Способ получения n-ацетилглюкозаминил-n-ацетилмурамил-l-аланил-d-глутаминовой кислоты

Изобретение относится к области синтеза физиологически активных мурамилдипептидов, более конкретно к усовершенствованному способу получения N-ацетилглюкозаминил-N-ацетилмурамил-L-аланил-D-глутаминовой кислоты (ГМДП-А). Способ получения N-ацетилглюкозаминил-N-ацетилмурамил-L-аланил-D-глутаминовой кислоты включает конденсацию незащищенного производного мурамовой кислоты с защищенным линейным дипептидом, каталитический гидрогенолиз синтезированного дибензилового эфира N-ацетилглюкозаминил-N-ацетилмурамил-L-аланил-D-глутаминовой кислоты (ДБЭ), выполняемый над палладиевым катализатором, отличающийся тем, что каталитический гидрогенолиз осуществляют в среде этилового спирта с применением промотора катализатора - гидразин гидрата (ГГ) и восстановителя - муравьиной кислоты (МК) при следующих соотношениях реагентов: соотношение по массе {ДБЭ:Pd}={1:0,100-0,500}; соотношение в массовых процентах {Pd:ГГ}={100:0,5-1,5}; соотношение в мольных эквивалентах {ДБЭ:МК}={1:2-4}. Применение данного изобретения обеспечивает более высокую селективность каталитического процесса образования целевого продукта формулы (IV), отвечающего за минимизацию нежелательных примесей в нем, и более высокий выход целевого продукта по сравнению с известными способами. 2 табл., 6 пр., 4 схемы.

 

Изобретение относится к области синтеза физиологически активных мурамилдипептидов, конкретно к усовершенствованному способу получения N-ацетилглюкозаминил-N-ацетилмурамил-L-аланил-D-глутаминовой кислоты (ГМДП-А).

Известно, что ГМДП-А обладает иммуномодулирующей, противоопухолевой и другими видами биологической активности [(RU 97101904 A); (US 4395399 A); (RU 96109376 A); (WO 9809989); (ЕР 0722332 В1); (US 2007167355 A); (RU 2209078); (RU 2139086 C1); (WO 2005007676); (US 5534492); (WO 9601645); (WO 9609063); (WO 2008070564); (WO 9313791)]. При этом токсикологические исследования этого соединения показали, что оно не является токсичным и, в отличие от многих других мурамилдипептидов, пирогенным в диапазоне приемлемых терапевтических доз [RU 2139086]. Поэтому актуальной задачей является создание способа получения данного соединения, приемлемого для его промышленного производства в качестве активной фармацевтической субстанции лекарственного средства.

В настоящее время для синтеза мурамилпептидов наибольшее распространение получили способы, включающие конденсацию защищенного или незащищенного производного N-ацетилмурамовой кислоты (ДС), имеющего активированную карбоксильную группу, и защищенного пептида (ДП), с последующим удалением защитных групп образовавшейся новой молекулы через стадии деблокирования защищенного мурамилпептида каталитическим гидрогенолизом [(SU 1346046); (SU 1326197); (SU 727647); (SU 660589); (US 4395399); (US 4101649); (US 408273;)]. В указанных патентных публикациях стадия каталитического гидрогенолиза бензильной сложноэфирной защиты выполняется способами, известными в данной области техники пептидного синтеза, - проведением реакции над палладиевым катализатором при весовом соотношении {деблокируемое вещество: палладий}, равном {1:0,01-0,05}, в среде, концентрированной (от 99,5% до 60%) уксусной кислоты. В патенте [RU 2181729] стадию каталитического гидрогенолиза бензильной сложноэфирной защиты производного мурамовой кислоты выполняют аналогично, но без применения уксусной кислоты, в среде этанола. Таким образом, в указанных патентных публикациях стадия деблокирования пептидного фрагмента мурамилпептида выполняется по общеизвестной методике с незначительными вариациями: путем выдержки деблокируемого вещества над палладиевым катализатором при соотношении {деблокируемое вещество: палладий}, равном {1:0,01-0,05} [(Гершкович А.А., Кибирев В.К., Химический синтез пептидов, Киев, Наукова Думка, 1992, с. 130)].

Наиболее близким к заявляемому техническому решению является способ получения N-ацетилглюкозаминил-N-ацетилмурамил-L-аланил-D-глутаминовой кислоты [US 4395399], в котором целевое вещество получают предварительной конденсацией незащищенного производного мурамовой кислоты (дисахарида) (I) и защищенного линейного дипептида (V), а стадию каталитического гидрогенолиза бензильной защиты в полученном дибензиловом эфире N-ацетилглюкозаминил-N-ацетилмурамил-L-аланил-D-глутаминовой кислоты (VIII) выполняют над палладиевой чернью в среде 75% уксусной кислоты в течение 6 часов (схема 1 А, Б, В, Г). В патенте не указаны соотношения деблокируемого вещества и палладиевого катализатора, однако в общей части патента сообщается, что проводимые химические реакции выполняются общеизвестными методами пептидного синтеза. Недостаток использованного метода гидрогенолиза заключается в том, что он не обеспечивает селективности реакции деблокирования. Не была учтена особенность строения данного производного (IX) глюкозаминилмурамил дипептида: после деблокировки пептидной части, концевой группой становится радикал глутаровой кислоты, способной в предлагаемых условиях длительной обработки в концентрированных водных растворах кислоты над катализатором претерпевать декарбоксилирование (схема 2), а также образовывать циклический ангидрид (схема 3). Таким образом, в предложенных условиях гидрогенолиза кроме целевого продукта в значимых количествах образуются примесные близкородственные продукты (X и XI), трудно отделяемые от основного вещества и влияющие на его фармакологические свойства, а также на выход целевого продукта.

Дополнительным недостатком предложенного способа является экстенсивность стадии каталитического гидрогенолиза - реакция длится 6 часов в сильнокислой среде, что создает условия для химической деструкции лабильного дибензилового эфира N-ацетилглюкозаминил-N-ацетилмурамил-L-аланил-D-глутаминовой кислоты (схема 4) с образованием продуктов (XII), загрязняющих целевой продукт.

По совокупности указанных недостатков способ [(US 4395399)]] не может быть использован для получения N-ацетилглюкозаминил-N-ацетилмурамил-L-аланил-D-глутаминовой кислоты фармакопейного качества и с высоким выходом.

Задача изобретения состоит в создании способа получения N-ацетилглюкозаминил-N-ацетилмурамил-L-аланил-D-глутаминовой кислоты лишеного этих недостатков.

Техническим результатом, на достижение которого направлено изобретение, является обеспечение более высокой селективности каталитического процесса образования целевого продукта формулы (IX), отвечающего за минимизацию нежелательных примесей в нем и более высокого выхода целевого продукта по сравнению с известными способами.

Технический результат достигается предлагаемым способом получения N-ацетилглюкозаминил-N-ацетилмурамил-L-аланил-D-глутаминовой кислоты, включающим конденсацию незащищенного производного мурамовой кислоты с защищенным линейным дипептидом и последующую стадию каталитического гидрогенолиза синтезированного дибензилового эфира N-ацетилглюкозаминил-N-ацетилмурамил-L-аланил-D-глутаминовой кислоты (ДБЭ), выполняемую в среде этилового спирта над палладиевым катализатором с применением промотора катализатора - гидразин гидрата (ГГ) и восстановителя - муравьиной кислоты (МК) при следующих соотношениях реагентов:

Соотношение по массе {ДБЭ:Pd}={1:0,100-0,500}

Соотношение в массовых процентах {Pd:ГГ}={100:0,1-1,5}

Соотношение в мольных эквивалентах {ДБЭ:МК}={1:2-4}

В предложенном способе конденсация дисахаридного (ДС) и дипептидного (ДП) реагентов выполняется известными методами пептидного синтеза, а каталитический гидрогенолиз полученного диэфира - при строгом качественном и количественном соблюдении предложенных условий, поскольку изменение параметров технологического процесса вне указанных условий не обеспечивает селективность деблокирования молекулы и приводит к образованию значимого количества нежелательных примесей к целевой молекуле, что в свою очередь снижает выход целевого продукта.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом. N-ацетил-D-глюкозаминил-N-ацетилмурамовой кислоты (ДС) (I) в растворе диметилформамида при температуре не выше 0°C подщелачивают добавлением третичных аминов и активируют добавлением известных активирующих агентов (реагента Вудворда К, бис(пентафторфенил)карбоната (II) или других с аналогичным действием). Получают активированный эфир N-ацетилглюкозаминил-N-ацетилмурамовой кислоты (III).

Защищенный дипептид, вводимый в реакцию в форме соли (V), переводят в свободное защищенное основание (VII) добавлением третичного амина.

Полученный раствор свободного защищенного основания приливают к раствору активированного ДС. Дают выдержку и контролируют конец реакции. Реакцию считают законченной, если в ВЭЖХ хроматограмме реакционной массы содержится менее 5% активированного ДС и менее 2% защищенного ДП.

Если имеет место выпадение в осадок солей побочных продуктов реакции, эти соли, например, (IV) и (VI) отфильтровывают. Промежуточный продукт - дибензиловый эфир N-ацетилглюкозаминил-N-ацетилмурамил-L-аланил-D-глутаминовой кислоты (ДБЭ) (VIII) выделяют методом осаждения или выпаривания под вакуумом. Сырец полупродукта очищают подходящими хроматографическими методами, концентрируют и анализируют на содержание основного вещества и примесей.

Применяя метод упарки и переупарки растворителя под вакуумом, переводят ДБЭ ГМДП-А в раствор в этиловом спирте.

Из двуххлористого палладия приготавливают катализатор палладиевая чернь (Pd), который хранят под слоем воды. Непосредственно перед проведением реакции гидрогенолиза декантируют водный слой над катализатором, несколькими промывками этиловым спиртом, удаляют остатки воды и суспензируют катализатор в среде этилового спирта. К катализатору добавляют промотор - гидразин гидрат (ГГ), соблюдая указанные диапазоны соотношения {Pd:ГГ}.

К спиртовой суспензии, содержащей палладий и ГГ последовательно прибавляют муравьиную кислоту и спиртовый раствор ДБЭ, соблюдая указанные диапазоны соотношения {ДБЭ:МК} и {ДБЭ:Pd}. В токе азота раствор перемешивают при комнатной температуре в течение 1 часа, контролируя завершенность реакции методом аналитической ВЭЖХ. Реакция считается завершенной, если в растворе остается менее 2% ДБЭ ГМДП-А.

Реакционную массу, содержащую сырец ГМДП-А, декантируют и методами вакуумной упарки и переупарки с водой очищают с одновременной заменой спиртового растворителя на водный. Водный раствор сырца ГМДП-А очищают методом препаративной обращенно фазовой ВЭЖХ. Целевые фракции, содержащие очищенный продукт, концентрируют в вакууме и лиофилизируют. Получают ГМДП-А с выходом от 56% до 67%, содержащую не менее 96% целевого вещества, не более 1,0% суммарно посторонних примесей и не более 0,5% единичной посторонней примеси.

Описанный способ позволяет осуществить стадию каталитического гидрогенолиза с высокой селективностью и получить N-ацетилглюкозаминил-N-ацетилмурамил-L-аланил-D-глутаминовуюкислоту с высокой степенью чистоты при высоком выходе целевого продукта.

Для целей данного изобретения возможно использовать как палладиевую чернь, так и палладиевый катализатор, нанесенный на носитель - уголь, Al₂O₃ или другие общепринятые для этих целей носители. В этом случае при расчете соотношений {деблокируемого вещество:Pd} и {Pd:ГГ} учитывают не техническую массу катализатора, а только массу содержащегося в нем палладия.

Гидразин гидрат для целей данного изобретения можно использовать в виде 100%-ного, 64%-ного или 35%-ного растворов. При этом в соотношении {Pd:ГГ} расчет ведут на 100%-ное содержание гидразин гидрата, который вводят в суспензию катализатора в этиловом спирте строго перед введением остальных реагентов.

В качестве ключевого дипептидного реагента для целей данного изобретения возможно использовать различные соли защищенного дипептида дибензилового эфира L-аланил-D-глутаминовой кислоты. Например, могут быть использованы тозилаты, хлоргидраты, оксалаты, трифторацетаты и другие соли (V) дибензилового эфира L-аланил-D-глутаминовой кислоты (защищенного линейного дипептида VII), получаемые известными методами пептидного синтеза [Гершкович А.А., Кибирев В.К. Химический синтез пептидов. Киев: Наукова Думка, 1992, с. 130]. Однако метод очистки сырца полупродукта ДБЭ ГМДП-А, необходимой перед проведением реакции гидрогенолиза, не является универсальным и зависит от исходной соли защищенного дипептида, взятого в синтез.

В качестве ключевого дисахаридного реагента в синтезе ГМДП-А используют незащищенную N-ацетил-D-глюкозаминил-N-ацетилмурамовую кислоту, получаемую известными методами [(Ghuysen J.-M., Bact. Rev. 32, №4, 407, 1972); (Ciorbaru R., Lederer E., Bioch. Bioph. Res. Comm. 59, №4, 1317, 1974); (SU 1135163); (SU 1496229)].

Пример 1

Получение дибензилового эфира N-ацетилглюкозаминил-N-ацетилмурамил-L-аланил-D-глутаминовой кислоты (ДБЭ ГМДП-А)

К раствору 83 г (0,168 М) N-ацетил глюкозаминил-N-ацетилмурамовой кислоты в 4,17 л диметилформамида при температуре минус 2°C±2°C прибавляют 26 мл триэтиламина и 78,15 г (0,24 М) реагента Вудворда К. Смесь перемешивают при температуре минус 2°C±2°C в течение 1 часа и затем, при комнатной температуре, от 1 часа и более до получения прозрачного раствора.

Раствор 161,51 г (0,310 М) дибензилового эфира L-аланил-D-глутаминовой кислоты трифторацетата в смеси 21 мл триэтиламина и 0,520 л диметилформамида прикапывают к раствору активированного дисахарида при перемешивании в течение 15-20 минут и оставляют при комнатной температуре на 20-часовую выдержку. Отбирают пробу раствора и контролируют завершенность реакции методом ВЭЖХ. Реакцию считают завершенной, когда на ВЭЖХ хроматограмме остаточное содержание активированного ДС не превышает 5%, а ДП - 2%.

К реакционной массе прибавляют 0,520 л 50%-ного водного этанола и упаривают ее на ротационном вакуумном испарителе при остаточном давлении 10-15 мм рт.ст. и температуре в кубовой бане 38-42°C.

Кубовый остаток очищают методом ионнообменной хроматографии последовательно на колонках, упакованных сорбентом Dowex, сначала в (H⁺-форме), а потом в (CH³COO-форме). В обоих случаях элюентом служит 50% водный этанол.

Элюат с целевым продуктом упаривают на ротационном вакуумном испарителе при остаточном давлении 10-15 мм рт.ст. и температуре в кубовой бане 38-42°C до прекращения испарения летучих. К кубовому остатку приливают 0,600 л метанола и переводят его в раствор. Добавлением к раствору диэтилового эфира высаждают дибензиловый эфир N-ацетилглюкозаминил-N-ацетилмурамил-L-аланил-D-глутаминовой кислоты. Выход продукта после вакуумной сушки при 25°C составляет 104,20 г (71% на ДС).

Получение N-ацетилглюкозаминил-N-ацетилмурамил-L-аланил-D-глутаминовой кислоты(ГМДП-А)

Из 24,82 г двуххлористого палладия с содержанием 59,80% Pd приготавливают 14,60 г палладиевой черни, которую хранят под слоем 0,250 л воды.

Перед проведением гидрогенолиза воду максимально декантируют, катализатор дважды промывают порциями по 0,10 л этилового спирта и приливают к нему последовательно 0,50 л этилового спирта; 0,114 г (0,114 мл) 64%-ного раствора гидразин гидрата (0,073 г 100%-ного ГГ) и 17,53 г (0,014 л) муравьиной кислоты.

Включают интенсивное перемешивание и к суспензии катализатора добавляют раствор 104,2 г дибензилового эфира N-ацетилглюкозаминил-N-ацетилмурамил-L-аланил-D-глутаминовой кислоты в 1,00 л этилового спирта.

При интенсивном перемешивании и комнатной температуре проводят гидрогенолиз. Через 1 час от начала реакции мешалку останавливают и, после осаждения катализатора на дно реактора, отбирают пробу раствора для определения конца реакции. Контроль ведут методом ВЭЖХ по содержанию остаточного ДБЭ ГМДП-А. Реакцию считают завершенной при содержании ДБЭ ГМДП-А≤2%. Время исчерпывающего деблокирования (содержание ДБЭ ГМДП-А≤2%) составляет 1 час. Супернатант над осевшим на дно реактора катализатором декантируют. Катализатор дважды промывают этиловым спиртом порциями по 0,10 л для полноты извлечения целевого продукта. Декантант, объединенный с промывным спиртом, упаривают в ротационном вакуумном испарителе при остаточном давлении 10-15 мм рт.ст. и температуре в кубовой бане 38-42°C до прекращения испарения летучих. К кубовому остатку приливают 0,600 л метанола и переводят его в раствор. Добавлением к раствору диэтилового эфира высаждают сырец N-ацетилглюкозаминил-N-ацетилмурамил-L-аланил-D-глутаминовой кислоты. Выход продукта после вакуумной сушки составил 75,25 г (91% на ДБЭ ГМДП-А и 63% на ДС).

Сырец ГМДП-А в мерной колбе на 0,5 л растворяют в 0,300 л воды и доводят объем колбы до метки.

Очистку сырца ГМДП-А осуществляют методом препаративной обращенно-фазовой ВЭЖХ на хроматографической градиентной системе, укомплектованной колонной-катриджем, заполненной модифицированным силикагелем «Polygoprep 100-30 С18».

В качестве подвижной фазы используют с заданным градиентом воду и 76% этиловый спирт.

Элюаты, близкие по хроматографическому профилю, содержащие целевой продукт, объединяют, концентрируют и лиофилизируют.

Получают 74,1 г ГМДП-А (выход 89,6% на ДБЭ ГМДП-А и 62,1% на ДС), содержащую 96% целевого вещества, 0,8% суммарно посторонних примесей и имеющую максимальное содержание единичной посторонней примеси 0,36%.

Пример 2

Получение дибензилового эфира N-ацетилглюкозаминил-N-ацетилмурамил-L-аланил-D-глутаминовой кислоты (ДБЭ ГМДП-А)

К раствору 85 г (0,172 М) N-ацетилглюкозаминил-N-ацетилмурамовой кислоты в 0,300 л диметилформамида при температуре минус 7°C±2°C прибавляют 20 мл 4-метилморфолина и 72 г (0,183 М) бис(пентафторфенил)карбоната. Смесь перемешивают при температуре минус 7°C±2°C в течение 1 часа и затем при комнатной температуре 2 часа до получения прозрачного раствора.

Раствор 98 г (0,172 М) дибензилового эфира L-аланил-D-глутаминовой кислоты тозилата в смеси 20 мл 4-метилморфолина и 0,300 л диметилформамида охлаждают до минус 7°C±2°C и медленно прикапывают к раствору активированного дисахарида при перемешивании в течение 15-20 минут и дают еще 20-минутную выдержку. Отбирают пробу раствора и контролируют завершенность реакции методом ВЭЖХ. Реакцию считают завершенной, когда на ВЭЖХ хроматограмме остаточное содержание активированного ДС не превышает 5%, а ДП - 2%.

Реакционную массу отфильтровывают от выпавших в осадок солей метилморфолина с побочными продуктами реакции (IV) и (VI) (см. схему 1). Фильтрат упаривают на ротационном вакуумном испарителе при остаточном давлении 1,0-1,5 мм рт.ст. и температуре в кубовой бане 38-42°C.

Сырец ДБЭ ГМДП-А очищают последовательно методом ионнообменной хроматографии кубового остатка на колонке, упакованной сорбентом «Sephadex DEAE А-25» в (CH³COO-форме), элюент - вода, а потом методом препаративной обращенно-фазовой ВЭЖХ. При ВЭЖХ используют в качестве сорбента силикагель «Polygoprep 100-30 С18». Элюцию ведут в градиентном режиме, используя в качестве элюентов 0,1 М уксусную кислоту и 76% этиловый спирт. Элюат, содержащий целевой продукт упаривают в ротационном вакуумном испарителе при остаточном давлении 10-15 мм рт.ст. и температуре в кубовой бане 38-42°C до прекращения испарения летучих. Кубовый остаток переливают в мерную колбу вместимостью 1,0 л и добавлением воды нормализуют объем раствора очищенного ДБЭ ГМДП-А до 1,0 л. Из раствора отбирают аликвоту и определяют в ней методом аналитической ВЭЖХ с применением стандартного образца содержание ДБЭ ГМДП-А и примесей. Выход продукта по данным анализа составляет 109,71 г (73% на ДС).

Получение N-ацетилглюкозаминил-N-ацетилмурамил-L-аланил-D-глутаминовой кислоты (ГМДП-А)

Раствор 109,71 г БДЭ ГМДП-А в 1,0 л воды помещают в кубовую колбу и упаривают в ротационном вакуумном испарителе при остаточном давлении 10-15 мм рт.ст. и температуре в кубовой бане 38-42°C до прекращения испарения летучих. К маслянистому кубовому остатку добавляют 0,250 л этилового спирта, взбалтыванием получают однородный раствор и переливают его в мерную колбу вместимостью 1,0 л. Добавлением этилового спирта нормализуют объем раствора очищенного ДБЭ ГМДП-А до 1,0 л.

Из 18,70 г двуххлористого палладия с содержанием 59,80% Pd приготавливают 11,0 г палладиевой черни, которую хранят под слоем 0,250 л воды.

Перед проведением гидрогенолиза воду максимально декантируют, катализатор дважды промывают порциями по 0,10 л этилового спирта и приливают к нему последовательно 0,50 л этилового спирта; 0,258 г (0,258 мл) 64%-ного раствора гидразин гидрата (0,165 г в пересчете на 100%-ный ГГ) и 23,00 г (0,019 л) муравьиной кислоты.

Включают интенсивное перемешивание и к суспензии катализатора добавляют раствор 109,71 г дибензилового эфира N-ацетилглюкозаминил-N-ацетилмурамил-L-аланил-D-глутаминовой кислоты в 1,00 л этилового спирта.

При интенсивном перемешивании и комнатной температуре проводят гидрогенолиз. Через 1 час от начала реакции мешалку останавливают и, после осаждения катализатора на дно реактора, отбирают пробу раствора для определения конца реакции. Контроль ведут методом ВЭЖХ по содержанию остаточного ДБЭ ГМДП-А. Реакцию считают завершенной при содержании ДБЭ ГМДП-А≤2%. Время исчерпывающего деблокирования (содержание ДБЭ ГМДП-А≤2%) составляет 1 час. Супернатант над осевшим на дно реактора катализатором декантируют. Катализатор дважды промывают этиловым спиртом порциями по 0,10 л для полноты извлечения целевого продукта. Декантант, объединенный с промывным спиртом, упаривают в ротационном вакуумном испарителе при остаточном давлении 10-15 мм рт.ст. и температуре в кубовой бане 35-38°C до прекращения испарения летучих. К кубовому остатку приливают 0,600 л воды и переводят его в раствор. При остаточном давлении 10-15 мм рт.ст. и температуре в кубовой бане 38-42°C раствор концентрируют до прекращения испарения летучих. Кубовый остаток переносят в мерную колбу на 0,250 л и доводят объем колбы до метки. Из нормализованного по объему раствора отбирают аликвоту и определяют методом аналитической ВЭЖХ с использованием стандарта содержание целевого вещества и примесей. Выход сырца ГМДП-А (IX) составляет 81 г (93% на ДБЭ ГМДП-А и 67,9% на ДС).

Очистку сырца ГМДП-А осуществляют методом препаративной обращенно-фазовой ВЭЖХ на хроматографической градиентной системе, укомплектованной колонной-катриджем, заполненной модифицированным силикагелем «Polygoprep 100-30 С18». В качестве подвижной фазы используют в градиентном режиме элюенты: воду и 76%-ный этиловый спирт.

Элюаты, близкие по хроматографическому профилю, содержащие целевой продукт, объединяют, концентрируют под вакуумом и лиофилизируют.

Получают 80,0 г ГМДП-А (выход 92% на ДБЭ ГМДП-А и 67% на ДС), содержащую 99% целевого вещества, 0,9% суммарно посторонних примесей и имеющую максимальное содержание единичной посторонней примеси 0,30%.

Пример 3

Получение дибензилового эфира N-ацетилглюкозаминил-N-ацетилмурамил-L-аланил-D-глутаминовой кислоты (ДБЭ ГМДП-А)

Реакцию конденсации проводят в условиях, описанных в примере 2, с использованием исходных реагентов: 85, г (0,172 М) N-ацетилглюкозаминил-N-ацетилмурамовой кислоты и 75,0 г (0,172 М) дибензилового эфира L-аланил-D-глутаминовой кислоты хлоргидрата.

Сырец ДБЭ ГМДП-А очищают методом препаративной обращенно-фазовой ВЭЖХ, используя в качестве сорбента силикагель «Polygoprep 100-30 С18». Элюцию ведут в градиентном режиме, используя в качестве элюентов 0,1 М уксусную кислоту и 76% этиловый спирт. Все технологические операции, начиная со стадии препаративной ВЭЖХ проводят как описано в примере 2.

Из нормализованного до объема 1 л очищенного водного раствора ДБЭ ГМДП-А отбирают аликвоту и определяют в ней методом аналитической ВЭЖХ с применением стандартного образца содержание ДБЭ ГМДП-А и примесей. Выход продукта по данным анализа составляет 97,69 г (65% на ДС).

Получение N-ацетилглюкозаминил-N-ацетилмурамил-L-аланил-D-глутаминовой кислоты (ГМДП-А)

Раствор 97,69 г БДЭ ГМДП-А в 1,0 л воды помещают в кубовую колбу и упаривают в ротационном вакуумном испарителе при остаточном давлении 10-15 мм рт.ст. и температуре в кубовой бане 38-42°C до прекращения испарения летучих. К маслянистому кубовому остатку добавляют 0,250 л этилового спирта, взбалтыванием получают однородный раствор и переливают его в мерную колбу вместимостью 1,0 л. Добавлением этилового спирта нормализуют объем раствора очищенного ДБЭ ГМДП-А до 1,0 л.

Из 83,3 г двуххлористого палладия с содержанием 59,80% Pd приготавливают 49,0 г палладиевой черни, которую хранят под слоем 0,250 л воды.

Перед проведением гидрогенолиза воду максимально декантируют, катализатор дважды промывают порциями по 0,10 л этилового спирта и приливают к нему последовательно 0,50 л этилового спирта; 0,076 г (0,076 мл) 64%-ного раствора гидразин гидрата (0,050 г в пересчете на 100%-ный ГГ) и 10,22 г (0,008 л) муравьиной кислоты.

Получение и очистку ГМДП-А проводят в условиях, описанных в примере 2.

Выход сырца ГМДП-А составляет 69,77 г (90% на ДБЭ ГМДП-А и 58,5% на ДС).

Выход очищенной ГМДП-А составляет 68,5 г ГМДП-А (88,3% на ДБЭ ГМДП-А и 57,4% на ДС). Содержание целевого вещества 98%; посторонних примесей, суммарно 0,6%; максимальное содержание единичной посторонней примеси 0,29%.

Пример 4

Получение дибензилового эфира N-ацетилглюкозаминил-N-ацетилмурамил-L-аланил-D-глутаминовой кислоты (ДБЭ ГМДП-А)

Реакцию конденсации проводят в условиях, описанных в примере 2, с использованием исходных реагентов: 85, г (0,172 М) N-ацетилглюкозаминил-N-ацетилмурамовой кислоты и 84,0 г (0,172 М) дибензилового эфира L-аланил-D-глутаминовой кислоты оксалата.

Сырец ДБЭ ГМДП-А очищают сочетанным методом ионообменной и препаративной обращенно-фазовой ВЭЖХ в условиях, описанных в примере 2. Из нормализованного до объема 1 л очищенного водного раствора ДБЭ ГМДП-А отбирают аликвоту и определяют в ней методом аналитической ВЭЖХ с применением стандартного образца содержание ДБЭ ГМДП-А и примесей. Выход продукта по данным анализа составляет 94,68 г (63% на ДС).

Получение N-ацетилглюкозаминил-N-ацетилмурамил-L-аланил-D-глутаминовой кислоты (ГМДП-А)

Раствор 94,68 г БДЭ ГМДП-А в 1,0 л воды помещают в кубовую колбу и упаривают в ротационном вакуумном испарителе при остаточном давлении 10-15 мм рт.ст. и температуре в кубовой бане 38-42°C до прекращения испарения летучих. К маслянистому кубовому остатку добавляют 0,250 л этилового спирта, взбалтыванием получают однородный раствор и переливают его в мерную колбу вместимостью 1,0 л. Добавлением этилового спирта нормализуют объем раствора очищенного ДБЭ ГМДП-А до 1,0 л.

Из 32,3 г двуххлористого палладия с содержанием 59,80% Pd приготавливают 19,0 г палладиевой черни, которую хранят под слоем 0,250 л воды.

Перед проведением гидрогенолиза воду максимально декантируют, катализатор дважды промывают порциями по 0,10 л этилового спирта и приливают к нему последовательно 0,50 л этилового спирта; 0,150 г (0,150 мл) 64%-ного раствора гидразин гидрата (0,100 г в пересчете на 100%-ный ГГ) и 14,91 г (0,012 л) муравьиной кислоты.

Получение сырца ГМДП-А проводят в условиях, описанных в примере 2. Выход сырца ГМДП-А составляет 67,62 г (90% на ДБЭ ГМДП-А и 56,7% на ДС).

Очистку и выделение сырца ГМДП-А осуществляют методом препаративной обращенно-фазовой ВЭЖХ в условиях, описанных в примере 2.

Получают 66,7 г ГМДП-А (выход 88,7% на ДБЭ ГМДП-А и 55,9% на ДС), содержащую 97% целевого вещества; 0,4% суммарно посторонних примесей имеющую максимальное содержание единичной посторонней примеси 0,19%.

Пример 5

Получение дибензилового эфира N-ацетилглюкозаминил-N-ацетилмурамил-L-аланил-D-глутаминоеой кислоты (ДБЭ ГМДП-А)

Реакцию конденсации проводят в условиях, описанных в примере 2, с использованием исходных реагентов: 85, г (0,172 М) N-ацетилглюкозаминил-N-ацетилмурамовой кислоты и 88,0 г (0,172 М) дибензилового эфира L-аланил-D-глутаминовой кислоты трифторацетата.

Сырец ДБЭ ГМДП-А очищают сочетанным методом ионообменной и препаративной обращенно-фазовой ВЭЖХ в условиях, описанных в примере 2. Из нормализованного до объема 1 л очищенного водного раствора ДБЭ ГМДП-А отбирают аликвоту и определяют в ней методом аналитической ВЭЖХ с применением стандартного образца содержание ДБЭ ГМДП-А и примесей. Выход продукта по данным анализасоставляет 105,20 г (70% на ДС).

Получение N-ацетилглюкозаминил-N-ацетилмурамил-L-аланил-D-глутаминовой кислоты (ГМДП-А)

Раствор 105,20 г БДЭ ГМДП-А в 1,0 л воды помещают в кубовую колбу и упаривают в ротационном вакуумном испарителе при остаточном давлении 10-15 мм рт.ст. и температуре в кубовой бане 38-42°C до прекращения испарения летучих. К маслянистому кубовому остатку добавляют 0,250 л этилового спирта, взбалтыванием получают однородный раствор и переливают его в мерную колбу вместимостью 1,0 л. Добавлением этилового спирта нормализуют объем раствора очищенного ДБЭ ГМДП-А до 1,0 л.

Из 25,0 г двуххлористого палладия с содержанием 59,80% Pd приготавливают 14,7 г палладиевой черни, которую хранят под слоем 0,250 л воды.

Перед проведением гидрогенолиза воду максимально декантируют, катализатор дважды промывают порциями по 0,10 л этилового спирта и приливают к нему последовательно 0,50 л этилового спирта; 0,114 г (0,114 мл) 64%-ного раствора гидразин гидрата (0,073 г в пересчете на 100%-ный ГГ) и 16,57 г (0,014 л) муравьиной кислоты.

Получение и очистку ГМДП-А проводят в условиях, описанных в примере 2.

Выход сырца ГМДП-А составляет 72,63 г (87% на ДБЭ ГМДП-А и 60,9% на ДС).

Выход очищенного ГМДП-А составляет 71,5 г (85,6% на ДБЭ ГМДП-А и 59,9% на ДС). Содержание целевого вещества 98%; посторонних примесей, суммарно, 1%; максимальное содержание единичной посторонней примеси 0,31%.

Пример 6 (по прототипу)

Получение дибензилового эфира N-ацетилглюкозаминил-N-ацетилмурамил-L-аланил-D-глутаминовой кислоты (ДБЭ ГМДП-А)

К раствору 83 г (0,168 М) N-ацетил глюкозаминил (1-4) - N-ацетилмурамовой кислоты в 4,17 л диметилформамида при температуре минус 2°C±2°C прибавляют 26 мл триэтиламина и 78,15 г (0,24 М) реагента Вудворда К. Смесь перемешивают при температуре минус 2°C±2°C в течение 1 часа и затем 1-1,5 часа до получения прозрачного раствора. Раствор 161,51 г (0,310 М) дибензилового эфира L-аланил-D-глутаминовой кислоты трифторацетата в смеси 21 мл триэтиламина и 0,520 л диметилформамида прикапывают при перемешивании в течение 15-20 минут и оставляют при комнатной температуре на 20-часовую выдержку. Отбирают пробу раствора и контролируют завершенность реакции методом ВЭЖХ. Реакцию считают завершенной, когда на ВЭЖХ хроматограмме остаточное содержание активированного ДС непревышает 5%, а ДП - 2%.

К реакционной массе прибавляют 0,520 л 50%-ного водного этанола и упаривают ее на ротационном вакуумном испарителе при остаточном давлении 10-15 мм рт.ст. и температуре в кубовой бане 38-42°C. Кубовый остаток очищают методом ионнообменной хроматографии последовательно на колонках, упакованных сорбентом «Dowex», сначала в (H⁺-форме), а потом в (CH³COO-форме). В обоих случаях элюэнтом служит 50% водный этанол. Элюат с целевым продуктом упаривают на ротационном вакуумном испарителе при остаточном давлении 10-15 мм рт.ст. и температуре в кубовой бане 38-42°C до прекращения испарения летучих. К кубовому остатку приливают 0,600 л метанола и переводят его в раствор. Добавлением к раствору диэтилового эфира высаждают дибензиловый эфир N-ацетилглюкозаминил-N-ацетилмурамил-L-аланил-D-глутаминовой кислоты. Выход продукта после вакуумной сушки при 25°C составляет 104,20 г (38% на ДС).

Получение N-ацетилглюкозаминил-N-ацетилмурамил-L-аланил-D-глутаминовой кислоты (ГМДП-А)

Из 4,25 г двуххлористого палладия с содержанием 59,80% приготавливают 2,5 г палладиевой черни, которую хранят под слоем 0,250 л воды.

50,00 г дибензилового эфира N-ацетилглюкозаминил-N-ацетилмурамил-L-аланил-D-глутаминовой кислоты растворяют в 0,800 л 75% уксусной кислоты и приливают к суспензии катализатора. При интенсивном перемешивании и комнатной температуре проводят гидрогенолиз. Через 4 часа от начала реакции мешалку останавливают и, после осаждения катализатора на дно реактора, отбирают пробу раствора для определения конца реакции. Контроль ведут через каждые 0,5 часа методом ВЭЖХ по содержанию остаточного ДБЭ ГМДП-А. Реакцию считают завершенной при содержании ДБЭ ГМДП-А≤2%. Время исчерпывающего деблокирования (содержание ДБЭ ГМДП-А≤2%) составляет 6 часов. Супернатант над осевшим на дно реактора катализатором декантируют и дважды промывают порциями по 0,150 л этилового спирта для полноты извлечения целевого продукта. Декантант с промывным спиртом упаривают в ротационном вакуумном испарителе при остаточном давлении 10-15 мм рт.ст. и температуре в кубовой бане 38-42°C до прекращения испарения летучих. К кубовому остатку приливают 0,600 л метанола и переводят его в раствор. Добавлением к раствору диэтилового эфира высаждают сырец N-ацетилглюкозаминил-N-ацетилмурамил-L-аланил-D-глутаминовой кислоты. Выход продукта после вакуумной сушки составляет 31,00 г (78,1% на ДБЭ ГМДП-А и 26,6% на ДС). Содержание основного вещества и примесей, определенных методом аналитической ВЭЖХ, составляет, соответственно, 88,5% и 9,5%.

Сырец ГМДП-А в мерной колбе на 0,5 л растворяют в 0, 300 л воды и доводят объем колбы водой до метки. Очистку ГМДП-А осуществляют методом препаративной обращенно-фазовой ВЭЖХ как описано в примере 2.

Элюаты, близкие по хроматографическому профилю, содержащие целевой продукт, объединяют, концентрируют и лиофилизируют.

Получают 29,9 г ГМДП-А с выходом 75% на ДБЭ ГМДП-А и 25,7% на ДС, содержащую 88,5% целевого вещества; 9,5% суммарно посторонних примесей и имеющую максимальное содержание единичной посторонней примеси 2,84%.

Для исследования влияния условий проведения гидрогенолиза на состав примесей проводили идентификацию примесей в образцах, полученных в примерах 1-6. Для идентификации использовали комбинированный метод высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии (ВЭЖХ-МС) с ионизацией электороспреем (EMI-MS) в режиме отрицательных ионов. Масс-спектры, полученные таким образом, содержали интенсивные пики [M-H]^- и незначительное число фрагментарных ионов. Это позволило установить молекулярные массы, рассчитать брутто-формулы и с большой долей вероятности предположить структуры основных примесных соединений, присутствующих в образцах.

В таблице 1 приведены предполагаемые структуры примесей, отвечающие их массовым числам, полученным методом ВЭЖХ-МС, в сравнении с массовыми числами ГМДП-А и его полупродукта ДБЭ ГМДП-А.

В таблице 2 приведены показатели качества ГМДП-А, полученной заявляемым способом либо по прототипу.

Показатели качества ГМДП-А, получаемой заявляемым способом, удовлетворяют требованиям, предъявляемым к фармацевтическим субстанциям: суммарное содержание посторонних примесей не более 1% и максимальное содержание единичной примеси - не более 0,5%.

Способ получения N-ацетилглюкозаминил-N-ацетилмурамил-L-аланил-D-глутаминовой кислоты, включающий конденсацию незащищенного производного мурамовой кислоты с защищенным линейным дипептидом и последующую стадию каталитического гидрогенолиза синтезированного дибензилового эфира N-ацетилглюкозаминил-N-ацетилмурамил-L-аланил-D-глутаминовой кислоты (ДБЭ), выполняемую над палладиевым катализатором, отличающийся тем, что согласно изобретению стадию каталитического гидрогенолиза осуществляют в среде этилового спирта с применением промотора катализатора - гидразин гидрата (ГГ) и восстановителя - муравьиной кислоты(МК) при следующих соотношениях реагентов:
соотношение по массе {ДБЭ:Pd}={1:0,100-0,500},
соотношение в массовых процентах {Pd:ГГ}={100:0,5-1,5},
соотношение в мольных эквивалентах {ДБЭ:МК}={1:2-4}.