - модифицированный ген дигидрофолятредуктазы; pA BGH - сигнал полиаденилирования и терминации транскрипции гена гормона роста быка; Ori - бактериальный репликатор.

Фиг 2. Результаты скрининга продукции 24 кандидатных клонов CHO-L7 через 72 и 96 часов после начала культивирования.

Фиг.3 - Связывание белков среды культивирования клеток pIRES-DHFR/IL7 с антителом к интерлейкину-7 человека в иммуноблоте.

1 - Среда культивирования клеток клона 11, 10 мкл

2 - Среда культивирования клеток клона 13, 10 мкл

3 - Образец экспрессированного в клетках E.coli (негликозилированного) ИЛ-7 человека (R&D Systems, кат. №207-IL-005/CF) - 1 мкл

4 - Маркеры молекулярного веса.

Фиг.4. Определение биологической активности ИЛ-7, секретируемого клетками клона 7/13.

Список последовательностей Seq ID No 1 - ДНК, кодирующая интерлейкин-7 человека (Приложение)

Изобретение поясняется следующими примерами:

Пример 1. Выделение кДНК интерлейкина-7 человека и получение экспрессионной плазмиды. Для получения кДНК ИЛ-7 человека использовали препарат кДНК на матрице РНК из аденокарциномы матки человека. Далее кДНК ИЛ-7 человека амплифицировали с помощью праймеров

IL7-for (5′-TGCTCCAGTTGCGGTCATCATGACTA-3′) и

IL7-rev (5′-CTGCATAAGCAGATAGATTCTTGGAGGATGC-3′),

параметры амплификации: 95°C × 5 мин; 35 циклов: 95°C × 15 сек, 55°C × 15 сек, 72°C × 20 сек и дополнительный цикл достройки 2 мин × 72°C. Продукт амплификации длиной 649 пар нуклеотидов очищали электрофорезом в 2% агарозном геле и клонировали в вектор pCD2.1 (Invitrogen). Плазмидные ДНК из нескольких клонов были выделены и просеквенированы в двух направлениях с помощью вышеприведенных праймеров. Сравнение последовательности вставки, содержащейся в одной из полученных плазмид, pCR2.1-IL7-5, с референсной последовательностью варианта 1 кДНК ИЛ-7 человека, аннотированной в GenBank (NM_000880.3), показало их полную идентичность (Seq ID No 1.).

Для создания экспрессионной плазмиды последовательность кДНК ИЛ-7 амплифицировали с помощью праймеров ecoIL (CCTGAATTCCACCATGTTCCATGTTTCTTTTAG), содержащего сайт рестрикции EcoRI и последовательность Козак, и bamIL (CCAGGATCCTCAGTGTTCTTTAGTGCCCATC), содержащего сайт рестрикции BamHI, и клонировали по данным сайтам рестрикции в вектор pIRES-DHFR с получением экспрессионной плазмиды pIRES-DHFR/IL7. Схема плазмиды pIRES-DHFR/IL7 представлена на Фиг.1.

Пример 2. Получение штамма культивируемых клеток-продуцента ИЛ-7 человека. Экспрессионную плазмиду pIRES-DHFR/IL7 переводили в линейную форму обработкой рестриктазой PvuI. Клетки CHOdhfr-, адаптированные к суспензионному росту, культивировали в среде PF-CHO LS (HyClone) с 4 мМ глутамина, 50 Ед/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина, 0,1 мМ гипоксантина и 0,016 мМ тимидина (Sigma) (полная среда). Клетки выращивали в 50-миллилитровых центрифужных пробирках на шейкере, при температуре 37°C и скорости вращения платформы 180 об/мин. Постоянную трансфекцию суспензионных клеток CHOdhfr- проводили в 24-луночных платах в бессывороточной среде с помощью липосомального реагента FreeStyle™ MAX Reagent (Invitrogen) по инструкции изготовителя. Через 1 сутки после трансфекции среду заменяли на полную, а еще через сутки переводили в селективные условия и культивировали далее в среде без гипоксантина и тимидина и с 20 нМ метотрексата (МТХ, Sigma), заменяя среду каждые 3 суток.

Концентрацию ИЛ-7 определяли с помощью иммуноферментного анализа. Пулы стабильно трансфецированных клеток высевали на среде PF-CHO LS без гипоксантина/тимидина с 1% сыворотки и 20 нМ метатрексата с плотностью 1,5 клетки на лунку в 96-луночные плоскодонные платы в объеме 200 мкл на лунку. На 7 и 11 сутки заменяли половину среды, добавляя свежую среду без сыворотки. Перед первой заменой среды все платы просматривали визуально и отмечали лунки, содержащие единичные клоны. На 14 сутки проводили скрининг, определяя концентрацию специфического белка в супернатантах лунок с единичными клонами. Затем отобранные клоны переносили вначале в 24-луночные платы (600 мкл среды на лунку), затем в 6-луночные платы (3 мл среды на лунку), а далее - в 50-мл центрифужные пробирки. Культивирование клеток проводили на шейкере при скорости вращения платформы 180 об/мин. В результате скрининга 24 клонов, культивируемых в среде с последовательно повышающимися концентрациями метотрексата (20-50-100-250-500 нМ), был получен штамм клеток овариев китайского хомячка CHO-IL7/13 с удельной продуктивностью (qP), равной 6,5 пг ИЛ-7/кл/сутки (Фиг 2). Максимальная концентрация ИЛ-7 человека при культивировании клеток данного клона составила 10850 нг/мл. Криоконсервированные клетки клона CHO-IL7/13 помещены в коллекцию.

Пример 3. Анализ белка, продуцируемого клетками штамма CHO-IL 7/13.

Клетки штамма CHO-IL 7/13 культивировали в среде с 20 нМ метотрексата, как описано в примере 2, в течение 72 часов. Клетки осаждали центрифугированием и образцы культуральной среды подвергали электрофорезу в полиакридамидном геле с ДДС-Na. Разделенные белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану, которую инкубировали с известными моноклональными антителами против интерлейкина-7 человека (Human IL-7 DuoSet, производства R&D Systems, USA). Результат, полученный после обработки вторыми антителами и проявления, представленный на Фиг.3, показывает наличие белковой полосы с молекулярным весом 29 килодальтон, связывающейся с антителами к ИЛ-7 человека и отсутствующей в среде культивирования контрольных клеток. Данный молекулярный вес соответствует гликозилированной форме интерлейкина-7 человека. Продуктивность штамма CHO-IL7/13 оценивали с помощью иммуноферментного анализа с антителами Human IL-7 DuoSet. Результаты измерений приведены на Фиг.4.

Определение биологической активности рекомбинантного ИЛ-7 человека выполняли на первичной культуре спленоцитов мыши, по способности данного цитокина стимулировать пролиферацию различных клеток лимфоцитарного ряда [2-4]. Спленоциты выделяли из селезенок мышей-гибридов F1 (C57BL/6×CBA) следующим образом. В асептических условиях селезенки измельчали, гомогенизировали многократным пропусканием через иглу шприца (d=1.2 мм). Клеточную суспензию в стерильном забуференном физиологическом растворе (PBS) фильтровали через двойной слой марли и центрифугировали. Затем лизировали эритроциты 0,86% раствором NH4Cl, далее клетки дважды отмывали в PBS и ресуспендировали в среде RPMI-1640 (Sigma) с 2,0 мМ L-глутамина, 50 мкМ 2-меркаптоэтанола и 80 мг/л гентамицина (полная среда). Полученные клетки (5×105 клеток на лунку) инкубировали в 4-х параллелях в присутствии различных концентраций стандартного образца белка ИЛ-7 (R&D Systems, кат. №207-IL-005) или различных разведении супернатантов среды культивирования клеток-штамма ИЛ-7/13, в которых концентрацию ИЛ-7 предварительно определяли с помощью иммуноферментного анализа (R&D Systems). Далее образцы супернатантов разводили таким образом, чтобы в полученных разведениях содержалось 100, 10 или 1 нг/мл рекомбинантного белка. Инкубацию клеток с образцами проводили в полной среде с добавлением 10% телячьей эмбриональной сыворотки (ТЭС) (Sigma) в 96-луночных плоскодонных культуральных платах (Costar) в течение 72 часов в CO2-инкубаторе при 37°C в условиях абсолютной влажности. За 20 часов до окончания инкубации к клеткам добавляли 3H-тимидин («Изотоп», С-Петербург) в конечной концентрации 5 µCi/мл. Далее клетки переносили на стекловолоконные фильтры с помощью харвестера Fil-terMate 96 (Perkin Elmer) и определяли интенсивность включения тимидина на β-счетчике MicroBeta TriLux 1450 (Perkin-Elmer), которую выражали в импульсах в минуту. Усредненный результат четырех параллельных опытов представлен на фиг.4, из которого следует, что эффективность стимуляции пролиферации спленоцитов супернатантом клеток клона ИЛ-7/13 практически совпадает с эффективностью стандартного образца ИЛ-7 в соответствующих дозах, что указывает на наличие у рекомбинантного ИЛ-7 адекватной биологической активности.

Штамм культивируемых клеток CHO-IL7/13- продуцент интерлейкина-7 человека, полученный трансфекцией клеток CHOdhfr плазмидой pIPvES-DHFR/IL7, содержащей ген интерлейкина-7 человека, общая схема которой приведена на фиг. 1, которая была синтезирована амплифицированием кДНК интерлейкина-7 человека с помощью праймеров: ecoIL CCTGAATTCCACCATGTTCCATGTTTCTTTTAG, содержащего сайт рестрикции EcoRI и последовательность Козак, и bamIL CCAGGATCCTCAGTGTTCTTTAGTGCCCATC, содержащего сайт рестрикции BamHI, с последующим клонированием по данным сайтам рестрикции в вектор pIRES-DHFR.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биохимии, в частности к антителу или его функциональному фрагменту, направленным против эпитопа стафилококка золотистого, а также к их применению для обнаружения стафилококка золотистого.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и представляет собой α1,6-глюкан-содержащее соединение Helicobacter pylori. Настоящее изобретение также раскрывает конъюгат для индукции иммунного ответа против H.pylori, содержащий указанное соединение, конъюгированное с белком-носителем.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к композициям для интенсивной продукции целевого белка в эукариотических клетках, включающим ДНК-вектор со вставкой гена целевого белка и агонист клеточных рецепторов.

Изобретение относится к области медицины, биотехнологии и генетической инженерии. Предложена тригибридная клетка для экспрессии белков, полученная путем гибридизации первой клетки, представляющей собой стволовую клетку или клетку, происходящую из некоммитированной клетки-предшественника, второй клетки, происходящей из общей лимфоидной клетки-предшественника, и третьей клетки, происходящей из общей лимфоидной клетки-предшественника, где указанная первая клетка не является клеткой миеломы, а также способ её получения и способ получения белков с её использованием.

Изобретение относится к молекулярной биологии и клеточным технологиям. Предложен способ получения клетки с заданным фенотипом, где указанный способ включает стадии гибридизации первой стволовой клетки или клетки, происходящей из некоммитированной клетки-предшественника, второй клетки, происходящей из общей лимфоидной клетки-предшественника, и третьей клетки, происходящей из общей лимфоидной клетки-предшественника, с получением гибридной клетки, которая проявляет фенотипическую пластичность, и воздействия на указанную гибридную клетку условий, выбранных из группы, состоящей из тимической стромальной клетки, цитокина, фактора роста, иммуноглобулина, лиганда рецептора или их комбинации так, чтобы указанная гибридная клетка стала указанной клеткой с фенотипом В-клетки, Т-клетки, миелоидной клетки или дедифференцированного фенотипа относительно указанной гибридной клетки.

Изобретение относится к области биотехнологии и генной инженерии. Предложена трансгенная зародышевая клетка не являющегося человеком позвоночного.

Настоящее изобретение относится к иммунологии и биотехнологии. Предложены варианты нуклеиновых кислот, каждый из которых кодирует аминокислотную последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина IgG1.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к полипептиду, несущему эпитоп BNP(1-32) человека, для получения лигандов, направленных против BNP(1-32) человека или proBNP(1-108) человека, где указанный полипептид имеет формулу a 1 − R 1 − X 1 − F G R K M D R − X 2 − R 2 − a 2 .

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения моноклональных антител (МКА) к V антигену Yersinia pestis. .

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантной продукции белков человека, и может быть использовано в производстве химерных антител к фактору некроза опухоли человека.
Изобретение относится к области биотехнологии и генетической инженерии. Предложен способ получения по меньшей мере одной трансфицированной эукариотической клетки-хозяина, экспрессирующей целевой продукт, включающий введение в клетку полинуклеотида, кодирующего целевой продукт, и полинуклеотида, кодирующего мутантный фермент дигидрофолатредуктазу по крайней мере одним вектором экспрессии, получение множества эукариотических клеток-хозяев, жизнеспособность которых зависит от потребления фолата, причем указанные эукариотические клетки-хозяева включают по меньшей мере чужеродный полинуклеотид, кодирующий целевой продукт, и чужеродный полинуклеотид, кодирующий фермент дигидрофолатредуктазу (ДГФР), культивирование указанного множества эукариотических клеток-хозяев в селективной культуральной среде, включающей метотрексат в концентрации 2,3-500 нМ и фолиевую кислоту в концентрации 12,5-50 нМ, и отбор по меньшей мере одной эукариотической клетки-хозяина, экспрессирующей целевой продукт.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой выделенную полинуклеотидную молекулу с функцией rEVE, рекомбинантный вектор экспрессии, экспрессионный шаттл-вектор, клетку-хозяина, а также способы с использованием вышеуказанной выделенной полинуклеотидной молекулы.

Изобретение относится к области молекулярной генетики и клеточной биологии и касается вектора экспрессии для трансгенного введения в клетки и ткани млекопитающих.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к молекуле нуклеиновой кислоты, которая является циклическим или линейным вектором, пригодным для экспрессии, по меньшей мере, одного целевого полипептида в клетках млекопитающих, включающая (а) по меньшей мере, одну экспрессирующую кассету (POI) для экспрессии целевого полипептида; (б) экспрессирующую кассету (MSM), включающую ген селективного маркера млекопитающих; (в) экспрессирующую кассету (MASM), включающую амплифицированный ген селективного маркера млекопитающих; причем экспрессирующая кассета (POI) фланкирована в направлении 5′ кассетой экспрессии (MASM), кассета экспрессии (MSM) локализована в направлении 3′ от кассеты экспрессии (POI) и в которой кассеты экспрессии (MASM), (POI) и (MSM) расположены в той же ориентации от 5′ к 3′.

Промотор // 2491344
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к промоторам, и может быть использовано в продукции гетерологичных белков клетками-хозяевами. .

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к средствам, ингибирующим ангиогенез, и может быть использовано в медицине. .
Изобретение относится к области молекулярной биологии и генетической инженерии и может быть использовано в медицинской генетике. .

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой плазмидный вектор для переноса ДНК, содержащий последовательность, кодирующую различные фрагменты онкобелка p185neu, способные индуцировать иммунный ответ в отношении опухолей, гиперэкспрессирующих p185neu.

Изобретение относится к биотехнологии и касается штамма клеток CHO-IL713. Охарактеризованный штамм получен трансфекцией клеток CHOdhfr плазмидой pIPvES-DHFRIL7, содержащей ген интерлейкина-7 человека. Плазмида pIPvES-DHFRIL7 была синтезирована амплифицированием кДНК интерлейкина-7 человека с помощью праймеров: ecoIL CCTGAATTCCACCATGTTCCATGTTTCTTTTAG, содержащего сайт рестрикции EcoRI и последовательность Козак, и bamIL CCAGGATCCTCAGTGTTCTTTAGTGCCCATC, содержащего сайт рестрикции BamHI, с последующим клонированием по данным сайтам рестрикции в вектор pIRES-DHFR. Предложенный штамм обладает более высокой продуцирующей способностью рекомбинантного интерлейкина-7 человека и может быть использован для лечения ряда патологических состояний, связанных с низким содержанием В- и Т-лимфоцитов. 4 ил., 3 пр.

Наверх